marquages immunohistochimiques immunocytochimie...
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APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATIONNEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE
I - Immunocytochimie : généralités
II - Préparation des tissus
A - Fixation
B - Inclusion
III - Traceurs
IV - Microscopie de fluorescence
A - Microscopie de fluorescence conventionnelle
B - Microscopie confocale à balayage laser
V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence
VI - Microscopie électronique
A - Microscopie électronique en transmission
B - Techniques de marquages en microscopie électronique
C - Applications aux marquages multiples
IMMUNOCYTOCHIMIE
Technique directe Technique indirecte
Anticorps
Traceur
Antigène
Tissu
Marquages immunohistochimiques
Test de spécificité par compétition
Sensibilité
Ac I
Ac II
Traceur 2Traceur 1
Marquages multiples
Marquages multiples
- Spécificité respective des anticorps et des méthodes de révélation
- Absence de réactions croisées
Spécificité
- Sensibilité respective des anticorps, des réactifs et des systèmes de révélation
- Limitations liées au masquage potentiel de sites antigéniques par le premier systèmede révélation
- Limitations liées à l encombrement stérique (cas de la détection d antigènes colocalisés au sein d un même élément cellulaire)
Sensibilité
APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATIONNEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE
I - Immunocytochimie : généralités
II - Préparation des tissus
A - Fixation
B - Inclusion
III - Traceurs
IV - Microscopie de fluorescence
A - Microscopie de fluorescence conventionnelle
B - Microscopie confocale à balayage laser
V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence
VI - Microscopie électronique
A - Microscopie électronique en transmission
B - Techniques de marquages en microscopie électronique
C - Applications aux marquages multiples
Fixation des tissus
Finalité:- Immobiliser les molécules in situ (antigènes)- Préserver l aspect (ultra)structural du tissu
Inconvénients:- Modification des antigènes pouvant changer leur affinité pour lesanticorps- Réticulation du tissu freinant ou empêchant la diffusion des réactifs
Choix du fixateur:- Selon le type d observation envisagée (m. optique ou électronique)- Selon les structures à préserver- Selon les molécules à immobiliser
Compromis
Principaux fixateurs
Déshydratants alcools, acétone, lyophilisation
Agents précipitants acide picrique, acide acétique
Agents de pontage chimique formaldéhyde, glutaraldéhyde, acroléine
Acide tannique
Tétroxyde d osmium (acide osmique)
Principaux fixateurs
Fixateurs aldéhydiques
Réagissent essentiellementavec les groupements aminésdes protéines
Tétroxyde d osmium (acide osmique)
Réagit principalement sur les doubles liaisons insaturéesdes lipides. Indispensable pour une bonne préservation desmembranes en microscopie électronique.
Utilisé en post-fixation après la fixation aldéhydique
Action des fixateurs sur les tissus
Inclusion
Résines époxy (hydrophobes) Epon, Araldite, Spurr
Résines acryliques (généralement hydrophiles) LR-White, Lowicryl, Métacrylates
Les monomères époxy forment un réseau depolymères branchés en présence de diamines
- Peuvent polymériser à basse température sous UV- Un peu instables sous le faisceau d électrons- Moins ramifiées et plus poreuses- N établissent pas de liaisons covalentes avec les constituants cellulaires- Perméables après polymérisation- Faible viscosité- Dureté un peu irrégulière (coupe plus difficile)
- Polymérisation à chaud (60°C)- Stables sous le faisceau d électrons- Préservation optimale des détails ultrastructuraux- Viscosité élevée- Imperméables après polymérisation- Bonne dureté pour la coupe
APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATIONNEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE
I - Immunocytochimie : généralités
II - Préparation des tissus
A - Fixation
B - Inclusion
III - Traceurs
IV - Microscopie de fluorescence
A - Microscopie de fluorescence conventionnelle
B - Microscopie confocale à balayage laser
V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence
VI - Microscopie électronique
A - Microscopie électronique en transmission
B - Techniques de marquages en microscopie électronique
C - Applications aux marquages multiples
Traceurs fluorescents
Fluorescéine (vert)
Rhodamine (rouge)
Texas red (rouge)
Phycoérythrine B et R (rouge)
Cyanines (vert à infrarouge)
Alexa (bleu à infrarouge)
Fluorescence
Absorption Émission
e1=h/ 1e2=h/ 2
e1 > e2
1 < 2
orbital basse(état de repos)
orbital haute(état excité)
noyau noyau
Excités par le rayonnement d une lampe à vapeurs de mercure ou d unlaser, les fluorochromes émettent une lumière de plus grande longueurd onde que la lumière d excitation
Principaux fluorochromes
Principales sources d excitation
Propriétés ondulatoires de la lumière
Autres traceurs
Enzymatiques
Peroxydase Phosphatase alcaline Glucose oxydase
Particulaires
Ferritine (10nm) Or colloïdal (1nm à 20nm)
Radioactifs
Tritium (3H) Iode (125I)
Révélation photographique(radioautograhie sur film ou sur émulsion nucléaire selon leniveau de résolution souhaité)
Révélation à l aide d un substrat et d un chromogène(peroxydase : H2O2 + 3,3 -diaminobenzidine)
Visualisation directe ou aprèsintensification à l argent(or colloïdal, selon la taille des particules)
APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATIONNEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE
I - Immunocytochimie : généralités
II - Préparation des tissus
A - Fixation
B - Inclusion
III - Traceurs
IV - Microscopie de fluorescence
A - Microscopie de fluorescence conventionnelle
B - Microscopie confocale à balayage laser
V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence
VI - Microscopie électronique
A - Microscopie électronique en transmission
B - Techniques de marquages en microscopie électronique
C - Applications aux marquages multiples
Microscope à fluorescence conventionnel
Principe de fonctionnement du microscope confocal
Caractéristiques:Caractéristiques:
source d’illumination laser ponctuelleexcitation au point focal dans l’échantillonun diaphragme de détection
illumination
échantillonlame
lamelle
Conventionnel Confocal
laser
excitation
miroirdichroïque
diaphragmed’émission
lumière réfléchiehors focus
lumièreréfléchie
objectif
plan focaléchantillon
photomultiplicateur
diaphragme de détection"pinhole"
hors focus
Principe de la microscopie Principe de la microscopie confocaleconfocale
coupe optique (2D)coupe optique (2D)
Z-Série (3D)Z-Série (3D)
Time Time series series (4D)(4D)
t0 t1 ….tX
Y
Z
Microscopie Microscopie confocale confocale à balayage laserà balayage laser
Microscope Leica TCS SP2 avec AOTF et détection spectrale
Ensemble de sources laser : argon et hélium/néon
Laser pulsé femtoseconde Coherent Mira 9000 accordable
Centre de Microscopie et ImagerieCentre de Microscopie et ImagerieStation de microscopie Station de microscopie confocaleconfocale
APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATIONNEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE
I - Immunocytochimie : généralités
II - Préparation des tissus
A - Fixation
B - Inclusion
III - Traceurs
IV - Microscopie de fluorescence
A - Microscopie de fluorescence conventionnelle
B - Microscopie confocale à balayage laser
V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence
VI - Microscopie électronique
A - Microscopie électronique en transmission
B - Techniques de marquages en microscopie électronique
C - Applications aux marquages multiples
Lapin
Souris
Chèvre
Anticorps primaires d espèces différentesAnticorps secondaires de même espèce
Doubles marquages immunocytochimiques
Lapin Souris
Lapin(sérum non immun)
Chèvre
Lapin
Anticorps primaires d espèces différentesAnticorps secondaires d espèces différentes
Doubles marquages immunocytochimiques
Spectres d émission des fluorochromeset cross-talk
400 450 500 550 600 650 700 750 800
Longueur d’onde (nm)
0
20
40
60
80
100 Alexa-488 Alexa-546 Alexa-633
Cross-talk
Cross-talk : sélection du signal émisCross-talk : sélection du signal émis
400 450 500 550 600 650 700 750 800Longueur d’onde (nm)
0
20
40
60
80
100 Alexa-488 Alexa-546 Alexa-633
Filtres bande-passe
ZT02
CO
ZT18
CO
DM
VL
GFAP/VIP
Plasticité gliale dans le NSCPlasticité gliale dans le NSC
0,64 µm
Analysesemi-quantitative
Série Z
Innervation Innervation glutamatergique glutamatergique des neurones à VIPdes neurones à VIP du NSCdu NSC
Superposition
*
ZT02 ZT180.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0
30
60
90
120
150
180
1 11 21 31 41 51
distance (px)
gra
y l
ev
els
BassoonVIPvGlut1-2
Innervation Innervation glutamatergique glutamatergique des neurones à VIPdes neurones à VIP du NSC:du NSC:Analyse Analyse semi-quantitativesemi-quantitative
Guillaumond et al., J. Neurochem., 2007
VIP
P-ERK1/2
GRP
P-ERK1/2-
GRP
GRP/VIP
P-ERK1/2-
VIP/GRP
Expression neuronale de P-ERK1/2 dans le NSCExpression neuronale de P-ERK1/2 dans le NSC
Nuit
1 - VIP
3 - GRP
5 - GRP/VIP
2 - P-ERK1/2
6 - P-ERK1/2-
VIP/GRP
4 - P-ERK1/2-
GRP
VIP VIP/GRPGRP
AVP non identifiés
21%
15%64%
26%
20%
54%
Jour
ZT18
Distribution spatiale et temporelle de P-ERK1/2 dans le NSCDistribution spatiale et temporelle de P-ERK1/2 dans le NSC
Guillaumond et al., J. Neurochem., 2007
TP : Expression et colocalisation neuronale de marqueurs rythmiques:Triple marquage P-ERK1/2/VIP/GRP dans le NSC chez le rat
Protocole de marquage
Fixation par perfusion intra-cardiaque de paraformaldéhyde 4% Echantillonnage de l hypothalamus antérieur contenant le NSC sur coupes frontales de 50 µm (vibratome)
Jour 1: Rinçages dans un tampon Tris pH 7,5 (3X10 min) Préincubation dans du sérum normal de chèvre (NGS) 30% + Triton X-100 0,2% (15min) Anti-P-ERK1/2 (monoclonal souris) 1/200 dans Tris + NGS 1% (4°C, sous agitation)
Jour 2 : Rinçages Tris + NGS 1% (3X10 min) Chèvre anti-IgG de souris conjugué à Alexa-568 (1/200, 2h) Rinçages Tris + NGS 1% (3X10 min) Anti-VIP (polyclonal lapin) 1/1000 + Anti-GRP (polyclonal cobaye) 1/1000 dans Tris + NGS 1% (4°C, sous agitation)
Jour 3 : Rinçages Tris + NGS 1% (3X10 min) Chèvre anti-IgG de lapin conjugué à FITC (1/200) +
Chèvre anti-IgG de cobaye conjugué à Alexa-647 (1/200) (2h) Rinçages Tris (3X10min) Montages des coupes sur lames gélatinées dans un tampon phosphate glycériné
Conservation des coupes à -20°C
APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATIONNEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE
I - Immunocytochimie : généralités
II - Préparation des tissus
A - Fixation
B - Inclusion
III - Traceurs
IV - Microscopie de fluorescence
A - Microscopie de fluorescence conventionnelle
B - Microscopie confocale à balayage laser
V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence
VI - Microscopie électronique
A - Microscopie électronique en transmission
B - Techniques de marquages en microscopie électronique
C - Applications aux marquages multiples
Microscopie électroniqueen transmission
Centre de Microscopie et ImagerieCentre de Microscopie et ImagerieStation de microscopie électroniqueStation de microscopie électronique
Microscope électronique à transmission Philips CM 10
Centre de Microscopie et ImagerieCentre de Microscopie et ImagerieStation Station dd ultramicrotomieultramicrotomie
Ultramicrotome Reichert Ultracut S
Module d’ultracryotomie FCS
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I - Immunocytochimie : généralités
II - Préparation des tissus
A - Fixation
B - Inclusion
III - Traceurs
IV - Microscopie de fluorescence
A - Microscopie de fluorescence conventionnelle
B - Microscopie confocale à balayage laser
V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence
VI - Microscopie électronique
A - Microscopie électronique en transmission
B - Techniques de marquages en microscopie électronique
C - Applications aux marquages multiples
Techniques de marquage en neurobiologieappliquées à la microscopie électronique
RADIOAUTOGRAPHIE
Principe:Détection d un signal radioactif émispar le tissu à l aide d une émulsion« nucléaire » liquide
Techniques de marquage en neurobiologieappliquées à la microscopie électronique
Applications:
Renouvellement des constituantscellulaires
Etude du transport axonal
Traçage de voies nerveuses
RADIOAUTOGRAPHIE
Visualisation des sites de capture des monamines(terminaisons catécholaminergiques et sérotoninergiques)
Organe vasculaire de la lame terminale Noyau suprachiasmatique
Radioautographie après capture de (3H)-monoamines(microscopie optique)
(3H)5-HT
(3H)5-HT
(3H)DA
Radioautographie après capture de (3H)-sérotonine(microscopie électronique)
organe vasculaire de la lame terminale Noyau arqué
Techniques de marquage en neurobiologieappliquées à la microscopie électronique
IMMUNOCYTOCHIMIE
Principe:Détection d une substanced intérêt après application d unanticorps spécifique et révélationdes complexes antigènes-anticorps à l aide d un marqueur.
Les marqueurs
Enzymatiques
Peroxydase révélée par:
Diaminobenzidine Dihydrochlorure de benzidine Tétraméthyl benzidine
Radioactifs
Tritium (3H) Iode (125I)
Particulaires
Ferritine (10nm) Or colloïdal (1nm à 20nm)
Techniques de marquage immunocytochimique
Révélation des complexes antigènes-anticorps: Techniques directes Techniques indirectes
Application des anticorps: Avant inclusion (pre-embedding) Après inclusion (post-embedding) Combinaison des deux approches (marquages multiples)
Méthode Peroxydase-Anti-Peroxydase (PAP)
3
2
1
ETAPES
1
2
3
Méthode Avidine-Biotine-Peroxydase (ABC)
Anticorps primaire
Complexe ABC
Anticorps secondaire biotinylé
Anticorps primaire
Descarries et al., J. Comp. Neurol., 375, 167-186, 1996
Innervation dopaminergique du neostriatum
Immunomarquage tyrosine hydroxylase(peroxydase, coupes sériées)
Eminence médiane : Terminaisons dopaminergiques tubéro-infundibulaires
Immunomarquage (Tyrosine Hydroxylase) Radiomarquage après capture de (3H)-dopamine
Epv : Espace périvasculaire* Terminaisons non marquées
T : pied tanycytaireFlêches : fenestrations de l endothélium vasculaire
Epv
APPROCHE DES INTERACTIONS CELLULAIRES ET DE LA COLOCALISATIONNEURONALE EN MICROSCOPIE OPTIQUE ET ELECTRONIQUE
I - Immunocytochimie : généralités
II - Préparation des tissus
A - Fixation
B - Inclusion
III - Traceurs
IV - Microscopie de fluorescence
A - Microscopie de fluorescence conventionnelle
B - Microscopie confocale à balayage laser
V - Marquages multiples en microscopie de fluorescence
VI - Microscopie électronique
A - Microscopie électronique en transmission
B - Techniques de marquages en microscopie électronique
C - Applications aux marquages multiples
Marquages combinés
Radioautographie (monoamines) / immunocytochimie
Noyau suprachiasmatique : interactions sérotonine (3H-5-HT) / GABA (anti-GAD)
Marquages combinés
Immunocytochimie associant différents marqueursen pré et/ou post-enrobage
--------------------------------------------------------------------------
Le choix de l approche doit tenir compte:
de l origine des anticorps primaires disponibles (espèces différentes ou même espèce)
de la sensibilité et/ou de la résolution recherchée(s)
des limitations respectives des méthodes qui seront associées
Double marquage en pré-enrobageImmunocytochimie (peroxydase)+ radioimmunocytochimie (125I)
Noyau paraventriculaire : colocalisation tyrosine hydroxylase/NPY
Double marquage en pré-enrobagePeroxydase / or 1nm intensifié à l argent
1µm
Noyau suprachiasmatique : innervation sérotoninergique des neurones à vasopressine
Double marquage en pré-enrobagePeroxydase révélée à l aide de chromogènes distincts
Benzidine dihydrochloride3,3 -diaminobenzidine
Anti-A(espèce a)
Anti-B(espèce b)
Anti-IgG espèce a Anti-IgG espèce b
(espèce c) (espèce c)
PAP(espèce a)
PAP(espèce a)
PAP(espèce b)
Double immunoperoxydase + radioautographie
+
capture(3H)5-HT
VIP GABA
5-HT
Triple marquage
Benzidine dihydrochloride3,3 -diaminobenzidine
Anti-A(espèce a)
Anti-B(espèce b)
Anti-IgG espèce a Anti-IgG espèce b
(espèce c) (espèce c)
PAP(espèce a)
PAP(espèce a)
PAP(espèce b)
Double marquage en post-enrobage(or colloïdal 5nm vs 15nm)
Anticorps primaires d espèces différentes
Anticorps primaires de même espèce
Double marquage en post-enrobage(or colloïdal 5nm vs 15nm)
Face A
Face A
Face B
Face B
Face A
Face B
Bertini and Kiss, Neuroscience, 42, 237-244, 1991
Co-localisation CRF/AVP dans l éminence médiane
Contrôle
Surrénalectomie
A, B : parvocellulairesC : magnocellulaires
D : parvocellulairesE : magnocellulaires
Double marquage immunocytochimique à l or colloïdal
5 nm : CRF 15 nm : AVP
Double marquage en pré/ post-enrobage(peroxydase/or colloïdal 15nm)
Innervation sérotoninergique et GABA-ergique des neurones du noyau rouge