Massispektromeetria

• Massispektromeetria on analüütiline meetod, mida kasutatakse ioonide massi/laengu suhte mõõtmiseks

• Kasutatakse, et leida proovi koostist

Massispektromeeter

• Põhimõtteline skeem:

Proov

ionisatsioon Kiirendamine mg.väljas

detektor registraator

Massispektromeetria põhimõte

• Erinevad osakesed eralduvad lähtuvalt nende laengu ja massi suhtest:

a=F/m• Kus a on kiirendus, F osakesele avaldatav jõud

(n. elektrivälja tugevus) ja m on osakese mass. • See valem kirjeldab osakeste liikumist/jaotumist

massispektromeetris juhul kui kõikide lahutatavate osakeste laeng on võrdne.

Massispektromeetriline analüüs. Eralduspõhimõte

• Ühendite massispektromeetrilise analüüsi aluseks on asjaolu, et erinevatel keemilistel ühenditel on erinevad aatommassid

• massispektromeetrilise analüüsi esimeses faasis aurustatakse ja ioniseeritakse analüüsitav aine või pigem selle komponendid (NaCl)

• Seega on uuritava aine komponentidel nüüd laeng, mis tähendab, et neid saab kontrollida elektri – või magnetvälja abil

Massispektromeetriline analüüs. Lühikirjeldus

• Ioonid saadetakse läbi kitsa pilu kiirenduskambrisse • Kiirenduskambrile rakendatakse magnetväli, mis on risti elektrivälja

suunaga ning mõjutab ioonide liikumist elektriväljas• Molekulide liikumistee ei ole sirge ning nende sorteerimine toimub

massi järgi (väikesed kalduvad liiga palju ja suured liiga vähe lennuteest kõrvale)

• Newtoni teise seaduse järgi on osakese kiirendus pöördvõrdeline tema massiga. Nii suudab ka magnetväli kallutada kergemaid ioone nende trajektoorist rohkem kõrvale kui raskemaid.

• Detektor mõõdab kui kaugele mingi ioon on oma algsest trajektoorist kallutatud ning viib selle sõltuvusse iooni massi/laengu suhtega.

• MS-e on palju eri tüüpe, mis mitte ainult ei analüüsi ioone erinevalt vaid ka produtseerivad erinevat tüüpi ioone. Kuid kõik MS-d kasutavad elektro-magnetvälja, et muuta ioonide trajektoore.

Ioonide allikas

• Ioonide allikas on see osa MS-st, mis ioniseerib analüüsitavat proovi. Seejärel transporditakse ioonid elektri- ja/või magnetvälja abil massi-analüüserisse.

• Ionisatsioonitehnikaid on palju erinevaid ja just need määravad, millist tüüpi proove saab analüüsida.

Ioonide allikas II

• Koosneb – Ioniseerimskambrist– Energiaallikast (elektronid, ioonid)– Soojusallikast (vältimaks proovi kondensatsiooni)– Kiirendi (andmaks soovitud kineetilist energiat). – Kiirenduse energia (pinge) sõltub analüsaatorist – kV-

d TOF-i ja V-d kvadrupoli puhul.– Väljundpilu

Ioonide allikas III

• Nõuded ioonide allikale:– Suure efektiivsusega (ioniseerimisprotsent

kõrge)– Annab stabiilse ioonide voo– Võimalikult madal taustsignaal– Põhjustama võimalikult vähe saastumist

proovide vahel.

Peamised ionisatsiooni tüübid

• Elektronlöök

• Keemiline ionisatsioon

• Desorptsioon-ionisatsioon:– Kiirete aatomitega pommitamine (FAB)– Sekundaarse iooni MS (SIMS)– Plasma desorptsioon– Maatriks-assisteeritud-laser-desorptsioon-ionisatsioon

(MALDI)– Elektronpihusti ionisatsioon (ESI)

Elektronlöögi ionisatsioon (EI)

• EI protsessis pommitatakse aurufaasis olevaid molekule elektronide vooga.

• Tekib positiivne molekulaarne ioon

• Ionisatsiooni toimumiseks peab elektronide voo energia ületama proovi molekulide ionisatsioonienergia. Klassikaliselt kasutatakse 70 eV. 70 eV juures ei mõjuta elektronide energia variatsioonid proovi ioniseerimist ja fragmenteerimist.

• Elektronide saamiseks kuumutatakse peenikest reeniumtraati (katoodi).

• Anood asub teisel pool ionisatsioonikambrit ning kasutamata elektronid püütakse seal kinni.

EI II

• Suure energiaga elektronid pommitavad aine molekule ja ioniseerivad nad

• Kasutatakse gaaside ja aurude analüüsil

• Paljude ainete puhul osutub liiga “karmiks” – põhjustab valdava fragmenteerumise, mille tõttu aine molekulaarset iooni ei pruugi detekteerida

Keemiline ionisatsioon (KI)

• Keemilise ionisatsiooni puhul toimub analüüsitavate molekulide ioniseerimine keemilise reaktsiooni kaudu, mis toimub molekulide ja ioniseeritud gaasi osakeste kokkupõrke teel.

• Keemiline ionisatsioon on “pehme” ionisatsiooni meetod

Keemiline ionisatsioon II

• Ioonide allikas KI puhul on sarnane EI omale.

• Viimane peab olema muudetud gaasilekke suhtes tihedaks.

• Elektronide energia on suurem (500 eV)

• Pumbad vaakumi tekitamiseks on võimsamad.

Keemiline ionisatsioon III• KI koosneb põhimõtteliselt kolmest etapist:

– Reagent-gaas ioniseeritakse suure energiaga elektronidega pommitades

– Tekkivad stabiilsed reagent-gaasi ioonid– Stabiilsed reagent-gaasi ioonid reageerivad proovi molekulidega.

• Proovi molekulide ioniseerimine toimub paljude erinevate ioon-molekul reaktsioonide kaudu. Moodustuvad [M+H]+ioonid.

• Kui reagent-gaasina kasutatakse metanooli, siis toimub reaktsioon juhul kui uuritava molekuli afiinsus prootoni suhtes on suurem kui metaanil.

• Reagent-gaasidena kasutatakse ka isobutaani ja ammoniaaki.• Reagent-gaasi valik mõjutab proovi fragmenteerumise määra.• KI võimaldab tekitada/analüüsida nii negatiivseid kui positiivseid

ioone.• Negatiivse iooni reziimi kasutatakse sageli halogeene sisaldavate

ühendite puhul

Näide KI protsessist

Metaan (CH4) on reagent-gaas. Positiivse iooni reziim.

I etapp: reagent-gaasi ionisatsioon

CH4 + e- = CH4+• +2e- (+ CH3

+ jt)

II etapp: stabiilsete reagent-ioonide teke

CH4 + CH4+• = CH5

+ + CH3•

CH4 + CH3+ = C2H5

+ + H2

III etapp: proovi molekulide ioniseerimine

M + CH5 + = [M + H]+ + CH4

M + CH5 + = [M + CH5]+

M + C2H5+ = [M + C2H5]+ jne

Keemiline ionisatsioon IV

• Keemilises ioonisatsiooni tagajärjel tekkinud ioonid on märksa stabiilsemad kui EI protsessis tekkinud ioonid, kuna:– Ioniseerumine toimub soojusliikumisest

põhjustatud kokkupõrkumiste tagajärjel– Tekkinud ioonide energia antakse kiiresti üle

neutraalsetele gaasimolekulidele– Tekkinud ioonidel on paarisarv elektrone ning

nad on seetõttu vähem reaktiivsed.

EI vs KI

• EI annab informatsiooni fragmentatsiooni kohta. On “karmim” meetod.

• KI eesmärk on tavaliselt saada teada molekulmass

• EI võimaldab töötada ainult positiivse iooni reziimis.

• Mõlemad meetodid nõuavad proovi viimist gaasifaasi ja mõlema puhul on molekulmassi piir u. 1000 Da.

Desorptsioon-ionisatsioon I

• Desorptsioon-ionisatsiooni tehnikate puhul pommitatakse ainet mingite suure energiaga osakestega (aatomite, ioonide, footonite jms) – nii saavutatakse uuritavate molekulide desorptsioon proovist ning samaaegselt ka ionisatsioon.

• Desorptsioon-ionisatsiooni meetodid võimaldavad kasutada MS-i ka suurte mittelenduvate ja “habraste” molekulide puhul (M > 100,000 Da).

Desorptsioon-ionisatsioon II

• Vedelate ja tahkete bioloogiliste proovide puhul kasutatakse sageli elektronpihusti ionisatsiooni (ESI, electronspray ionisation) või MALDI -t.

• Metallide analüüsil kasutatakse eelkõike induktiivselt seotud plasmat (ICP).

Välja desorptsiooni ionisatsioon (Field desorption, FD)

• Esimene tõsine katse (Beckey, 1969) ioniseerida mittelenduvaid, termiliselt labiilseid ühendeid.

• Proov asetatakse peemikestele metallist mikronõelu meenutavatele struktuuridele.

• Viimastele rakendatakse kõrge elektriväli, mis põhjustab proovi molekulide üleminekut gaasifaasi.

Elektronpihusti ionisatsioon (ESI)

• Desorptsioon-ionisatsiooni tehnikate arenedes otsiti võimalusi suuremate molekulide analüüsiks.

• ESI tehnika pakkus lahenduseks ionisatsiooni, mille käigus analüüsitav molekul saab rohkem kui ühe laengu.

• Tänapäeval võimaldab tavaline ESI massispektromeeter (n. m/z ulatus 2000 – 4000 analüüsida suure molekulmassiga valke (M > 1000000) lisades ühele molekulile 20-40 laengut.

• ESI peamised kasutusalad on bioloogia- ja farmaatsiaalased analüüsid.

ESI II• Kontseptsioon: Malcolm Dole, 1968• Tänapäevane (edukas) versioon): John Fenn (Nobeli preemia keemias,

2002)

• Sobivas lahustis lahustatud proov juhitakse ionisatsioonikambrisse läbi teraskapillaari, millele on rakendatud pinge (3-4 kV)

• Pingete erinevuse tõttu kapillaari otsa ja vastaselektroodi vahel tekib elektriväli, mis lõhub proovi lahuse laetud tilgakesteks.

• Tilgakestele suunatakse kuuma lämmastiku voog, mis sunnib lahustit aurustuma.

• Optimaalne vedeliku voolukiirus ESI-s on vahemikus 2- 10 L.• Lahustiks on tavaliselt vee ja atsetonitriili segu koos väikese hulga

orgaanilise happega• ESI (nagu enamus uuemaid ionisatsioonimeetodeid) võib toimuda positiivse

või negatiivse iooni reziimis.• Analüsaatoritest sobib ESI kõige paremini kokku kvadrupoliga.

ESI mehhanism• Võib eristada kolme protsessi:

– Tilga moodustumine– Tilga kokkutõmbumine– Ioonide desorptsioon gaasifaasi

• Positiivse iooni reziimis kontsentreeruvad katioonid metallkapillaari otsal ja on tõmmatud vastaselektroodi poole (elektrivälja mõju).

• Samal ajal hoiab neid tagasi vedeliku pindpinevus.

• Kapillaari otsa tekib Taylori koonus, millest piisavalt suure pinge juures eralduvad pisikesed vedelikutilgad.

Taylori koonuse teke

• Kui väike kogus elektrit juhtivat vedelikku panna elektrivälja, siis ei ole tilga kuju mõjutatud ainult vedeliku pindpinevusest.

• Pinge suurenedes (kui elektrivälja mõju ja pindpinevus on jõult ligilähedased) omandab tilk ümaraotsalise koonuse kuju.

• Teatud piirpinge juures eraldub koonuse ümar ots tilgana.

• Tilga eraldumine ongi elektropihustud (ESI) protsessi algus – vedelik hakkab üle minema gaasifaasi.

ESI mehhanism II• Tekkivate tilkade suurus on mõjustatud väga mitmetest faktoritest (solvendi

voolukiirus, rakendatud pinge, kapillaari läbimõõt jms.)• Solvendi aurustumine viib tilkade suuruse vähenemiseni• Mida väiksemaks muutub tilk, seda lähemale tulevad üksteisele

ühenimeliste laengutega osakesed.• Kui tilgakeste pinnanlaeng ületab Rayleigh ebastabiilsuse piiri, siis tilgad

lõhustuvad.• Solvendi edasine aurustumine viib Coulombi lõhenemiseni.• Protsess kordub kuni analüüsitavad molekulid on solvendist vabad.• Ioonide desorptsiooni täpse mehhanismi üle ei ole täielikule üksmeelele

jõutud.• Üks levinud hüpotees on, et lõhustumine toimub kuni jääb ainult üks paljude

laengutega molekul.

• ESI on väga tundlik meetod. Tema puuduseks on tulemuse sõltuvus väga paljudest faktoritest.

MALDI

• MALDI = matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectroscopy

• Massispektroskoopia oli algselt kasutusel ainult kergesti lenduvate molekulide analüüsil.

• MALDI võimaldab analüüsida ka valke ja polümeere

MALDI analüüs

• Proov lahustatakse ning sellele lisatakse spetsiaalne komponent – maatriks (trans-kaneelhape, 2,5-dihüdroksobensoehape) – millel on võime neelata UV-kiirgust.

• Segu asetatakse õhukindlasse ruumi ja ruumile rakendatakse vaakum. Proovi solvent aurustub ja prooviplaadile jääb õhuke kile maatriksist ja uuritavast ainest.

• Segu pommitatakse laserkiirega. Tänu maatriksile on see võimeline neelama palju energiat, millest osa kandub üle uuritavale proovile.

• Maatriks reageerib ka uuritava segu molekulidega, nii et need omandavad laengu.

• Madala rõhu, kõrgendatud temperatuuri ja neeldunud energia tulemusena valgud ja polümeerid aurustuvad ja on seetõttu analüüsitavad massispektromeetriga.

Uued ionisatsioonimeetodid

• Desorptsioon - Elektronpihusti ionisatsioon (Desorption Electrospray Ionization, DESI) – Proov asetatakse väljapoole MS vaakumit ja seda pommitatakse

laetud mikrotilkadega ning juhitakse siis massispektromeetrisse.

• Otseanalüüs Reaalajas (Direct analysis in real time, DART)– Siin kasutatakse ioniseerimiseks metastabiilseid heeliumi või

lämmastiku aatomeid

• Mõlemal juhul saab– Proovi ilma mingi ettevalmistuseta analüüsida.– Analüüsida saab tahkeid aineid

Küsimused ionisatsiooni kohta

• Miks on vaja molekulid viia ioonsele kujule?

• Milliseid ionisatsiooni meetodeid saab kasutada negatiivsete ioonide tekitamiseks?

• Millise lahutusmeetodiga EI sobib hästi kokku?

Massianalüsaator I

• Massianalüsaatorid eraldavad ioone nende massi/laengu suhte järgi.

• Kõik massispektromeetrilised analüüsid põhinevad laetud osakeste liikumisele vaakumis elektri-magnetvälja mõjul, kusjuures kehtivad kaks järgmist seaduspära

Lorentzi jõu seadus :

jaNewtoni teine seadus:

• Kus F on ioonile rakendatud jõud, m on iooni mass, a on kiirendus, q on iooni laeng, E on elektrivälja tugevus, ja v x B on iooni kiiruse ja magnetvälja vektorite ristprodukt (ortogonaalne mõlema vektoriga).

Massianalüsaator II• Võrdsustame mõlema võrrandi paremad pooled:

• Saadud võrrand kujutab endast laetud osakeste liikumist kirjeldavat klassikalist valemit. Koos osakeste algtingimustega määrab see osakeste liikumise ajas ja ruumis ja moodustab vundamendi iga massispektromeetri jaoks.

• Seosest järeldub, et kaks ühesuguse massi/laengu suhtega osakest käituvad täpselt ühtemoodi.

• Seega mõõdavad kõik massispektromeetrid suhet m/q• Massianalüsaatoreid on palju kuid nende kõigi tööprintsiibid

põhinevad eelmainitud seadusele. Igal analüsaatoril on oma plussid ja miinused. Mõnikord kasutatakse rohkem kui ühte analüsaatorit.

Levinumad massianalüsaatorid• Lennuaja analüsaator (TOF, Time-of-flight)

TOF kasutab elektrivälja ioonide kiirendamiseks ja mõõdab aega, mis neil ioonidel kulub detektorini jõudmiseks. Sama laenguga osakestel on võrdsed ka kineetilised energiad ning nende liikumiskiirus sõltub ainult nende massist. Kergemad ioonid jõuavad kiiremini detektorisse. TOF võimaldab nii suurt tundlikkust kui kiireid analüüse.

• Kvadropol (Quadrupole)Kvadropol analüsaatorid kasutavad ostsilleerivaid elektrivälju, et selektiivselt stabiliseerida või destabiliseerida raadiosagedusega kvadropoli välja läbivaid ioone. Kvadropol massianalüsaator toimib nagu massiselektiivne filter ja on tihedalt seotud kvadropol ioonilõksu (quadropole ion trap) analüsaatoriga.

• Kvadropol ioonilõksu analüsaator (Quadrupole ion trap)Kvadropol ioonilõksu analüsaator töötab põhimõtteliselt samamoodi kui kvadrupol MS, ainult et analüüsitavad ioonid püütakse kinni ja lastakse siis järk-järgult lahti. Teiste sõnadega ioone säilitatakse järgnevate analüüside jaoks.

• Fourier analüsaator (Fourier transform ion cyclotron resonance or Fourier transform mass spectrometry (FTMS))FTMS mõõdab osakeste massi nii, et detekteerib ringlevate ioonide poolt tekitatud voolu. Iooni ringlemise sagedus sõltub tema massi/laengu suhtest ning seda saab dekonvulteerida kasutades Fourier transformatsiooni. FTMS on väga tundlik ja suure lahutusvõimega

Kvadropol

• Sellel analüsaatoril on 4 paralleelset metallvarba, milledele on üheaegselt rakendatud konstantne ja raadiosagedusega elektriväli.

• Erinevad ioonid liiguvad sellises elektriväljas erinevalt ning sorteeritakse oma liikumise alusel.

• Ioonide segu saab skaneerida muutes süstemaatiliselt elektriväljade tugevust ning lubades seega läbi analüsaatori ainult väljavalitud m/z suhtega ioonid.

• Kvadropol-analüsaatorid ei ole väga suure lahutusvõimega, kuid neid on kerge ühendada erinevate ioonide allikatega ning nad on suhteliselt odavad.

Detektor

• Massispektromeetri viimane komponent on detektor.• Detektori ülesanne on salvestada laeng või vool, mis

tekib kui ioon läbib detektori või põrkub vastu selle pinda.• Massispektromeetrilise analüüsi väljundiks on

massispekter, mille x-teljel on massi/laengu suhted (või massid) ning y-teljel ioonide suhteline intensiivsus.

• Detektoritena kasutatakse tavaliselt elektronkordisteid. Kuna detektorisse jõudev ioonide arv on tavaliselt üsna väike, siis on signaali saamiseks enamasti vajalik märkimisväärne võimendus.

Ühendatud (kombineeritud, i.k. hyphenated) MS

• Gaasikromatograafia-massispektromeetria

• Vedelikkromatograafia-massispektromeetria

• Tandem MS (MS/MS)

MS/MS

• Tandemmassispektromeetrias kasutatakse mitmekordset masside selekteerimist või analüüsi.

• selektsioonid/analüüsid on enamasti üksteisest eraldatud eri fragmentatsiooni vormide põhjal.

• MS/MS sisaldab sageli mitut tüüpi analüsaatorit: – üks analüsaator eraldab näiteks ühe peptiidi paljude

massispektromeetrisse süstitute hulgast, – teine analüsaator stabiliseerib peptiidi ioone ajal kui need gaasi

molekulidega kokku põrkuvad põhjustades sellega „kokkupõrkest indutseeritud dissotsiatsiooni” (collision-induced dissociation, CID),

– kolmas analüsaator kataloogib peptiidide fragmendid. • MS/MS võib sisaldada ka ainult ühte tüüpi analüsaatorit kuid

teostada skaneerimist ajast sõltuvalt nagu kvadrupol ioonilõks.• MS/MS tähtis rakendus on valkude identifitseerimine.

Tulemused ja nende analüüs

• MS võib produtseerida erinevat tüüpi andmeid, levinuim on kindlasti massispekter. Mõningat tüüpi MS tulemused on kõige paremini esitatavad massikromatogrammi kujul.

• Massispektromeetria tulemused võivad olla esitatud ka kontuurkaartidena massi/laengu suhtega ühel teljel, intensiivsusega teisel ning mingi lisaparameetriga (enamasti on selleks aeg) kolmandal.

• Analüüsitulemuste paremaks mõistmiseks on vaja osata vastata mõningatele küsimustele

Olulised küsimused/vastused MS analüüsi mõistmiseks

• Kas need tulemused on saadud positiivse või negatiivse iooni režiimis?

• On väga tähtis teada uuritava iooni laengut. Seda on sageli vaja osakese neutraalse massi määramiseks kuid see annab infot ka molekuli iseloomu kohta.

• Mis ioonide allikat on kasutatud?• See on väga oluline kuna erinevad ioonide allikad põhjustavad väga

erinevaid tulemusi. Elektronlöögi puhul on tulemuseks palju fragmente, enamasti ühelaengulisi. Elektronpihusti puhul saame sageli mitmelaengulised ioonid ning fragmentatsioon on palju väiksem.

Küsimused/vastused 2

• Kas tegemist on MS/MS spektriga?• Tandem massispektromertria puhul toodetakse näiteks teises etapis

nimme fragmente.

• Mis päritoluga on analüüsitav proov?• Sellele küsimusele vastamine annab infot võimalike

lisaainete kohta. Tööstuslikus produktis on tavaliselt mingid tootmisprotsessiga seotud saasteained. Bioloogilise proovi puhul võime eeldada teatava hulga soola olemasolu proovis.

Küsimused/vastused 3

• Milline oli proovi ettevalmistus?• Proove peab sageli analüüsiks ette valmistama. Näiteks MALDI

puhul on väga oluline, millist ainet (aineid) kasutati MALDI maatriksina. Viimane avaldab desorptsiooni-ionisatsiooniprotsessile rohkem mõju kui laseri võimsus.

• Mis on analüüsi eesmärk?• Massispektromeetria võib anda vastuseid mitmetele küsimustele:

millised on analüüsitavate molekulide massid, kui puhas on proov, milline on uuritavate molekulide struktuur. Iga erineva eesmärgi puhul tuleb valida erinev lähenemine.