metodos inoculacion cuantif inoculo

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Mtodos de inoculacin

24 de abril al 5 de mayo de 2012

Curso: Mtodos en fitopatologaUnidad de Fitopatologa

Dto. de Proteccin VegetalFacultad de Agronoma.

Dr. Pedro Mondino

Inoculacin en plantas

La inoculacin en plantas la realizamos con el fin de producir enfermedad a las mismas o, en el caso de controladores biolgicos, para protegerlas del ataque de patgenos.Debemos disponer de inculo viable.Debemos poner ese inculo en contacto con la planta.La planta debe estar en un estadio susceptible.Debemos dar las condiciones necesarias para que ese inculo colonice la planta y se produzca la enfermedad.

Inoculacin de plantas

El inculo de hongos puede ser: Esporas o micelio, mientras que en el caso de bacterias es la propia clula bacteriana.En general se debe tener en cuenta cual es la manera en que naturalmente penetra a la planta dicho inculo.Por ejemplo: en aquellos casos en que el patgeno penetra por heridas ser conveniente depositar el inculo en una herida.


Es muy importante conocer cual es la cantidad mnima de inculo necesaria para producir infeccin.En un ensayo en que inoculamos una serie de plantas es necesario que todas sean inoculadas de la misma manera y con cantidades similares de inculo.Luego de la inoculacin es comn mantener a las plantas en condiciones de humedad y temperatura apropiadas para que el patgeno pueda desarrollarse.


Podemos inocular para probar patogenicidad. En ese caso, si no lo hacemos de manera correcta podemos llegar a resultados errneos en el diagnstico.Podemos inocular plantas para evaluar el efecto de alguna medida de control. Por ejemplo evaluar el efecto de un fungicida o de un producto biolgico.


En los ensayos es esperable que las plantas testigo manifiesten la enfermedad, mientras que las plantas tratadas (si el tratamiento es efectivo) los niveles de enfermedad sean menores.

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Inoculacin de bacterias

Las bacterias pueden inocularse mediante la aspersin de los rganos de la planta con una suspensin de clulas bacterianas.

Es necesario saber ajustar la concentracin en la suspensin de bacterias.


Inoculacin de hojas con una suspensin bacteriana. Mediante carborundum se producen pequeas heridas.


Resultado de la Inoculacin de hojas.


Embolsado para mantener la humedad de los brotes inoculados.


Aparicin de sntomas.


Inoculacin de Pseudomonas syringae pv papulans en frutos de manzana mediante aspersin con una suspensin de esporas.

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El racimo de frutos luego de inoculados son embolsados para evitar inoculaciones naturales.


Papa infectada por Ralstonia solanacearum mostrando la zooglea.


Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearummostrando marchitamiento de la hoja. La inoculacin se realiz mediante puncin en una yema lateral.

Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearummostrando marchitamiento de la hoja. La inoculacin se realiz mediante puncin en una yema lateral.



Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearummostrando marchitamiento de la hoja.


Inoculacion de Xanthomonas campestris pv cucurbitaemediante aspersion de cotiledones

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Inoculacin de suelo

Ralstonia inoculada mediante riego con suspensionbacteriana

Test de hipersensibilidad en NO Husped

Mtodo de inoculacin mediante infiltracin del mesfilo..


Resultado de la inoculacin (mesfilo infiltrado) izq.Resultado positivo (reaccin de hipersensibilidad) der.


Resultado positivo

Diferentes tipos de inoculacin

Inoculacin en plantas de olivo de hojas, tallos, races y cuello

Cuello

HojasRaz

Tallos

Inoculacin de frutos

A partir de una colonia esporulada se realiza una suspensin de conidios en suero fisiolgico estril.Pequeas heridas de 1 a 2 mm de profundidad se practican con un objeto punzante en la zona ecuatorial de los frutos.Cada herida es inoculada con 10 microlitros de una suspensin de esporas de 104 esporas/ml

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Inoculacin de frutos Inoculacion de frutos

Inoculacin de frutos ctricos con 10 l unasuspensin de esporas de Penicillium digitatum (104 conidios/ml)


Desinfeccin superficial

Inoculacin de heridas con suspensin de patgeno

Secado a temp.ambiente (2hs)

Almacenamiento 1 mes a 5C

Inoculacin de heridas con suspensin de antagonista

Frutos de manzana inoculados

Herida protegidaHerida control


Inoculacin de frutos de kiwi con una suspensin de esporas de Botrytis cinerea


Inoculacin se zapallos con Fusarium spp.

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Inoculacin de zapallos con Fusarium spp.

Inoculacin de hojas mediante aspersin de suspensin de esporas

Manchas de las hojas y fruto de manzanos causados por Glomerella cingulata en Ro Grande do Sul, Brasil.Mtodo: aspersin con una suspensin de 106conidios/ml

Inoculacion con discos de micelioBotryosphaeria spp.Mediante sacabocado se marcan los discos de micelio sobre la placa

Inoculacion con discos de micelio

Los discos son colocados sobre la rama previamente herida superficialmente.Posteriormente se cubre con film

Inoculacin con discos de micelio

Cada rama se identifica.


Resultado de la inoculacin con diferentes aislamientos de Botryosphaeria spp.

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Resultado de la inoculacin en plntulas de arndano con discos de micelio de Botryosphaeria clavispora.

Inoculacin de suelo

Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron.) Deighton, agente causal de la mancha ocular del trigo.Inoculacin de suelo estril mezclando con trozos de tallos afectados, y sembrando semillas de una variedad susceptible, desinfectadas superficialmente.

Inoculacin del sustrato

Inoculacin con discos de micelio de Pythium

Inoculacin en bandejas

Inoculacin de lechuga con discos de micelio de Sclerotinia sclerotiorum

Inoculacin de tallos mediante discos de micelio

Inoculacin al suelo.

Mediante riego de una suspensin de conidios (haciendo heridas o no)

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Inoculacin de semillas

Inoculacin de plantines de citrus Resultado



Bacterizacin de semillas

Cuantificacin de esporas

Uso de la cmara de Neubauer

Cmara de Neubauer

Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro.en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula .Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea de un cuadrado corresponde a 1 milimetrocuadrado.La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm

respecto a la superficie.De forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.

Cmara de Neubauer

Esquema

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Cmara de NeubauerSi contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de 20 esporas (en las cuatro reas sumadas)la concentracin en la suspensin ser :concentracin en la suspensin (esporas / mL) = (20/4) y eso multiplicado por 10.0005 x 104 esporas por mililitro.

5 esporas por cada 0,1 microlitro

50 por microlitro

50.000 por mililitro

Cmara de Neubauer

En la cmara de Neubauer el lmite mnimo de conteo es de 1 x 104 esporas/ml.

Recuento en placa

Consiste en sembrar en placas con medio de cultivo alcuotas de la suspensin de microorganismos.las condiciones ptimas de conteo se dan cuando se desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa. Como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.).

Recuento en placa

Se preparan diluciones sucesivas de 1 en 10.Para la segunda dilucin se toma 1 mL de la primer dilucin y se descarga en 9 mL de diluyente y assucesivamenteLas diluciones a sembrar se eligen segn la carga esperada o permitida. Generalmente, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas.

Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3).

Diluciones Diluciones

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Recuento en placa

Esquema

Recuento en placa

Este mtodo permite determinar slo las clulas microbianas viables

Siembra en superficie

Se deposita 0.1 mL de cada dilucin en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo.Se realiza duplicado para cada dilucin.Se emplea la misma pipeta para todas las diluciones comenzando por la ms diluida.Se debe extender sobre toda la superficie de la placa

usando un rastrillo estril.Se usa un nico rastrillo para todas las diluciones en el mismo orden (de la ms diluida a la ms concentrada)

Uso de la filtracin

Cuando la concentracin es baja mediante filtracin y siembra del filtro se pueden medir la concentracin de bacterias en medio liquido.

Escala de Mc Farland

2,7 x 1099,10,993,0 x 1099,01.010

2,4 x 1099,20,882,1 x 1099,30,771,8 x 1099,40,661,5 x 1099,50,551,2 x 1099,60,449,0 x 1089,70,33

6,0 x 1089,80,223,0 x 1089,90,11u.f.c./ml.SO4H2 al 1%Cl2Ba al 1%Tubo

Escala de Mcfarland

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