PCR‐based tools for the detection of food‐borne pathogens

PCR market

PCR technology supposes a revolution in microbiological analysisPCR technology supposes a revolution in microbiological analysis offering:

Reliable resultsGreater efficiency and speed in obtaining the resultsy p gEasy methodologyReproducible resultsLower costsLower costs

2

PCR market

In Europe 2006 (R D d li i l li ti l ):In Europe, 2006 (R+D and clinical applications only):

PCR reagents market: 624 M $

Thermal cycler market: 423 M $Source: Frost & Sullivan, 2008

Areas of interest for pathogen detection:

Source: adapted from Biosensors and Bioelectronics, Vol. 

3

22, 1205‐1217 (2007)

PCR market

Growing interest in rapid methods based on PCR technologyGrowing interest in rapid methods based on PCR technology

Source:  ISI web of science 2007. Adapted from Biosensors and Bioelectronics Vol 22 1205 1217 (2007)

4

Bioelectronics, Vol. 22, 1205‐1217 (2007)

PCR market

Growing number of publications focused on pathogen detectionGrowing number of publications focused on pathogen detection based on PCR technology

31,42 %

28,74%

PCR

Traditional culture 28,74 %

10,73%

Traditional culture

ELISA

6,51%Biosensors

22,60%Other

Source : ISI web of science 2007. Publications onpathogen detection methods over the last 20 years

5

PCR market

CEN 2003 Defines the following criteria for a standard PCRCEN 2003 ‐ Defines the following criteria for a standard  PCR method:

Analytic and diagnostic precision

High detection probabilityHigh detection probability

Robustness

Internal amplification control

Low contamination risk

Easy use and interpretation

6

Industry Problems

Food Industry main problems in Quality Control are caused byFood Industry main problems in Quality Control are caused bySlowness in obtaining the results which causes a delay in the release of analyzed products

Lack of personnel trained to perform PCR‐based analyses

Quality Control costs are highQuality Control costs are highDue to the high number of hours of personnel required per analysis

Due to long time to market product readiness

Pathogens in food samples are usually hard to detect since ththey arePresent at low levels, with accompanying bacterial flora

Quiescent due to thermal, radiation, freezing treatments…

7

Q , , g

Industry Needs

Food Industry requiresFood Industry requires

Fast results

Reliable and robust results

Sensitive methods with high specificity

Easy‐to‐perform analytical tools

A t PCR i f ti d t i iAccess to PCR information and training

8

Solutions

Culture & PCR: both based on exponential amplification:

Culture1

PCR

2

3

44

2n 2n2 2

9

Microbial

Mission: Develop and produce bio‐technological products to provide 

better, faster, easier, and cost‐effective PCR analysis to industrybetter, faster, easier, and cost effective PCR analysis to industry

10

Microbial Solutions

HIGHER SPECIFICITY AND SENSITIVITY

No false negatives nor false positives

Influence of accompanying bacterial flora is lower than in traditional culture or immunological systems

Increased sensitivity with a standard pre‐enrichment step

11

Microbial Solutions

HIGHER THROUGHPUT

Every reaction includes an Internal Amplification Control

1 reaction = 1 analysis       No need of parallel control PCR reactions

Different analysis in the sample plate are possible

96 well plate96 well plate94 sample analysis

1 Positive control

1 Non Template Control

12

Microbial Solutions

EASY TO PERFORM METHODOLOGY

Minimum number of steps

SAMPLE

Several pathogens analyzed in one thermocycler run

SAMPLEENRICHMENT DNA EXTRACTION REAL‐TIME PCR

b l d k‐ Using Microbial DNAready kit or other systems

‐ Automation is possible

A good purification of your DNA will avoid inhibitions!

13

Microbial Solutions

LOWER COSTS:

Price per analysis:Salmonella (ISO 6579:2002) and Listeria monocytogenes (ISO 11290:2004)Salmonella (ISO 6579:2002) and Listeria monocytogenes (ISO 11290:2004)

versus Bactoplex (Salmonella + L. monocytogenes)

Salmonella + Listeria monocytogenes

Bactoplex (DNA extraction + PCR)

Positive result aprox. 24 € aprox. 12,5 €p p ,

Negative result aprox. 13 € aprox. 12,5 €

14

Microbial Solutions

LOWER COSTS:

Hours of a technician required per analysis:Salmonella (ISO 6579:2002) and Listeria monocytogenes (ISO 11290:2004)Salmonella (ISO 6579:2002) and Listeria monocytogenes (ISO 11290:2004) 

versus Bactoplex (Salmonella + L. monocytogenes)

Salmonella + Listeria Bactoplex (DNA monocytogenes

(extraction + PCR)

Positive result ~ 80 min ~30 min

Negative result ~ 50 min ~30 min

15

Microbial Solutions

LOWER COSTS:

Time to market product readiness:

Culture (ISO) DNA extraction + PCRPositive result 5 days 19 hoursPositive result 5 days 19 hours

Negative result 3 days 19 hours

16

Microbial Products

Salmofast Legiofast Soon available:Salmofast

Listerfast

g fENVIRON

LegiofastSPECIES

Soon available:

A f tStaphyfast

S aureusf

CampylofastTHERMO DNAready

Sample preparationTyrofastClostridium tyrobutyricum

ArcofastArcobacter butzleri

CronofastCronobacter spp. (E. sakazakii)

DNAreadyLysis Solution

Positive controls:  Reference material for Real time PCR

ColifastO157:H7

ListerfastBactoplex

Listeria + SalmonellaSalmonella spp. + Listeria monocytogenes +

PCR positive control SLCCCronobacter spp. + Campylobacter

material for Real time PCR ListerfastSPECIES

Bactoplex PIFCronobacter spp. + Salmonella

PCR positive control LEGLegionella pneumophila + spp.

PCR Quantitation Standard

17

PCR Quantitation Standard

Microbial Products

Salmofast

R lt i l th 4 h ft i h t i BPWResults in less than 4 hours after pre‐enrichment in BPWDetection limit tested: 3ufc/l in water samples and 5ufc/25g in foodWith an internal amplification control to avoid false negative results100% sensitivity and specificity100% efficiencyValidation against European Standard FOOD‐PCR method in dairy productsValidation against European Standard FOOD PCR method  in dairy products, eggs, raw and cured meat, poultry, raw and smoked fish, species, vegetables, fruits, and precooked dishes.

18

Microbial Products

ListerfastDetermination of

Listeria monocytogenes

Results in less than 4 hours after pre‐enrichment in FraserDetection limit tested: 3‐4 ufc/reactionWith an internal amplification control to avoid false negative resultsWith an internal amplification control to avoid false negative results100% sensitivity and specificity100% efficiencyValidation in dairy products, eggs, raw and cured meat, poultry, raw fish, species, and precooked dishes.

19

Microbial Products

BactoplexListeria + Salmonella

Results in less than 4 hours after pre‐enrichments in BPW and FraserDetection limit tested: 3‐6 ufc/25g for Salmonella, and 3‐4 ufc/reaction for / g , /Listeria monocytogenesWith an internal amplification control to avoid false negative results100% sensitivity and specificity100% sensitivity and specificity100% efficiencyValidation in dairy products, eggs, raw meat, poultry, raw vegetables, raw and smoked fish and precooked dishes

20

smoked fish, and precooked dishes

Microbial Products

LegiofastENVIRONO

Results in less than 4 hoursDetection limit: 3‐4 ufc/reactionWith an internal amplification control to avoid false negative results100% sensitivity and specificity (detects all 15 serogroups L. pneumophila)100% efficiency100% efficiencyValidation against ISO 11731 in water sample from showers, refrigeration towers, environmental outbreaks, and water supply systems.

21

Microbial Products

LegiofastSPECIES

Results in less than 4 hoursQuantification limit: 1 ufc/reactionWith an internal amplification control to avoid false negative results100% sensitivity and specificity (detects all Legionella species)100% efficiency100% efficiencySYBRGreen based detection, easy interpretation of the results by dissociation curves.

22

Microbial Products

CampylofastTHERMO

Results in less than 4 hoursDetection limit: 1 ufc/reactionWith an internal amplification control to avoid false negative results100% sensitivity and specificity (detects all thermotolerant Campylobacter)100% efficiency100% efficiencyValidation against ISO 10272 in raw meat, poultry, fruits, vegetables, dairy products, raw fish, and others.

23

Microbial Products

CronofastCronobacter spp. (E. sakazakii)

Results in less than 4 hoursDetection limit: 1 ufc/reactionWith an internal amplification control to avoid false negative results100% sensitivity and specificity (detects all Cronobacter species)100% efficiency100% efficiencyValidation against ISO 22964 in powdered infant formula.

24

Microbial Products

Bactoplex PIFCronobacter spp. + Salmonella

Results in less than 4 hoursDetection limit: 1 ufc/reactionWith an internal amplification control to avoid false negative results100% sensitivity and specificity (detects the presence of all Salmonella and Cronobacter species)100% efficiencyValidation against ISO 6579:2002 and ISO 22964 in powdered infant formula

25

Microbial Products

 1 ml pre‐enrichment

Spin 10.000 g 5 min

DNAreadyLysis Solution

Discard supernatant

Resuspend pellet with 200 µl 

Fast DNA extractionMinimum number of stepsTested on dairy products, raw 

of DNAready Lysis Buffer

Incubate:30 min 56ºC10 min 95ºC5 min ‐20ºC

vegetables, eggs, fruits, fruit juices, precooked dishes, raw and cured meat, poultry, raw and smoked fish, ice‐creams

Proceed with 1 µl to real time PCR (dilute 1/10 if necessary)

creams

26

Microbial technical product benefitsSalmofast

ListerfastL i fOPEN KITS: Microbial products work with most of the 

thermocyclers in the market.

Bactoplex

fast

LegiofastSPECIES

LOWER COSTS: cheaper analysis, less technician’s hours, shorter time to market.

plex

Campylofast

Bactoplex PIFCronobacter spp. + Salmonella

AVOID RISKS: protect your brand with our carefully chosen oligonucleotides using scientific criteria:

fast

CronofastCronobacter spp. (E. sakazakii)

DNAreadyL i S l ti

Highest stability / lowest variability

Highest inclusivity and specificity ArcofastArcobacter butzleri

StaphyfastS aureus

Avoid false negative results

ColifastO157:H7

TyrofastClostridium tyrobutyricum

27 Microbial Kits

ListerfastSPECIES

Microbial support to implement PCR

TURN‐KEY SOLUTIONTURN KEY SOLUTION

We study your needs depending on the type and number of samples analyzed

We propose the best solution to your needs

W t l b d t l ti PCR b d tWe come to your lab and set‐up your real‐time PCR‐based system

We perform the first analysis with you in your lab

We provide courses and training on PCR analysis

We offer full support for any technical problem you may find

28

Microbial

Microbial efforts are exclusively directed to research,development, and production of new tools for the detectionof pathogenic bacteria by PCR

Years of experience help in identifying the best genetic targets, andin the design of the appropriate molecular tools to detect them

Quality is our main goal

Our analysis systems are based on years of rigorous investigations, and on the application of the characteristics and conditions that a good molecular target must accomplish. 

This has lead us to present a product which goes a step forward in the detection of food‐borne pathogens.

29

Microbial Official Supporters

CDTi

CIDEM

PCiT de GironaPCiT de Girona

AGAUR

Universitat de Girona (UdG)

Generalitat de Catalunya (Catalonia Government)

Ministerio de Educación y Ciencia (Spanish Government)

d d ( h )

30

Ministerio de Industria, Turismo y Comercio (Spanish Government)

Microbial Certifications

All our products have been validated against International Standard Procedures

UNE EN ISO 9001:2008 (ENAC UKAS)UNE EN ISO 9001:2008 (ENAC, UKAS)

AFNOR certification (In progress)

31

32

Parc Científic i Tecnològic de Girona

Pic de Peguera, 15. Edifici Jaume Casademont, E

E‐17003 Girona

Spain

Tel. +34 972 183236

Fax. +34 972 183236

www microbial‐systems com

32

www.microbial systems.com

info@microbial‐systems.com