metodi elettroforetici
TRANSCRIPT
Metodi elettroforetici. (SSCP, HDA, TGGE e DGGE)
Molecole di DNA a singolo filamento migrano in un gel di poliacrilammide non denaturante in maniera dipendente dalla struttura tridimensionale e quindi della loro sequenza.
Single Strand Conformation Polymorphism
(SSCP)
Fattori da prendere in considerazione per la SSCP
• amplificazione di frammenti corti (150-300 bp)• denaturazione completa• composizione della matrice del gel• composizione del tampone• lunghezza del gel e durata elettroforesi e temp.• concentrazione del DNA• Impossibile predire la mobilità elettroforetica del
SS
Esempi di SSCP
Eterozigoti
Heteroduplex analysis (HDA)
slow
Parametri importanti
• Temperatura dell’elettroforesi• Dimensioni amplificato (100-200 bp)• presenza di glicerolo• RNA-SSCP• matrice del gel• delezioni/inserzioni più facili da visualizzare• Universal Heteroduplex Generator (frammento
sintetico con delezione di 2-5 bp)
Esempio di HDA
F508
Elettroforesi capillare
Analisi di LOH mediante tipizzazione di microsatelliti
Analisi di mutazione per sequenza
Instabilità di microsatelliti
Polimorfismi determinati per sequenza
Normale
Omozigote Mut
Eterozigote Mut
SSCP-CE
Analisi di RFLP
Temperature e Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
(TGGE e DGGE)
Denaturazione
La separazione avviene in base a differenze nella temperatura di fusione delle molecole. La denaturazione causa rallentamento nel gel. Le differenze sono esaltate negli eteroduplex.
Rilevamento di Mutazioni mediante DGGE