IMUNOLOGIAIMUNOLOGIA TRANSPLANTULUITRANSPLANTULUI

ILEANA CONSTANTINESCUILEANA CONSTANTINESCU

EDITURA UMF CAROL DAVILAEDITURA UMF CAROL DAVILA

1

20092009

2

PREFAȚĂ

Atunci când mă gândesc la o boală, nu caut niciodată un leac pentru aceasta,

ci un miljoc de a o preveni.“LOUIS PASTEUR”

Imunologia transplantului este o specialitate nouă care își croiește drumul între specialități prin frumusețea abordării noilor tehnologii de biologie moleculară, prin semnificația rezultatelor și impactul acestora asupra deznodământului transplantului.

Atât genotiparea alelelor HLA cât și detecția și identificarea anticorpilor citotoxici sunt investigații imunologice de transplant care au nevoie de o interpretare extrem de laborioasă, iar expertiza imunologului este extrem de importantă în transplantul renal, medular, cardiac, hepatic, pulmonar, pancreatic, etc.

Alături de investigațiile imunologice pretransplant sunt foarte importante și evaluările posttransplant care urmăresc posibila apariție a rejetului subclinic, apariția neoplaziilor sau a altor complicații imunologice legate de regimurile imunosupresoare practicate, care sunt decisive în ceea ce privește evoluția pacienților transplantați.

Centrul de Imunogenetică și Virusologie, Fundeni, a fost înfințat în anul 2000 și are ca domeniu de activitate imunologia transplantului, imunologia tumorală, diagnosticul virusologic. Acest centru, este centru de referință metodologic în imunologia transplantului pentru România din anul 2006, în același an obținând și acreditarea cu Federația Europeană de Imunogenetică (EFI). Seria acreditărilor a fost completată de acreditarea ISO realizată în anul 2009. Prin intermediul acestui centru, s-au organizat numeroase workshop-uri interne și internaționale, simpozioane, cursuri pentru toate centrele de imunogenetică din țară și pentru comunitatea de transplant din Europa.

Prin realizările profesionale, centrul nostru, care este și primul centru de biologie moleculară în diagnosticul imunologiei de transplant

3

din România, are o activitate deosebit de susținută pe toate tipurile de transplant care se efectuează la noi în țară, monitorizând anual peste 1000 de pacienți care au efectuat un transplant.

Avem speranța că această monografie va fi utilă tuturor rezidenților care doresc să aprofundeze aspectele imunologiei de transplant, de cercetare sau de practică clinică în domeniul transplantologiei și să reprezinte o lucrare de referință pentru colegii noștrii imunologi din întreaga țară.

Octombrie, 2009

Conf. Dr. Ileana Constantinescu

Șeful Centrului de Imunogenetică și Virusologie, Institutul Clinic Fundeni

Directorul Departamentului de Granturi și Cercetare Științifică, UMF “Carol Davila”

4

CUPRINSCUPRINS

COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE.....................................................................................9

ORGANIZAREA GENELOR ANTIGENELOR LEUCOCITARE UMANE (HLA)

ÎN COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE (MHC)………………………………………………………………………………………………………………..9

STRUCTURA MOLECULELOR HLA…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….13

STRUCTURA MOLECULELOR HLA DE CLASA I…………………………………………………………………………………………………………………13

STRUCTURA MOLECULELOR HLA DE CLASA A II-A………………………………………………………………………………………………………….14

EMERGENŢA DE NOI ALELE……………………………………………………………………………………………………………………………………………15

LINKAGE DISEQUILIBRIUM (LEGĂTURĂ DEZECHILIBRATĂ)……………………………………………………………………………………………….16

GENETICA HLA……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..17

SEMNIFICAŢIE CLINICĂ………………………………………………………………………………………………………………………………………………...17

METODE SEROLOGICE DE TIPIZARE HLA…………………………………………………………………………………………………………………………………………………18

TIPIZAREA HLA PRIN TESTUL DE LIMFOCITOTOXICITATE………………………………………………………………………………………………….19

5

IZOLAREA CELULELOR………………………………………………………………………………………………………………………………….20

PROTOCOL DE LUCRU PENTRU TESTUL LIMFOCITOTOXICITĂŢII DEPENDENTE DE COMPLEMENT……………………21

VARIABILITATEA REZULTATELOR DE TIPIZARE HLA SEROLOGICE…………………………………………………………………….22

TIPIZAREA HLA PRIN METODE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ……………………………………………………………………………………………………………23

INTRODUCERE……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….23

PRINCIPIILE METODELOR MOLECULARE DE LUCRU ÎN HISTOCOMPATIBILITATE……………………………………………………………..25

AMPLIFICAREA GENELOR……………………………………………………………………………………………………………………………..26

GENOTIPAREA HLA SSOP………………………………………………………………………………………………………………………………………………27

GENOTIPAREA HLA SSP…………………………………………………………………………………………………………………………………………………28

TIPIZAREA HLA BAZATĂ PE SECVENŢIERE (SBT)……………………………………………………………………………………………………………………30

TEHNOLOGIA MICROARRAY…………………………………………………………………………………………………………………………………………………32

LIMITELE METODELOR DE BIOLOGIE MOLECULARĂ……………………………………………………………………………………………………………..34

EVALUAREA ACURATEŢEI METODELOR DE TIPIZARE HLA………………………………………………………………………………………………………………34

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL RENAL..........................................................................35

STATUSUL CURENT AL TRANSPLANTULUI RENAL………………………………………………………………………………………………………………………...35

FACTORI DETERMINANŢI AI EVOLUŢIEI PE TERMEN LUNG……………………………………………………………………………………………………………36

EVALUAREA ANTICORPILOR CITOTOXICI………………………………………………………………………………………………………………………………………39

SCREENING-UL ANTICORPILOR CITOTOXICI PRIN METODA LIMFOCITOTOXICITĂTII DEPENDENTE DE COMPLEMENT……….39

SCREENING-UL ANTICORPILOR CITOTOXICI PRIN METODA ELISA…………………………………………………………………………………..39

IDENTIFICAREA ANTICORPILOR CITOTOXICI PRIN METODA ELISA …………………………………………………………………………………….41

SCREENING-UL ANTICORPILOR CITOTOXICI PRIN METODA LUMINEX……………………………………………………………………………….43

TESTUL CROSSMATCH…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..44

TESTUL CROSSMATCH PRIN METODA LIMFOCITOTOXICITĂŢII…………………………………………………………………………………………45

TESTUL CROSSMATCH PENTRU CELULA T………………………………………………………………………………………………………45

TESTUL CROSSMATCH PENTRU CELULA B………………………………………………………………………………………………………46

CROSSMATCH PRIN TEHNICA ELISA PENTRU CELULA T ŞI B…………………………………………………………………………………………….47

CROSSMATCH PRIN METODA FLOWCITOMETRIEI………………………………………………………………………………………………………….49

CROSSMATCHING PRIN TEHNOLOGIA LUMINEX...............................................................................................................50

CROSSMATCH-UL PENTRU AUTOANTICORPI……………………………………………………………………………………………………………………51

ALGORITMUL EVALUĂRII IMUNOLOGICE ÎN TRANSPLANTUL RENAL CU DONATOR VIU………………………………………………………………….51

ALGORITMUL EVALUĂRII IMUNOLOGICE ÎN TRANSPLANTUL RENAL CU DONATOR CADAVRU………………………………………………………..52

6

EFECTUL SURSEI DONATORULUI ASUPRA SUPRAVIEŢUIRII ALOGREFEI.............................................................................55

MATCHING-UL IMUNOLOGIC: CONCEPTUL DE MATCHING ÎN TRANSPLANTUL RENAL……………………………………………………………………57

TRANSPLANTURILE RENALE ABO INCOMPATIBILE…………………………………………………………………………………………………………..58

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL HEPATIC.......................................................................62

COMPATIBILITATEA DONATOR – PRIMITOR ÎN TRANSPLANTUL HEPATIC……………………………………………………………………………………….64

BOALA ACUTĂ DE GREFĂ CONTRA GAZDĂ (GVHD) ÎN TRANSPLANTUL HEPATIC……………………………………………………………………………..65

MONITORIZAREA PACIENTULUI POSTTRANSPLANT HEPATIC………………………………………………………………………………………………………….66

EVALUARE IMUNOLOGICĂ……………………………………………………………………………………………………………………………………………67

EVALUAREA VIRUSOLOGICĂ…………………………………………………………………………………………………………………………………………67

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL MEDULAR......................................................................73

STABILIREA COMPATIBILITĂŢII HLA……………………………………………………………………………………………………………………………………………..73

SELECŢIA DONATORULUI ÎNRUDIT………………………………………………………………………………………………………………………………..74

SELECŢIA DONATORULUI NEÎNRUDIT……………………………………………………………………………………………………………………………..74

SELECTIA DONATORULUI DIN BANCA DE SÂNGE DIN CORDONUL OMBILICAL………………………………………………………………..76

APRECIEREA PROBABILITĂŢII DE A GĂSI UN DONATOR NEÎNRUDIT………………………………………………………………………………76

GENELE KIR ȘI TRANSPLANTUL DE CELULE STEM HEMATOPOETICE………………………………………………………………………………………………..77

IMUNOGENETICA NON-HLA ȘI TRANSPLANTUL DE CELULE STEM HEMATOPOETICE…………………………………………………………………………79

POLIMORFISMUL GENELOR CITOKINELOR………………………………………………………………………………………………………………………79

ANTIGENELE MINORE DE HISTOCOMPATIBILITATE………………………………………………………………………………………………………….80

INCOMPATIBILITATEA ABO ȘI SUPORTUL TRANSFUZIONAL……………………………………………………………………………………………………………80

RECONSTITUIREA SISTEMULUI IMUN DUPĂ TRANSPLANTUL DE CELULE STEM HEMATOPOETICE…………………………………………………….81

GLOSAR DE TERMENI - IMUNOLOGIA TRANSPLANTULUI………………………………………………………………………………85

IMUNOLOGIA TUMORALĂ A NEOPLAZIILOR POSTTRANSPLANT...............................................................92

INTRODUCERE………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….92

ONCOGENE ŞI CANCER....................................................................................................................................................................96

BAZA MOLECULARĂ A CANCERCINOGENEZEI ÎN MAI MULTE TREPTE.................................................................................................96

BIOLOGIA CREŞTERII TUMORALE…………………………………………………………………………………………………………………………………..98

MECANISMELE INVAZIEI ŞI METASTAZĂRII…………………………………………………………………………………………………………………….99

MECANISME EFECTOARE ANTI-TUMORALE…………………………………………………………………………………………………………………….101

IMUNOSUPRAVEGHEREA…………………………………………………………………………………………………………………………………….103

Antigenele tumorale umane recunoscute de celulele T..........................................................................104

ANTIGENE TUMORALE COMUNE....................................................................................................................................106

7

ANTIGENE DE DIFERENŢIERE..........................................................................................................................................108

PROTEINE MUTANTE...................................................................................................................................................109

PROTEINE SUPRAEXPRIMATE........................................................................................................................................110

PRODUSE GENICE NORMALE SUBGLICOZILATE..............................................................................................................111

ANTIGENE VIRALE........................................................................................................................................................113

CONCEPTE EMERGENTE...............................................................................................................................................................,.113

IDENTIFICAREA ANTIGENELOR TUMORALE UMANE.......................................................................................................................113

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL CANCERULUI................................................................................117

MARKERI TUMORALI – APLICAŢII CLINICE...................................................................................................................................117

ANALIZA STATISTICĂ A DATELOR DE MONITORIZARE IMUNOLOGICĂ...........................................................................................122

ROLUL IMUNOLOGULUI ÎN MONITORIZAREA ANTITUMORALĂ A STUDIILOR CLINICE....................................................122

RECOMANDĂRI PENTRU MANAGEMENTUL MARKERILOR TUMORALI............................................................................................123

METODE DE LUCRU UTILIZATE ÎN IMUNOLOGIA TUMORALĂ...................................................................129

TESTE IMUNOENZIMATICE............................................................................................................................................................129

TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ ÎN DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC TUMORAL……………………………………………………………………………..131

VACCINURI ÎN CANCER……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….140

IMUNIZAREA GENETICĂ................................................................................................................................................................144

MONITORIZAREA TERAPIILOR IMUNOLOGICE ÎN CANCER................................................................................................................145

CONTROLUL DE CALITATE ÎN MONITORIZAREA IMUNOLOGICĂ.........................................................................................146

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ A NEOPLAZIILOR APARATULUI RENAL - POSTTRANSPLANT RENAL……………………………………148

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ A TUMORILOR RENALE PARANCHIMATOASE……………………………………………………………………………………148

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ A TUMORILOR VEZICII URINARE………………………………………………………………………………………………………….153

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ A ADENOCARCINOMULUI DE PROSTATĂ………………………………………………………………………………………..166

GHID PRACTIC PRIVIND SELECŢIA TESTELOR IMUNOLOGICE PENTRU

MONITORIZARE ÎN CANCERUL UROLOGIC POSTTRANSPLANT RENAL…………………………………………………………………….176

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ A DIFERITELOR TIPURI DE CANCER - POSTTRANSPLANT HEPATIC…………………….182

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ A DIFERITELOR TIPURI DE CANCER - POSTTRANSPLANT CARDIAC…………………184

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ A DIFERITELOR TIPURI DE CANCER POSTTRANSPLANT MEDULAR………………….185

CANCERUL ÎN VIITOR: DIAGNOSTICUL MOLECULAR ŞI PROGNOSTICUL……………………………………………………….186

GLOSAR DE TERMENI - IMUNOLOGIA TUMORALĂ……………………………………………………………………………………..187

8

COMPLEXUL MAJOR DECOMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATEHISTOCOMPATIBILITATE

Ileana Constantinescu

Organizarea genelor antigenelor leucocitare umane (HLA)

în complexul major de histocompatibilitate (MHC)

9

Complexul HLA ocupă un segment de 1,5-2 centiMorgani pe braţul scurt al cromozomului 6 şi conţine gene care codifică moleculele de histocompatibilitate de clasa I, având 2000 kilobaze (HLA–A, HLA–B, HLA–C), moleculele de histocompatibilitate de clasa II, de aproximativ 1000 kilobaze (HLA–DRB1, HLA–DQB1, HLA–DQA1, HLA–DPB1), moleculele de clasa a treia, de aproximativ 1000 kilobaze (C2, C4, factorul B, citocromul P-450, 21-hidroxilaza) [2].

Genele care codifică aloantigenele HLA de clasa I şi clasa a II-a sunt apropiate unele faţă de altele la nivelul braţului scurt al cromozomului uman 6. Această parte a genomului constituie sistemul major de histocompatibilitate (MHC) şi este denumit complexul HLA [4,28].

Moleculele HLA de clasa I sunt exprimate la nivelul tuturor celulelor nucleate şi al plăcuţelor sanguine, pe când moleculele HLA de clasa a II-a se găsesc la nivelul celulelor prezentatoare de antigen, cum sunt celulele dendritice, limfocitele B şi macrofagele [30]. Rolul fundamental al moleculelor de clasa I şi clasa a II-a este de a se lega la peptide proprii şi peptide non-proprii, pe care apoi le transportă la membrana plasmatică a celulelor pentru fenomenul de recunoaştere de către receptorul pentru antigen al celulei T [15].

Astfel, prezentarea peptidelor virale şi bacteriene de către moleculele de clasa I şi clasa a II-a antigenelor receptorilor pentru antigen ai celulelor T, conduce la un răspuns imun.

Moleculele HLA de clasa I leagă peptide formate din 8 - 10 aminoacizi, peptide ce rezultă din degradarea proteosomică a proteinelor citoplasmatice şi prezintă aceste peptide limfocitelor T citotoxice, CD8+. Astfel, moleculele de clasa I sunt primele care alertează celulele T faţă de celulele infectate viral.

Moleculele HLA de clasa a II-a leagă peptide formate din 13-25 de aminoacizi, care rezultă din degradarea endosomală a proteinelor exogene şi endogene şi prezintă aceste peptide limfocitelor T helper, CD4+. Moleculele de clasa a II-a joacă un

10

rol important în stimularea răspunsului imun faţă de organisme cum sunt bacteriile piogene. Activarea celulelor T CD8+ şi CD4+ prin aceste două căi duce la diviziune celulară şi diferenţiere, rezultând un răspuns imun celular şi respectiv umoral [15].

Complexul HLA conţine aproximativ 4.000.000 de perechi de baze de ADN şi este de dimensiune comparabilă cu genomul bacteriei Escherichia coli. În interiorul complexului HLA se disting trei regiuni (Fig.1).

Fig.1. Harta simplificată a complexului HLA.Gruparea complexului HLA în regiunile de clasa I, a II-a şi a III-a.

În regiunile de clasa I şi a II-a sunt redate poziţiile relative ale genelor codificând izotipurile funcţionale ale HLA clasa I şi clasa a II-a. La nivelul regiunii clasei a III-a se observă poziţia relativă a genelor care codifică componentele complementului C2, C4 şi factorul B. Toate aceste trei regiuni conţin şi alte gene.

În apropierea centromerului cromozomului 6, există regiunea clasei a II-a care conţine genele de clasa a II-a; pe când în apropierea telomerului, braţului scurt al cromozomului 6, există regiunea clasei I care conţine genele de clasa I [21].

Între regiunile clasei I şi a II-a este situată regiunea clasei a III-a. Această regiune conţine o varietate de proteine diferite

11

care codifică componentele complementului C4, C2 şi FACTORUL B. Atât regiunea clasei I cât şi regiunea clasei a II-a conţin şi alte gene decât cele ale clasei I sau clasei a II-a care sunt neînrudite structural cu acestea.

Genele care dau denumirea oficială a HLA sunt cele din interiorul complexului HLA care codifică aloantigenele de clasa I şi clasa a II-a, gene şi pseudogene.

Principalele gene de clasa I codifică lanţurile grele denumite şi lanţurile alfa ale celor 6 forme de clasa I , HLA-A, -B, -C, -E, -F şi -G. În completare mai există şi HLA-H, -J, -K şi -L care sunt pseudogene nefuncţionale strâns înrudite din punct de vedere al secvenţei nucleotidice cu genele funcţionale de clasa I (Fig.2)

Fig.2. Harta regiunii HLA clasa I.

Această figură ilustrează genele HLA-H, -J, -K şi -L care sunt gene complete de clasa I neexprimate, respectiv pseudogene. Familia de gene MIC conţine 5 gene între care genele MICA şi MICB sunt exprimate, iar MICC, MICD şi MICE sunt pseudogene. Genele nedenumite (barele verticale scurte) sunt fragmente de gene de clasa I. HFE este o genă funcţională, asemănătoare clasei I, la ~4 Mb telomeric de HLA-F. În completarea genelor cunoscute din această figură mai există încă ~50 de gene care sunt răspândite printre genele clasei I şi care nu sunt înrudite structural cu acestea. În populaţia umană toţi cromozomii 6 poartă cele 6 gene HLA de clasa I. În contrast cu acest fapt, anumiţi cromozomi 6 au deleţii de ~50 kb în regiunea clasei I care include şi pseudogena HLA-H [21].

12

Gena care codifică β2 microglobulina, lanţul uşor al moleculelor HLA de clasa I, nu este situat în complexul HLA ci pe cromozomul uman 15. Din cauza acestei localizări cromozomiale gena β2 microglobulinei nu are o denumire în nomenclatura HLA.

Moleculele HLA de clasa a II-a sunt heterodimeri compuşi din lanţuri α şi β de dimensiuni similare. Există 5 izotipuri ale proteinelor HLA de clasa a II-a care sunt denumite HLA-DM, -DO, -DP, -DQ şi -DR.

Genele pentru lanţurile α şi β sunt localizate în regiunea HLA de clasa a II-a şi cele mai multe dintre acestea sunt organizate în perechi de lanţuri α şi β genice care contribuie la acelaşi izotip (Fig.3).

Fig.3. Harta regiunii HLA de clasa a II-a

Sunt ilustrate 3 tipuri de categorii de gene: gene care codifică lanţurile şi ale moleculelor HLA de clasa a II-a, pseudogene înrudite cu genele lanţurilor şi şi genele care codifică alte funcţii implicate în procesarea şi prezentarea antigenelor de către HLA de clasa I. De asemenea, sunt menţionate genele LMP2 şi LMP7 care codifică subunităţi ale proteozomei, genele TAP1 şi TAP2 care codifică un peptid transportor şi gena tapasinei care facilitează eliberarea peptidelor din TAP la nivelul moleculelor de clasa I.

13

Genele care codifică lanţurile α sunt denumite A (DMA şi DOA) iar genele ce codifică lanţurile genelor β sunt denumite B (DMB şi DOB). Aceste gene care codifică HLA-DQ α şi β sunt HLA-DQA1 şi respectiv HLA-DQB1. Partea din regiunea HLA de clasa II care codifică moleculele HLA-DR este mai complicată deoarece are câteva gene funcţionale de lanţ β precum şi pseudogene, numărul lor variind între diferiţi cromozomi 6 [21]. Diferitele aranjamente pentru genele lanţului β sunt denumite haplotipuri DRB.

Structura moleculelor HLA

Structura moleculelor HLA de clasa I

Moleculele HLA de clasa I conţin fiecare o copie a două polipeptide şi anume: un lanţ greu, glicoproteină de ~45kDa care este ancorată la membrană, şi un lanţ uşor, solubil în apă, de 12kDa (Fig.4).

Fig.4. Structura schematică a moleculei HLA de clasa I.Genele care codifică lanţurile grele HLA de clasa I au o structură caracteristică în care diferite domenii proteice sunt codificate de exoni separaţi.

În total, exonii genelor lanţurilor grele de clasa I conţin 1089-1101 nucleotide (incluzând codonul terminator) şi codifică lanţuri grele de 362-366 reziduri de aminoacizi. (Fig.5)

14

Fig.5. Organizarea exon-intron a unei gene HLA de clasa I.

La nivelul lanţului greu de clasa I, fiecare domeniu proteic este codificat de exoni diferiţi. L codifică secvenţa conducătoare, TM codifică regiunea trans-membranară, CYT codifică coada citoplasmatică şi 3’UT este regiunea 3’ netradusă. Diferenţe mici în lungimea lanţurilor grele de clasa I din diferite alele sau locusuri, provin din inserţii şi deleţii în regiunea transmembranară şi din modificări de lungime ale cozii citoplasmatice datorită plasării diferenţiale a codonului terminator în interiorul exonilor 6, 7 sau 8.

Polimorfismul antigenic al moleculelor HLA-A, B şi C este datorat diferenţelor în secvenţele de aminoacizi ale lanţulului greu al HLA de clasa I. Cele mai multe dintre aceste diferenţe apar prin substituţii nucleotidice la nivelul exonilor 2 şi 3. Genele lanţului greu al HLA- A, B şi C sunt foarte polimorfe în contrast cu genele lanţului greu al HLA-E şi G, ce dezvoltă un polimorfism limitat denumit oligomorfism. Pentru HLA-F, o singură alelă este recunoscută în prezent şi de aceea gena este considerată a fi monomorfă.

Structura moleculelor HLA de clasa a II-a

Moleculele HLA de clasa a II-a conţin fiecare o copie a unui lant α şi β, amândouă fiind ancorate la membrană (Fig.6).

15

Fig.6. Structura schematică a moleculelor HLA de clasa II.Lanţurile şi prezintă fiecare două domenii extracelulare, o regiune trans-membranară şi o coadă citoplasmatică. Domeniile extracelulare ale lanţului sunt 1 şi 2 iar cele ale lanţului sunt 1 şi 2.

Lanţurile au 33-35 kDa, iar lanţurile au 26-28 kDa, diferenţele în dimensiuni datorându-se în principal glicozilării. Organizarea exon – intron a genelor de clasa a II-a este asemănătoare genelor de clasa I, astfel exonii codifică domenii separate ale proteinelor [29].

Genele lanţurilor şi au structură similară în care exonul 1 codifică peptidul conducător şi exonii 2 şi 3 codifică cele două domenii extracelulare.

La nivelul genelor lanţului exonul 4 codifică domeniul transmembranar şi exonul 5 codifică coada citoplasmatică. Prin contrast, la nivelul genelor lanţului , atât regiunea transmembranară cât şi coada citoplasmatică sunt codificate de exonul 4 (Fig.7).

Fig.7. Organizarea exon intron a genelor codificând lanţurile α şi β ale moleculelor

HLA de clasa a II-a.Legendă: L - secvenţa conducătoare; TM - regiunea transmembranară;

16

CYT - coada citoplasmatică; 3’UT - regiunea 3’ netradusă.

Polimorfismul moleculelor HLA de clasa a II-a poate deriva atât de la nivelul lanţurilor cât şi de la nivelul lanţurilor , dar acest lucru depinde de izoforma clasei a II-a. Pentru HLA-DR, lanţul este monomorf şi toate polimorfismele derivă din genele lanţurilor . Componentul cel mai polimorf al genelor de clasa a II-a este HLA-DRB1 pentru care sunt definite 221 de alele [21].

Pentru HLA-DQ şi DP atât lanţurile şi contribuie la polimorfism, iar genele corespunzătoare sunt foarte polimorfe. În contrast, izoformele HLA-DM şi HLA-DO sunt puţin polimorfe.

Emergenţa de noi alele

Microvariaţii la nivelul serotipurilor şi crearea de noi alele care sunt chimere a două serotipuri distincte pot fi fenomene relativ dinamice.

Alelele noi emerg cu o rată înaltă şi devin fixate în populaţie, în teorie, dacă au un avantaj selectiv în prezentarea peptidelor provenite de la organisme infecţioase.

Alelele noi sunt generate via mutaţii punctiforme, recombinări şi evenimente asemănătoare conversiei genice [3].

17

Fig.9. Nomenclatura specificităţilor HLA.Prefixul HLA precede antigenele sau alelele pentru a defini MHC-ul speciei. Denumirile A, B, C, DR etc, definesc locusul. Acesta este urmat de un număr care denotă antigenul definit serologic sau un număr cu un asterix care denotă alela definită molecular. În anumite cazuri, litera w este plasată înaintea antigenului serologic indicând că este o denumire de lucru, provizorie.

Linkage Disequilibrium (Legătură dezechilibrată)

Observaţia că alelele de la nivelul diferitelor locusuri genetice există în populaţie în acelaşi haplotip, semnificativ mai frecvent decât ar fi aşteptat, se numeşte Linkage Disequilibrium. Frecvenţa estimată a două alele (f1, f2) a se produce împreună este produsul frecvenţei genei fiecărei alele din populaţia respectivă ([f aşteptată = f1 x f2]) [17]. Frecvenţa observată este determinată din studii familiale în cadrul aceleaşi populaţii.

Linkage Disequilibrium este un fenomen tipic pentru MHC uman şi se extinde de la HLA-A până la HLA-DQ. Cel mai cunoscut exemplu pentru acest fenomen este haplotipul din populaţia caucaziană A1, Cw7, B8, DR17 [4], DR52, DQ2 care este întâlnit aproximativ de 4 ori mai frecvent decât este estimat [17].

Genetica HLA

Una din consecinţele conglomeratului de gene HLA de la nivelul cromozomului 6 este că cei mai mulţi indivizi moştenesc

18

un set de alele HLA nerecombinat de la fiecare părinte. Aceste gene sunt exprimate codominant. Astfel, dacă tipurile HLA ale membrilor familiei sunt determinate, segregarea tipurilor HLA în interiorul familiei poate fi utilizată pentru construirea tipurilor HLA din fiecare cromozom. Setul alelelor HLA găsit pe un cromozom este denumit haplotip. Determinarea haplotipurilor este importantă pentru identificarea persoanelor înrudite identice, deoarece purtarea de antigene din haplotipuri diferite este frecventă.

Fiecare individ moşteneşte două haplotipuri MHC de la fiecare părinte şi astfel are două alele pentru fiecare dintre gene. Aceste alele sunt exprimate codominant. Moştenirea genelor MHC urmează regulile segregării ale lui Mendel. În cadrul unei familii, fiecare copil moşteneşte un haplotip MHC de la mamă şi unul de la tată [17]. Prin convenţie, haplotipurile paternale sunt denumite a şi b şi cele maternale c şi d. Astfel, există patru genotipuri posibile MHC la nivelul copiilor: ac, ad, bc şi bd. Probabilitatea de a exista oricare dintre cele patru variante de genotipuri este de 1:4 [17]. Într-o familie cu 5 copii, cel puţin doi dintre copii vor fi identici HLA (presupunând ca nu există fenomen de crossing over) (Fig.8).

Fig.8. Segregarea alelelor la nivelul unui locus genetic.

Semnificaţie clinică

Elementul cheie, pentru transplantul renal de succes, este reprezentat de abilitatea identificării corecte a potrivirii histocompatibilităţii dintre primitori şi donatori şi de a încerca

19

un prognostic de funcţionalitate, vindecare şi de viaţă pentru aceşti pacienţi având în vedere posibilitatea apariţiei fenomenului de rejet (gazdă versus alogrefă renală, sau în cazul transplantului medular alogrefă versus gazdă).

Tipizarea antigenelor leucocitare umane (HLA) joacă un rol important deoarece moleculele HLA sunt ţintele primare ale răspunsurilor imune în transplanturile alogenetice, sunt critice pentru răspunsurile la stimuli antigenici şi sunt implicate în susceptibilitatea genetică faţă de anumite boli imune şi autoimune.

Antigenele şi alelele complexului major de histocompatibilitate sunt definite şi revizuite de către Organizaţia Modială a Sănătăţii, care organizează periodic manifestări ştiinţifice prin care se asigură o abordare comună a nomenclaturii şi tipizării. Cea mai bună potrivire HLA dintre toate variantele este potrivirea între gemeni identici.

În practică, acest lucru se întâmplă foarte rar şi marea majoritate a transplantelor se efectuează între donatori neînrudiţi şi receptori potriviţi din punct de vedere al histocompatibilităţii. Este foarte clar că, atât pentru transplantul renal cât şi pentru transplantul de măduvă, cu cât potrivirea este mai bună cu atât alogrefa va funcţiona în condiţii bune iar complicaţiile ulterioare vor fi minore. Dacă potrivirea este redusă primitorul va necesita cantităţi considerabile de imunosupresoare pentru a preveni rejetul grefei. Acest lucru conduce la riscul unor malignităţi secundare şi la apariţia infecţiilor oportuniste.

Metode serologice de tipizare HLA

Metodele serologice furnizează foarte rapid şi simplu rezultatele histo-compatibilităţii. Aceste metode folosesc ser care conţine anticorpi faţă de antigenele HLA. Anticorpii anti HLA sunt foarte specifici pentru determinanţii structurali individuali care caracterizează antigene diferite ale sistemului

20

HLA. Astfel, când serurile conţinând anticorpi anti-HLA sunt puse în contact cu limfocite, anticorpii se leagă numai de antigenele specifice ţintă. Când complexul antigen - anticorp este format pe suprafaţa celulei în prezenţa complementului, activarea complementului duce la liza celulară. Astfel, moartea celulei este un indicator de specificitate comună a antigenului şi a anticorpului şi este un rezultat al testului “pozitiv”. Detecţia acestei specificităţi între anticorp şi antigen furnizează răspunsul la câteva întrebări fundamentale în testarea histocompatibilităţii:

1. Care sunt antigenele HLA ale unei celule particulare? Când este cunoscută specificitatea anticorpului (aşa cum se întâmplă la reactivii de tipizare HLA) şi celula este de fenotip necunoscut, rezultatul testului pozitiv cu anticorpi specifici identifică antigenele celulei.

2. Sunt anticorpi anti HLA într-un ser particular?

Când un ser este testat pentru prezenţa anticorpilor anti-HLA, un test pozitiv indică activitate anti limfocitară în ser. Din modelul de reacţii pozitive şi negative, cu un panel de celule tipizate HLA, poate fi găsită specificitatea anticorpilor. Dacă serul pacientului reacţionează cu celulele donatorului, cei doi indivizi sunt incompatibili. Astfel, printr-un proces iterativ, de testare a serului şi tipizare a celulelor, antigenele HLA sunt definite, panelul de limfocite tipizate este generat şi sunt create colecţiile de seruri tipizate anti-HLA de specificitate cunoscută.

Tipizarea HLA prin testul de limfocitotoxicitate

Tipizarea HLA serologică este realizată prin expunerea celulelor necunoscute la o baterie de antiseruri de specificitate HLA cunoscută. Serurile pentru tipizare sunt selectate pentru a rezulta scoruri pozitive puternice care să asigure reproductibilitatea. Dacă celulele sunt omorâte, în prezenţa

21

antiserului şi a complementului, celula se presupune a avea acelaşi antigen HLA ca şi specificitatea anticorpului.

Un ser ideal pentru tipizare HLA ar trebui să fie monospecific, adică să aibă specificitate pentru un singur antigen HLA.

Totuşi, în realitate, aloanticorpii observaţi într-un singur ser sunt în general polispecifici. Un aloantiser poate conţine anticorpi faţă de multipli determinanţi de pe antigenul imunizant.

Anumiţi determinanţi sunt clasici, adică, este vorba de specificităţile HLA private care caracterizează fiecare tip HLA. Alţi determinanţi sunt publici, adică, sunt împărţiti la câteva antigene care, în mod colectiv, constituie antigene cross reactante de grup cross-reacting antigen group (CREG group). Majoritatea antiserurilor HLA sunt seruri complexe obţinute de la femei multipare. Lichidul placentar s-a dovedit a fi o sursă secundară valoroasă de aloantiseruri pentru tipizarea HLA. Anticorpii anti-HLA sunt de asemenea găsiţi la pacienţi expuşi la antigene HLA prin transfuzii de sânge sau grefe de organe.

Totuşi, aceste metode de obţinere a antiserurilor HLA sunt dificile şi de aceea au fost elaborate metode care să utilizeze anticorpi nefixatori de complement şi care se bazează numai pe legarea antigenului, cum este ELISA sau citometria în flux.

Mulţi anticorpi multiclonali reacţionează cu mai mult de o specificitate HLA ceea ce arată existenţa de determinanţi antigenici comuni la nivelul moleculelor HLA.

Mai nou, folosirea metodelor moleculare de tipizare HLA a crescut, astfel că eforturile prin metodele serologice au fost reduse mult.

Un număr foarte mic de laboratoare mai menţin încă metodele serologice de tipizare HLA dar, şi în aceste situaţii, acestea sunt completate obligatoriu de metodele de biologie

22

moleculară pentru a rezolva incertitudinile şi limitele metodei serologice.

Izolarea celulelor

Limfocitele sunt tipul celular preferat pentru tipizarea HLA serologică, screening-ul anticorpilor şi crossmatching. În mod tradiţional, limfocitele sunt izolate din sânge total periferic prin separare în gradient de densitate – când donatorul este viu. În cazul donatorului cadavru, limfocitele sunt separate din splină sau ganglioni limfatici. Lucrând această metodă, trebuie o grijă deosebită pentru a prepara o suspensie celulară de viabilitate foarte bună şi care să nu conţină eritrocite şi trombocite. Tipizarea HLA pentru clasa II de antigene HLA, HLA –DR şi DQ este performată pe preparate limfocitare îmbogăţite cu limfocite B. Procedurile de izolare speciale, performate, sunt necesare, deoarece aproximativ 80% din limfocitele din sângele periferic sunt celule T inactive care nu conţin antigene HLA de clasa a II-a pe suprafaţa lor.

Izolarea limfocitelor T şi B cu ajutorul bilelor magnetice este în prezent cea mai comună metodă pentru tipizarea HLA şi crossmatching. Bilele, căptuşite cu anticorpi oferă versatilitate, viteză a revenirii celulare şi o bună puritate a preparatului celular final. Bilele peliculizate cu anti-CD2 sau anti-CD8 sunt folosite pentru izolarea celulelor T şi anti-CD19 pentru celulele B. Bilele magnetice pot fi folosite pentru obţinerea numărului adecvat de celule din sângele total, din diferite tampoane sau din preparate de limfocite din sângele periferic.

Celulele legate de aceste bile devin mai sensibile ca ţinte posibil datorită modificării membranelor celulare şi astfel testele necesită o perioadă de incubare mai redusă ca timp, faţă de metodele standard de citotoxicitate.

23

Protocol de lucru pentru testul limfocitotoxicităţii dependente de complement

Antiseruri HLA individuale sunt dispensate câte 1 µL în godeuri microtest, de specificitate desemnată, în plăcuţe de plastic compuse din 60 sau 72 de godeuri având capacitatea de 15µL. Un model de seruri anti HLA este ales cu specificităţi care acoperă toate posibilităţile variantelor de tipuri HLA. În general, fiecare tip este reprezentat de cel putin doua antiseruri. Astăzi, laboratoarele obţin plăcuţe de tipizare congelate, comerciale, gata de folosit.

Pentru tipizarea HLA, serurile dintr-o plăcuţă de testare sunt dezgheţate şi aproximativ 2000 de limfocite sunt dispensate în godeu. Apoi plăcuţa este incubată 30 de minute la temperatura camerei pentru a permite anticorpilor anti-HLA a se lega la antigenele lor HLA ţintă specifice. Complementul (5 µL) este adăugat în general ca ser de iepure şi plăcuţa este incubată timp de 60 de minute. Testul de citotoxicitate dependentă de complement pentru tipizarea HLA-DR şi DQ este performat cu seruri corespunzătoare de tipizare de clasa aII-a, numai că metoda este modificată pentru celule B: iniţial are loc incubarea celulelor, iar serul este încălzit la 370C sau 220C pentru 60 de minute; după adăugarea complementului, amestecul este incubat timp de 120 de minute la temperatura camerei. Creşterea temperaturii este folosită pentru a evita reacţiile fals pozitive care pot rezulta din legarea anticorpilor nespecifici, reactivi la rece. Când se utilizează pentru tipizarea clasei a II-a bile imunoabsorbante, timpii de incubare sunt în general reduşi cu aproximativ jumătate, posibil din cauza slăbirii membranei celulare datorită ataşării bilelor.

Pentru a vizualiza celulele moarte şi vii este adăugat un colorant, eozina Y urmată de formalină pentru a fixa reacţia, apoi se utilizează microscopul cu contrast de fază. Celulele vii exclud colorantul şi apar luminoase şi refractante, iar celule moarte conţin colorant şi sunt uşor mărite de volum şi întunecate. Există o metodă alternativă de vizualizare care foloseşte fluorocromi, cum este fluoresceina diacetat (verde),

24

înainte de dispensarea în plăcuţă. Când celulele sunt omorâte testul este pozitiv, iar fluoresceina curge afară şi celulele “dispar”. Rezultatele pozitive sunt comparate cu un godeu negativ, unde toate celulele sunt viabile. Se poate adăuga un al doilea fluorocrom de culoare contrastantă, cum este ethidium bromide (roşu), pentru a vizualiza celulele moarte.

Fiecare godeu este scorificat individual prin inspecţie, notând procentul celulelor moarte per godeu. Testul este clar pozitiv când cel puţin jumatate din celule sunt moarte. Tipajul HLA rezultă prin interpretarea modelului de reactivitate al unor seruri individuale şi a specificităţii lor. În fenotiparea unui individ pentru HLA clasa a I-a se aşteaptă să se găsească modele de rezultate cu două antigene pentru, fiecare din locusurile A, B şi C. Când numai un singur antigen este identificat într-un locus, individul poate fi homozigot pentru acel tip de antigen sau, laboratorul a eşuat în a identifica cel de-al doilea antigen deoarece serurile pot să nu conţină anticorpi pentru epitopii prezenţi pe celulele ţintă sau există o exprimare redusă a moleculelor HLA pe limfocitele testate.

Variabilitatea rezultatelor de tipizare HLA serologice

Serurile de tipizare HLA nu sunt uniforme deoarece complexitatea polimorfismului HLA face imposibilă crearea un reactiv standard pentru fiecare specificitate. Fiecare laborator de tipizare HLA are responsabilitatea de a obţine antiserurile adecvate şi de a monitoriza performanţa acestora, inclusiv a produselor comerciale.

Rezultate obţinute cu plăcuţele de tipizare ale laboratorului pot fi comparate cu acelea ale altor colecţii de seruri pentru confirmarea unui anumit fenotip HLA. Toate laboratoarele de tipizare HLA sunt controlate de către inspectorii Federaţiei Europene de Imunogenetică (EFI) sau de către Societatea Americană pentru Histocompatibilitate şi Imunogenetică (ASHI), pentru a verifica calitatea reactivilor serologici şi a reactivilor celulari folosiţi pentru testarea clinică.

25

Programele de control de calitate naţionale şi internaţionale sunt disponibile pentru tipizare, crossmatching şi anticorpi citotoxici, iar performanţa satisfăcătoare este obligatorie pentru acreditarea EFI şi/sau ASHI a laboratorului.

O a doua variabilă a tipizării HLA serologice este complementul seric, un reactiv disponibil comercial care cumulează practic serurile de la câteva sute de iepuri. Serul de iepure conţine anticorpi heterofili cu activitate limfocitară antiumană care îi măreşte eficienţa în testele de citotoxicitate. Supraabundenţa acestor anticorpi antiumani face ca şi complementul să fie citotoxic şi astfel se produc rezultate fals pozitive. Fiecare laborator trebuie să îşi verifice sursa de complement pentru a găsi varianta care promovează reacţii citotoxice intense fără a produce toxicitate nespecifică. Deoarece nu există o sursă standard de complement, acelaşi ser testat în diferite laboratoare, are potenţialul de a produce rezultate discordante.

Alte variabile sunt metodele folosite pentru a vizualiza celulele vii şi moarte, timpii de incubare şi definirea terminării perioadei de lucru a testului, precum şi interpretarea rezultatelor.

Tipizarea HLA prin metode de biologie moleculară

Introducere

Specificităţile serologice au fost identificate prin modelul de legare al anticorpilor în testele serologice şi din activarea limfocitelor de către antigenele distincte ale complexului major de histocompatibilitate (MHC) în testul culturii mixte limfocitare (MLC).

Cu ajutorul clonării genice şi a secvenţializării ADN, specificităţile antigenelor HLA sunt în prezent cunoscute a

26

deriva din diferenţele de secvenţă localizate în câteva regiuni hipervariabile de la nivelul moleculelor MHC.

Cele mai multe dintre diferenţe au apărut din evenimentele de conversie intragenică şi intergenică care au condus la polimorfismul complex care caracterizează sistemul HLA.

La nivelul genelor HLA de clasa aII-a, regiunile variabile se găsesc în principal în exonul 2, iar la genele HLA clasa I; zonele polimorfe sunt concentrate în exonul 2 şi 3.

Aceste variaţii de secvenţă, sunt localizate în zona de legare a antigenului şi la nivelul regiunilor alfahelix care întâmpină receptorul celulei T.

Aceste localizări strategice sunt expuse abilităţii sistemului imun de a recunoaşte şi a răspunde la patogeni (şi posibil autoimunogeni) şi la antigeni endogeni sau exogeni.

Alelele HLA poartă multe din aceleaşi motive secvenţiale dar în combinaţii diferite.

În consecinţă, antigenele de clasa I şi clasa aII-a, pot fi aşezate ca un pachet de combinaţii ale acestor polimorfisme secvenţiale, care au ca bază o secvenţă comună de nucleotide.

Fenomenul observat al crossreactivităţii antiserurilor şi mai recent fenomenul de crosshibridizare al nucleotidelor marcate poate fi explicat de faptul că anumite antigene pot avea aceleaşi secvenţe.

O consecinţă importantă a acestor motive secvenţiale purtate în comun este că anumite combinaţii heterozigote ale alelelor nu pot fi întodeauna distinse de o a doua combinaţie diferită.

Toate metodele de tipizare ADN trebuie să ia în considerare aceste aspecte când propun schemele pentru identificarea alelelor.

În mod evident, cea mai performantă metodă de tipizare HLA ar fi aceea care ar putea performa o analiză completă

27

secvenţială a ADN-ului de la nivelul genelor HLA pentru fiecare individ.

Secvenţierea nucleotidică automată este folosită în mod curent ca şi „standardul de aur” pentru tipizarea HLA, dar această tehnologie este în general mai restrânsă pentru Centrele de Imunogenetică care sunt implicate în programele de transplant de celule stem hematopoetice care folosesc frecvent donatori neînrudiţi.

În tabelul următor sunt redate comparativ caracteristicile metodelor de tipizare HLA serologice şi moleculare.

Tabelul nr.1. Comparaţie între metodele de tipizare HLA

serologice şi bazate pe ADN [2].

Metode SEROLOGICE ADN: SSP/SSOP ADN: SBT

Numărul de tipuri identificabile

HLA-A

HLA-B

HLA-C

HLA-DR

HLA-DQ

HLA-DP

21

43

10

18

9

-

21-151

43-301

10-83

18-282

9-43

6-87

151

301

83

282

43

87

Materialul probei

2-3 milioane de limfocite vii

Cantităţi infime de ADN

Cantităţi infime de ADN

Reactivi Aloantiseruri (furnizare limitată) câteva monoclonale

Oligonucleotide sintetice primeri / oligonucleotide marcate (furnizare nelimitată)

Oligonucleotide sintetice primeri (furnizare nelimitată)

Puterea de a identifica noi alele

Foarte limitată: depinde de disponibilitatea şi specificitatea serurilor

Limitată: bazată pe cunoştinţa secvenţelor şi pe noi modele de reacţie

Nelimitată: noi alele identificate prin secvenţiere

Nivelul de Nivel generic De la generic la nivel Nivel alelic

28

rezoluţie pentru alelele cunoscute

alelic

Factori importanţi

Expresia HLA pe suprafaţa celulară.

Viabilitatea celulelor

Calitatea şi cantitatea ADN-ului genomic şi factorii de amplificare.

Obligativitatea respectării cu stricteţe a protocolului

Calitatea şi cantitatea ADN-ului genomic şi factorii de amplificare.

Metodele moleculare de tipizare oferă avantaje importante faţă de metodele serologice incluzând acurateţea mult îmbunătăţită, rezoluţia înaltă şi flexibilitatea probelor. Metodele moleculare de tipizare pot fi în particular avantajoase pentru tipizarea probelor conţinând molecule HLA care sunt în acelaşi CREG.

Câteva publicaţii au documentat beneficiul clinic al tipizării moleculare evidenţiind în special cele două aspecte deja menţionate şi anume acurateţea mult îmbunătăţită şi rezoluţia înaltă a tipizării.

Menţionăm că datele de secvenţiere furnizate de metodele moleculare împreună cu cunoştinţele despre structura şi funcţia sistemului HLA sunt în mod curent folosite pentru înţelegerea mai bună a bazei moleculare a alorecunoaşterii şi a bolilor cu determinism genetic HLA.

Principiile metodelor moleculare de lucru în histocompatibilitate

Prima metodă de tipizare moleculară a detectat lungimea polimorfismului fragmentului de resctricţie (RFLP) în ADN-ul genomic şi a fost folosită în special pentru tipizarea HLA de clasa aII-a.

29

De asemenea o altă metodă de biologie moleculară utilizată frecvent este metoda cu hibridizare la matriţa ARN folosind oligonucleotide marcate cu secvenţă specifică (SSOP). După descoperirea reacţiei de amplificare genică (PCR) au fost dezvoltate rapid câteva metode facile şi robuste de tipizare HLA prin biologie moleculară. Prima metodă utilizată a fost SSOP. Această metodă a fost urmată de dezvoltarea metodei cu primeri de secvenţă specifică care se bazează pe specificitatea amplificării pentru a determina tipurile de HLA.

Cea mai recentă dezvoltare în domeniul metodelor de biologie moleculară pentru tipizarea HLA este tipizarea bazată pe descifrarea secvenţelor – secvenţiere (SBT) care are avantajul automatizării şi a unei acurateţi perfecte. Secvenţierea este urmată de dezvoltarea tehnologiei microarray pentru genotiparea HLA.

În tabelul 2 sunt prezentate cele mai folosite metode de biologie moleculare în tipizarea HLA.

Tabelul nr.2. Tehnici moleculare de testare a histocompatibilităţii [2].

NUME

REACTIVI CARACTERISTICI

PROCESE

CARACTERISTICE

Polimorfismele detectate

RFLPEndonucleaze bacteriene de restricţie

Southern blotting Lungimea fragmentului de restricţie

SSPPrimeri PCR de secvenţă specifică

PCR/gel electroforeză De la nivel generic la nivel de alelă

SSOP

Oligonucleotide cu secvenţă specifică, marcate

PCR/hibridizare a oligonucleotidelelor marcate la produsul PCR

De la nivel generic la nivel de alelă

SBTPrimeri etichetaţi/terminatori de secvenţiere

PCR/secvenţierea nucleotidică a produsului PCR

Nivel de alelă

*În prezent este în curs de investigare clinică şi tehnologia microarray pentru genotiparea HLA.

30

Amplificarea genelor

Majoritatea metodelor moleculare de genotipare HLA folosesc reacţia PCR pentru a amplifica selectiv segmentele genelor HLA care sunt necesare tipizării.

Specificitatea amplificării poate fi specifică de locus (de exemplu, HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1), specifică de grup (de exemplu: DRB1-01, DRB1-02) sau cu specificitate alelică (de exemplu: DRB1*-0401, DRB1*0402).

Pentru PCR specificitatea este determinată de secvenţa primerilor şi condiţiile de amplificare (cum sunt ciclurile de temperatură şi Mg2+).

Cele mai multe scheme de tipizare necesită condiţii care evită co-amplificarea pseudogenelor.

Genotiparea HLA SSOP

Hibridizarea cu oligonucleotide marcate de secvenţă specifică (sonde) a fost prima metodă de tipizare HLA bazată pe PCR. Această metodă simplifică amplificarea selectivă a HLA ţintă urmată de hibridizarea cu un panel de oligonucleotide marcate.

Cele două formate mai frecvent folosite sunt:

Dot sau slot blot cu ADN-ul amplificat legat de un suport solid (cum este membrana) şi hibridizat cu substanţe de marcat în soluţie

Revers dot sau slot blot cu substanţe de marcat legate de un suport solid, hibridizat cu ADN-ul amplificat în soluţie.

Formatul dot blot este favorabil pentru tipizarea unui număr mare de probe. Unele laboratoare cu volum mare de lucru, folosesc această metodă pentru tipizarea unor loturi de 96 sau 384 de probe. Metoda revers dot blot este favorabilă

31

pentru testarea unui număr mic de probe. Reactivii pentru dot/slot-blot sunt disponibili comercial, existând kituri standardizate având toate componentele necesare lucrului incluse.

O cantitate de 1-5 µL de ADN amplificat din fiecare probă este aplicată pe o membrană de nylon. Dupa hibridizarea cu oligonucleotidele marcate, membranele sunt spălate pentru a îndepărta legarea nespecifică.

Se utilizează un substrat astfel încât se dezvoltă o reacţie de culoare rezultând un model al hibridizării pozitive şi negative care este folosit pentru a desemna tipul HLA.

Un avantaj major al acestui procedeu este că, atât controlul pozitiv cât şi controlul negativ pot fi incluse pentru fiecare reacţie.

În rezumat, principiul metodei este bazat pe revers hibridizare. Materialul ADN extras şi amplificat biotinilat este aport denaturat chimic şi separat în spire care sunt hibridizate cu oligonucleotide specifice marcate (sonde) imobilizate ca linii paralele pe benzi.

În etapa urmatoare, de spălare, are loc îndepărtarea materialului amplificat nelegat. Dupa spălare, este adăugat conjugatul cu streptavidină şi fosfatază alcalină care se leagă la hibrizii biotinilaţi formaţi anterior.

Incubarea cu o soluţie substrat, conţinând un cromogen, conduce la obţinerea unui precipitat gri/maro.

Reacţia este oprită printr-o etapă de spălare şi modelul reactivităţilor sondelor este înregistrat.

Amplificarea este efectuată prin PCR (Fig.10). Datele obţinute sunt introduse în calculator, iar programul interpretează şi redă tipul alelic HLA.

Tipizarea PCR-SSOP reprezintă o metodă cu un înalt nivel de rezoluţie şi acurateţe.

Această metodă este foarte adecvată pentru analiza unui număr mare de probe pe o perioadă lungă de timp, fiind foarte

32

eficientă pentru lucrul pacienţilor aflaţi pe listele de aşteptare. Dezavantajele acestei metode sunt durata mare a timpului de lucru (9,50 ore) şi costul ridicat în cazul în care se utilizează pentru un număr redus de probe.

Fig.10. Genotiparea ADN HLA prin metoda SSOP.

Genotiparea HLA SSP

Una din cele mai frecvente metode de biologie moleculară utilizată pentru genotiparea HLA este metoda de amplificare genică cu primeri cu secvenţa specifică (SSP). Perechile de primeri sunt elaborate pentru a amplifica specific fiecare secvenţă polimorfă HLA care trebuie să fie detectată, pentru a furniza nivelul dorit de rezoluţie al tipizării. Trebuie menţionat că există o pereche de primeri care amplifică un segment diferit al ADN-ului şi care în mod curent este inclusă în acelaşi tub ca şi control intern pozitiv al amplificării. ADN-ul ţintă este adăugat în reacţie alături de primeri şi celelalte componente de reacţie (ADN polimeraza, tamponul, Mg2+)apoi este performată ciclizarea termică.

Produsele de amplificare PCR sunt uzual detectate prin separare pe un gel de agaroză. După electroforeză, ADN-ul este marcat cu ethidium bromide şi reacţia este scorificată pentru prezenţa produşilor de amplificare ai primerilor

33

controlul intern şi prezenţa sau absenţa produsului de amplificare specific HLA. Combinarea reacţiilor HLA pozitive şi negative este folosită pentru a desemna tipul HLA. Dacă nu sunt prezente produse de amplificare specifice HLA şi nu se identifică nici produsul controlului intern, reacţia este cotată ca eşec şi trebuie repetată.

Numărul de primeri incluşi în test variază în funcţie de locus şi de nivelul de rezoluţie cerut. Pentru o rezoluţie scăzută HLA DRB este nevoie de 20-30 de reacţii; pentru o tipizare ABC, în mod curent, este nevoie de 100-200 de reacţii. Setul de primeri pentru tipizare sunt furnizaţi comercial.

Cum numărul de alele cunoscute este în continuă creştere şi numărul minim de reacţii necesare pentru tipizarea SSP creşte de asemeni.

Avantajul major al acestei metode este că dotarea cu echipament este minimă, timpul necesar pentru testare este scurt, ceea ce face ca metoda să fie ideală pentru lucru în cazul donatorului cadavru şi este uşor de performat (Fig.11).

Dezavantajele majore sunt reprezentate de necesitatea unui număr mare de reacţii şi de nevoia unei cantităţi mari de ADN înalt purificat care să asigure ca specificitatea reacţiei nu este compromisă.

Una din slăbiciunile formatelor de lucru actuale este că primerii de tipizare HLA nu sunt întodeauna controlaţi intern. Astfel, un rezultat fals negativ poate fi obţinut dacă controlul intern (o pereche diferită de primeri) este pozitiv, iar primerii specifici HLA sunt disfuncţionali.

Mai nou, producătorii acestor kituri includ, de regulă, şi controale interne pentru fiecare reacţie.

În rezumat, metoda parcurge următoarele etape: ADN-ul este extras din probă şi amestecat cu primeri având specificitate pentru secvenţele caracteristice ale fiecărui tip de HLA. Aliquote din probă sunt plasate în tuburi separate fiecare

34

conţinând un set specific de primeri şi apoi sunt amplificate în termobloc.

Produsele de amplificare sunt apoi vizualizate în electroforeză, gelul fiind marcat cu ethidium bromide şi fotografiat în lumină UV.

Prezenţa benzilor indică faptul că proba ADN a avut secvenţa corespunzătoare unui tip particular de HLA.

Absenţa amplificării implică absenţa acelei secvenţe alelice particulare în proba ADN.

Toate tuburile conţin un primer suplimentar care serveşte ca şi control al amplificării PCR.

Fig.11. Rezultatele metodei SSP ADN HLA.

Tipizarea HLA bazată pe secvenţiere (SBT)

Tipizarea HLA bazată pe secvenţiere (SBT) implică determinarea secvenţei nucleotidice a unei segment amplificat

35

aparţinând unei gene HLA. Aceasta se realizează folosind un secvenţializator nucleotidic automat, iar procedeul se desfăşoară, pe scurt, după cum urmează: segmentul de genă HLA este amplificat şi excesul de nucleotide şi primeri este îndepârtat. ADN-ul amplificat este folosit ca matriţă pentru reacţia de secvenţiere iar produsele reacţiei de secvenţiere sunt purificate şi aplicate pe un gel de secvenţiere.

Reacţiile SBT conţin un amestec de nucleotide normale şi nucleotide modificate (dideoxinucleotide) care termină polimerizarea când sunt încorporate în spira replicativă a ADN. Un primer este folosit pentru a iniţia sinteza ADN folosind ADN polimeraza. Când un dideoxinucleotid este încorporat într-o nouă moleculă ADN polimerizarea este terminată. Astfel, extensia primerilor este generată astfel încât se termină la fiecare poziţie a moleculei ADN.

Markeri fluorescenţi sunt utilizaţi pentru a distinge lanţurile terminate de fiecare bază (A, C, G sau T). Markerii sunt încorporaţi folosind culori pentru primeri sau culori pentru dideoxinucleotidele terminatoare.

Extensiile primerilor sunt separate pe un gel care rezolvă diferenţele de dimensiuni ale acestor secvenţe ADN până la nivel de o singură bază. Gelul este efectuat într-un secvenţializator ce conţine laser care excită moleculele markerilor şi un detector care înregistrează emisia fiecărui marker.

Software-ul converteşte datele primare într-o cromatogramă şi aliniază automat nucleotidele pentru fiecare poziţie. Datele sunt editate automat şi secvenţa este comparată cu o bază de date conţinând toate secvenţele cunoscute, pentru a alinia alelele în probă.

Un avantaj al acestei metode este că fiecare secvenţă, din fiecare spiră ADN poate fi determinată pentru a confirma tipul. Acest lucru este recomandat deoarece artefactele tehnice pot determina câteodată pierderea unui nucleotid particular care

36

poate conduce la o interpretare incorectă a datelor de la heterozigoţi.

În concluzie, variaţiile mici în secvenţa genică pot fi relevate numai prin secvenţiere directă care conferă o acurateţe perfectă rezultatelor.

În rezumat, etapele metodei sunt: ADN-ul este izolat din probă şi amplificat prin PCR folosind primeri specifici de locus, grup sau alelă.

Produsul de amplificare este apoi distribuit în 4 tuburi, fiecare conţinând polimerază, dideoxinucleotide (dNTP) şi amestecuri de secvenţiere. Fiecare din cele 4 amestecuri este marcat cu un terminator de secvenţe fluorescent: tubul 1 cu citozina marcată (C*); tubul 2 cu guanină marcată (G*); tubul 3 cu thymină marcată (T*), iar tubul 4 cu adenină marcată (A*).

Produsul este amplificat prin PCR pentru a încorpora terminatorii marcaţi. Cele 4 tuburi cu probe sunt puse în electroforeză pentru a separa produsele de extensie ale primerilor în funcţie de dimensiuni.

Secvenţializatorul detectează fluorescenţa în fiecare bandă şi software-ul converteşte datele în secvenţe nucleotidice. De asemenea, software-ul compară secvenţele cu o bază de date de secvenţe HLA şi descifrează tipul HLA.

Tehnologia Microarray

Principiul de bază al hibridizării ADN microarray este legarea complementară a secvenţelor de acizi nucleici simplu spiralate. Pe un microarray (numit şi microcip), secvenţe cunoscute denumite ţinte, sunt ataşate la locaţii fixe (puncte - spots) pe o suprafaţă solidă cum este sticla, folosind punctarea robotică (Fig.12).

Cele mai frecvent folosite sunt două tipuri de ADN microarray:

37

a. cADN sau ADN genomic array, cu secvenţe lungi de ADN complementar de 500-5.000 perechi de baze imobilizate, fiecare reprezentând o genă sau un fragment specific de cromozom.

b. Oligo array, ale căror microcipuri au secvenţe ADN mai scurte (oligo-nucleotide), de 20-100 perechi de baze imobilizate ca ţinte; secvenţele necunoscute în soluţie numite sonde (cum este cADN sau ARN marcat fluorescent), se vor lega la ţinte complementare imobilizate.

Acelaşi principiu se poate aplica şi altor ţinte şi sonde ca: proteine, glicani, etc.

Pentru HLA, tehnologia microarray va trebui să-şi dovedească eficienţa şi performanţa, deoarece secvenţierea este un concurent redutabil în ceea ce priveşte sensibilitatea, specificitatea şi descifrarea de alele noi.

Fig.12. Microarray – microcip ADN HLA.

Limitele metodelor de biologie moleculară

38

Metodele care detectează secvenţe cheie polimorfe, pentru a deduce un tip HLA pot, uneori, elabora un tip incorect dacă sunt prezente alele necunoscute. Aceste metode nu pot detecta întodeauna alele noi la nivelul locusurilor polimorfe testate.

Mai mult, probleme pot apărea cu diferite interpretări ale datelor depinzând de lista secvenţelor HLA folosite pentru asamblarea tipului HLA. Aceste circumstanţe fac să fie dificilă compararea tipizărilor performate la date diferite.

În completare, extrapolarea de la datele de secvenţiere, limitate la un anumit tip HLA, poate determina uneori asamblarea de diferite tipuri depinzând de metoda şi reactivii folosiţi pentru tipizare.

O limitare majoră, care afectează tipizarea ampliconilor heterozigoţi, este că multiplele interpretări ale datelor sunt posibile pentru anumite combinaţii de alele. Această situatie poate fi rezolvată prin performarea tipizării pe alele amplificate selectiv. Câteodată ambiguităţile pot fi rezolvate folosind o combinaţie de date provenite de la două metode cum ar fi de exemplu, SSOP şi SSP sau SBT şi SSP.

Din aceste considerente, este obligatoriu ca toate centrele de imunogenetică şi histocompatibilitate să aibă posibilitatea de a performa cel putin două metode de genotipare HLA.

O limitare majoră este dată de faptul că interpretarea datelor este influenţată de baza de date de secvenţe folosite pentru a interpreta rezultatele obţinute. SBT, care determină secvenţa unui segment ce reprezintă o porţiune substanţială a genei HLA, este mai puţin susceptibil la aceste probleme. Dacă secvenţa este determinată pentru o alelă amplificată selectiv, secvenţa este precisă. Deoarece multe laboratoare nu determină secvenţa pentru întreaga genă HLA, polimorfismul din afara regiunii secvenţei nu este detectat.

Multe laboratoare performează metoda SBT folosind matriţe heterozigote cum ar fi două alele HLA-A care sunt co-

39

amplificate. Aceste date sunt tipic interpretate comparând secvenţa determinată cu secvenţele pentru toate combinaţiile posibile de alele cunoscute.

Uneori aceste rezultate sunt ambigue, cum ar fi multiplele interpretări ale rezultatelor de secvenţiere ale datelor heterozigoţilor. Dacă baza de date al secvenţelor HLA este lărgită ca număr, atunci numărul ambiguităţilor sau al interpretărilor alternative ale datelor obţinute creşte.

Evaluarea acurateţei metodelor de tipizare HLA

Complexitatea identificării alelelor HLA necesită asigurarea unor rezultate de înaltă calitate.

Standardele actualizate şi detaliate pentru tipizarea HLA bazată pe ADN, sunt menţinute de către Societatea Americană pentru Histocompatibilitate şi Imunogenetică (ASHI) [1] şi de către Federaţia Europeană de Imunogenetică (EFI).

Centrele de Imunogenetică şi Histocompatibilitate sunt obligate să participe în scheme de control extern de calitate.

În tipizarea HLA calitatea este o problemă cheie. Conceptul de control de calitate în laborator asigură că testul adecvat este performat cu o competenţă tehnică de un standard înalt pe proba adecvată şi că rezultatul corect este trimis cu interpretarea calificată către clinicianul care o cere. Testele imunologice de histocompatibilitate au nevoie de interpretarea expertului astfel încât rezultatele ajunse în clinică să poată fi înţelese corect de către clinician.

Cu alte cuvinte, laboratorul face parte din echipa de lucru a clinicii, imunologul având un rol important în stabilirea gradului de potrivire HLA dintre donator şi primitor şi în a da verdictul pentru transplant din punct de vedere imunologic.

De asemenea, evaluarea imunologică post-transplant renal este la fel de importantă, dozarea imunosupresiei şi

40

determinarea anticorpilor anti-HLA orientând terapia de întreţinere.

Centrele de imunogenetică şi histocompatibilitate din Europa sunt obligate să se acrediteze cu Federaţia Europeană de Imunogenetică (EFI), care documentează şi actualizează toate tehnicile de lucru în ceea ce priveşte tipizarea HLA, determinarea anticorpilor citotoxici şi testul crossmatch.

Federaţia Europeană de Imunogenetică (EFI) elaborează standardele de performanţă în imunogenetică şi histocompatibilitate.

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN

TRANSPLANTUL RENAL

__________ ___________

Ileana Constantinescu, Ioanel Sinescu, Ana Moise

Statusul curent al transplantului renal

Primul transplant renal de succes a fost performat la Boston în 1954 între gemeni genetic identici. In Romania, primul transplant renal a fost efectuat de către Domnul Profesor Dr. Eugen Proca în anul 1980 la Institutul Clinic Fundeni. În anul 1997 s-a efectuat primul transplant renal de la cadavru, după recoltare multiorgan. În anul 1998 a fost performat primul transplant renal la un pacient diabetic. În acelaşi an, s-a efectuat primul transplant renal la un adult cu insuficienţă renală cronică prin neoplasm. Seria

41

performanţelor continuă, în 1999 având loc primul transplant renal la copil, cu rinichi prelevat de la cadavru iar în 2005 realizându-se primul transplant renal la un copil anefric prin tumora Wilms bilaterală.

Transplantul renal este tratamentul cel mai eficient pentru marea majoritate a pacienţilor cu insuficienţă renală cronică, îmbunătăţind semnificativ calitatea vieţii, în anumite cazuri crescând speranţa de viaţă.

Imunosupresia actuală performantă, a condus la o evoluţie în timp mult îmbunătăţită, supravieţuirea alogrefelor renale la un an şi respectiv la cinci ani după transplantul renal de la cadavru fiind în prezent, de aproximativ 90% şi respectiv 70% [3].

Acest succes a dus la creşterea numărului de transplante renale care nu pot fi susţinute doar de donatori cadavru, al căror număr rămâne staţionar.

În prezent se utilizează din ce în ce mai mult rinichi de la aşa numiţii donatori “marginali” sau donatori cadavru cu criterii de donare “extinse” sau de la donatori non-heart-beating. De asemenea se utilizează foarte mult şi rinichii proveniţi de la donatori vii care acoperă aproximativ 25% din transplanturile renale în Marea Britanie şi 50% în Statele Unite [3].

În România, programul de transplant renal se bazează aproape exclusiv pe donatori vii, donatorii cadavru fiind în medie de 20 pe an.

Actualmente, în transplantul renal, toate eforturile se concentrează pentru îmbunătăţirea pe termen lung a evoluţiei pacienţilor.

Factori determinanţi ai evoluţiei pe termen lung

Îmbunătăţirile supravieţuirii pe termen lung sunt în principal rezultatul unei evoluţii bune în primul an post-transplant [12].

42

Rata pierderilor alogrefelor renale după un an a rămas, însă, relativ neschimbată din anii 1980, la 3 – 5 % pe an. Pierderea alogrefelor se datorează în principal nefropatiei cronice a alogrefei. Recurenţa bolii renale iniţiale are loc în aproximativ 10% din cazuri [3].

Factorii de risc imunologic pentru nefropatia cronică a alogrefei includ episoadele de rejet şi imunosupresia suboptimală.

Missmatch-urile între donatori şi primitori pentru locusurile HLA-DR, HLA-A şi HLA-B reduce de asemeni, supravieţuirea pe termen lung în transplantul renal.

Factorii non-imunologici care duc la nefropatia cronică a alogrefei sunt numeroşi şi includ vârsta înaintată a primitorului, sexul masculin, hipertensiunea şi vârsta înaintată a donatorului.

Deoarece nu există un tratament eficient pentru nefropatia cronică a alogrefei, şi aceasta necesită retransplant, este important să se încerce pe cât posibil a minimaliza factorii de risc asociaţi.

*****

Pentru transplantul renal, din punct de vedere imunologic, trebuie parcurse trei etape. Dacă pacientul cu insuficienţă renală cronică se află înscris pe lista de aşteptare de câţiva ani, se evaluează periodic detecţia şi identificarea anticorpilor citotoxici.

Pacienţii pot dezvolta aloanticorpi ca răspuns faţă de moleculele HLA străine dobândite din sarcini, transfuzii sau alogrefe anterioare. Aceşti anticorpi pot fi cauza rejetului alogrefei renale.

În momentul în care se pune problema transplantului renal se efectuează tipizarea HLA, atât pentru primitor cât şi pentru donator, iar în etapa a treia se efectuează testul crossmatch. Crossmatching-ul a fost dezvoltat pentru a detecta

43

aloanticorpii donator – specifici în serul pacienţilor care candidează pentru un transplant renal. Folosirea tehnicilor de crossmatch sensibile, pentru a evalua compatibilitatea primitorilor şi donatorilor de rinichi, a eliminat fenomenul de rejet hiperacut al alogrefelor renale şi a avut o contribuţie majoră la îmbunătăţirea supravieţuirii alogrefelor şi a pacienţilor.

Tipizarea HLA joacă un rol foarte important în transplantul renal. Caracteristica moleculelor HLA este imensa lor diversitate la nivelul populaţiei umane. Tipizarea HLA detectează şi clasifică această diversitate. De-a lungul anilor, odată cu progresele tehnicii, au fost în mod continuu descoperite noi molecule HLA, astfel încât în 1999 s-a trecut oficial de numărul de 1000 de alele HLA recunoscute [2].

Identificarea alelelor HLA este, cu siguranţă, problema actuală cea mai complexă în diagnosticul molecular.

În prezent se cunosc mai mult de 1300 alele în populaţia din întreaga lume, la nivelul celor 12 locusuri exprimate ale clasei I şi clasei a II-a [10].

Polipeptidele codificate de către aceste alele diferă una de alta prin una sau mai multe substituţii aminoacidice care sunt de fapt mutaţii cu sens greşit (missens) [30].

Nu există alte locusuri genetice umane mai polimorfe decât locusurile HLA. De exemplu, locusul HLA-B are mai mult de 400 de alele cunoscute [30]. În prezent este cunoscută secvenţa genomică completă a MHC [26].

MHC conţine mai mult de 200 de gene, iar dintre acestea mai mult de 20 de locusuri codifică proteine implicate în legarea şi prezentarea produselor de degradare peptidice ale proteinelor la receptorul antigenic al celulei T.

Astfel, MHC participă la diferite nivele în procesarea peptidelor antigenice şi la prezentarea acestora [24]. În completarea genelor HLA exprimate, există numeroase

44

pseudogene de clasa I şi clasa a II-a care sunt localizate în complexul major de histocompatibilitate. Aceste pseudogene pun probleme dezvoltării metodelor moleculare de tipizare HLA, deoarece este necesar a tipiza genele exprimate fără a fi posibil a se detecta şi pseudogenele apropiat înrudite. Foarte rar prezenţa unei pseudogene poate duce la ambiguităţi ale tipizării moleculare HLA.

Numărul de alele cunoscute, coresunzătoare unei specificităţi particulare, variază de la 1 la mai mult de 50 [2]. Avantajul imens al metodelor de tipizare HLA moleculare este că depistează alături de alelele exprimate şi alelele nule, silenţioase sau puţin exprimate. Relaţia între specificităţile serologice şi tipurile moleculare nu este întodeauna directă (Fig.9). De exemplu, multe alele recent descoperite nu au fost tipizate prin metode serologice şi de aceea nu au specificitatea serologică definită.

În contrast faţă de metodele de tipizare serologice, tipizarea HLA moleculară poate detecta orice secvenţă nucleotidică polimorfă. Aceasta furnizează oportunitatea de a performa tipizare HLA la diferite nivele de rezoluţie începând de la grupuri de alele până la alele idividuale.

Tipizarea care defineşte grupuri de alele, în mod curent aproximând specificităţile serologice, este considerată de rezoluţie joasă sau generică (de exemplu, HLA-DRB1-04). Tipizarea prin metode care rezolvă toate alelele cunoscute este considerată de înaltă rezoluţie (de exemplu, HLA-DRB1*0401). Tipizarea care rezolvă tipurile HLA dincolo de specificităţile serologice, dar nu atinge nivelul alelic, este descrisă ca tipizare de rezoluţie medie (de exemplu, HLA- DRB1– 0401/09/13/16/21/26/33).

Complexitatea deosebită este cauzată de diferenţele dintre tipizările HLA moleculare şi există o nevoie crescândă continuă, de a actualiza interpretarea datelor de tipizare moleculare ca şi numărul de alele HLA cunoscute.

45

Câteva metode moleculare detectează secvenţele cheie polimorfe şi folosesc aceste date pentru a depista alelele. Interpretarea acestor date este influenţată de baza de date a secvenţelor HLA folosită pentru interpretarea acestor rezultate.

Preponderenţa mare a polimorfismului de la nivelul genelor clasei I şi a II-a are loc în exonii care codifică α1 şi α2 la clasa I (exonii 2-3) şi α1 şi β1 la clasa aII-a, (exonul 2), domenii care leagă peptidele procesate [18].

Anumite poziţii ale nucleotidelor la nivelul acestor exoni sunt invariabile, altele pot avea două, trei sau chiar patru din bazele existente ca posibilităţi. Astfel, anumiţi codoni sunt constanţi pe când alţii expun variate grade de variabilitate. Având în vedere că exonii polimorfi sunt relativi scurţi în lungime (aproximativ 250 nucleotide) ei pot fi uşor amplificaţi în PCR pentru studii de diagnostic molecular.

De exemplu, toate alelele DRB1 au codificată glicina la poziţia 20 pe când alte alele pot codifica glicina, valina sau acidul aspartic la nivelul codonului 86. Cele 289 de alele DRB1 apar din multiplele combinaţii posibile ale acestor polimorfisme [3].

Evaluarea anticorpilor citotoxici

Screening-ul anticorpilor citotoxici prin metoda limfocitotoxicitătii dependente de complement

Screening-ul anticorpilor anti HLA este folosit pentru a detecta prezenţa acestora la pacienţii care sunt candidaţi pentru transplant renal. Screening-ul a fost în mod tradiţional, performat folosind metoda limfocitotoxicitătii dependente de complement.

Cele mai multe laboratoare evaluează lunar, din punct de vedere al screening-ului anticorpilor citotoxici, pacienţii aflaţi pe listele de aşteptare. Serurile fiecărui pacient sunt testate

46

pentru prezenţa anticorpilor împotriva unui panel de celule care conţin cele mai frecvente tipuri HLA în populaţia donatoare, prezentă la nivelul unor diferite combinaţii de HLA-A şi B (sau DR şi DQ pentru clasa II), pentru a permite determinarea specificităţilor aloanticorpilor [13]. Formatul poate fi astfel gândit ca un test în masă pentru toţi pacienţii sau un test pentru un singur pacient. Procentul de anticorpi ,ca panel (PRA), este calculat ca procent al numărului de celule pozitive faţă de numărul total de celule din panel, multiplicat cu 100.

PRA este indicatorul imunizării pacientului faţă de HLA. Trebuie menţionat că specificitatea anticorpilor din serurile cu un PRA înalt nu poate fi determinată, de cele mai multe ori. Anumite proceduri cum ar fi diluţia serurilor sau ambele, se pot utiliza pentru a determina identificarea anticorpilor.

Screening-ul anticorpilor citotoxici prin metoda ELISA

Recent a fost dezvoltată o metodă foarte sensibilă de fază solidă pentru detecţia anticorpilor anti-HLA folosind tehnica ELISA. Preparate purificate ale antigenelor HLA sunt peliculizate pe plăcuţe de plastic şi sunt utilizate pentru a capta anticorpii anti-HLA din serul pacienţilor.

În acest fel se evită folosirea celulelor cu întregul lor complex de markeri de suprafaţă. Reacţiile fals pozitive, datorate legării anticorpilor la antigenele non HLA, sunt evitate prin folosirea acestei tehnologii. Antigenele HLA purificate, cu afinitate, sunt izolate din plăcuţe sanguine sau din liniile celulare limfoblastoide, cumulate şi fixate la baza godeului din plăcuţa de plastic în care are loc testul. Antigenele derivate din placuţele sanguine sunt numai HLA de clasa I, pe când antigenele din liniile celulare limfoblastoide pot fi de clasa I, de clasa II sau combinaţii ale ambelor tipuri de antigene [19].

47

Avantajele testului ELISA, faţă de testul convenţional de limfotoxicitate dependentă de complement, includ procesarea rapidă şi uşoară a mai multor probe, prin cititoare automate de plăcuţe, şi eliminarea dependenţei testului de viabilitatea limfocitelor şi a complementului [22].

Serul pacientului este incubat în godeul plăcuţei respective unde orice anticorp anti-HLA de aviditate adecvată se leagă de antigenul fixat. După îndepărtarea anticorpilor nelegaţi este adăugat un anticorp cuplat cu o enzimă care este direcţionat împotriva IgG uman. Adăugarea substratului enzimatic conduce la dezvoltarea reacţiei de culoare în cazul testelor pozitive.

Formatul de interpretare a citirii rezultatelor pentru detecţia anticorpilor citotoxici prin tehica ELISA poate fi, fie pozitiv (anticorpi prezenţi ), fie negativ (anticorpi absenţi). Nu se calculează PRA, iar testul de identificare a anticorpilor citotoxici în cazul reacţiei pozitive, se efectuează tot prin tehnica ELISA şi are o valoare diagnostică pretransplant deosebit de importantă.

De exemplu, este important de ştiut dacă primitorul aflat pe lista de aşteptare este imunizat şi dacă anticorpii citotoxici identificaţi sunt identici cu alelele HLA ale potenţialului său donator de rinichi.

În acest caz, testul crossmatch va fi clar pozitiv iar pericolul unui rejet acut, imediat în perioada post-transplant, este iminent.

Testul ELISA este formulat numai pentru detecţia anticorpilor HLA de tip IgG. În consecintă, testul ELISA standard nu poate detecta anticorpii citotoxici de tip IgM şi anticorpii non-HLA dar detectează anticorpii IgG nefixatori de complement pe care testele de citotoxicitate îi omit.

Testul ELISA poate eşua în a detecta un anticorp cu specificitate pentru un antigen HLA rar, care poate fi absent sau la nivele foarte scăzute în cumulul de antigene. Recent au

48

fost dezvoltate teste ELISA capabile să identifice şi anticorpii de tip IgM.

În rezumat, principiul metodei de lucru pentru screening-ul anticorpilor citotoxici de clasa I şi aII-a prin metoda ELISA este: serul pacientului este adăugat în godeuri căptuşite cu glicoproteine HLA clasa I, respectiv clasa aII-a, permiţând anticorpilor să se lege (dacă sunt prezenţi).

Anticorpii nelegaţi sunt apoi spălaţi. Se adaugă în godeuri un reactiv ce conţine globulină anti-umană (anti-IgG) cuplată cu fosfatază alcalină şi se incubează. Anticorpii anti-IgG nelegaţi sunt apoi spălaţi şi se adaugă substratul PNPP (p-nitrofenil fosfat). După 30 de minute de incubare reacţia este oprită adăugând soluţie de hidroxid de sodiu. Densitatea optică a probelor este măsurată cu un spectrofotometru.

Interpretarea rezultatelor screening-ului pentru ANTICORPII anti-HLA clasa I şi clasa AII-A este:

Rezultatele cu absorbanţă mai mare sau egală de 2 ori decât media controalelor negative sunt POZITIVE.

Notă: diferenţele de citire între absorbanţe pentru duplicatele rezultatelor nu trebuie să fie mai mari de 20%. Pentru a nu interfera citirea, pe spatele plăcii nu TREBUIE SĂ existe urme de reactivi sau urme de talc.

Identificarea anticorpilor citotoxici prin metoda ELISA

Metoda de identificare a anticorpilor anti HLA clasa I şi aII-a prin tehnica ELISA are, ca principiu de lucru următoarele etape:

1. Serul pacientului este adăugat în godeuri căptusite cu glicoproteine HLA clasa I, respectiv clasa aII-a,

49

permiţând anticorpilor să se lege (daca sunt prezenţi).

2. Anticorpii nelegaţi sunt apoi spălaţi.

3. Se adaugă în godeuri un reactiv ce conţine globulină anti-umană (anti-IgG) cuplată cu fosfatază alcalină şi se incubează.

4. Anticorpii anti-IgG nelegaţi sunt apoi spălaţi şi se adaugă substratul PNPP (p-nitrofenil fosfat).

5. După 30 de minute de incubare reacţia este stopată adăugând soluţie de hidroxid de sodiu.

6. Densitatea optică a probelor este măsurată cu un spectrofotometru.

Interpretarea rezultatelor Pentru identificarea anticorpilor anti-HLA clasa I, validarea rezultatelor este efectuată dacă:

media controalelor negative < 0,225 media controalelor pozitive > 0,900

Pentru identificarea de anti-HLA clasa a II-a, validarea rezultatelor este efectuată dacă:

media controalelor negative < 0,225 media controalelor pozitive > 1,000

Atât pentru identificarea de anti-HLA de clasa I cât şi anti-hla clasa aII-a, rezultatele cu valoarea densităţi optice egal sau mai mare decât valoarea prag (cut off) sunt considerate pozitive [27].

50

Fig.13. Principiul metodei ELISA pentru detecţia anticorpilor citotoxici.

Screening-ul anticorpilor citotoxici prin metoda Luminex

Odată cu creşterea numărului de pacienţi de pe lista de aşteptare, se pune problema identificării anticorpilor citotoxici pentru a evalua şansele acestor pacienţi de a efectua transplantul renal în condiţii imunologice de siguranţă.

Sistemul multiplex Luminex poate fi folosit atât pentru screening-ul cât şi pentru identificarea anticorpilor citotoxici având o sensibilitate şi o specificitate performantă.

Principiul acestei noi tehnologii este capacitatea de a măsura simultan analiţi multiplii într-un singur godeu de reacţie.

51

Cu tehnologia Luminex, reacţiile moleculare au loc pe suprafaţa seturilor de microsfere colorate codificat, folosind un amestec de 2 coloranţi fluorescenţi de intensitate diferită.

Microsferele acţionează ca purtători moleculari care capturează o probă şi apoi sunt etichetate cu un raportor fluorescent care se leagă la proba capturată de pe microsferă. Microsferele sunt apoi transferate într-un instrument care foloseşte microfluide pentru a le alinia într-un singur şir care va trece printre două lasere. Un laser luminează culorile din interiorul microsferei, pentru a identifica bila care va fi citită, şi al doilea laser excită culoarea de pe suprafaţa bilei. Printr-o tehnică optică avansată sunt captate semnalele de culoare şi procesarea digitală a semnalelor este translatată, în timp real, în date cantitative pentru fiecare reacţie [20].

Fig.14. Tehnologia Luminex de identificare a anticorpilor.

Comparând Luminex-ul cu alte metodologii folosite pentru screening-ul anticorpilor (cum sunt CDC-AHG, ELISA şi flowcitometrie), a fost relevat faptul că sensibilitatea acestei metode este comparabilă cu cea a flowcitometriei [14] (tabelul 3).

52

Tabelul nr. 3. Comparaţie între metodele actuale folosite pentru detecţia

anticorpilor citotoxici

Metodă Anticorpi detectaţi / total

%

CDC-AHG 12 / 66 18

ELISA 32 / 66 48

Luminex 44 / 66 67

Flowcitometrie

48 / 66 73

Prin tehnica Luminex se pot lucra deodată 96 de probe, astfel încât, se poate face screening-ul şi identificarea anticorpilor pe o singură placă, ceea ce înseamnă eficienţă maximă în testarea pacienţilor [14].

Testul crossmatch

Scopul testului crossmatch este de a detecta prezenţa, în serul pacienţilor, a anticorpilor direcţionaţi împotriva antigenelor HLA ale potenţialului donator de rinichi. Dacă sunt prezenţi, anticorpii semnalizează că sistemul imun al primitorului a fost sensibilizat faţă de alelele donatorului şi este susceptibil a rejeta puternic orice alogrefă ce poartă respectivele antigene.

La nivelul rinichiului transplantat, ţinta principală a acestor anticorpi sunt antigenele HLA de pe endoteliul vascular al capilarelor şi arteriolelor. Complexele antigen HLA – anticorp de pe endoteliu activează complementul şi duc la distrugerea celulară, apoi, plăcuţele agregate, eventual producând cheaguri de fibrină care îngustează vasele, cauzează necroza ischemică.

Chiar şi titrul scăzut de anticorpi, în particular cei direcţionaţi împotriva clasei I de antigene, pot contribui la rejetul alogrefei renale.

53

De asemenea, un alt rol important al testului crossmatch este performanţa de sensibilitate şi specificitate pentru antigenele HLA.

Testul crossmatch prin metoda limfocitotoxicităţii

Un test crossmatch simplu poate fi performat prin metoda citotoxicitătii clasice utilizând drept ţintă limfocitele din sângele periferic al donatorului. Acest tip de crossmatch este folosit curent ca şi evaluare preliminară pentru potenţialii donatori vii înrudiţi pentru transplant de alogrefă renală. Limfocitele din sângele periferic sunt aproximativ 80% celule T care poartă numai antigene HLA de clasa I şi 20% celule B şi monocite care poartă atât antigene HLA de clasa I cât şi de clasa aII-a.

Un rezultat crossmatch intens pozitiv, prin citotoxicitate dependentă de complement (CDC) (50% sau mai mult, celule moarte per godeu), indică în mod clar prezenţa anticorpilor anti-HLA de clasa I.

Astfel, 10-20% din moartea celulară poate rezulta dintr-un anticorp specific pentru clasa aII-a sau se poat datora unui anticorp slab anti clasa I. Pentru a rezolva specificitatea anticorpilor, crossmatch-ul este performat apoi pe preparate celulare îmbogăţite atât cu limfocite T cât şi B.

Testul crossmatch pentru celula T

Crossmatch-ul pentru celula T se performează la temperatura camerei dar şi la 370C în anumite laboratoare pentru a evita legarea anticorpilor reactivi la rece, presupuşi a fi autoreactivi. Un test crossmatch pozitiv pe celula T, prin orice metodă, contraindică transplantul renal indiferent cât de slab este nivelul de reacţie. Există câteva metode pentru îmbunătăţirea sensibilităţii testului crossmatch prin CDC pentru celula T:

54

1. Incubaţia extinsă pentru a creşte sensibilitatea – cea mai simplă modificare a testului de citotoxicitate este extinderea timpului de incubare al celulelor, serului şi complementului.

2. Etapa de spălare Amos – această metodă intercalează o etapă de spălare după incubarea celulelor donatorului cu serul primitorului înainte de adăugarea complementului, pentru îndepărtarea factorilor anticomplementari din ser.

3. Globulina anti-umană - citotoxicitatea anumitor anticorpi poate fi amplificată prin adăugarea unui anticorp, într-o etapă ulterioară, în mod obişnuit un reactiv policlonal tip imunoglobulină anti-umană (AHG).

În rezumat, testul crossmatch pentru celula T prin metoda CDC prezintă următoarele etape de lucru:

1 µL din serul primitorului este dispensat în multiple godeuri ale plăcuţei microtest; pentru pacienţii imunizaţi sunt puse în reacţie seruri multiple cu PRA cunoscut.

Sunt adăugate celulele T ale donatorului (2-3 x 106) şi testul este incubat pentru 30-60 de minute.

Pentru a creşte sensibilitatea testului, serurile sunt spălate din godeuri înainte de adăugarea complementului.

Adăugarea unui al doilea anticorp, cum este IgG-ul de capră anti-uman creşte şi mai mult sensibilitatea.

După câteva minute de incubare cu AHG, este adăugat complementul şi testul este incubat pentru încă 60 de minute.

Incubarea de lungă durată a complementului până la 3 ore, este uneori performată în loc de adaugarea AHG.

Dacă serul primitorului conţine anticorpi care reacţionează cu celulele donatorului, celulele sunt omorâte şi colorantul (eozina sau ethidium bromide) pătrunde în interiorul celulelor indicând un test crossmatch pozitiv.

Un test crossmatch pozitiv pentru celula T este o contraindicaţie pentru transplantul renal.

55

Testul crossmatch pentru celula B

Testul crossmatch pentru anticorpi cu specificitate faţă de antigene HLA de clasa aII-a necesită folosirea limfocitelor B ca şi ţinte şi aceiaşi timpi de incubare extinsă ca şi la tipizarea serologică HLA DR şi DQ. Un test crossmatch pozitiv pe celula B poate apare datorită unor anticorpi care se leagă la antigene HLA de clasa I sau de clasa aII-a.

Mai mult, celulele B sunt un indicator mai sensibil pentru anticorpii slabi de clasa I deoarece ei poartă molecule de clasa I într-o mai mare densitate decât celulele T. Crossmatch-ul prin flowcitometrie poate distinge între anticorpii B adevăraţi şi anticorpii slabi de clasa I ai unui crossmatch citotoxic pozitiv pe celulă B.

Pentru evoluţia transplantului renal, anticorpilor preformaţi faţă de antigenele HLA de clasa aII-a nu este clară încă semnificaţia.

Transplantul renal de succes la pacienţi cu titru scăzut de anticorpi anti HLA clasa aII-a fost raportat, după cum a fost raportat şi fenomenul de rejet acut al alogrefei renale în cazul titrului crescut al anticorpilor anti-HLA clasa aII-a.

Este posibil ca pierderea grefelor transplantate în cazul crossmatch-ului negativ pe celula T şi pozitiv pe celula B să fie datorată componentelor anti-HLA clasa I ale acestor seruri aloreactive.

56

Fig.15

Crossmatch prin tehnica ELISA pentru celula T şi B

ELISA foloseşte anticorpi anti-HLA de clasa I şi respectiv clasa aII-a, care sunt peliculizate în microgodeurile plăcuţei. Ăntr-o primă etapă se pune lizatul de limfocite extrase din sângele donatorului şi antigenul HLA vor fi captate şi fixate în godeu de către aceşti anticorpi. Ulterior, este pus în reacţie serul primitorului, urmat de adăugarea unui anticorp secundar anti IgG uman cuplat cu o enzimă

Prin adăugarea substratului rezultă o reacţie de culoare a cărei intensitate este masurata cu ajutorul cititorului ELISA. Interpretarea rezultatelor testului este bazată pe compararea densităţilor optice ale godeurilor de testat faţă de godeurile de control pozitiv şi negativ. [5].

Principalul avantaj constă în faptul că nu este nevoie de limfocite viabile sau de fixare de complement, iar testul imunoenzimatic nu este confruntat cu interferenţe ale medicamentelor citotoxice cum este globulina anti-timocite sau muronomab OKT3 [5].

În Centrul de Imunogenetică şi Virusologie din Institutul Clinic „Fundeni” crossmatch-ul este performat printr-un test calitativ ELISA în fază solidă pentru detecţia anticorpilor IgG direcţionaţi către antigenele HLA din clasa I şi aII-a specifice donatorului.

Principiul metodei de lucru

Prepararea lizatului de limfocite ale donatorului Reacţia ELISA propriu-zisă (Fig.16)

57

Fig.16. Crossmatch – principiul metodei ELISA.

Glicoproteinele HLA sunt preparate din limfocite prin solubilizarea celulelor cu un detergent neionic. După solubilizare, lizatele de limfocite se adaugă în godeurile în care au fost imobilizaţi anticorpi monoclonali specifici pentru HLA clasa I şi clasa a II-a. Glicoproteinele HLA sunt lăsate să se lege de anticorpii monoclonali şi apoi glico-proteinele nelegate sunt îndepărtate prin spălare.

Godeurile conţinând glicoproteinele legate sunt testate cu ser uman pentru a detecta anticorpii anti-molecule HLA. Anticorpii nelegaţi sunt îndepărtaţi prin spălare.

Se adaugă apoi în godeuri un reactiv anti-globulină umană (anti-IgG) marcat cu fosfataza alcalină şi godeurile se incubează. Anti-IgG nelegat se îndepărtează prin spălare

Se adaugă substratul PNPP (p-nitrofenil fosfat)(Fig. 16). După 30 minute de incubare reacţia este oprită cu soluţie de hidroxid de sodiu.

Densitatea optică a culorii formate se masoară cu un spectrofotometru.

Interpretarea rezultatelor – Criteriul de pozitivitate

Se citesc absorbanţele la 405 sau 410 nm folosind filtrul de referinţă de 490 nm.

Control negativ 0,300

58

Control pozitiv 1,000

Control lizat 0,900

Rezultatele care au media absorbanţelor > 2X media valorilor

controalelor negative, sunt pozitive.

Crossmatch prin metoda flowcitometriei

Această tehnică de lucru este între 30 - 250 de ori mai sensibilă decât metodele serologice vizuale pentru detecţia anticorpilor anti-HLA de tip IgG. Celulele T sunt separate electronic de celulele B, prin folosirea unui anticorp faţă de antigene de suprafaţă ale celulelor T,(cum ar fi complexul CD3-PCR, marcat cu fluoresceină)

O poartă electronică poate fi creată astfel încât, numai celule T marcate cu fluoresceină sunt selectate. Limfocitele donatorului sunt incubate cu serul primitorului pentru a permite legarea oricăror anticorpi anti-donator. Anticorpii legaţi la populaţia de celule T selectată sunt detectaţi prin adaugarea unui anticorp anti IgG uman, anti Fc specific.

F(ab’)2 este cuplat cu un fluorocrom de culoare diferită de cea a anticorpului care marchează celulele T (de exemplu verde dacă anti CD3 a fost roşu). Flowcitometrul numără celulele T cuplate şi crează o histogramă proiectând numărul de celule versus intensitatea fluorescenţei. Celulele necuplate rămân lângă origine iar celulele cuplate la dreapta originii pe axa X.

O deplasare la dreapta a vârfului de celulă T, în comparaţie cu controlul negativ, indică faptul că anticorpii anti-HLA de clasa I din serul pacientului s-au legat de celulele T ale donatorului. Flowcitometria se poate performa şi pe celule B legate cu anticorpi specifici acestora.

59

Flowcitometria este în general performată pe serul cel mai recent şi pe o selecţie de seruri istorice, reactive, pentru toţi pacienţii aflaţi pe lista de aşteptare pentru donatori cadavru şi care au un risc crescut de rejet (cum ar fi alogrefa rejetată anterior, PRA înalt, donator viu înrudit cu crossmatch serologic pe celula T negativ şi pe celula B pozitiv).

Câteodată crossmatch-ul pozitiv prin flowcitometrie apare când crossmatch-ul serologic pe celula T şi B este negativ. Indicaţiile pentru transplant, în aceste cazuri, rămân controversate. Există două posibile explicaţii pentru aceste observaţii: existenţa prezenţei anticorpilor anti-HLA care nu sunt citotoxici sau exista prezenţei anticorpilor blocanţi care interferează cu testarea.

Crossmatching prin tehnologia Luminex

Prin această metodă se poate lucra crossmatch cu sensibilitate şi specificitate de performanţă comparabile cu cele obtinute prin flowcitometrie. Totuşi, la ora actuală, utilizarea cea mai de succes a Luminex-ului, ca şi cost/eficienţă şi acurateţe este pentru detecţia şi identificarea anticorpilor citotoxici (Fig. 17).

60

Fig.17. Principiul tehnologiei Luminex.

Crossmatch-ul pentru autoanticorpi

În evaluarea crossmatch a serului primitorului pentru compatibilitate cu donatorul, cel mai important este să distingem anticorpii nespecifici, antilimfocitari numiţi autoanticorpi, de anticorpii specifici anti-donator. Prezenţa autoanticorpilor este detectată de testul auto crossmatch în care serul pacientului şi limfocitele acestuia sunt combinate în testul standard de citotoxicitate.

Autoaticorpii pot da rezultate fals pozitive într-un test crossmatch cu limfocitele potenţialului donator conducând la descalificarea eronată a acelui donator. Alternativ, anticorpii preexistenţi pot masca prezenţa anticorpilor specifici anti-donator. Auto crossmatch-ul este performat de rutină în cazul tuturor crossmatch-urilor cu donatori vii pentru fiecare ser care este testat.

Algoritmul corect de testare crossmatch pentru un receptor aflat pe lista de așteptare pentru un transplant renal, constă în punerea în reacție a limfocitelor donatorului cu serul istoric de la data precedentei evaluări și cu serul din pre-ziua transplantului; concomitent se lucrează și testul autocrossmatch.

Testarea pentru autoanticorpi prin flowcitometrie este, de asemenea, recomandată în particular în cazul unui crossmatch serologic negativ cuplat cu un test crossmatch pozitiv neaşteptat prin flowcitometrie.

Rezultate de crossmatch fals pozitive, prin tehnica flowcitometrică, se pot produce când pacientul are autoanticorpi de specificitate nedeterminată. Astfel de

61

autoanticorpi pozitivi prin flowcitometrie nu sunt consideraţi a fi o contraindicaţie pentru transplantul renal.

Algoritmul evaluării imunologice în transplantul renal cu donator viu

Grupele sanguine ale donatorului şi receptorului trebuie să fie compatibile. Tipizarea HLA ajută la selectarea celui mai adecvat donator viu când sunt disponibili mai mulţi donatori.

Înainte de transplant se efectuează testul crossmatch pentru evitarea fenomenului de rejet hiperacut. Un test crossmatch pozitiv exclude transplantul renal de la acel donator.

62

Fig.18. Evaluarea imunologică în vederea transplantului renal de la donator viu.

Algoritmul evaluării imunologice în transplantul renal cu

donator cadavru

Donatorul cadavru şi potenţialii receptori trebuie să aibe grupe sanguine compatibile. Apoi este performată tipizarea HLA şi gradul de compatibilitate este folosit pentru alocarea rinichilor de la cadavru.

Anumite date sugerează că prezenţa nepotrivirilor HLA care au fost prezente într-o alogrefă anterioară (în special pentru locusul DR), poate duce la pierderea timpurie a alogrefei renale. Astfel, ar fi înţelept să evităm astfel de nepotriviri.

Când PRA este > 10% este prudent să efectuăm teste pentru a determina dacă unii dintre anticorpi sunt mai mult autoreactivi decât aloreactivi. Anticorpii autoreactivi nu cresc riscul de rejet dar cei aloreactivi cresc riscul de pierdere a alogrefei renale. Titrul mare de anticorpi aloreactivi se datorează, de obicei, sarcinilor anterioare, transplanturilor sau transfuziilor de sânge.

Determinarea anticorpilor citotoxici poate fi utilă în evitarea anumitor antigene HLA. La pacienţii foarte sensibilizaţi (PRA > 50%) poate fi foarte dificil de găsit un donator crossmatch negativ. Evitarea transfuziilor poate ajuta ca titrul anticorpilor citotoxici să scadă în timp.

63

Fig.19. Evaluarea imunologică în vederea transplantului renal de la cadavru.

Alegerea unui donator viu versus donator cadavru pentru transplantul renal

64

Fig.20 Donator viu versus cadavru pentru transplantul renal.

Folosirea donatorului viu pentru transplantul renal este avantajoasă deoarece supravieţuirea alogrefei este mai bună şi este posibil transplantul preemptiv [6]. Cel mai bun donator este, de obicei, un membru din familie.

Donatorul marginal

Deşi nu este acceptată încă o definiţie unanimă, aceşti donatori includ persoane la vârste extreme, cu hipertensiune sau diabet sau indivizi cu un risc crescut de transmitere a diferitelor boli. În mod surprinzător, transplantul de rinichi de la un astfel de donator marginal duce în multe cazuri la o funcţie renală bună la nivelul receptorului.

S-a constatat că transplantul renal dual de la donatori marginali dă rezultate similare transplanturilor cu un singur rinichi de la donatori non-marginali [16]. Transplantul dual nu pare să crească rata complicaţiilor chirurgicale [16]. Sistemele de scorificare care folosec variabilele donatorului cum sunt: vârsta, hipertensiunea arterială în antecedente, funcţia renală, rezultatele biopsiei renale şi missmatch-ul HLA, pot furniza o abordare cantitativă pentru furnizarea rinichilor marginali [23].

Donatori non-heart-beating

Principala problemă legată de transplanturile renale de la acest tip de donatori este rata crescută de funcţie renală

65

întârziată şi de nefuncţionare primară comparativ cu rinichii provenind de la donatori cadavru heart-beating [8].

Efectul sursei donatorului asupra supravieţuirii alogrefei

Comparaţia între primitorii de rinichi cu diferite surse de donatori, la 3 ani de supravieţuire a alogrefelor renale, a arătat că cea mai bună supravieţuire a fost observată la cei cu donatori frati, HLA identici [6].

Grefele provenite de la soţi sau soţii şi alţi donatori vii neînrudiţi au supravieţuit la fel ca şi grefele provenite de la părinţi, toate supravieţuind mai mult în comparaţie cu grefele provenite de la donatori cadavru [6].

Fig.21. Impactul sursei donatorului asupra supravieţuirii alogrefei

renale de la donori vii înrudiţi.

Aceste date au încurajat centrele de transplant renal pentru a face cât mai multe transplanturi de la donatori vii, în acest fel evitând şi lunga aşteptare pentru un donator de rinichi cadavru.

66

Efectele potrivirii HLA asupra

supravieţuirii alogrefei renale provenite de la un donator viu

Fig.22. Impactul potrivirii HLA asupra supraviţuirii

grefei renale de la donatori vii înrudiţi

(după L.K. Lebeck şi M.R. Garovoy – Histocompatibility testing and organ sharing, chapter 8).

Supravieţuirea alogrefei este cea mai bună pentru alogrefe HLA identice de la fraţi şi este urmată apoi de alogrefe cu un singur haplotip nepotrivit. Important este că timpul de înjumătăţire (T½) al grefelor care supravieţuiesc la cel puţin un an este proporţional cu gradul de matching. Această informaţie poate fi folosită împreună cu alţi factori pentru a selecta cel mai adecvat potenţial donator de rinichi [27].

67

Matching-ul imunologic: conceptul de matching în transplantul renal

Influenţa pozitivă a potrivirii HLA asupra supravieţuirii grefei renale a fost demonstrată timp de mai bine de 25 de ani [11, 31, 6]. În practică, gasirea unui donator de rinichi cu zero missmatch HLA este extrem de rară. De aceea, eforturile se concentrează pentru găsirea unui donator cu minimum de nepotriviri HLA sau, se merge mai departe, până spre limita maximă de nepotriviri, astfel încât să putem avea, totuşi, un matching HLA optim.

În acest sens, de exemplu, între 1988 şi 1996 programele de transplant renal ale Eurotransplant au mers pe minimă potrivire pentru cel puţin un antigen HLA-B şi un antigen HLA-DR.

Chiar şi în prezent, multe programe continuă să folosească aceste cerinţe minime pentru potrivirea HLA aşa cum reiese din profilul de matching HLA al programului de alocare de rinichi al Eurotransplant [9].

În mod regretabil nu există încă un consens general despre definiţia a ceea ce înseamnă un donator inacceptabil HLA.

În orice caz, anticorpii citotoxici detectaţi în serul actual al pacientului identifică antigenele HLA de clasa I inacceptabile ale donatorului şi prognozează un crossmatch pozitiv care este testul final înainte de transplant.

Relevanţa anticorpilor pentru urmatoarele aspecte este controversată:

68

1) antigenele HLA de clasa a II-a;

2) antigenele HLA de clasa I care au fost identificate numai în serurile istorice ale pacientului;

3) antigenele HLA ale donatorului care au fost nepotrivite în cazul unui transplant anterior, dacă acest lucru este aplicabil.

Toate aceste restricţii imunologice afectează aproximativ 30% din pacienţii aflaţi pe lista de aşteptare a Eurotransplant [9].

În mod ideal ar trebui considerat un index de potrivire şi pentru antigenele HLA inacceptabile ale donatorului.

Matching-ul imunologic este relevant numai când există un număr suficient de mare de donatori [31]. Cu cât sunt mai mulţi donatori cu atât este mai mare şansa unui matching bun, prin aceasta înţelegând o potrivire de 50% pentru alelele HLA-A, B şi DR.

Orice politică de a maximiza numărul de zero missmatch-uri HLA-A, B, DR ar trebui să acţioneze pe un număr cât mai mare de donatori posibili. Acelaşi lucru trebuie să se aplice şi pentru pacienţii înalt sensibilizaţi.

În anii recenţi, progrese mari s-au efectuat prin potrivirea HLA la nivel de alelă [7]. De asemenea, trebuie menţionat că mulţi primitori de alogrefă renală cu nepotriviri HLA continuă să aibă o funcţie bună mulţi ani după transplant, sugerând că anumite nepotriviri HLA sunt totuşi acceptate [8].

În timpurile testării serologice HLA un ser cu PRA înalt era considerat a fi compus din mulţi anticorpi anti-HLA. Mai târziu s-a observat că serul pacienţilor înalt sensibilizaţi aşteptând un transplant renal era, în general, compus dintr-un număr mic de anticorpi direcţionaţi faţă de antigenele publice, denumite şi CREGs şi mai puţin din anticorpi multipli, fiecare reacţionând cu un antigen HLA specific convenţional. Mai mult, frecvenţa CREGs era mult mai mare, 35% până la 88%, faţă de cele mai comune antigene HLA-A şi B. Prin interferenţă

69

potrivirea pentru antigenele donatorului şi receptorului incluse în acelaşi CREG, respectiv potrivirea CREG, poate duce la un număr mai mare de transplanturi potrivite şi la un nivel mai redus de sensibilizare a pacienţilor având grefe repetate. În completare, datorită includerii unor antigene private HLA-A şi B în cadrul aceleaşi CREG, un număr de antigene rare pot fi potrivite mult mai uşor, oferind posibilitatea unei supravieţuiri alogrefei mult îmbunătăţite pentru un număr mai mare de pacienţi.

Un studiu recent de potrivire pentru “CREGs” (cross reactive groups), a sugerat că atât donatorii cât şi primitorii care sunt potriviţi pentru aceste grupuri de antigene, pot avea mai puţine teste crossmatch pozitive şi pot beneficia de o alogrefă renală cu o supravieţuire de lungă durată [8].

În rezumat, evaluarea imunologică pretransplant renal a pacienţilor cuprinde: genotipul HLA, anticorpii citotoxici-screening, dacă este cazul identificare şi testul crossmatch.

Transplanturile renale ABO incompatibile

În mod tradiţional, compatibilitatea de grup sanguin este considerată esenţială pentru transplantul renal de succes, deoarece rinichii ABO incompatibili transplantaţi sunt rapid distruşi de fenomenul de rejet hiperacut datorat anticorpilor anti-A şi/sau anti-B care se leagă de antigenele A şi/sau B de pe endoteliul grefei, activând cascada complementului şi inducând agregarea trombocitară şi tromboza intravasculară [8].

70

În 1981, Slapak şi colaboratorii au observat că plasmafereza rezolvă rapid rejetul la un transplant renal accidental incompatibil ,ABO care s-a produs din cauza unei erori de lucru a grupelor sanguine.

Recent interesul pentru folosirea rinichilor de la donatori vii ABO incompatibili a crescut foarte mult, mai ales în ţări unde din motive culturale nu există sursă alternativă de donatori.

Chirurgii japonezi au raportat faptul că subgrupe selectate de pacienţi pot atinge o evoluţie acceptabilă după transplantul renal ABO incompatibil, dacă anticorpii anti-ABO sunt reduşi pretransplant combinat cu splenectomie şi/sau anticoagulante postoperator şi doze înalte de imunosupresoare.

Titrurile de anticorpi pretransplant sunt reduse prin schimbare de plasmă (plasma exchange) sau imunoabsorbţie cu înlocuire ulterioară cu plasmă tip AB.

Splenectomia este performată în încercarea de a reduce capacitatea primitorului de a produce anticorpi anti-A/anti-B în cazul în care transplantul se efectuează de la un donator de rinichi ABO incompatibil.

Terapia anticoagulantă cu inhibitori ai agregării trombocitare este utilizată pentru a preveni iniţierea coagulării intravasculare diseminate intrarenal, datorită rejetului umoral. Acest tip de transplant poate fi aplicat cu succes pentru pacienţii care primesc rinichi de la donatori vii şi nu este posibil în cazul donatorilor cadavru.

71

BIBLIOGRAFIE

1. American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, http://www.ashi-hla.org

2. Baxter-Lowe, L.A, and Colombe, B.W., Histocompatibility Testing (19), in Lange Medical Immunology, Tenth Edition, 2001.

3. Callaghan, C. J., and Bradley, J. A., Current status of Renal Transplantation Cpt. 1 in Transplantation Immunology Methods and Protocols edited by Philip Horniclx, Marlene Rose, Humana Press Inc. 2006.

4. Campbell, R.D. and Trowsdale, J. Immunology Today 18, 43, 1997.

5. Cecka, J.M. and Reed F.E., Histocompatibility Testing, Cross-Matching, and Allocation of Kidney Transplants in Handbook of Kindey Transplantation, Fourth Edition, Gabriel M. Danovitch, 2005 by Lippincott Williams & Wilkins.

6. Cecka, J.M., The role of HLA in renal transplantation. Human Immunology 56: 6-16, 1997.

7. Chua, M.S., Sarwal, M. Microarrays: New tools for transplantation research. Pediatric Nephrology, 18:319-327, 2003.

8. Danovitch, G.M., Handbook of Kindey Transplantation Fourth Edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2005

9. De Meester, J., Persijn, G.G., Claas, F.H.J., Frei, U: In the queue for a cadaver donor kidney transplant: new rules and concepts in the Eurotransplant International Foundation. Nephrology Dialysis Transplantation 15,3, 333-338, 2000.

10. European Bioinformatics Institute, http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla

11. Gilks, W.R., Gore, S.M., Bradley, B.A., Matchability in kidney transplantation. Tissue Antigens; 32:121-129, 1988.

12. Hariharan, S., McBride, M.A., Cherikh, W.S., Tolleris, C. B., Bresnahan, B. A., and Johnson, C. P., Posttransplant renal function in the first year predicts long-term kindey transplant survival. Kidnei Int. 62, 311-318, 2002.

13. Harrison, J, Navarrete, C., Selection of Platelet Donors and Provision of HLA Matched Platelets, in Histocompatibilitz Testing. Imperial Collage Press, 2000; 379

14. Herczyk, W.F., Luminex, Vendor Forum, ASHI Quarterly, 104, Third Quarter, 2003.

72

15. Janeway, C.A., Travers P: Antigen recognition by T lymphocytes. Ed 3 Immunobiology 41-46, 1997, Garland Publishing, New York and London.

16. Jerius, J. T., Taylor, R. J., Murillo, D., and Leone, J. P. Double renal transplants from marginal donors: 2-year results. Journal of Urology, 163, 423-425, 2000.

17. Johnson, A.H., Katovich, Hurley. C., Hartzman, R.J., Wade, J.A., Human Leucocyte Antigen : The Major Histocompatibility Complex of Man, 40, 927-946, in Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, John Bernard Henry, M.D., 2001, Saunders, Twentieth Edition.

18. Little, A-M., Parham, P: Polymorphism and evolution of class I and class II genes and molecules. Reviews in Immunogenetisc, 1Ş105-123, 1999.

19. Lucas, D.P., Paparounis, M.L., Meyers, L., Mart, J.M., Zachary, A.A.,: Detection of HLA class I specific antibodies by the QuikScreen Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Clin Lab Diagn Lab Immunol, 1997;4:252

20. Luminex Corporation, 1998-2000. Luminex 100 User Manual Version 1.7 Rev B.

21. Marsh, S.G.E., Parham, P. Barber., Barber L.D., The HLA FactsBook, Academic Press, 2000.

22. Moore, S.B., Ploeger, N.A., DeGoey, S.R.,: HLA antibody screening: Comparison of a solid phase enzyme-linked immunoassay with antiglobulin augmented lymphocytotoxicity. Transplantation 1997; 64:1617.

23. Nyberg, S. L., Matas, A. J., Kremers, W. K., et. al. Improved scoring system to assess adult donors for cadaver renal transplantation. American Journal of Transplantation. 3, 715-721, 2003.

24. Rhodes, D.A., Trowsdale, J.: Genetics and molecular genetics of the MHC. Reviews in Immunogenetics, 1:21-31, 1999.

25. Rodey Glenn E. HLA Beyond Tears. De Novo, Inc. 2000;213.

26. Sanger Centre, http://www.sanger.ac.uk./HGP/Chr6/MHC/shtml

27. Thelan, D., Rodey, G., American Society of Histocompatibility and Immunogenetics Laboratory Manual, edn. Lenxa, K.S: ASHY.

28. Trowsdale, J. Immunogenetics 41,1-17,1995.

29. Trowsdale, J. In HLA and MHC: Genes, Molecules and Function (Browning, M. And McMichael, A. Eds), 1996, Bios Scientific Publishers, Oxford.

73

30. Williams, T.M., Human Leucocyte Antigen Gene Polymorphism and the Histocompatibility Laboratory, The Journal of Molecular Diagnostics, 3, 3, 2001.

31. Wujciak, T., Opelz, G., Matchabililty as an important factor for kidney allocation according to the HLA Match. Transplantation Proceedings; 27: 1403-1405, 1997.

32. Zachary, A.A., Delaney, N.C., Lucas, D.P., Laffell, M.S., Characterization of HLA Class I Specific Antibodies by ELISA Using Solubilized Antigen Targets: I. Evaluation of the GTI Quik-ID Assay and Analysis of Antibody Patterns. Human Immunology 2001; 62:3, 228-235

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN TRANSPLANTUL HEPATIC

_______________ _______________

Ana Moise, Ileana Constantinescu

Primul transplant de ficat la om, a fost realizat în 1963 de către echipa chirurgicală condusă de dr. Thomas Starzl, în Denver, SUA. În ciuda perfecţionării continue a tehnicilor chirurgicale, transplantul hepatic a rămas la nivel experimental, cu o rată a supravieţuirii la un an de cca. 25%,

74

până prin anii ’80 când a fost introdusă Ciclosporina ca tratament imunosupresor.

Şi în prezent, deşi rata supravieţuirii la 1an a ajuns la 80 – 85% şi continuă să se îmbunătăţească, transplantul de ficat rămâne o procedură formidabilă dar grevată de complicaţii frecvente.

În general, afecţiunile hepatice care induc necesitatea unui transplant, pot fi divizate în două grupe:

- afecţiuni acute: cum ar fi hepatitele virale fulminante. - afecţiuni cronice: hepatite virale cronice, hepatite autoimune, hepatopatii

alcoolice (indicaţie controversată, condiţionată de abstinenţa pretransplant), ciroză biliară primitivă, colangită sclerozantă, boli metabolice (boala Wilson ).

Transplantul hepatic este limitat de numărul de organe cadaverice disponibile. În ultimii ani, numărul organelor disponibile de la cadavru a rămas relativ stabil, în timp ce numărul pacienţilor înscrişi anual pe lista de aşteptare pentru transplantul hepatic este în continuă creştere.

Această discrepanţă între organele disponibile şi nevoia de transplant a condus la reevaluarea continuă a criteriilor de selecţie şi includere pe lista de aşteptare. În prezent, scorul MELD (Model for End-Stage Liver Disease) este recomandat, deoarece se bazează pe 3 parametri biochimici obiectivi, larg disponibili şi reproductibili (bilirubina serică, creatinina serică şi INR protrombină), iar pentru populaţia pediatrică se utilizează un model similar, scorul PELD (Pediatric End- Stage Liver Disease) care foloseşte următoarele variabile: vârsta, albumina serică, bilirubina serică totală, INR şi retardul statural. [1, 2, 3, 4]

Donatori marginali:

1. vârstă > 50 ani: deşi vârsta înaintată a donatorului se poate asocia cu funcţia deficitară a grefei, lipsa de organe

75

şi evoluţia favorabilă post-transplant par să justifice numărul în creştere al donatorilor > 50 ani.[5]

2. steatoza hepatică: ficatul cu infiltrare grasă uşoară sau moderată poate fi utilizat cu rezultate bune dacă timpul de ischemie rece este redus.[6]

3. markeri pozitivi pentru virusul hepatitic B sau C: grefele provenind de la donatori cu markeri de infecţie VHB sau VHC pot fi utilizate la receptori cu ciroză secundară infecţiei VHB, respectiv VHC, dacă se administrează tratament profilactic specific.[7,8]

Transplantul cu ficat împărţit (split liver transplantation ): un ficat de la cadavru este împărţit în două grefe funcţionale, lobul drept fiind folosit pentru un receptor adult, iar lobul stâng (segmentele 2, 3 şi 4) sau segmentul lateral stâng (segmentele 2 şi 3) pentru un adult scund sau un copil. Majoritatea centrelor consideră că împărţirea in vivo este superioară celei ex vivo dacă sunt luate în considerare rezultatele imediate şi pe termen lung. Principalul dezavantaj al tehnicii cu ficat împărţit constă în supravieţuirea mai mică a grefei şi numărul crescut de complicaţii biliare comparative cu transplantul hepatic integral.

Transplantul hepatic “în domino” reprezintă situaţia în care un pacient cu o afecţiune genetică şi ficat normal morfologic (de exemplu, amiloidoză familială) primeşte un ficat de la donator cadavru, iar ficatul pacientului cu amiloidoză este transplantat unui receptor marginal având în vedere că apariţia manifestărilor amiloidozei familiale apar după o perioadă lungă (20-30 ani).[9]

Transplantul hepatic cu donator viu (living donor liver transplantation- LDLT). Este o metodă bazată pe capacitatea remarcabilă de regenerare a ficatului. Din punct de vedere istoric, metoda se adresa iniţial părinţilor ce aveau copii cu afecţiuni hepatice şi care erau dispuşi să le doneze o porţiune din ficatul lor sănătos, dar în prezent se efectuează si transplantul adult – adult. Ficatul donatorului se regenerează şi este funcţional 100% în circa 4 – 6 săptămâni.

76

Avantajele LDLT sunt: scurtarea perioadei de aşteptare; posibilitatea alegerii momentului optim, înainte de apariţia deteriorării progresive a funcţiei hepatice şi condiţiei pacientului; scăderea timpului de ischemie rece; creşterea rezervorului de donatori;

Dezavantajul major al LDLT este morbiditatea de aproximativ 10% şi, în cazuri rare (0.2-0.5%), mortalitatea donatorului [10-13].

Compatibilitatea donator – primitor în transplantul hepatic

Potrivirea dintre donator şi receptor implică doi factori:

1. grupul sanguin: donatorul trebuie să aibă grupul sanguin compatibil dar nu neapărat identic cu al primitorului. Totuşi, studiile au arătat că un transplant izogrup oferă o supravieţuire mai bună decât un transplant cu grup compatibil.

2. dimensiunea corpului (body size): este foarte dificil să introduci ficatul unei persoane bine dezvoltate în corpul unei persoane de statură mică şi ca urmare potrivirea dimensiunilor între primitor şi donator este esenţială.

Spre deosebire de transplantul de rinichi sau de măduvă osoasă, în transplantul hepatic, compatibilitatea HLA nu este necesară cu toate că a fost raportată o relaţie inversă între compatibilitate şi supravieţuire [14]. Oricum, genotiparea HLA se efectuează numai în scopuri ştiinţifice nu şi în scopul alocării alogrefelor hepatice.

Genotipul HLA DRB1*11 este asociat în 70% din cazurile de transplant hepatic cu episoade de rejet acut şi cu creşterea nivelului seric al neopterinului, IL-1β, IL-2R, IL-8.

Genotipul HLA DRB1*13 este asociat cu infecţii VHC posttransplant şi sepsis.

77

Crossmatch-ul nu se performează de rutină preoperator dar, ocazional, poate fi realizat retrospectiv. Au fost raportate numai câteva cazuri de rejet hiperacut datorate prezenţei anticorpilor anti-donor. Motivul acestei aparente rezistenţe a ficatului la rejet hiperacut nu este încă pe deplin cunoscut. S-a sugerat că ficatul nu este sensibil la anticorpii preformaţi sau că, datorită dimensiunilor sale mari, rezultă o diluţie a anticorpilor la nivele la care ei nu mai sunt nocivi.

Ocazional, în cazul unor transplante combinate, ficat şi rinichi, crossmatch-ul pozitiv pretransplant s-a negativat posttransplant. Două ipoteze au fost lansate în ce priveşte mecanismul prin care se produce această scădere a nivelului anticorpilor citotoxici: 1) formarea de complexe imune solubile; 2) pierderea de sânge asociată operaţiei de transplant hepatic ce determină o scădere a titrului anticorpilor [14].

Boala acută de grefă contra gazdă (GVHD) în transplantul hepatic

Ficatul face parte din sistemul reticuloendotelial, este un organ mare cu o reţea vasculară întinsă şi care conţine în parenchim un număr mare de celule limfoide. Se estimează că numărul limfocitelor din parenchimul unei grefe hepatice este mult mai mare decât cel dintr-o grefă de măduvă osoasă.

GVHD acut posttransplant hepatic apare când limfocitele imunocompetente ale donatorului, transferate odată cu ficatul, sunt activate şi suferă o expansiune clonală. Mecanismul intim al acestui proces nu este încă bine cunoscut. Lezarea ficatului datorată manevrelor chirurgicale ar induce o stare de imunosupresie şi alterarea raportului citokinelor TH1/TH2. Recent, o mai mare atenţie se acordă limfocitelor T reglatoare CD4+ CD25+, deoarece ele joacă un rol important în imunoreglare şi imunotoleranţă, fiind capabile să inhibe funcţiile limfocitelor T CD4+, CD8+ şi a celulelor NK [15].

78

Diagnosticul precoce al acestei afecţiuni şi strategia terapeutică reprezintă o provocare, întrucât rata de mortalitate este încă mare, în jur de 85%. Din fericire incidenţa acestei boli este scăzută, 1 – 2%, şi pare să fie influenţată de mai mulţi factori ce ţin atât de donator cât şi de primitor: compatibilitatea HLA, vârsta înaintată a primitorului, imunodeficienţa primitorului [16, 17,18].

Legat tot de aceste limfocite imunocompetente ale donatorului, transferate primitorului odată cu organul transplantat, se descrie aşa-numitul "sindrom al limfocitelor pasagere" (SLP) [19].

Acest sindrom se referă la fenomenul de hemoliză aloimună mediată de complement, datorat producției de anticorpi antieritrocitari de către limfocitele B cu memorie ale donatorului. Faptul că acești anticorpi provin de la donator a fost demonstrat prin teste de alotipizare a imunoglobulinelor.

De obicei, specificitatea este față de antigene eritrocitare ale sistemelor ABO și Rh si doar ocazional față de antigene aparținând altor sisteme eritrocitare ( Kidd, Lewis ), situație întâlnită atunci când donatorul a fost sensibilizat prin transfuzii sanguine sau sarcină. Tratamentul imunosupresor administrat posttransplant joacă un rol etiologic important. Ciclosporina și tacrolimusul permit proliferarea rapidă a limfocitelor B transferate, care vor produce anticorpi.

Este o complicație raportată mai frecvent în cazul transplantelor cu mismatch minor ABO si poate fi cauza unor hemolize "neexplicate" apărute în perioada postoperatorie. Incidența SLP biochimic (haptoglobină scăzută, transaminaze și bilirubină indirectă crescute) în transplantul hepatic este de circa 30 – 40% .

De obicei apare în săptămânile 1 – 3 posttransplant și are o evoluție autolimitată cu remisiune completă în circa 3 luni. Dintre factorii ce influențează severitatea hemolizei amintim: cantitatea de țesut limfoid transferată, nivelul izoaglutininelor

79

eritrocitare la donator înainte de transplant, capacitatea de clearence a acestor anticorpi de către primitor [20-23].

În cele mai multe cazuri tratamentul implică doar substituția cu masă eritrocitară, izogrup cu donatorul, și numai rareori sunt necesare și alte mijloace terapeutice: plasmafereză, Ig intravenos, corticosteroizi sau anticorpi monoclonali anti CD20 (Rituximab) [24].

Monitorizarea pacientului posttransplant hepatic

Evaluare imunologică

Fenomene de rejet post transplant hepatic pot fi întâlnite la peste 50% din pacienti și sunt tratate relativ ușor și cu succes dacă sunt diagnosticate precoce. Din păcate, semnele și simptomele clinice (febră, dureri abdominale, ascită, hepatomegalie, inapetență ) și testele paraclinice (creșterea nivelelor serice ale bilirubinei, transaminazelor, fosfatazei alcaline) sunt nespecifice.

Uzual, diagnosticul se pune prin biopsie hepatică percutană aspectul histopatologic sugestiv fiind reprezentat de infiltratul celular mixt în spațiul port, cu epiteliul ductelor biliare și al venei centrale/porte alterat.

O provocare continuă pentru imunologii şi cercetătorii ce activează în domeniul transplantului, este descoperirea unor noi markeri, cât mai specifici şi cât mai accesibili, care să permită un diagnostic cât mai precoce şi prin metode neinvazive, a fenomenelor de rejet.

Citokinele TH1 şi alte citokine proinflamatorii, incluzând TNF-α, IFN-γ, IL-2, sunt mediatori primari ai rejetului alogrefei [25,26]. Pe de altă parte citokinele TH2, cum ar fi IL-4 sau IL-10, inhibă răspunsul TH1 şi compromite imunitatea gazdei, dar promovează tolerenţa transplantului (27).

80

În plus, limfocitele T helper, sub acţiunea Transforming Growth Factor ( TGF-β ) şi a IL-6, se pot diferenţia într-un subset de celule ce secretă IL-17, citokină recent recunoscută ca inductoare a răspunsurilor inflamatorii.

IL-1β, IL-2R, IL-6, IL-8, TNF-α şi neopterina serică reprezintă indicatori fideli ai răspunsului imun mediat celular la pacienţii cu transplant hepatic şi din acest considerent sunt markeri imunologici prognostici pentru fenomenul de rejet acut.

Algoritmul immunologic de evaluare posttransplant trebuie să cuprindă, în mod obligatoriu, cel puţin determinarea IL-2R, TNF-α şi neopterinei pentru o monitorizare imunologică de acurateţe, care să ofere o imagine cât mai fidelă asupra răspunsului imun celular.

Evaluarea imunologică este cu atât mai importantă în condiţiile imunosupresiei cu inhibitor de calcineurin şi în cazul infecţiilor posttransplant induse de virusuri din familia herpesviridae care, la rândul lor, manipulează răspunsul imun al gazdei.

Evaluarea virusologică

Evaluarea virusologică pre și posttransplant este foarte importantă pentru monitorizarea pacienților cu transplant hepatic.

Recurenţa afecţiunii iniţiale post-transplant este o provocare majoră pentru hepatolog.

Afecţiunea care ridică cele mai importante probleme legate de recidiva post-transplant este infecţia cu VHC. Reinfecţia grefei cu VHC este universală, recurenţa histologică fiind notată la 50-80% din pacienţi la 1 an post-transplant. O proporţie de 15-30% dintre pacienţii cu hepatită cronică C recurentă dezvoltă ciroză hepatică la 5 ani post-transplant.

81

O serie de factori se asociază cu riscul hepatitei VHC recurente post-transplant: încărcătura virală mare pre-transplant şi precoce posttransplant, genotipul 1b şi 4, anumite antigene HLA ( HLA DRB1*13 ), timpul de ischemie rece prelungit, steatoza severă (> 30%), asocierea carcinomului hepatocelular, vârsta donatorului > 50 ani, tipul de imunosupresie (utilizarea OKT3), numărul episoadelor de rejet acut tratate cu bolusuri de metilprednisolon, tratamentul rejetului cu anticorpi anti-limfocitari, infecţia cu virusul citomegalic, absenţa coinfecţiei VHB pretransplant [6,9,28,29].

Rareori recurența infecției VHC se asociază cu forme agresive de hepatită ce pot duce la pierderea grefei, iar câteva rapoarte recente sugerează că incidența și severitatea recurenței sunt mai crescute în cazul transplantului de ficat de la donatori vii [31].

Eradicarea infecţiei VHC pre-transplant reprezintă modalitatea optimă de profilaxie a infecţiei grefei. Regimul antiviral optim pentru tratamentul hepatitei C recurente post-transplant este regimul combinat interferon, preferabil pegylat, plus ribavirină. Durata şi doza optimă a fiecărui agent antiviral nu sunt încă standardizate. Retransplantarea pacienţilor cu infecţie VHC recurentă rămâne controversată datorită rezultatelor slabe.

Până în urmă cu aproximativ o decadă, pacienţii transplantaţi pentru ciroză de etiologie VHB prezentau cel mai nefavorabil prognostic dintre toţi pacienţii transplantaţi pentru afecţiuni hepatice non-maligne cu o proporţie de 73% din decesele înregistrate în primele 60 zile posttransplant.

Reinfecţia VHB a grefei se poate produce cu particule VHB circulante, cu particule virale provenind din sursele de replicare extrahepatice ale VHB (sistemul hematopoetic, pancreas) sau ambele.

Factorii asociați cu o rată de reinfecție mai mică și cu îmbunătățirea supraviețuirii posttransplant includ [31]:

82

1. replicare virală absentă (absența în ser a ADN-HBV și/sau AgHBe);

2. profilaxia pe termen lung a hepatitei VHB;

3. hepatita HBV fulminantă;

4. coinfecția cu virus delta (VHD);

Combinaţia imunoglobulină specifică anti-VHB (HBIG)-lamivudină reprezintă în momentul actual regimul profilactic preferat în majoritatea centrelor de transplant hepatic din lume, fiind asociată cu o rată de reinfecţie cuprinsă între 0 şi 9.5% [30, 32], iar rata de supraviețuire la 5 ani a acestor pacienți este asemănătoare cu a pacienților transplantați pentru alte afecțiuni non-virale. Monoterapia cu HBIG sau lamivudină se asociază însă cu dezvoltarea de mutaţii ce conferă rezistenţă la tratament (mutaţii în gena S pentru HBIG sau mutaţii în gena P a polimerazei virale – mutaţii YMDD pentru lamivudină).

Retransplantare pacienților cu infecție VHB recurentă poate fi realizată cu succes dacă se asociază o terapie antivirală și cu HBIG în doze crescute.

Citomegalovirusul (CMV) este un patogen frecvent implicat în infecțiile posttransplant, contribuind semnificativ la creșterea morbidității și mortalității în transplantul de organe solide. Un risc mai mare de a dezvolta infecție primară simptomatică prezintă primitorii seronegativi care au avut un donator seropozitiv. Alți factori de risc pentru activarea CMV sunt: tipul de organ transplantat, mismatch-ul HLA dintre donator și primitor, intensitatea terapiei imunosupresoare, sexul feminin.

Pe lângă efectul direct determinat de invazia țesuturilor, CMV este implicat în patogeneza rejetului acut sau cronic și de asemenea crește riscul de recurență al infecției VHC si scade supraviețuirea globală a pacientului și a grefei [33].

83

O dovadă a rolului jucat de CMV în rejetul alogrefei este observația că terapia profilactică și antivirală îmbunătățește funcția grefei și inhibă rejetul acut. Deși reactivitatea imună în infecțiile CMV a fost intens studiată în ultimii ani, mecanismul imunologic prin care CMV induce rejetul alogrefei rămâne controversat. Una din ipoteze susține că limfocitele T CMV-specifice, cu potențial citotoxic și producătoare de citokine proinflamatorii, cum ar fi TNF-α, pot reacționa direct cu anumite complexe CMH/peptide alogene, proces cunoscut sub denumirea de "imunitate heteroloagă". O altă ipoteză se referă la stimularea indirectă a aloimunității. Infecția CMV induce producția locală de citokine proinflamatorii, cum ar fi TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, sau chemokine CC și CXC, care determină recrutarea și activarea leucocitelor din grefă (34,35).

Este deja bine cunoscut rolul pe care îl joacă imunitatea celulară în controlul infecției. Concentrațiile crescute de neopterină reflectă răspunsul imun mediat celular și în infecțiile produse de CMV sau EBV, fiind un marker imunologic foarte util în diagnosticul acestor infecții la pacienții cu transplant hepatic, deoarece nivelele serice de neopterină cresc în stadiile timpurii ale acestor infecți, de obicei chiar înainte de seroconversie.

BIBLIOGRAFIE

1. Forman LM, Lucey MR. Predicting the Prognosis of Chronic Liver Disease: An Evolution From Child to MELD. Hepatology 2001; 33: 473-5

2. Garcia-Tsao G, Elferink RO. MELD: the end of Child-Pugh classification? J Hepatol 2002; 36: 141-5

3. Kamath PS, Wiesner RH, Malinchoc M et al. A model to predict survival in patients with endstage liver disease. Hepatology 2001; 33: 464-70

84

4. Wiesner R, Edwards E, Freeman R et al. The model for end-stage liver disease (MELD) and allocation of donor livers. Gastroenterology 2003; 124: 91-6

5. Hoofnagle JH, Lonbardero M, Zetterman RK et al. Donor age and outcome of liver transplantation.Hepatology 1996; 24: 89-96

6. Keeffee EB. Selection of patients for liver transplantation. In Transplantation of the Liver, edited by Maddrey WC, Schiff ER, Sorrell MF. Lippincott Williams & Wilkins 2001; 5-34

7. Vergas HE, Laskus T, Wang LF et al. Outcome of liver transplantation in hepatitis C virusinfected who received hepatitis C virus-infected grafts. Gastroenterology 1999; 117:149-53

8. Dodson SF, Bonham CA, Geller DA et al. Prevention of de novo hepatitis B infection in recipients of hepatic allografts from anti-HBc positive donors. Transplantation 1999; 68: 1058-61

9. Wiesner RH, Rakela J, Ishitani MB et al. Recent Advances in Liver Transplantation. Mayo Clin Proc 2003; 78: 197-210

10. American Society of Transplant Surgeons, Ethics Committee. Position paper on adult-to adult living donor liver transplantation. Liver Transpl 2000; 6: 815-817

11. Broering DC, Sterneck M, Rogiers X. Living donor liver transplantation. J Hepatol 2003; 38: S119-S135

12. Renz JF, Roberts JP. Long-term complications of living donor liver transplan-tation. Liver Transpl 2000; 6(6 suppl 2): S73-S76

13. Ghobrial RM, Saab S, Lassman C et al. Donor and recipient outcomes in right lobe adult living donor liver transplantation. Liver Transpl 2002; 8: 901-909

14. Manikkam S, Stock P, et al. Clinical transplantation, in Medical Immunology, tenth edition edited by Parslow TG, Stites DP, Terr AI, Imboden JB. McGraw-Hill 2001; 719-742

15. Edinger M, Hoffman P, Ermann J, et al. CD4 + CD25+ regulatory T cells preserve graft–versus-tumor activity while inhibiting graft vs. host disease after bone marrow transplantation. Nat Med 2003; 9:1144 -50

16. Perri R, Assi M, Talwalkar J, et al. Graft vs. host disease after liver transplantation : a new approach is needed. Liver Transpl 2007; 13: 1092-9

85

17. Smith DM, Agura E, Netto G, et al. Liver transplant- associated graft vs. host disease. Transplantation 2003; 75:118-26

18. Chan EY, Larson AM, Gernsheimer TB, et al. Liver Transpl 2007; 13: 516-22

19. Audet M, Panaro F, Piardi T, et al. Passenger Lymphocyte Syndrome and Liver Transplantation.Clinical and Developmental Immunology 2008;

20. Yazer MH and Triulzi DJ Immune hemolysis following ABO-mismatched stem cell or solid organ transplantation Current Opinion in Hematology 2007;14, 6,664– 670.

21. Sternberg A J, Lee G, Croxton T, et al. Severe hemolysis after minor ABO unmatched kidney transplant—a non-secrector transplanted from a donor with high anti-A titre. Transfusion Medicine2000;10;1, 87–89

22. Sokol RJ, Stamps R, Booker DJ, et al.. Posttransplant immune-mediated hemolysis Transfusion 2002 , vol. 42, no. 2, pp. 198–204

23. Shortt J, Westall GP, Roxby D, et al. A ‘dangerous’ group O donor: severe hemolysis in all recipients of organs from a donor with multiple red cell alloantibodies. American Journal of Transplantation, vol. 8, no. 3, pp. 711–714, 2008.

24. Panaro F, DeChristopher PJ, Rondelli D, et al. Severe hemolytic anemia due to passenger lymphocytes after living-related bowel transplant Clinical Transplantation 2004; 18, 3, 332–335

25. Amirzargar A, Lessanpezeshki M, Fathi A, et al. TH1/TH2 cytokine analysis in Iranian renal transplant recipients. Transplant Proc 2005; 37(7): 2985-7

26. Lessanpezeshki M, Amirzargar A, Fathi A, et al. Value of pretransplantation cytokine profiles for predicting acute rejection in renal transplant recipients. Transplant Proc 2005; 37(7): 2982-5

27. Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, et al. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol 2001; 19:683-765

28. Gheorghe L, Gheorghe C. Transplantul hepatic: indicaţii, contraindicaţii, selecţia pacienţilor, evaluare şi alegerea momentului optim. Revista pentru Educaţie Medicală Continuă 2002; 1: 107-114.

86

29. Ponce M, Berenguer M, Prieto M et al. Should we discard old donors for hepatitis C candidates? The importance of donor steatosis. Hepatology 2003: 38: 226A.

30. Han SH, Ofman J, Holt C et al. An efficacy and cost-effectiveness analysis of combination hepatitis B immune globulin and lamivudine to prevent recurrent hepatitis B after orthotopic liver transplantation compared with hepatitis B immune globulin monotherapy. Liver Transpl 2000; 6: 741-748.

31. Imperial JC, Keeffe EB. Liver transplantation in Handbook of liver disease, second edition, edited by Lawrence S. Friedman, Emmet B. Keeffe, Churchill-Livingstone, 2004; 401-415

32. Rao W, Wu X, Xiu D. Lamivudine or lamivudine combined with hepatitis B immunoglobulin in prophylaxis of hepatitis B recurrence after liver transplantation: a meta-analysis. Transplant International 2009; 22 (4): 387-395

33. Razonable RR. Cytomegalovirus infection after liver transplantation: current concepts and challenges. World Gastroenterology 2008; 14(31):4849-60

34. Reinke P, Prosch S, Kern F. Mechanisms of human cytomegalovirus (re)activation and its impact on organ transplant patient. Transpl Infect Dis 1999; 1(3): 157-64

35. Adams AB, Williams MA, et al. Heterologous immunity provides a potent barrier to transplantation tolerance. J Clin Invest 2003; 111(12): 1887-95

87

EVALUAREA IMUNOLOGICĂ ÎN

TRANSPLANTUL MEDULAR

____________ ____________

Ana Moise, Ileana Constantinescu

În prezent, transplantul autolog sau alogeneic de celule stem hematopoietice ( TCSH ), reprezintă o opţiune terapeutică bine–cunoscută, având un loc bine stabilit în algoritmul de tratament al multor afecţiuni: afecţiuni hematologice congenitale sau dobândite, tumori solide, boli autoimune, amiloidoză, anomalii ereditare de metabolism [1]. Sursele de celule stem sunt reprezentate de măduvă osoasă, sânge periferic, sânge din cordonul ombilical. Rezultatele clinice obţinute par să fie similare, indiferent de sursă, iar alegerea modalităţii de recoltare depinde de vârsta primitorului şi/sau donatorului, indicaţia de transplant, preferinţa donatorului, experienţa şi dotarea centrului unde se face transplantul.

88

Rezultatul unui TCSH depinde în mare măsură de următorii factori de risc: stadiul bolii, intervalul de timp scurs de la diagnostic pâna la momentul transplantului, vârsta pacientului ( în general, se obţin rezultate mai bune la copii decât la adulţi ), histocompatibilitatea donator-primitor, combinaţia de sex donator-receptor ( riscul de rejet este mai mare dacă donatorul este femeie iar primitorul bărbat) . De asemenea, există un risc potenţial de transmitere a unor boli, de la donator la primitor, cum ar fi: infecţii, boli congenitale, boli autoimune, cancere [2].

Stabilirea compatibilităţii HLA

Federaţia Europeană de Imunogenetică ( EFI ) este forul european ce defineşte standardele în laboratoarele de histocompatibilitate şi stabileşte criteriile minime privind tipizarea HLA pentru TCSH de la donator înrudit sau neânrudit.

Dar, dacă în transplantul de organe solide, putem vorbi de mismatch-uri HLA “acceptabile” situaţia este complet diferită în cazul transplantului de măduvă osoasă sau de celule stem. Acest tip de transplant implică chiar celulele sistemului imun şi orice nepotrivire între donator şi receptor, chiar și modificarea unui singur aminoacid în situsul de recunoaștere a antigenului, poate determina fenomene grave de rejet, fie în sensul unei boli gazdă contra grefă fie în sens invers ca boală de grefă contra gazdă.

Determinarea unui potențial donator implică o apreciere riguroasă a disponibilității și statusului de potrivire HLA a membrilor familiei, și identificarea unui donator neînrudit potrivit, dacă nu există donator înrudit disponibil. Deoarece antigenele HLA determină un răspuns aloimun, potrivirea

HLA joacă un rol preventiv critic în reducerea riscului de afectare a grefei și de apariție a bolii de grefă contra gazdă. Pe de altă parte, efectul de grefă contra leucemie, asociat cu

89

mismatch-ul HLA, reprezintă un mijloc imunologic de a reduce riscul de recurență de boală la pacienții cu risc crescut.

Selecția donatorului înrudit

Cel mai adecvat donator este un frate potrivit din punct de vedere al genotipului HLA.

Conform recomandărilor EFI este obligatorie tipizarea imediată a HLA – A, B, DRB1 la toţi membrii familiei disponibili. Iniţial se poate face un screening prin tipizare fenotipică dar ulterior, la perechile compatibile fenotipic, tipizarea se definitivează prin metode de biologie moleculară de rezoluţie înaltă care permit descrierea alelelor HLA la nivel de 4 digits.

Tipizarea ABDR poate confirma identitatea genotipică pentru întregul set de gene HLA ( potrivire 12/12 ). Din cauza unui slab ”dezechilibru de legare” între locusul DP şi locii DR/DQ, în 1 – 2% din cazuri, datorită recombinărilor pot apare mismatch-uri DP între fraţi altfel identici. Probabilitatea ca un frate să fie identic HLA este de 25%, în timp ce probabilitatea unui frate haploidentic este de 50%.

Selecţia donatorului neînrudit

Dacă un frate, identic din punct de vedere al genotipului HLA, nu este disponibil, transplantul cu celule stem hematopoietice potrivite HLA – A, B, C, DRB1/DQB1 de la un donator neînrudit are aceleași rate de supraviețuire fără boală, mai ales pentru pacienții cu risc scăzut, dar se asociază cu o frecvență crescută a complicațiilor posttransplant [3,4]. Mismatch-urile alelice de obicei implică diferențe în situsul de legare al peptidului, ceea ce influențează recunoasterea dependentă de celulele T.

”Standardul de aur” este reprezentat de tipizarea cu rezoluție înaltă a locusurilor HLA – A, B, DRB1, DQB1, DPB1. Dacă transplantul se face pentru o afecțiune nemalignă, nu este necesar efectul de grefă contra leucemie, mediat prin

90

incompatibilitatea DP, și potrivirea DPB1 poate fi luată în considerare când sunt disponibili mai mulți donatori compatibili HLA – A/B/C/DR/DQ (5).

Realizarea în siguranță a transplanturilor de celule stem de la donatori neînrudiți se datorează, în mare parte, progreselor obținute în domeniul imunogeneticii. La începutul anilor '90, stabilirea compatibilității tisulare era stânjenită de metodele de tipizare HLA de rezoluție slabă ( metode serologice ), în special pentru alelele HLA de clasa I. Studiile recente, bazate pe metode de tipizare de rezoluție înaltă ( metode moleculare ), au arătat că potrivirea la nivel de alelă se asociază cu rezultate mai bune oricare ar fi regimul de condiționare, mieloablativ sau de intensitate redusă [3]. Oricum, importanța relativă a fiecărui locus în parte rămâne o problemă discutabilă. În timp ce efectul mismatch-urilor A/B/C/DRB1 a fost bine documentat prin multiple studii retrospective, rolul incompatibilității DQ sau DP rămâne controversat. Date recente privind transplantul de celule stem cu depleție de limfocite T, de la donator neînrudit, arată că matching-ul HLA- DPB1 se asociază cu risc crescut de recădere independent de statusul de compatibilitate a celorlalte locusuri [6].

Rezultate diferite au fost raportate și în studii ce implicau pacienți de etnii diferite. În populația japoneză, mismatch-urile A/B/C/DRB1 reprezintă factor de risc semnificativ pentru GVHD acută de gradul III sau IV, și numai diferențele A, B sau DRB1 se asociază cu mortalitate crescută [7]. Un alt studiu din SUA arată că nepotrivirile HLA-A/B/C/DRB1, dar nu și mismatch-urile DQ sau DP, se însoțesc de o scădere a ratei de supravietuire [8].

În cazul potrivirii alelice HLA în proporție de 80-90%, în completarea tipizării HLA de înaltă rezoluție se efectuează și testul crossmatch. În cazul în care testul crossmatch este pozitiv, acest fapt nu reprezintă o contraindicație absolută

91

pentru transplantul medular, dar regimul imunosupresor trebuie reconfigurat în totalitate.

În concluzie, toate aceste aspecte legate de potrivirea sau nepotrivirea alelelor HLA, trebuie luate în considerare, în funcție și de particularitățile clinico-biologice ale cazului care urmează a fi transplantat medular.

Selectia donatorului din banca de sânge din cordonul ombilical

În general, în acest caz se face tipizare HLA-A/B cu rezoluție joasă și tipizare HLA-DRB1 cu rezolutie înaltă și matching-ul se stabilește la acest nivel, deoarece se pare că incompatibilitățile HLA sunt mai puțin dăunătoare și cel mai important parametru, de care depinde rezultatul transplantului, este cantitatea de celule stem conținută de unitatea de sânge recoltată [9].

Aprecierea probabilității de a găsi un donator neînrudit

Identificarea unui donator neînrudit potrivit la nivel de alele HLA, este un proces mare consumator de timp și bani. Pe baza noilor cunoștiințe privind frecvența alelelor și haplotipurilor în populații diferite, se apreciază că următorii parametri au un impact negativ (10):

prezența unor alele rare la pacient ( B*4405 );

un haplotip HLA-ABDR care nu se numără printre cele 10 mai frecvente haplotipuri la populația caucazoidă;

asocieri B-DR neobișnuite ( ex. B65-DRB1*0101 );

asocieri DR-DQ neobișnuite ( ex. DRB1*1501-DQB1*0603 );

prezența alelelor B*2705, B18, B*4402, B*4403, B51 ce se însoțesc de un risc crescut de mismatch HLA-C;

primitor și donator de etnii diferite;

92

În concluzie: Sistemul HLA, cu circa 100 de specificități definite serologic și peste 2500 de alele, reprezintă o barieră majoră în transplantul de celule stem hematopoetice. Consensul actual este că, selectarea donatorilor neînrudiți pe baza genotipării HLA prin metode moleculare de rezoluție înaltă se însoțește de cele mai bune rezultate.

Dacă sunt disponibili mai mulți donatori HLA identici, se recomandă alegerea unui bărbat, ABO identic și/sau CMV negativ.

Oricum, importanța fiecărui locus individual rămâne încă o problemă deschisă, ce necesită o definire mai clară și, în acest sens, o contribuție importantă vor avea studiile multicentrice. De asemenea, mai rămâne de stabilit care este rolul pe care îl joacă alți factori imunogenetici care pot fi implicați, cum ar fi: antigenele sistemului minor de compatibilitate, genele citokinelor și chemokinelor, genele KIR.

Genele KIR și transplantul de celule stem hematopoetice

Receptorii KIR (Killer cell immunoglobulin-like receptors) sunt molecule care fac parte din familia imunoglobulinelor și care se găsesc pe suprafața celulelor NK. Locusul genelor KIR se află pe cromozomul 19 și face parte dintr-un complex mai mare numit Complexul Receptorului Leucocitar (leukocyte receptor complex – LRC). Din punct de vedere structural, receptorul KIR este constituit dintr-o porțiune extracelulară, cu 2 sau 3 domenii imunoglobulinice (2D sau 3D), și o porțiune intracelulară, lungă sau scurtă, L (long) și S (short). KIR-urile cu domeniul intracelular lung au o acțiune inhibitoare asupra celulelor NK, pe când cele cu domeniul intracelular scurt transmit semnale activatoare.

Prin interacțiunea izotipurilor inhibitoare cu anumite molecule HLA de clasa I, celulele sănătoase sunt protejate de acțiunea citolitică a celulelor NK.

93

Astfel, receptorii KIR par șă joace un rol semnificativ în controlul răspunsului imun, ceea ce explică asocierile observate între anumite gene KIR și boli autoimune (artrita reumatoidă), psoriazis, progresia infecției HIV [11, 12,13].

KIR 2DL1 au ca ligand alelele HLA-C de grup 2, caracterizate prin prezența resturilor de lizină în poziția 80 și asparagină în poziția 77 (Cw2, Cw4, Cw5, Cw6), pe când KIR 2DL2 si 2DL3 recunosc alelele HLA-C de grup 1, cu asparagină în poziția 80 si serină în poziția 77 (Cw1, Cw3, Cw7, Cw8). KIR 3DL1 este receptor pentru alelele HLA-Bw4.

Deoarece sunt localizate pe cromozomi diferiți, genele receptorilor KIR și liganzilor se transmit independent descendenților. Genotipul HLA clasa I determină în final ce repertoriu de receptori KIR va fi exprimat pe suprafața celulelor NK, astfel încât fiecare celulă NK funcțională să exprime cel puțin un receptor KIR inhibitor pentru antigenele HLA proprii. Coexpresia a două sau mai multe KIR-uri inhibitoare este mult mai rară [14].

Celulele NK care exprimă receptori KIR pentru propriul HLA de clasa I, dacă întâlnesc celule cu un alt fenotip HLA (așa cum se poate întâmpla în cazul unui alotransplant ), sesizează lipsa ligandului specific și mediază alloreacțiile (”missing self” recognition) [15].

Aceste mismatch-uri KIR - ligand apar deseori in transplantul cu donator haploidentic. Când alloreactivitatea NK se exercită în direcția donor – versus- primitor pare să aibe un rol crucial în îmbunătățirea rezultatelor posttransplant haploidentic și se asociază cu [16]:

rată de recădere de boală, semnificativ mai mică;

rată de supraviețuire fără evenimente mai bună, atât la pacienții transplantați în perioada de remisiune cât și la cei cu recădere de boală;

94

reducerea riscului global de recădere sau deces;

În ceea ce privește receptorii KIR activatori, liganzii lor specifici nu sunt pe deplin cunoscuți. Se pare că există o interacțiune slabă între KIR2DS1 și moleculele HLA-C Lys80 și între KIR2DS2 și moleculele HLA-C Asn80. Spre deosebire de KIR-urile inhibitorii, cele activatoare prezintă o mare varietate și heterogenitate în populația generală și în diverse grupuri etnice.

Circa 25% din caucazieni, care sunt homozigoți pentru așa-numitul haplotip A, nu posedă receptori KIR activatori, restul, homo- sau heterozigoți pentru haplotipul B, prezintă gene inhibitorii și variate combinații de gene activatoare.

În cazul unui transplant de la donator cu NK aloreactive, prezența haplotipului B la donator se asociază cu scăderea incidenței mortalității legate de transplant, mortalitate datorată în special infecțiilor.

Receptorii KIR activatori stimulează secreția de citokine și citotoxicitatea celulelor NK împotriva celulelor infectate, în contextul absenței selfului, și de asemenea pot controla infecția printr-un mecanism indirect rezultat din interacțiunea celulelor NK cu celulele dendritice. In vivo, această interacțiune conduce la o creștere a raportului Th1/Th2 [17,18].

În concluzie, creșterea numărului de transplante de celule stem hematopoetice cu mismatch HLA este fezabilă în prezent, în condițiile unei înțelegeri cât mai complete a mismatch-urilor ”permise” și a rolului genelor KIR.

Imunogenetica non-HLA și transplantul de celule stem hematopoetice

Deși tipizarea HLA rămâne elementul central în selecția donatorilor și este un factor determinant major în ce privește

95

rezultatele obținute posttransplant, secvențierea genomului uman a relevat existența a mii de polimorfisme genice (single nucleotide polymorphisms) a căror semnificație și importanță în ce privește transplantul autolog rămâne încă a fi elucidată.

Polimorfismul genelor citokinelor

Multe din polimorfismele genelor citokine apar in regiunea reglatoare a genei și astfel este influențată cantitatea de citokine produsă ca răspuns la un stimul infecțios sau allogeneic.

Studiile inițiale s-au făcut în transplantul de organe solide și s-a demonstrat că pacienții cu genotip high-secretor de TNF-α și low-secretor de IL-10 prezintă risc mai mare de rejet al grefei. Ulterior studiile au fost extinse și în transplantul de CSH.

GVHD acuta este rezultatul eliberării de citokine proinflamatorii (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α) în timpul ”furtunii de citokine” consecutivă radioterapiei și chimioterapiei din regimul de condiționare. La aceasta se adaugă și activarea limfocitelor T și NK ale donatorului, activare urmată de secreția predominantă de citokine de tip Th1 (IL-2, IFN-γ, TNF-α ).

Citokinele inflamatorii sunt de asemenea implicate în patogenia pneumoniei interstițiale, bolii venoocluzive, în susceptibilitatea la infecții sau în metabolismul medicamentelor.

Un studiu japonez, facut pe pacienți transplantați de la donatori potriviți, neînrudiți, a arătat o asociere între polimorfismul TNF-863 si 857 la donator și/sau primitor și o incidență mai mare a GVHD grad III-IV și o rată mai mică de recădere de boală [19]. Polimorfismele TNF-α (-308) si TNF-β (+1069) s-au asociat cu complicații toxice [20].

Polimorfismele IL-10 -1082 și -592 determină apariția a trei posibile haplotipuri care sunt low-, intermediate- sau high-

96

secretoare de IL-10. Haplotipul low-secretor la primitor se asociază cu GVHD severă la pacienții tratați numai cu Ciclosporină sau Ciclosporină cu Methotrexat și cu supraviețuire mai mică [21].

Polimorfismul IL-6 -174G/G la primitor se asociază cu GVHD acut și cronic.

Polimorfismul IL-1α -889 la donator sau la primitor se asociază cu îmbunătățirea ratei de supraviețuire și reducerea mortalității legate de transplant [22].

Antigenele minore de histocompatibilitate

GVHD care apare după un transplant de la frate HLA identic este inițiat de limfocitele T care recunosc antigene minore de histocompatibilitate ( peptide derivate din proteinele intracelulare, codate de gene de pe cromozomi autozomali sau de pe cromozomul Y ). Unele antigene (ex: HA-1, HA-2) se găsesc numai pe celulele sistemului hematopoietic, iar altele (ex: H-Y, HA-3) sunt exprimate ubicuitar pe țesuturile normale. Cele codate de gene de pe cromozomul Y sunt implicate în transplantul cu mismatch de sex. Nepotrivirile între donator și primitor pentru HA-1, HA-2, HA-4, HA-5 se asociază cu creșterea incidenței GVHD [23].

Alte gene implicate în apariția complicațiilor posttransplant (GVHD, episoade infecțioase) includ familia supergenelor receptorilor hormonilor steroidieni (printre care receptorul pentru estrogen și receptorul pentru vitamina D), genele care reglează răspunsul gazdei la microorganisme (mieloperoxidaza, receptorul Fcγ), genele TLRs (Toll-like receptors care activează celulele prezentatoare de antigen), genele NOD (nucleotide-binding oligomerisation domain) [24-26].

Incompatibilitatea ABO și suportul transfuzional

97

Aproximativ 15 – 25% din perechile primitor – donator frate HLA-identic, sunt incompatibile ABO. În transplantul mieloablativ, incompatibilitatea ABO se asociază cu risc crescut de întârziere în grefarea celulelor roșii, aplazie eritrocitară pură, hemoliză. Mismatch-ul ABO nu afectează grefarea neutrofilelor, incidența rejetului de grefă, progresia bolii sau supraviețuirea globală [27].

Posttransplant se adoptă următoarea politică transfuzională:

pentru incompatibilitate ABO majoră (ex. primitor grup 0-donator grup A) se utilizează masă eritrocitară de grup 0, indiferent de grupul sanguin al donatorului sau receptorului, până când anticorpii ABO-specifici ai primitorului sunt nedetectabili și testul antiglobulinic este negativ;

pentru incompatibilitate ABO minoră (ex. primitor grup A-donator grup 0) se utilizează masă eritrocitară de grupul donatorului;

pentru incompatibilitate ABO majoră și minoră (ex. primitor grup B-donator grup A) se utilizează masă eritrocitară de grup 0, până când anticorpii ABO-specifici ai primitorului sunt nedetectabili și testul antiglobulinic este negativ și apoi se trece la grupul donatorului;

Reconstituirea sistemului imun după transplantul de celule stem hematopoetice

98

Transplantul de celule stem oferă un model unic de reconstituire imună graduală și ilustrează perfect relația dintre tipul imunodeficienței și infecțiile cu anumiți patogeni [28].

Imediat după regimul de condiționare apare o fază de aplazie până la regenerarea neutrofilelor de la donator. În această fază există un risc foarte mare pentru infecții bacteriene, fungice (aspergiloză), virale (în special cu HSV).

A doua etapă, primele 3-4 luni, se caracterizează prin refacerea celulelor răspunsului imun înăscut (granulocite, monocite, macrofage celule NK) și printr-o deficiență a imunității celulare. Infecția CMV, datorată în special reactivării, reprezintă cea mai mare problemă în această fază și, mai puțin frecvent apar infecții cu virusuri respiratorii/enterice sau adenovirusuri.

În a treia etapă, după 4 luni, majoritatea pacienților prezintă o deficiență a imunoglobulinelor, în special IgG2. Regenerarea limfocitelor B, CD19+ se realizează, de obicei, în decursul primului an posttransplant. Primitorii de transplant alogeneic sunt în mod particular vulnerabili la infecții cu bacterii încapsulate (S. Pneumoniae, H. Influenzae).

BIBLIOGRAFIE

1. Ljungman P, Urbano-Ispizua A, Cavazzana-Calvo M, et al. Allogeneic and autologous transplantation for haematological disease, solid tumors and immune disorders: Definitions and current practice in Europe. Bone Marrow Transplant 2006; 37: 439-449

2. Niederweiser D, Gentilini C, Hegenbart U, et al. Transmission of donor illness bz stem cell transplantation: should screening be different in older donors? Bone Marrow Transplant 2004; 34: 657-665

3. Petersdorf EW. Risk assessment in hematopoietic stem cell transplantation. Best Pract Res Clin Haematol 2007; 20: 155-170

99

4. Hurley CK, Wagner JE, Setterholm MI, Confer DL. Advances in HLA: Practical implications for selecting adult donors and cord blood units. Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12: (1 Suppl 1): 28-33

5. Tiercy JM. The rol of HLA in HSCT. The EBMT Handbook, 5th

edition 2008; 46-92

6. Shaw BE, Marsh SG, Mayor NP, et al. HLA- DPB1 matching status has significant implications for recipients of unrelated donor stem cell transplants. Blood 2006; 107: 1220-1226

7. Morishima Y, Sasazuki T, Inoko H, et al. The clinical significance of HLA allele compatibility in patients receiving a marrow transplant from serologically HLA-A, B, DR matched unrelated donors. Blood 2002; 99: 4200-4206

8. Flomenberg N, Baxter-Lowe LA, Confer D, et al. Impact of HLA class I and class II high resolution matching on outcomes of unrelated donor bone marrow transplantation. Blood 2004; 104: 1923-1930

9. Gluckman E, Rocha V. Donor selection for unrelated cord blood transplants. Curr Op Immunol 2006; 18: 565-570

10. Tiercy JM, Bujan-Lose M, Chapuis B, et al. Bone marrow transplantation with unrelated donors: What is the probability of identifying an HLA-A/B/C/w/DRB1/B3/B5/DQB1- matched donor? Bone Marrow Transpl 200; 26: 437-441

11. Warrington KJ, Takemura S, Goronzy JJ, Weyand CM. CD4+,CD28- T cells in rheumatoid arthritis patients combine features of the innate and adaptive immune systems. Arthritis Rheum 44:13; 2001.

12. Martin MP, Nelson G, Lee JH, Pellett F, et al. Susceptibility to Psoriatic Arthritis: Influence of Activating Killer Ig-Like Receptor Genes in the Absence of Specific HLA- C Alleles. J Immunol 169:2818; 2002.

13. Martin MP, Gao X, Lee JH, Nelson GW, Detels R, Goedert JJ, Buchbinder S, Hoots K, Vlahov D, Trowsdale J, et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS, Nat Genet 31:429; 2002.

100

14. Yawata M, Yawata N, Draghi M, et al. Roles for HLA and KIR polymorphisms in natural killer repertoire selection and modulation of effector function. J Exp Med 2006; 203: 633-645

15. Ruggeri L, Aversa F, Martelli MF, Velardi A. Haploidentical transplantation and NK cells recognition of missing self. Immunol Rev 2006; 214: 202-218

16. Ruggeri L, Mancusi A, Capanni M, et al. Donor NK cell allorecognition of missing self in haploidenrical haematopoietic transplantation for acute myeloid leukemia. Challenging its predictive value. Blood 2007; 110: 433-440

17. Smith HRC, Heusel JW, Mehta IK, et al. Recognition of a virus-encoded ligand by a natural killer cell activation receptor. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 8826-8831

18. Degli Esposti MA, Smyth MJ. Close encounters of different kinds: Dendritic cells and NK cells take centre stage. Nature Reviews Immunology 2005; 5: 112-124

19. Ishikawa Y, Kashiwase K, Akaza T, et al. polymorphisms in TNFA and TNFR2 affect outcomes of unrelated bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 2002; 29: 569-575

20. Mullighan CG, Bardy PG. Advance in the genomics of allogeneic haematopoietic stem cell transplantation. Drug Development Research 2004; 62: 273-292

21. Lin MT, Storer B, Martin PJ, et al. Relation of an IL-10 promoter polymorphism to GVHD and survival after haematopoietic -cell transplantation. N Engl J Med 2003; 349: 2201-2210

22. Cullup H, Stark G. IL-1 polymorphism and GVHD. Leuk Lymphoma 2005; 46: 517-523

23. Goulmy E. Human minor histocompatibility antigens. Curr Opin Immunol 1996; 8:75-81

24. Middleton PG, Cullup H, Dickinson AM, et al. Vitamin D receptor gene polymorphism associates with GVHD and survival in HLA-matched sibling allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 2002; 30:223-228

25. Napolitani G, Rinaldi A, Bertoni F, et al. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type

101

1-polarizing program in dendritic cells. Nature Immunology 2005; 6: 769-776

26. Holler E, Rogler G, Brenmoehl J, et al. Prognostic significance of NOD2/CARD15 variants in HLA-identical sibling haematopoietic stem cell transplantation: Effect on long term outcome is confirmed in 2 independent cohorts and may be modulated by the type of gastrointestinal decontamination. Blood 2006; 107: 4189-4193

27. Helbig G, Stella-Holowiecka B, Woinar J, et al. Pure red cell apasia following major and bidirectional ABO-incompatible allogeneic stem cell transplantation: Recovery donor-derived erythropoiesis after long-term treatment using different therapeutic strategies. Ann Hematol 2007

28. Toubert A. Immune reconstitution after allogeneic HSCT. The EBMT Handbook, 5th edition 2008; 297-316

102

Glosar de termeni - Imunologia transplantului

Alelă: variantă a unei gene într-un locus genetic particular. Cele două alele, de pe cei doi cromozomi omologi, pot fi identice, şi individul este homozigot sau diferite şi el este heterozigot.

Alogrefă: este tipul cel mai răspandit de grefă şi se referă la situaţia în care un organ se transplantează unui individ aparţinând aceleiaşi specii, dar diferit genetic.

Aloreactivitate: descrie stimularea celulelor T de către moleculele MHC, altele decât cele proprii; marchează recunoaşterea moleculelor MHC alogenice. Astfel de răspunsuri sunt numite aloreacţii.

Anticorp: este o proteină care se leagă specific la o substanţă particulară, antigenul corespunzător. Fiecare moleculă de anticorp are o structură unică care îi permite să se lege specific la antigenul său corespunzător, dar toţi anticorpii au aceeşi structură şi sunt cunoscuţi ca imunoglobuline sau Ig-uri. Anticorpii sunt produşi de celulele plasmatice ca răspuns faţă de infecţie sau imunizare, legându-se la patogeni, neutralizându-i şi îi pregăteşte pentru distrugere de către fagocite.

Anticorpi citotoxici: anticorpi anti-HLA

Antigen: orice moleculă care se leagă specific de un anticorp. Numele lor provine de la abilitatea acestora de a genera anticorpi. Nu toate antigenele sunt capabile să stimuleze

103

producţia de anticorpi; antigenele care induc producţia de anticorpi sunt denumite imunogene.

ASHI: Societatea Americană de Histocompatibilitate şi Imunogenetică.

Autogrefă: când un organ se transplantează aceluiaşi individ, dar în altă parte a organismului.

CD: Clusters of differentiation, sunt grupuri de anticorpi monoclonali care identifică aceeaşi moleculă de la suprafaţa celulară. Molecula de la suprafaţa celulei este desemnată CD urmat de un numar (de exemplu: CD1, CD2 etc).

Celulele prezentatoare de antigen: sunt celule înalt specializate care pot procesa antigene ale căror fragmente peptidice le proiectează pe suprafaţa celulară împreună cu moleculele necesare activării celulelor T. Principalele celule prezentatoare de antigen pentru celulele T sunt celulele dendritice, macrofagele şi celulele B.

Celulele T CD4 (helper): aceste celule ajută celulele B pentru a produce anticorpi ca răspuns la stimularea antigenică. Cele mai eficiente celule T helper sunt cunoscute ca celule TH2, care produc citokinele IL4 şi IL5. Celulele CD4 sunt importante pentru recunoaşterea peptidelor antigenice legate la moleculele MHC de clasa aII-a. Acţionează ca şi co-receptori prin legarea la partea laterală a moleculelor MHC de clasa aII-a.

Celulele T CD8: sunt celule T care poartă co-receptorul CD8. Aceste celule recunosc antigenele, de exemplu antigenele virale, care sunt sintetizate în citoplasma celulei. Peptidele derivate din aceste antigene sunt transportate de către TAP, asamblate cu molecule MHC de clasa I în reticulul endoplasmatic şi expuse ca complexe peptide MHC de clasa I pe suprafaţa celulară. Celulele T CD8 se diferenţiază în celule T CD8 citotoxice.

Centimorgan: unitate de măsură a distanţei dintre două locusuri în linkage, stabilită prin frecvenţa recombinărilor între

104

locusuri. Este egal cu o frecvenţă de recombinare de 1% între locusuri. Are simbolul cM. Unitate de recombinare.

Centromer: punct de unire a cromatidelor. La om secvenţele centromerice sunt diferite.

Chimera: coexistenţa la nivelul unui singur individ sau la nivelul ţesuturilor sau celulelor a două genotipuri diferite. De exemplu, primitorul unui transplant de maduvă de la un individ genetic diferit are celulele sanguine de origine ale donatorului ca şi celulele autologe. Termenul provine din mitologia greacă, reflectând un monstru cu un cap de leu, un corp de capră şi coada unui dragon.

Citokine: polipetide secretate care afectează funcţia altor celule. Citokinele sunt importante pentru interacţiunile celulare din cadrul răspunsului imun. Citokinele produse de fagocitele mononucleare se numesc monokine; cele produse de limfocite se numesc limfokine.

Cod genetic: triplete de baze din ADN şi ARN care poartă informaţia genetică, necesară sintezei proteinelor. Este un veritabil dicţionar care permite trecerea de la un grup de 3 nucleotide (triplet sau codon) la un aminoacid specific.

Codon: secvenţe a trei nucleotide mARN, care codifică un aminoacid specific.

Codon ambiguu: care codifică mai mulţi aminoacizi cu sens greşit (missens)şi care în urma unei mutaţii devine un codon terminator al sintezei lanţului polipeptidic.

Codon iniţiator: unul dintre cei 2 codoni AUG sau GUG care marchează începutul sintezei proteice.

Codoni sinonimi: care codifică acelaşi aminoacid.

Codoni terminatori: care anunţă terminarea sintezei proteinelor. Când ribozomii ajung în dreptul lor, sinteza se opreşte şi lanţul polipeptidic este eliminat.

Conversie genică: înlocuire a materialului genetic de pe un sit particular al unei cromatide, de către materialul genetic situat pe un punct exact corespunzător, de pe o cromatidă ne-

105

soră; este o formă particulară de recombinare, care explică apariţia unor anomalii de segregări.

CREGs: Cross reactive groups (grupuri care reacţionează încrucişat) epitopi publici care sunt responsabili pentru crossreactivitatea serologică bine cunoscută care este observată între aloantiserurile HLA. Modelul crossreactivităţii serologice a antiserurilor HLA au fost utilizate pentru a categorisi genele HLA de clasa I în grupuri majore crossreactive sau CREGs. Baza moleculară a crossreactivităţii serologice este existenţa concomitentă, diferenţiată a epitopilor publici la nivelul mai multor gene HLA.

Cromatină: complexul de ADN, histone, proteine nehistonice şi puţin ARN care compune cromozomul.

Cromozom: purtătorul informaţiei genetice.

Crossing-over: încrucişare, schimb de material genetic între cromatidele cromozomilor omologi.

Crossmatch: test care evidenţiază anticorpi direcţionaţi faţă de antigenele HLA prezente la nivelul limfocitelor T ale donatorului (clasa I) sau la nivelul limfocitelor B ale donatorului (clasa a II-a) implicate în răspunsul imun; prin acest test se previne fenomenul de rejet în transplantul renal.

EFI: Federaţia Europeană de Imunogenetică

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, este un test serologic în care un antigen sau un anticorp legat este detectat utilizând anticorpi cuplaţi cu o enzimă care converteşte un substrat incolor într-un produs colorat. Testul ELISA este larg folosit în biologie şi medicina ca şi în imunologie.

Epitop: determinant antigenic definit

Epitop privat: iniţial, un epitop privat a fost considerat a fi unic la nivelul unui singur produs genetic alelic. Astăzi prin epitop privat înţelegem epitopii care se află la nivelul unui grup limitat sau familii de alele strâns înrudite, cum sunt alelele A2 (A*0201-0229), sau alelele B39 (B*39 01011-*3915). Epitop de grup este un termen şi mai adecvat pentru a descrie

106

acest tip de epitop şi poate fi interschimbat cu termenul de “privat”.

.

Epitopi publici: există concomitent, diferenţiat între conglomeratele de gene HLA care în mod normal aparţin la grupuri diferite de gene, strâns înrudite, de exemplu, existenţa concomitentă a epitopului public între A2 şi moleculele B57 sau 58.

Exon: secvenţă de nucleotide care codifică o secvenţă de aminoacizi specifici. În medie, ei sunt constituiţi din 100-300 de nucleotide. O genă este, astfel constituită din mai mulţi exoni separaţi prin introni, iar fiecare exon poate fi considerat un modul al unei proteine.

Expresie genică: manifestare fenotipică a unei gene specifice; este condiţionată de natura genei, dominantă sau recesivă, de interacţiunea cu alte gene, condiţiile de mediu, penetranţă şi expresivitate.

Fenotip: caracteristicile detectate ale unei celule sau organism; rezultă din interacţiunile genotipului cu mediul.

Genă: informaţia nucleotidă care asigură sinteza unei secvenţe de aminoacizi şi care ocupă un locus specific.

Genom: set haploid de cromozomi. Totalitate a variantelor genetice de pe un locus dat. Dacă pe un locus se găsesc n alele, atunci pot exista n homozigoţi şi n(n-1)/2 heterozigoţi. Numărul total al genotipurilor de pe acelaşi locus este egal cu n(n+1)/2. Genomul uman conţine 6,4 x 10-10 g ADN, echivalentul a 5800 de milioane de baze, în timp ce al Escherichia Coli are numai 4 milioane. Nucleul diploid uman include 6 milioane de gene.

Genotip: constituţia genetică a unui organism.

Haplotip: setul de alele HLA găsit pe un cromozom.

Histocompatibilitate: identitate la nivelul moleculelor de histocompatibilitate de clasa I şi clasa a II-a. Termenul este folosit în sens operaţional însemnând similaritate suficientă

107

între moleculele HLA ale donatorului şi primitorului, în transplantul de organe.

HLA: antigene leucocitare umane sau “leucocite de histocompatibilitate”.

Imunogenetică: ramura a geneticii care studiază complexitatea proceselor ce asigură apărarea şi integritatea organismului, în ipoteza în care în organism pătrund antigene străine; controlul genetic al imunoglobulinelor, deficienţele condiţionate genetic, răspunsul imun, imunitatea celulară etc, variabilitatea genelor implicate în acest proces (ABO, Rh, HLA) precum şi tulburările autoimune; imunogenetica a descoperit complexul major de histocompatibilitate, a reuşit să cartografieze regiunea cromozomială 6 pe care este situat acest sistem, a elucidat structura anticorpilor (imunoglobulinelor), a explicat fenomenele de compatibilitate şi incompatibilitate, a precizat existenţa asociaţiilor dintre genele sistemului HLA şi diverse tulburări.

Interleukinele: sunt citokine secretate în principal de celulele mononucleare (limfocitele şi fagocitele mononucleare) care induc creşterea şi diferenţierea limfocitelor şi a celulelor stem hematopoietice pluripotente.

Intron: secvenţă de 100-1000 nucleotide situată în afara sau în interiorul genei care separă exonii (secvenţele de nucleotide ADN care sunt transcrise) şi sunt prezente în mARN. Toţi intronii studiaţi până acum încep cu secvenţe GT şi se termină cu secvenţele AG. Uneori, secvenţele de început şi de sfârşit se repetă de numeroase ori. Intronii coordonează sinteza proteinelor şi diminuează frecvenţa mutaţiilor survenite în cursul recombinării.

Izogrefă: când un organ se transplantează între indivizi ai aceleiaşi specii, cu configuraţie antigenică identică (gemeni monozigoţi).

Linkage: asociere a două sau mai multe gene nealele în aşa fel încât se transmit ca o singură unitate dacă nu intervine fenomenul de crossing-over.

108

Linkage disequilibrium : legătură dezechilibrată – tendinţă a unor alele situate pe locusuri diferite de a apărea împreună pe acelaşi cromozom sau haplotip, într-o secvenţă mai mare decât cea aşteptată teoretic.

MHC: complexul major de histocompatibilitate: regiune cromozomială formată din locusurile care au rol fundamental în procesele imune. La om MHC este sistemul HLA, omolog cu complexul H2, la şoarece.

Microarray: tehnologie cu microcipuri, care are ca principiu de bază hibridizarea complementară a secvenţelor simplu spiralate ale acizilor nucleici. În genetica cancerului, ADN microarray este creată prin plasarea diferitelor ADN-uri pe un mic fragment al unui microcip, folosindu-le apoi, pentru a evalua expresia ARN în celulele normale sau maligne.

Mutaţie: modificare permanentă şi transmisibilă a structurii şi implicit a funcţiei unei gene. De obicei, termenul de mutaţie se referă la o singură genă. Prin lărgirea conceptului, în categoria mutaţiilor au fost incluse modificările numerice şi structurale ale cromozomilor, precum şi modificările numerice ale genomului (poliploidia).

Neopterina: pteridină serică secretată de macrofag; valorile serice crescute ale neopterinei reprezintă expresia activării răspunsului imun celular.

Polimorfism: înseamnă existenţa într-o varietate de forme diferite. Polimorfismul genetic este variabilitatea de la nivelul locusului genei în care se produc variante genice la o frecvenţă mai mare de 1%. Complexul major de histocompatibilitate (MHC) este cel mai polimorf conglomerat de gene cunoscut la om.

Prezentarea antigenică: descrie antigenul ca fragmente peptidice legate la moleculele MHC pe suprafaţa unei celule. Celulele T recunosc antigenul când este prezentat în acest fel.

Procesarea antigenică: este degradarea proteinelor în peptide care se pot lega la moleculele MHC pentru prezentare la celulele T. Toate antigenele, cu excepţia peptidelor, trebuie

109

să fie procesate în peptide înainte de a putea fi prezentate de către moleculele MHC.

Rejetul grefei: reacţie imunologică direcţionată faţă de moleculele de histocompatibilitate din grefă care conduce la eliminarea sau rejetul grefei.

RT-PCR: reacţie de amplificare genică folosită pentru a amplifica secvenţele ARN. Enzima revers-transcriptaza (RT) este folosită pentru a converti secvenţa ARN într-o secvenţă de ADN complementar (cADN), care este apoi amplificată prin PCR.

Segregare: separare a cromozomilor omologi în meioză, implicit, separarea şi migrarea în gameţi diferiţi a celor 2 membri ai oricărei perechi de alele. În acest fel se disociază şi caracterele materne şi paterne. Este prima lege a lui Mendel, legea segregării genelor.

Sistemul complement: este un set de proteine plasmatice care reacţionează împreună pentru a ataca formele extracelulare ale patogenilor.

Sistemul grupelor sanguine ABO: antigene care sunt exprimate pe eritocite. Ele sunt folosite pentru tipizarea sângelui uman pentru transfuzii. Indivizii care nu exprimă antigenele A sau B pe eritrocitele lor, în mod natural formează anticorpi care interacţionează cu acestea.

Sit: “pozitie”, “localizare”; 1. Cea mai mică unitate a unei gene care poate suferi o mutaţie. 2. Secvenţă de nucleotide recunoscută specific de anumite proteine.

Tapasin (TAP – associated protein): este o moleculă cheie în asamblarea moleculelor MHC de clasa I; o celulă deficientă în această proteină are numai molecule MHC de clasa I instabile pe suprafaţa celulară. TAP1 şi TAP2 (“transporters associated with antigen processing”) sunt proteine – casetă care leagă ATP, implicate în transportul peptidelor scurte din citosol în lumenul reticulului endoplasmatic, unde se asociează cu moleculele MHC de clasa I.

110

TCR (“T-cell receptor”): receptorul celulei T este al lanţurilor înalt variabile şi heterodimer legate disulfidic, exprimate de membrana celulară ca un complex cu lanţurile CD3 permanente. Celulele T care poartă acest tip de receptor frecvent denumite celule T .

Telomer: cromomer terminal situat la extremităţile cromozomilor care au rolul de a împiedica fuziunea cromozomilor intacţi.

Xenogrefa: este transplantul de organe între specii diferite

(de exemplu: de la porc sau de la babuin la om).

111

112