UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTALLISANDRO ALVARADODECANATO DE AGRONOMADEPARTAMENTO CIENCIAS BIOLOGICASMICROBIOLOGIA AGRICOLA

Microorganismos de la Celulosa, Fijacin Biolgica del Nitrgeno, Mineralizacin del Nitrgeno.

Grupo: 8-MircolesIntegrantes:Roberth Escalona C.I 22333471Mary Villares C.I 20241526Wilmer Sanchez C.I 20045414Melvin Quintero C.I 20076853Hctor Snchez C.I 20867159Crismar Torres C.I 22194660Andrs Torres C.I 17378716

Cabudare 28/10/2014Objetivos: Practica N 8 MICROBIOLOGIA DE LA CELULOSA1. Aislar microorganismos capaces de utilizar la celulosa como nica fuente de carbono.2. Observar los diferentes tipos de microorganismos celulticos actuando sobre el material suministrado.3. Detectar los posibles cambios fsicos y qumicos en el sustrato utilizado.

Se preparo una dilucin la cual contena 10gr de suelo a una fiola con 90ml de agua destilada esterilizada (ADE) e identificada como 10-1 se agito durando 2 minutos y luego se transfirieron 10 ml de la dilucin 10-1 a otra fiola con 90ml de ADE y se identifico con 10-2, a partir de estas diluciones se procedi a realizar los siguientes experimentos:Aislamiento de microorganismo en medio liquido:a.1 Con tiras de papel:Resultados:DilucionespH InicialpH Final

10176

10276

Obtuvimos presencia de colonias en la cual al realizar la tincin se observaron diplobacilos gram () en ambas diluciones. No hubo cambio de coloracin durante el periodo de incubacin No se encontr presencia de burbujas (produccin de gas) en ninguno de los tubos.

Discusin: hubo presencia del genero bacteroides; bacterias deslizantes (cytophaga) que se encuentran en el suelo; la mayor parte de las citofagas crecen como bacilos aislados esbeltos, y son especializadas en la descomposicin de la celulosa. (Roger Y. Stanier) no hubo consumo de celulosa debido a que la celulosa presentada fue en papel de filtro en muy alta cantidad para estos microorganismos; sin embargo hubo reduccin de PH favorable para dichas bacterias.

a. Con sustratos molidos:Cambio de colorGeneracin de burbujasObservacin visual

Con tapnSe observo un color amarillo intenso, perdiendo el color verdoso.Si genero burbujasPresencia de 1 bacilo gram () en la tincin.

Sin tapnSe observo un amarillo mas fuerteNo genero burbujasPresencia de una cadena de 4 bacilos gram () en la tincin.Presencia de hongos en la superficie.

.

(Celulosa molida en pequeos trozos evidencia de cambios y consumo)

Con tapon: (anaerbica) se evidencio complejo celulticos multienzimaticos (celulosomas) debido a la presencia de burbujas (gram -), gneros pertenecientes clostridium, acetivibrio, Bacteroides y hemicelusa (rodriguez. C. biotecnologa celular. 2005)

Sin tapon: (aerbica) accin de bacterias aerbicas (gram -) celulomonas y thermobifida estas degradan la celulosa a travs de la excrecin de celulasas extracelulares La presencia de hongos tienen ms xito que las bateras en el proceso de la degradacin en suelos cidos (Rodrguez. C. biotecnologa celular. 2005)

b. Aislamiento en medio solido:DilucinPlacas con agar celulosaPlacas con agar charpentier

101Presencia de 7 colonias. Se pudo observar en la tincin bacterias de tipo bacilos y diplobacilos.Presencia de 9 colonias, poco desarrollado en el papel y color negro. Se observaron bacilos celulolitico por debajo del papel.

102Presencia de 5 colonias, pero no tuvieron mucho desarrolloSe observaron 10 colonias, al igual que la otra se observaron bacilos celuloliticos y diplobacilos gram -

101: mayor cantidad de colonias debido a mayor concentracin de suelo accionando bacterias celulticas.102: menor cantidad debido a menor concentracin de suelo accionando bacterias celulticas.Evidenciando que la estructura del suelo franco- arcilloso contienen un importante contenido parcial de microorganismos celulotiticos. Sin embargo el rea en MAESTRA CIENCIAS- MICROBIOLOGA BOGOT D.C. 2009 establece que el desarrollo de microorganismos celulticos es mayor en suelos limo-arcillosos:

Objetivos: Practica N 9FIJACION BIOLOGICA DEL NITROGENO (ASOCIATIVA Y NO ASOCIATIVA)1. Observar los ndulos desarrollados y caracterizarlos de acuerdo al tamao y ubicacin en el sistema radical.2. Comprobar la efectividad de la simbiosis mediante la observacin de la coloracin interna de los ndulos.3. Observar el estado de bacteroide de Rhizobium en los ndulos.4. Observar desarrollo de colonias de Rhizobium sp.(fijadores biolgicos asociados del nitrgeno) en agar manita rojo congo.5. Observar el desarrollo de colonias de fijadores biolgicos de vida libre.6. Caracterizar aislados de bacterias diazotrficas.

Evaluacin de la nodulacin en plantas de caraotas (Phaseolus vulgaris) y frijol (Phaseolus sp.) para aislamiento de Rhizobium sp.

Caractersticas de los ndulos de acuerdo al tamao y ubicacin en el sistema radical:Ndulos efectivos: son generalmente grandes y son los que estn ubicados en las races primarias y en las secundarias superiores. Las plantas que presentan ndulos efectivos obtienen mayor rendimiento y presentando un crecimiento normal y hojas de color verde sano.Ndulos inefectivos: son pequeos, numerosos y con frecuencia estn distribuidos en todo el sistema radical. Las plantas con ndulos inefectivos se desarrollan lentamente.

Ndulos en Caraota Ndulos en Frijol

Para comprobar la efectividad de la simbiosis se realizo un corte en los ndulos de la planta:Los ndulos internamente presentan una coloracin rosado intenso representando ndulos sanos y efectivos de las leguminosas, esto se debe a una protena de pigmento rojo (leghemoglobina); esta protena especial contiene hierro (fe) y molibdeno (Mo) siendo responsable de asociacin activa a la fijacin del nitrgeno activo; esta condicin crea un ambiente con poco oxigeno dentro del ndulo lo que permite que la bacteria viva y fije N2 y con llevando la regulacin de la entrada del oxigeno al ndulo, estos ndulos cambian su coloracin rosa a verde con la edad pasando a ser inefectivos.Los ndulos inefectivos son internamente de coloracin blanca o verde plido y no cambian su coloracin con la edad.

Observacin del estado del bacteroide, (transcurrido 72 horas):Con la tincin de gram se constato la viabilidad de los ndulos y se observo el bacteroide con forma de bacilo gram (-), estos viven en simbiosis con la raz de la planta y despus de un proceso de infeccin inducido por la propia planta; mediante la secrecin de lectina proporcionando el nitrgeno necesario para que la planta lo absorba: a cambio la planta le brinda hospedaje.

Bacteroide

Cultivo de colonias Rhizobium sp en agar manita rojo cong.

Caraota Frijol A los cuatro das, se observo en general, crecimiento lento, se realizo la tincin de gram a las colonias y dieron como resultados bacterias de tipo bacilos gram negativas. Aislamiento de bacterias Aislamiento de bacterias

En este aislamiento se obtuvo un crecimiento ligeramente bajo, debido al factor tiempo, deduciendo la falta de absorcin del rojo congo, ya que presentaban una coloracin rosada o blanca, estableciendo una analoga con Rojas et. al, 2009, seala que a los 8 das toma una coloracin; sin embargo se conoce que las colonias Rhizobium sp. En las plantas llegan al parnquima hipodrmico a travs de los pelos radiculares en los que forman colonias filamentosas y dentro de estas se dividen rpidamente, pasando despus a la fase de bateroides (Martinez et. Al) Al aislarla el agar manita rojo congo permite la diferenciacin bioqumica de las especies de acuerdo a sus componentes, conocindose as la tolerancia de las colonias a factores abiticos tales como la habilidad para crecer a diferentes tipos de PH (4.5; 6.8; 9 y 11) y ah diferentes temperaturas (4.5 C; 30C 37C y 40C) (Bequer et. al., 2000. Moraud et al., 2009)Mediante el anlisis de correlacin de Pearson se establece que las bacterias diazotrficas aisladas tienen una correlacin con la materia orgnica, fsforo, pH del suelo, profundidad de la raz y tipo de riego; estas bacterias tienen capacidad de fijar el nitrgeno atmosfrico en una forma mas aprovechable como el amoniaco. En la caracterizacin fenotpica deberan ser las caractersticas de bacilo largo ovoide y la forma de colonia circular, regular, elevada, lisa, crema brillante, (Zapater, 1975)

Objetivos: Practica N 10 MINERALIZACION DEL NITROGENO1. Evaluar cualitativamente el proceso de mineralizacin del nitrgeno por las poblaciones microbianas.2. Determinar el poder nitrificador de una muestra de suelo.3. Comparar la accin desnitrificadora de diferentes poblaciones microbianas.Leyenda de los cuadros a. b. c. y d:

a. Proceso de amonificacin (Caldo nutritivo):

MuestraDa 1Da 2Da 3Da 4Da 5

Suelo++++++++

Estircol mono gstrico+++++++++++

Estircol poligstrico++++++++++

(-) no hubo cambio(+) baja intensidad de color (++) mediana intensidad de color (+++)alta intensidad de color

Suelo: durante los primeros dos das hubo baja intensidad de amonio posteriormente presentaron mediana intensidad de color, los microorganismos del suelo descomponen sustancias orgnicas y transforman compuestos que contienen carbono, nitrgeno y azufre. El xido nitroso se produce dentro del ciclo del nitrgeno a travs de reacciones de nitrificacin y desnitrificacin del nitrgeno orgnico contenido en orina y heces del ganado.Estircol monogstrico: el primer da hubo liberacin de amonio en baja intensidad posteriormente en el 2do, 3er y 4 da presento un aumento de color, sin embargo al 5to da disminuyo su intensidad de color; (Nitrgeno no proteico) sin embargo los animales monogstricos tienen un estmago "simple", en que solo tienen lugar ligeras modificaciones microbianas de los nutrientes disponibles antes de que ocurra el proceso de absorcin. Los microorganismos estn en contacto con el material indigestible, y los productos de la fermentacin microbiana pueden ser absorbidos parcialmente por el animal hospedero para suplir parte de sus necesidades energticas (Wenk, 2001), es decir con una poco digestibilidad por lo tanto existe una alta productividad de amonio dando presencia la fuente principal de nitrgeno. Estircol poligstrico: presencia continua de liberacin de amonio medianamente, se sabe que los animales poligstricos presentan un sistema digestivo complejo formada por 4 compartimientos; haciendo que una gran cantidad de subproductos con alto contenido de nitrgeno sean sintetizados, existen bacterias desnitrificadoras anaerbicas como las amelasas y las proteasas (Wenk, 2001) analgicamente el estircol poligstrico es menos productor de amonio que el monogstrico.Segn los resultados obtenidos el suelo presenta una menor amonificacion que el estircol poligastrico.

b. Proceso de amonificacion (Caldo a base de Urea)MuestraDa 1Da 2Da 3Da 4Da 5

Suelo++++++++++

Monogstrico++++++++++++++

Poligstrico+++++++++++++

(-) no hubo cambio de color(+)baja intensidad de color (++) mediana intensidad de color (+++)alta intensidad de color

Previamente aislado con caldo nutritivo obtuvimos resultados confiables bajo literatura estudiada, la urea es un compuesto qumico que se encuentra en abundancia en la orina y en el material fecal, con un contenido de 46% de nitrgeno, al agregar urea a el aislamiento del material del suelo, monogastrico y poligastrico acelera la produccin de amonio.

c. Poder nitrificador del suelo:MuestraNitritosNitratos

Suelo + sulfato de amonio 0.05%Da 1++Da 2+Da3+Da4-Da5-Da1++Da 2++Da 3++Da 4+Da 5+

(-) no hubo cambio de color(+)baja intensidad de color (++) mediana intensidad de color (+++)alta intensidad de color

La actividad potencial de las bateras nitrificantes (quimioautotrofos) parecen haber variado debido a factores adversos; el de la nitrificacin actan microorganismos aerbicos estrictos, necesitan disponer de oxgeno en el ambiente para poder llevar a cabo estas reacciones. Por lo tanto en condiciones anaerbicas la nitrificacin se detiene acumulndose NH4+. Los primeros das se observ una coloracin algo fuerte, indicando presencia de nitritos y nitratos en la solucin estudiada, al transcurrir los das va disminuyendo la presencia de nitritos y van aumentando la presencia de nitratos, sabiendo que para obtener los nitratos, los nitritos presentes deben oxidarse y as mismo ir produciendo energa, viendo al final del ensayo, que hay una ausencia total de nitritos y solo se observan nitratos en menor cantidad, entendiendo que estos nitratos son el producto de la oxidacin de los nitritos presentes en la solucin.

d. Desnitrificacin:MuestraDa 1Da 2Da 3Da 4Da 5pH InicialpH Final

Suelo-+++-78

Estircol monogstrico++++++-78

Estircol poligstrico++++++++78

(-) no produjo burbujas (+)baja produccin de burbujas(++)alta produccin de burbujas

Teniendo en cuenta que en este proceso ocurre una reduccin de los nitratos hasta obtener nitrgeno gas, se observ que entre los distintos sustratos y a diferencias de los das, una reduccin de los nitratos ms acelerada entre los primeros das en el estircol poligstrico y no habiendo reduccin alguna en el suelo, entendiendo que esto ocurre por la especificidad de los organismos presentes en los distintos sustratos, al transcurrir los das se observ que hubo un aumento en la presencia de burbujas en el estircol monogstrico dando a entender que los microorganismos presentes son un poco ms lentos para la reduccin de los nitratos, al final del ensayo se presenci la ausencia absoluta de burbujas en los dos primeros sustratos, entendiendo esto que ya al quinto da no continuaba el proceso de reduccin de los nitratos a diferencia del estircol poligstrico que aunque en menor cantidad an los microorganismos presentes se mantenan en proceso de reduccin de los nitratos presentes.

Conclusin

Existen microorganismos celulticos especializados en la degradacin de celosa jugando un papel fundamental; es uno de la fuentes de carbohidratos ms abundantes en la biomasa vegetal pueden proveer sustratos carbonatos para otros microorganismos, sabiendo que intervienen mltiples factores como el pH del suelo, la fuente de carbono (celulosa) y de nitrgeno (urea). (Levin y Forchiassin 1995, 1997). Los organismos que presentan asociacin simbitica en el sistema radical de las plantas estudiando ndulos con bacterias del genero rhizobium demuestran la simbiosis necesaria en plantas de importancia econmica a nivel agronmico teniendo una alta productividad en ndulos efectivos .La accin microbiana puede mineralizar o inmovilizar el nitrgeno, el alto contenido de nitrgeno acelera la velocidad de mineralizacin debido a la provisin de nutrientes, tambin favorece a la degradacin de materia orgnica dando as la disponibilidad de nutrientes a las plantas a una velocidad moderada. (estircoles)

Bibliografia

Angelica chavez V. glosario de biotecnologa autor,2006 Prescott, L. M., Harley, J. P., y Klein, D. A.Microbiologa. 4 edicin. McGraw-Hill Interamericana, 1999. Madigan, M. T., Martinko, J. M., y Parker, J.Brock Biologa de los Microorganismos. 10 edicin. Prentice-Hall. Madrid, 2003. Daz, R., Gamazo, C, y Lpez-Goi, I.Manual prctico de Microbiologa. 2 edicin. Masson, S.A.. Barcelona, 1999.