metodi metodi diddiidicampionamento … · tossine biologiche screening di zone molto piccole...
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METODI METODI METODI METODI DIDIDIDI CAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTONEL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO NEL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO NEL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO NEL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO
AMBIENTALE IN AMBIENTALE IN AMBIENTALE IN AMBIENTALE IN ANIMAL FACILITYANIMAL FACILITYANIMAL FACILITYANIMAL FACILITY
Dott.ssa Piera Anna MartinoDott.ssa Piera Anna MartinoDott.ssa Piera Anna MartinoDott.ssa Piera Anna MartinoDIPAV, Sezione di Microbiologia e Immunologia Veterinaria
Facoltà di Medicina VeterinariaUniversità degli Studi di Milano
Siena, 16 settembre 2011
Il monitoraggio microbiologico all’internodi una animal facility è molto importante e, in
genere, è associato al controllo dello stato sanitario degli animali stabulati
superficiariaacqua
CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI
Permette di determinare o confermare la presenza di agenti biologiciÈ fondamentale come supporto
All’attività di monitoraggio sanitarioNella determinazione dell’ampiezza della contaminazioneNella valutazione dell’attività di disinfezione
CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI
Il campionamento necessita La scelta di una porzione della superficie da indagare
Superfici non porose (plastica, metallo, acciaio, …)La scelta di uno strumento efficace per la raccolta dei contaminanti microbici
Fase di indagineTipologia dell’agenteDimensione e tipologia della/e superficie/iLimiti del metodo di campionamento
CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI
Gli elementi essenziali per ottenere un campionamento “di successo” includono:
Personale adeguatamente istruitoStrategia di campionamento
Definizione degli obiettiviScelta del numero e dei tipi di campioni ambientali da raccogliereScelta dei terreni colturali
Laboratorio qualificato di sostegnoControllo di qualità
CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI
In ogni procedura sperimentale di campionamento di agenti biologici dovranno essere utilizzati
Materiali steriliPre-sterilizzati in autoclave o irradiati
Tecniche di asepsiGarantiscono un campione significativo
CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI
Tre possibili fasi del campionamento delle superfici:1. Fase di screening iniziale2. Fase di caratterizzazione/identificazione3. Fase di pulizia e controllo post-disinfezione
CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI
1. Fase di screening inizialeCampionamento qualitativoPresenza o assenza del microrganismo/i nell’ambienteScelta di punti sicuramente o molto probabilmente contaminati
Porzioni di filtri di ventilazione/condizionamentoAttenzione alle dimensioni del campione
Fase rapida
CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI
2. Fase di caratterizzazione/identificazioneCampionamento quantitativoImportanza dell’area campionata in quanto i risultati sono riportati come concentrazione/areaPermette di identificare le potenzialità dell’infezione, le possibili vie di diffusioneIdentifica le zone da decontaminare/disinfettareFase più indaginosa
CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICICAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI
3. Fase di pulizia e controllo post-disinfezionePermette di controllare l’efficacia delle procedure di disinfezione
Riduzione del numero dei microrganismi ~0 UFC o al limite dello strumento/metodo utilizzato
Tre possibilità di campionamento:Più campioni per avere un’area maggioreZone raggiungibili dal trattamentoZone “difficili” da raggiungere
Attenzione alla presenza di residui di disinfettantiUso di terreni con neutralizzanti
MA QUALI AGENTI BIOLOGICIMA QUALI AGENTI BIOLOGICIMA QUALI AGENTI BIOLOGICIMA QUALI AGENTI BIOLOGICISONO DA RICERCARE NELLSONO DA RICERCARE NELLSONO DA RICERCARE NELLSONO DA RICERCARE NELL’’’’AMBIENTE?AMBIENTE?AMBIENTE?AMBIENTE?
MEDCHROME.COM
GLI STRUMENTI A DISPOSIZIONEGLI STRUMENTI A DISPOSIZIONEGLI STRUMENTI A DISPOSIZIONEGLI STRUMENTI A DISPOSIZIONE
salviette/spugnettesalviette/spugnettesalviette/spugnettesalviette/spugnette
tamponitamponitamponitamponi
piastre a contattopiastre a contattopiastre a contattopiastre a contatto
LE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHE
BatteriVirusTossine biologiche
Screening di piccole zone
Valutazione della contaminazione
Valutazione efficacia della decontaminazione
Campionamento di un’area piccola
Solo per superfici non porose
Garze/spugne sterili 5 x 5 cm
Inumidire con soluzione sterile
Campionamento mediante sagoma o su un’area ben definita
SPUGNETTE
Agenti biologici
UsiTargetDescrizioneTipo di campione
LE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHE
BatteriVirusTossine biologiche
Screening di zone molto piccole
Valutazione della contaminazione di punti critici
Valutazione efficacia della decontaminazione
Campionamento di un’area molto piccola
Solo per superfici non porose, angoli e piccole fessure
Tamponi sterili singoli
Inumiditi con soluzione sterile o in terreno di trasporto
Campionamento di un’area ben definita
TAMPONE
Agenti biologici
UsiTargetDescrizioneTipo di campione
LE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHELE LORO CARATTERISTICHE
BatteriScreening di zone piccole
Valutazione della contaminazione
Valutazione efficacia della decontaminazione
Campionamento di un’area piccola
Solo per superfici non porose
Raccolta del campione mediante pressione della piastra sulla superficie identificata
PIASTRE A CONTATTO
Agenti biologici
UsiTargetDescrizioneTipo di campione
• Non usare su superfici molto contaminate• Breve shelf-life• Scelta del terreno colturale
DA RICORDAREDA RICORDAREDA RICORDAREDA RICORDARE
È importante che durante la conservazione e il trasporto i campioni siano mantenuti refrigerati e inviati al laboratorio il più rapidamente possibile
Il laboratorio processerà altrettanto celermente i campioni
Uso di metodi analitici validati perché i risultatisiano ripetibili, riproducibili e confrontabili
CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ARIAARIAARIAARIA
Permette di raccogliere e valutare la concentrazione e la composizione di agenti biologici aerosolizzatiAttenzione alla caratteristica dei bioaerosol di sedimentare e ridisperdersi per movimenti dell’ariaLimitazioni legate al posizionamento e al tempo di campionamento (collection time) dello strumento utilizzato
Risultati negativiRisultati negativiRisultati negativiRisultati negativi indicano solo che un determinato agente non è presente in un certo sito in concentrazioni evidenziabili al momento del campionamentoRaccolta di più campioni nel tempo
CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ARIAARIAARIAARIA
1. Campionamento passivo2. Campionamento attivo
“impattatori”/aspiratorifiltrazione
CAMPIONAMENTO PASSIVO DELLCAMPIONAMENTO PASSIVO DELLCAMPIONAMENTO PASSIVO DELLCAMPIONAMENTO PASSIVO DELL’’’’ARIAARIAARIAARIA
Passivo o Passivo o Passivo o Passivo o deposizionaledeposizionaledeposizionaledeposizionaleDeposizione per via gravitazionale delle bioparticellesu una superficie
Poco costoso e facile da eseguireCampionamento non quantitativo
Volume raccolto sconosciutoParticelle più grandi si depositano prima e in maggior numero rispetto alle piccole
CAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELL’’’’ARIAARIAARIAARIASistema a compressioneSistema a compressioneSistema a compressioneSistema a compressione
Campionamento forzato di aria su una superficie solida o liquida mantenendo i microrganismi aerogeni vitali o fisicamente inalteratiMetodo Metodo Metodo Metodo ““““a compressionea compressionea compressionea compressione””””
Microrganismi superficie solida o semisolidaL’aria viene aspirata e convogliata, attraverso fori circolari o ugelli, direttamente
Terreno agarizzatoAgar-sangue, TSA, R2A
Superficie adesiva
Campionamento forzato di aria attraverso una membrana filtranteEfficienza di raccolta legata
Alle dimensioni delle particelleAlle proprietà fisiche delle particelleAlle forze inerziali ed elettrostaticheAlle caratteristiche del campionatore
Vengono raccolte le particelle più piccole del diametro dei pori del filtro
CAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELLCAMPIONAMENTO ATTIVO DELL’’’’ARIAARIAARIAARIASistema per filtrazioneSistema per filtrazioneSistema per filtrazioneSistema per filtrazione
Diverse tipologie di filtri ma attenzione alla disidratazione del campione sul filtro
Membrane in gelatina SartoriusMembrane in gelatina Sartorius
CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ACQUAACQUAACQUAACQUA
Drinking waterAmpio range di microrganismi
Coliformi, E. coli, Campylobacter, virusLimite legato al bassissimo numero di organismi presenti nell’acqua di bevandaProcedure microbiologiche basate su:
Concentrazione/arricchimento del campioneIsolamento microrganismiQuantificazione (UFC/mL)
CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ACQUAACQUAACQUAACQUA
Crescita su terreni selettivi/UFC
Colture cellulari/CPE/unitàformanti placca
Identificazione/conta
Filtrazione su membranaAdsorbimento/eluizioneConcentrazione
BATTERIVIRUS
MICRORGANISMIMICRORGANISMIMICRORGANISMIMICRORGANISMI
METODIMETODIMETODIMETODI
Necessità di un approccio multi-steps
CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ACQUAACQUAACQUAACQUACONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONE
BATTERIFiltri con diametro 47 mm e pori da 0.22 a 0.45 µmSemina su terreni solidi o liquidi
Importante fare più repliche per ottenere una conta piùprobabile
CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ACQUAACQUAACQUAACQUACONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONECONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONE
Uso di tecniche di pre-arricchimento e arricchimento per alcuni batteri
IN ITALIAIN ITALIAIN ITALIAIN ITALIA
Per l’acqua di bevanda (in bottiglia) i parametri sono:
Escherichia coli 0/250 mLEnterococchi 0/250 mLPseudomonas aeruginosa 0/250 mLConta a 22 °C 100/mLConta a 37 °C 20/mL
CAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELLCAMPIONAMENTO DELL’’’’ACQUAACQUAACQUAACQUACONCENTRAZIONE E CONTACONCENTRAZIONE E CONTACONCENTRAZIONE E CONTACONCENTRAZIONE E CONTA
VIRUSAdsorbimento ed eluizione su filtroUso di filtri in polisulfonato (0.02 µm)Presenza/assenza (TC)Tecnica delle placche
Metodi classici Sensibili ma indaginosi nella caratterizzazione dei microrganismiLegati al volume di campione
Metodi molecolariSensibili ed affidabiliNon discriminano tra microrganismi vivi e “morti”Non permettono di valutare la patogenicità
LIMITI DEI METODI MICROBIOLOGICILIMITI DEI METODI MICROBIOLOGICILIMITI DEI METODI MICROBIOLOGICILIMITI DEI METODI MICROBIOLOGICI
Metodi standardizzati disponibili International Organization of Standardization (ISO)European Committee for Standardisation (CEN)American Public Health Association (APHA)French Standard (NF)In continua revisione e aggiornamento
STANDARDIZZAZIONE DEI METODISTANDARDIZZAZIONE DEI METODISTANDARDIZZAZIONE DEI METODISTANDARDIZZAZIONE DEI METODI
QUINDI QUINDI QUINDI QUINDI …………
CAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTOSIGNIFICATIVOSIGNIFICATIVOSIGNIFICATIVOSIGNIFICATIVO
OBIETTIVI STRUMENTI
CONOSCENZADELLA PROPRIA
STRUTTURA