metode istraživanja u histologiji
DESCRIPTION
Metode istraživanja u histologiji. Livia Puljak Katedra za histologiju i embriologiju. Zašto se uči histologija. Učenje mikroskopske građe ljudskog tijela Razumijevanje načina na koji različita tkiva funkcioniraju – temelj za fiziologiju - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Zašto se uči histologija
• Učenje mikroskopske građe ljudskog tijela• Razumijevanje načina na koji različita tkiva
funkcioniraju – temelj za fiziologiju• Da bi znali kako izgleda bolesno tkivo, moramo
znati kako izgleda zdravo – temelj za patologiju• Histologija je važna za moderna znanstvena
polja: apoptoza stanice, prepoznavanje stanice, implantacija embrionalnih matičnih stanica, itd.
• Histologija je temelj za kliničke znanosti
2
Proučavanje tkiva
• Uobičajeni postupak: pripravljanje histoloških rezova• Promatranje svjetlosnim mikroskopom• Tkiva i organi su debeli
– Treba ih rezati da kroz njih može prolaziti svjetlo• Moguće je promatrati žive stanice
– Tanki slojevi tkiva• Ipak, najčešće se tkiva mogu proučavati tek nakon što
se izrežu na tanke rezove koji se prilijepe na stakalca
4
Idealan histološki preparat
• Pripravak tkiva očuvan• Tkivo na stakalcu ima jednaku građu i molekularni
sastav kakvo je imalo u tijelu• Rijetko izvedivo u praksi• Na pripravku gotovo uvijek ima
– Artefakata– Deformacija– Gubitaka sastojaka
Nabor na preparatu hrskavice
5
Priprema histoloških rezova
1. Uzimanje i obrada tkiva ili stanica
2. Fiksiranje/smrzavanje tkiva
3. Uklapanje tkiva
4. Rezanje tkiva mikrotomom ili kriostatom
5. Bojanje tkiva
6. Analiza
6
Fiksacija
• Za pripremu trajnih preparata
• Da se izbjegne razgrađivanje tkiva– Enzimima– Bakterijama
• Nužna brza i prikladna fiksacija
• Kemijske i fizikalne metode fiksacije
7
Kemijska fiksacija tkiva
• Otopine tvari (fiksativi)• Stabiliziraju ili križno povezuju tkivne bjelančevine• Rezanje i umakanje tkiva u otopinu• Intravaskularna perfuzija
• Ubrizgavanje fiksativa u krvožilni sustav
8
Kemijski fiksativi
• Križno povezivanje bjelančevina– Aldehidi
• Precipitirajući fiksativi– Alkohol
• Oksidirajuće tvari– Osmijev tetraoksid, kalij dikromat, kromna kiselina,
kalij permanganat• Živini spojevi• Pikrati • HOPE fiksativ
9
Fizikalna fiksacija tkiva
• Fiksacija toplinom• Kad se bris osuši na sobnoj temperaturi• Preparat se nekoliko puta prinese plameniku• Rutinski se koristi za bakterije• Čuva morfologiju, ali ne interne strukture• Toplina:
– denaturira proteolitičke enzime– spriječava autolizu
10
Postupak uklapanja ili impregniranja tkiva
• Dehidriranje– Uklanja se voda– Uzastopnim prenošenjem u sve koncentriranije
mješavine etanola i vode• Zamjena etanola otapalom za sredstvo za uklapanje• Za vrijeme prožimanja otapalom tkivo obično postane
prozirno (prosvjetljivanje)• Uklapanje u otopljeni parafin u termostatu• Van termostata:
– tkivo proženo parafinom se stvrdne
11
Uklapanje tkiva
• Tkivo se može rezati tek kad se uklopi u neko čvrsto sredstvo
• Za rezanje mikrotomom – plastične smole i parafin
• Za rezanje smrznutih rezova – uklapanje u poseban medij koji se brzo smrzne
12
Rezanje tkiva
• Rezanje tkiva točno određene debljine
• Mikrotom– Nužna prethodna
složena priprema tkiva
• Kriotom– Smrznuti rezovi,
jednostavna priprema tkiva
Mikrotom
Kriotom
14
Smrznuti rezovi
• Brza metoda• Bez prethodnog dugog postupka uklapanja• Rutinska primjena u bolnicama za pregledavanje
tkiva tijekom kirurškog zahvata• Korisno u histokemijskom istraživanju vrlo
osjetljivih enzima i malih molekula• Za proučavanje tkivnih lipida
15
Bojenje
• Tkiva su uglavnom bezbojna
• Stoga nije moguće svjetlosnim mikroskopom proučavati neobojena tkiva
• Bojenjem se ističu pojedini sastojci tkiva
• Bazofilne boje
• Acidofilne boje
• Trikromi
• Kontrastno bojenje
16
Hematoksilin i eozin
Jednjak
Hematoksilin boji bazofilne sastojke tkiva, a eozin boji acidofilne sastojke
17
Trikromi
Trikromi dobro prikazuju jezgru i citoplazmu, a različito oboje kolagen i glatko mišićje
18
Kontrastno bojenje
-U mnogim postupcima (npr. imunocitokemija) pojedinosti na rezovima označavaju se nekim precipitatom-Ali tada se ne vide obrisi stanica-Kontrastno bojenje, jednom bojom, omogućuje blijedo bojenje jezgre i citoplazme
-Slika: crveno je bojenje za protein CD61, a plavo je kontrastno bojenje jezgre
19
Svjetlosni mikroskop
-Zasniva se na uzajamnom djelovanju svjetla i tkivnih sastojaka-Najvažniji preduvjet za dobivanje jasne slike jest moć razlučivanja mikroskopa
20
Polarizacijski mikroskop
Omogućuje prepoznavanje tvorba građenih od vrlo pravilno poredanih molekula
21
Slika preparata snimljenog na polarizacijskom mikroskopu
Štakorski mezenterij obojen pikrosirijusom za prikazivanje kolagenih vlakana. U polariziranom svjetlu kolagena su vlakna obojena sjajno crveno ili žuto
Polarizacijski mikroskop omogućuje prepoznavanje tvorba građenih od vrlo pravilno poredanih molekula
22
Konfokalni mikroskop
Omogućuje veoma točno fokusiranje na sasvim tanku ravninu unutar stanice ili histološkog reza
23
Slika preparata snimljenog na konfokalnom mikroskopu
Mreža aktinskih vlakana u glatkom mišiću dijafragme štakora
24
Slika preparata snimljenog na fluorescencijskom mikroskopu
Fibroblasti maternice. Bojanje s 3 različite fluorescentne boje.
Fluorescencijski mikroskop sadrži izvor ultraljubičastog svijetla i posebne filtre za odabir svjetlosnih zraka različitih duljina
25
Elektronski mikroskop-Dopušta povećanja od 400 000 puta
-Transmisijski EM (na slici)-Snop elektrona prolaze kroz preparat
-Skenirajući (scanning) EM-Omogućuje prikaz naizgled trodimenzionalne slike-Uski snop elektrona polagano klizi na površini preparata (skenira)
26
Ako su tkiva dobro obrađena i fiksirana mogu se uspoređivati kontrolna tkiva
obojena H&E sa onima koja su patološki promijenjena i utvrditi razlike
30
Proučavanje histoloških preparata
• Pregledati cijeli preparat
• Presjek – poprečni ili uzdužni
• Povećanje – veliko, srednje ili malo
• Na mnogim preparatima je teško točno utvrditi za sve stanice koje su – nemojte se stoga frustrirati
32
Ako nema informacije o povećanju, treba utvrditi je li malo, srednje ili veliko
Hint: Malo povećanje – puno stanica, veliko povećanje – malo stanica
35