medios lquidos y bio react ores 2009
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
MEDIOS LÍQUIDOS Y SISTEMAS AVANZADOS DE
MICROPROPAGACIÓN
Características de los medios líquidos
Hiperhidricidad
Bioreactores
Reactores de Inmersión Temporaria
Micropropagación de plantas
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Medios líquidos
• Menores costos
• Mejor calidad de planta
• Mecanización del proceso
Técnica ideal paraproducción masiva deplantas
Micropropagación de plantas
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Ventajas
• Mayores tasas de crecimiento
• Mayor superficie de contacto
• Toma de nutrientes y reguladores mas eficiente
• Dispersión mas efectiva de metabolitos tóxicos
• Facilidad de limpieza del material de vidrio
Micropropagación de plantas
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Micropropagación de plantas
Medios líquidos
Curtis, 2005.
• Formación de una capaestacionaria (“Nernst”).
• Tasa de absorción de ioneslimitada.
• Espesor depende de laagitación.
• Medios líquidosestáticos/agitación
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Micropropagación de plantas
Medios líquidos
Curtis, 2005.
• Concentración de oxígeno,principal factor limitante delcrecimiento.
• Heterotrofia de tejidos vegetalesen cultivo.
• Oxidación de azúcaresdeterminante principal de lademanda biológica de oxígeno(BOD).
• Baja solubilidad del oxígeno enel medio de cultivo.
• Principal demanda: meristemos.
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Micropropagación de plantas
Shaker rotatorio paraErlenmeyer.
Rotor para tubos de ensayo.
Medios líquidos
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Principal problemática:VITRIFICACIÓN O HIPERHIDRICIDAD
Desorden fisiológico, metabólico y morfológico
en condiciones de cultivo in vitro .
Micropropagación de plantas
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Micropropagación de plantas
•Apariencia turgente
•Superficie acuosa
•Órganos translúcidos•Coloración menos verde
•Brotes frágiles, se quiebran fácilmente
•Capacidad de enraizamiento reducida o nula
Características de los brotes hiperhídricos:
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Condiciones adversas
• Altas concentraciones de citoquininas
• Alta HR en el recipiente de cultivo
• Recipientes herméticos
• Bajas concentraciones de agar
Micropropagación de plantas
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Principales síntomas
Menor contenido de Ca+2Ausencia de parénquima enempalizada
Hojas mas gruesas,elongadas, arrugadas
Mayor actividad deglutamato deshidrogenasa
Hipertrofia del parénquimacortical y médular
Tallos de mayor diámetro
Menor contenido declorofila
Estomas anormales y en menornúmero
Menor peso seco
Menor capacidadfotosintética
Color anormal
Mayor absorción de aguaMenor desarrollo del sistemavascular
Hojas translúcidas yquebradizas
Menor contenido decelulosa
Grandes espaciosintercelulares
Arrosetamiento
HipolignificaciónEpidermis y cutícula delgadasEntrenudos cortos
Bioquímicos AnatómicosMorfológicos
Micropropagación de plantas
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Planta normal Planta vitrificada
Micropropagación de plantas
Vaccinium corymbosum
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
NORMALVITRIFICADO
Micropropagación de plantas
Achyrocline flaccida
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
NORMAL VITRIFICADO
Micropropagación de plantas
NORMAL
VITRIFICADO
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VÍA DE SÍNTESIS DE LIGNINAY FLAVONOIDES REDUCIDA
POR VITRIFICACIÓN
Phenylalanine
Ác.coumárico
Ác. cinamico
P-coumaryl-CoA
LIGNINAFLAVONOIDES
P-coumarato:CoA
ligasa
(Adaptado de George, 1993)
HIPOLIGNIFICACIÓN
Micropropagación de plantas
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Micropropagación de plantas
Cambios morfológicos y anatómicos en Vanilla planifolia
Sreedhar et al., 2009.
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Micropropagación de plantas
Sreedhar et al., 2009.
Cambios morfológicos y anatómicos en Vanilla planifolia
Tejidos vasculares
Endodermis
Tejidos vasculares
Parénquima en empalizada
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Micropropagación de plantas
A) Superficie del tallo, B) Sistema vascular, C) Aumento de B, mostrandoengrosamiento de las paredes de los vasos, D) Estructura de estomas.
Sreedhar et al., 2009.
Cambios morfológicos y anatómicos en Vanilla planifolia
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Aireación cultivo Densidad del medio
HR Disponibilidad PGRs Disponibilidad nutrientes
Constituyentes
Pared Celular
Estrés aireación
Producción etileno
ETILENO
Actividad enzimática
Pared Celular
Elasticidad Pared
Celular
Propiedades mecánicas
Pared Celular
Forma de la célula
Efecto sobre
microtúbulos
Tamaño de la célula
Engrosamiento
Pared Celular Orientación
microfibrillas
FuncionamientoCélula Guarda Aerénquima ehiperhidratación
VITRIFICACIÓN
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Como prevenirla
• Medio de cultivo:
– Incrementar la concentración de agar – Disminuir concentración de citoquinina
• Tapado de recipientes: – Permitir intercambio gaseoso
• Condiciones ambientales: – Enfriamiento basal – Incrementar la aireación
• Otras medidas
Micropropagación de plantas
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COMPUESTOS QUECONTRARESTAN LA
VITRIFICACIÓN
Phloroglucinol
Phloridzin
VÍA DE SÍNTESIS DE LIGNINAY FLAVONOIDES REDUCIDA
POR VITRIFICACIÓN
Phenylalanine
Ác.coumárico
Ác. cinamico
P-coumaryl-CoA
LIGNINAFLAVONOIDES
P-coumarato:CoA
ligasa
(Adaptado de George, 1993)
HIPOLIGNIFICACIÓN
Micropropagación de plantas
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Micropropagación de plantas
Curtis, 2005.
Bioreactores
• Requerimientos fisiológicos delos tejidos vegetales pueden seincompatibles con el diseño yfuncionamiento de bioreactorestradicionales.
• Amplia gama de diseños, enfunción del tejido a propagar,escala de producción, etc.
• Basados en los mismos
principios de agitación,demanda y transferencia de O2,etc.
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Micropropagación de plantas
Bioreactores para la propagación de plantas:
•De inmersión temporal:
•BIT ®
•RITA ®
•De inmersión permanente
•Nalgene ®
•Life reactor ®
, Osmotek
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Bioreactor de Inmersión Temporal (BIT®)
Centro de Bioplantas, Cuba.
Micropropagación de plantas
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Sistema BIT®
Bioreactor de Inmersión Temporal (BIT®)
Centro de Bioplantas, Cuba.
Micropropagación de plantas
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Micropropagación de plantas
Bioreactor de Inmersión Temporal (BIT®)
• Volumen de medio/explanto
• Tiempo de inmersión
• Frecuencia de inmersión
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
EJEMPLOS DE APLICACIÓN
Coeficiente de multiplicación se incrementó de 2 a 8 (promedio).
28 días
Multiplicación de Musa sp; sistema BIT®
Escalona, 2005.
Micropropagación de plantas
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Micropropagación de plantas
Nápoles et al. 2009.
Multiplicación de Psidium guajava en BIT®
Efecto del volumen de medio y frecuencia de inmersión.
El tiempo de inmersión fue de 3 min. en todos los tratamientos.Se utilizaron 20 explantos por recipiente, de 1,5 litros.
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍA
Sistema RITA®
Reactor de Inmersión Temporal Automatico (RITA®)
CIRAD, Francia.
Micropropagación de plantas
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Dpto. Biología VegetalFACULTAD DE AGRONOMÍASistema RITA®
Reactor de Inmersión Temporal Automatico (RITA®)
CIRAD, Francia.
Micropropagación de plantas
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Micropropagación de plantas
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Las principales ventajas
del sistema Rita®
Disminución del costo de mano de obra , debido ala facilidad de manipulación de los explantes y del
cambio de medio. Permite una mejor nutrición mineral. Uncontacto estrecho entre la superficie de los explantes yel medio durante la fase de inmersión. Por capilaridad,una fina película de medio se mantiene sobre losexplantes. Fuerte disminución de los problemas de asfixia ovitrificación de los tejidos en comparación con unainmersión permanente.
Renovación completa del aire dentro delrecipiente durante cada inmersión. Mejor separación de los tejidos o células bajo elefecto de las burbujas. Control de los procesos morfológicos debido a la
frecuencia y la duración de inmersión. Protección de cada recipiente contra lacontaminación por los filtros. Manipulación individualfácil. Abolición de los riesgos de contaminacióncruzada.
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EJEMPLOS DE APLICACIÓN
• Café, tasa de multiplicación en medio sólido: 6-7 cada 3 meses.En RITA igual tasa en 5 semanas.
• Banana, 700 a 1000 embriones somáticos por RITA.
• Eucalyptus grandis, tasa de multiplicación 11,5 contra 3,5 ensistemas convencionales.
• Otros: papa, ananá, Phalaenopsis, etc.
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Multiplicación de Musa sp ; sistema RITA®
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Regeneración de frutilla transgénica por organogéneis,sistema RITA.
Hanhineva, 2007.
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Embriogénesis somática de Hevea brasiliensis , sistema RITA.
Etienne, 1997.Embriones/g de callo:
En medio sólido: 36
Sistema RITA: 255
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Micropropagación de plantas
Bioreactores de inmersión permanente
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Bioreactores de inmersión permanente
Micropropagación de plantas
Nalgene ®
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EJEMPLOS DE APLICACIÓN
Multiplicación de Vaccinium corymbosum , BR de inmersión permanente.
Ross, 2006.
La tasa de multiplicación se incrementó de 4 a 28 (promedio).
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Multiplicación de Achyrocline flaccida , BR de inmersión permanente.
Ross, 2006.
La tasa de multiplicación se incrementó de 4 a 11 (promedio).
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RESULTADOS
ExplantosInstalación
30 días 60 días
Micropropagación de plantas
Ross, 2006.
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BIOREACTOR
10 explantos
Tasa mult: 12/yema
480 microestacas
2 meses
MEDIO SÓLIDO
Tasa mult: 4/explanto
10 explantos
40 explantos
160 microestacas
30 días
30 días
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AA B
m
x
m
x
RESULTADOS
Cortes histológicos
Cortes transversales de tallo: (A) Sin phloroglucinol; (B) 40 mg.L-1 dephloroglucinol; m: médula; x: xilema
Micropropagación de plantas
Ross, 2006.
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Enraizamiento
Micropropagación de plantas
Ross, 2006.
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Micropropagación de plantas
Lifereactor ® , Osmotek
Recipiente descartable depolietileno preesterilizado, 1,5 o 5litros.
Sistema airlift.
Accesorios para manteneresterilidad del sistema,purificación y humidificación delaire.
Soporte.
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Micropropagación de plantas
Escalado
Panax ginseng
Paek et al., 2005.
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Micropropagación de plantas
Escalado
a) y b) Manzana
c) Chrysantemum
d) Ajo
e) Vid
f) Bulbos de Lilium
Paek et al., 2005.