manual de bioquimica clinica version 2007 farmacia uaem

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MORELOS

MANUAL DE LABORATORIO DE

BIOQUÍMICA CLÍNICA

ELABORADO POR _M. en C. Leticia Arellano M. _______ _L. F. Blanca Estela Duque Montaño_ _Dra. Claudia Hallal Calleros ______

Fecha de elaboración: Febrero 2005 Última revisión: __Julio 2007____ Fecha de validación: ___________ (Consejo Técnico)

Conocimiento al Servicio de la Salud

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PONDERACIÓN Y OBJETIVO GENERAL DEL LABORATORIO

SEMESTRE

7

Nº Hrs/sem

4

Nº Créditos

4

-OBJETIVO GENERAL DEL LABORATORIO Presentar al alumno la información general acerca de algunas determinaciones de rutina empleadas en Bioquímica Clínica, así como la importancia de llevar un control de calidad abarcando la fase pre-analítica, analítica y post-analítica. El alumno relacionará los resultados sobre el buen funcionamiento metabólico del organismo, así como, la alteración del mismo, causando diversas patología. Además, deberá adquirir conciencia sobre los riesgos que se corren al trabajar en un laboratorio clínico, a fin de prevenirlos y evitarlos. -NORMAS Y REGLAMENTOS ESPECÍFICOS. Reglamento de seguridad de Laboratorios Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002 Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997. Norma Oficial Mexicana NOM-009-STPS-1993 Norma Oficial Mexicana NOM-012-STPS-1993 Norma Oficial Mexicana NOM-114-STPS-1994.

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C O N T E N I D O

Pr-Nº

Título de la Práctica

Objetivo de la Práctica

Hrs

Pg.

1 Garantía de Calidad en el laboratorio de Bioquímica Clínica.

Conocer y familiarizarse con los conceptos básicos sobre control de calidad, exactitud, precisión, gráficos de Levey-Jennings, garantía y aseguramiento de calidad.

4

2 Obtención y conservación de muestras sanguíneas.

Conocer la forma correcta de realizar una extracción de sangre por punción venosa y capilar, y adiestrarse en la conservación de muestras sanguíneas, para la obtención de suero o plasma.

4

3 Citometría El alumno realizará el montaje y conteo de eritrocitos, determinación de la concentración de hemoglobina e índices eritrocitarios, e identificará las células presentes en sangre periférica de un individuo, relacionando estos parámetros con el estado de salud del mismo.

4

4 Carbohidratos Conocer la importancia que tiene la determinación de glucosa en sangre para la evaluación del metabolismo de carbohidratos.

4

5 Proteínas Conocer la importancia de las proteínas en el organismo. Determinar su concentración plasmática y asociarla con posibles alteraciones en los órganos encargados de metabolizarlos.

4

6 Compuestos nitrogenados no proteicos.

Conocer la importancia de determinar los compuestos nitrogenados no proteicos y su asociación con alteraciones en el metabolismo de proteínas y aminoácidos, así como con problemas renales.

4

7 Metabolismo de Lípidos Conocer la importancia de los lípidos en el organismo, así como las alteraciones que se pueden presentar en su metabolismo y la manera de identificarlas.

4

8 Examen General de Orina En base a la composición normal 4

4

de la orina, detectar alteraciones en vías urinarias o poner de manifiesto la existencia de alteraciones metabólicas de diversa etiología.

9 Electrolitos Conocer la importancia de los electrolitos en el organismo y los métodos empleados para cuantificarlos.

4

10 Enzimas Conocer la importancia de las enzimas de interés clínico en el organismo.

4

Medidas de seguridad en el Laboratorio. Manejo de RPBI

Dar a conocer al alumno las medidas básicas de seguridad en el laboratorio clínico. Almacenamiento y Eliminación de los RPBI según NOM 087 Ecol.

4

5

PRACTICA No. TEMA (O UNIDAD) FECHA

1 GARANTÍA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA

ALUMNO

OBJETIVO: Conocer y familiarizarse con los conceptos básicos sobre control de calidad, exactitud, precisión, gráficas de Levey – Jennings, garantía y aseguramiento de calidad.

1- INTRODUCCIÓN.

Para utilizar los estudios de laboratorio apropiadamente es necesario disponer de la apreciación de la validez técnica de una prueba (precisión y exactitud); de su valor diagnóstico (sensibilidad y especificidad); de la adecuada obtención de la muestra por analizar, así como de las fuentes potenciales de error que pueden influir en los resultados. Los procesos de control de calidad aseguran la precisión y la reproducibilidad de los resultados del laboratorio. Los conceptos antes mencionados permiten calificar la eficiencia del proceso de medición de las sustancias cuya concentración se mide en diversos especimenes: sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera. La precisión la conocemos con los parámetros estadísticos de desviación estándar y el coeficiente de variación calculados. La exactitud la conocemos con el %E calculado.

La sensibilidad y especificidad de una prueba o determinación de laboratorio que emite resultados cuantitativos pueden representarse en forma de curvas de distribución gaussiana. Levey y Jennings introducen la idea de analizar un material de control conjuntamente con cada serie de muestras de paciente y expresar los resultados mediante gráficos de control. Un eje es el tiempo o procesos numerados secuenciales. El otro eje es el valor de cada resultado de control de calidad. Los gráficos permiten a los analistas ver los resultados de control de calidad durante semanas o meses.

Garantía y aseguramiento de Calidad La garantía de calidad en los servicios de salud puede valorarse y controlarse, puede ser optimizada, y sus beneficios superan sus costes y su objetivo es suministrar a los pacientes servicios y productos de calidad. El aseguramiento de la calidad contempla cuatro aspectos: 1.- Control preanalítico y postanalítico. 2.- Control interno de la calidad. 3.- Control externo de la calidad. 4.- Estandarización. 2- EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS

EQUIPO Y MATERIALES REACTIVOS

cantidad Descripción cantidad descripción

1 Gradilla 500 ml Agua destilada

1 Pipeta graduada de vidrio de 1.0 ml

1 Pipeta graduada de vidrio de

6

2.0 ml



5 Tubos de ensaye de 13 x 100

1 Vaso de precipitados de 25 ml

4 Balanzas electrónicas de precisión

1 Termómetro

3- MÉTODOS Y/0 PROCEDIMIENTOS. I. Determinación de la Precisión y Exactitud Analítica de un Pipeteo. 1. Colocar un vaso de precipitados de 25 ml en el platillo de una balanza

electrónica de precisión. 2. Tarar la balanza. 3. Con una pipeta de vidrio de 1 ml, ir añadiendo sucesivamente, en el vaso de

precipitados, 1 ml de agua destilada, hasta alcanzar 10 ml de ésta. 4. Anotar sucesivamente los pesos medidos. 5. Realizar por triplicado. 6. Calcular el peso que corresponda a cada ml añadido. 7. Repetir los pasos 1 a 5 utilizando: primero una pipeta de 2 ml, después una de 5

ml y finalmente una pipeta de 10 ml. 8. Calcular el coeficiente de variación para cada una de las series de valores de

peso de 1 ml de agua destilada. 9. Buscar el valor de la densidad del agua a la temperatura de trabajo en el

laboratorio. 10. Teniendo en cuenta el valor de la densidad del agua a la temperatura de trabajo,

calcular el peso teórico de 1 ml de agua a esa temperatura. Este será el valor real de peso de 1 ml de agua.

11. Calcular la exactitud de la media de cada una de las series de valores de peso, con respecto al valor real calculado teóricamente.

5- PROCESAMIENTO DE LOS DATOS Elaboración de una gráfica de Levey-Jenning. 1.- Realizar 20 análisis repetidos sobre un suero control normal, de la siguiente manera: 2.- Enumerar 20 para determinar su concentración de hierro. Los resultados

3.- Con estos valores trazar una gráfica de Levey-Jennings. En las abcisas graficar. En días sucesivos se intercala el suero control patológico entre las muestras analizadas cada día, obteniéndose los siguientes resultados:

Día Resultado 1 49 2 51

7

3 50

4 50.5

5 48.5

6 49

7 49

8 50

9 49.5

10 55

11 51

Día Resultado

12 50

13 50

14 49

15 51.5

16 52

17 48

18 51.5

19 47.5

20 52.5

21 48

22 49

Día Resultado

23 50

24 49.5

25 50

26 51

27 51.5

28 52

29 52.5

30 53.5

31 54

X S cv

Estos últimos valores han de ser debidamente reseñados en la gráfica previamente trazada.

Grafica de Resultados (L-J)A 1. Partir de estos valores de concentración de hierro obtenido en el análisis previo

del suero control, calcular la media y la desviación estándar de los mismos. 2. Trazar una línea continua horizontal en el centro de la hoja de papel milimétrico. 3. Trazar en la misma hoja, tres líneas discontinuas a cada lado de la línea recta

central, de forma que todas las rectas sean paralelas y equidistantes entre sí, y que las más periféricas estén cercanas al borde superior e inferior de la hoja.

4. Anotar en ordenas, es decir, en el extremo izquierdo de las rectas: El valor de la media, a nivel de la línea central El valor de media, más o menos una desviación estándar, respectivamente, a nivel de las líneas inmediatamente superior e inferior a la central. El valor de la media, más o menos dos DE, respectivamente, a nivel de las líneas inmediatamente superior e inferior a las anteriores. El valor de la media, más o menos tres DE, respectivamente, a nivel de las líneas inmediatamente superior e inferior a las anteriores.

5. Anotar en abscisas, es decir, en el borde inferior de la hoja, la sucesión de días en los que se practica el análisis del suero control simultáneamente al de las muestras.

6. Marcar con un punto, cada uno de los valores de concentración de hierro, obtenidos en el análisis de los sueros control intercalados entre las muestras.

7. Estos puntos se han de situar en la intersección entre la cifra que corresponde a cada valor (reflejado en ordenadas) y el día en el que fue obtenido (reflejado en abscisas.)

Nota, Considerar como: - Límite de aviso, a las líneas que tienen asignado el valor de la media +/-1 DE.

Este límite establece un nivel de confianza del 67%, es decir, de cada 100 veces que se realiza un análisis, 67 resultados deben estar dentro de este límite.

- Límite de alarma, a las líneas que tienen asignado el valor de la media +/- 2 DE. Este límite establece un nivel de confianza del 95%.

- Límite de acción, a las líneas que tienen asignado el valor de media +/- 3 DE. Este límite establece un nivel de confianza del 99.7% (aproximadamente, del 100%).

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4- RESULTADOS Cálculos Interpretación de resultados de la grafica.

Si un resultado está fuera del límite de alarma (el de la media +/- 2 DE) pero el siguiente está dentro de este límite, el sistema analítico está bajo control estadístico y no se requiere emprender ninguna acción.

Si dos resultados consecutivos se encuentran fuera del límite de alarma pero dentro del de acción, se debe revisar el sistema analítico y solucionar los problemas que se encuentren.

Si un resultado está fuera del límite de acción, el sistema analítico está fuera de control, por lo que no deben ser considerados válidos los valores obtenidos en las muestras, en ese momento y a partir de él, y se tiene que actuar para remediar esta situación.

Se considera que la situación de falta de control está corregida cuando se obtienen tres nuevos resultados consecutivos que se encuentran dentro del límite de alarma.

6- CUESTIONARIO

1. ¿En qué consiste la fase preanalítica? 2. ¿En qué consiste la fase posanalítica? 3. ¿Qué es el control de calidad? 4. ¿Qué información nos proporcionan las gráficas de Levey-Jennings?

7. REPORTE TÉCNICO a)- MARCO TEÓRICO. b)- DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS. c)- RESULTADOS d)-DISCUSIÓN DE RESULTADOS. e)- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. f)- BIBLIOGRAFÍA.

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2 OBTENCION Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS SANGUÍNEAS

ALUMNO

OBJETIVOS

Conocer la forma correcta de realizar una extracción de sangre por punción venosa y capilar, y adiestrarse en la conservación de muestras sanguíneas, para la obtención de suero o plasma.

1. INTRODUCCION

Toma de muestra La sangre de un paciente es una de las muestras más empleadas en las determinaciones de bioquímica clínica, por ello es de gran valor el aprender a realizar una correcta extracción de sangre. La toma de muestra sanguínea debe considerar los siguientes aspectos: 1. El personal encargado de realizar la extracción. Se requiere de personal con suficiente destreza, confianza en sí mismo, ética profesional, paciencia y comprensión. 2. El paciente. El estado físico, la edad y el sitio de punción son características del paciente que hay que tomar en cuenta cuando se realiza una extracción de sangre. 3. El material. Contar con un espacio confortable para el paciente, en el cual pueda estar relajado y con el material estéril o aséptico necesario (en buen estado), son otro factor que influye en una correcta toma de muestra. 4. La técnica de extracción. Las técnicas de extracción de sangre no se aprenden en un día, es un arte que debe desarrollarse mediante estudio, observación y práctica, para adquirir una destreza y confianza adecuadas. 5. Las determinaciones que se realizarán. Es importante conocer las determinaciones que se realizarán, ya que dependiendo del número y tipo de determinaciones que se realizarán, será la cantidad de muestra a extraer. Casi todas las muestras de sangre se extraen por punción venosa, que es un método relativamente fácil y adecuado para obtener volúmenes de 1 a 20 ml de sangre. La extracción de sangre venosa generalmente se realiza en las venas del antebrazo aunque también puede realizare en las venas del dorso de la mano, yugular, femoral o safena. La sangre puede extraerse con una jeringa o bien empleando tubos al vacío con tapón de goma adaptados a una aguja de doble filo que permite por un lado, puncionar la vena del paciente y por el otro perforar el tapón del tubo al vacío. Para realizar las punciones con jeringa, se emplean agujas hipodérmicas de diferentes calibres, los calibres más empleados son: 20x32, 21x32 y 22x32. El sistema de tubos al vacío emplea diferentes tubos que se identifican por el color de su tapón y se eligen en función de la prueba que se vaya a realizar; este sistema emplea agujas de los siguientes calibres: 22x38, 21x38 y 20x38. En bioquímica clínica existen determinaciones que requieren cantidades mínimas de

punción se lleva a cabo con una lanceta que provoca una herida de una profundidad estandarizada y puede realizarse en la yema de un dedo de la mano, en el lóbulo de la oreja o en el talón (en el caso de los neonatos). Existen en el mercado lancetas automáticas (vacutainer) como la amarilla con profundidad controlada de 2.4 mm en

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la incisión, para punción capilar en talón de bebés y la azul con profundidad controlada de 1.9 mm en la incisión, para punción capilar en yema de dedo adulto. Procesamiento y conservación de las muestras Cuando se desea trabajar con sangre entera o plasma, se requiere el uso de un anticoagulante. Los anticoagulantes más empleados en bioquímica clínica son: EDTA (sal disódica o dipotásica): Es el anticoagulante más utilizado en las técnicas hematológicas a concentraciones de 1 - 2 mg/ml de sangre. La coagulación se evita por eliminación de calcio de la sangre. Citrato de sodio: Es el anticoagulante de elección para los estudios de coagulación. Se utiliza a la concentración de una parte de Citrato sódico 0.11M (3.8 %) por nueve partes de sangre total. Evita la coagulación al unirse al calcio de la sangre en un complejo soluble. Heparina: Se utiliza a una concentración de 0.2 ml de Heparina saturada por 1.0 ml de sangre total. La coagulación se evita por neutralización de la trombina. Oxalato de amonio y potasio (oxalato doble): Se compone de 6 partes de oxalato de amonio y 4 partes de oxalato de potasio. Se utiliza a una concentración de 2 mg por ml de sangre total. La coagulación se evita por la eliminación del calcio en la sangre. Todas las muestras deben conservarse bien cerradas. Las muestras obtenidas por punción venosa o capilar, pueden emplearse enteras (anticoaguladas) o bien separar los componentes celulares de la parte líquida y obtener suero (en caso de que la muestra se deje coagular) o plasma (en caso de haber utilizado anticoagulante). La separación puede llevarse a cabo por sedimentación (muestra anticoagulada) o retracción del coágulo (muestra coagulada). En ambos casos puede acelerarse la separación centrifugando a 2500rpm/5min. En el caso de las muestras enteras se recomienda trabajarlas de inmediato o bien conservarlas a 4°C por un tiempo máximo de 24 horas. Si lo que se requiere es suero o plasma, una vez separados deben verterse en un contenedor limpio y procesarlos inmediatamente, en caso necesario pueden conservarse a 4°C por 24 horas o bien a –20°C o -70°C por tiempos prolongados. 2. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS


cantidad Descripción cantidad Descripción

1 Gradilla 100 ml Alcohol etílico al 70%

1 Jeringa de 5 ml

1 Torundero MATERIAL BIOLOGICO

1 Ligadura cantidad Descripción

1 Aguja de doble filo para tubo al vacío

5 ml Sangre total

2 Tubos de ensaye de 13 x 100 2 ml Suero


1 Tubo al vacío tapón lila

1 Tubo al vacío tapón rojo

1 Tubo microtainer

1 Tubo capilar

1 Lanceta

2 Pipetas pasteur

1 Bulbo gotero

1 Centrífuga

1 Barra de plastilina chica

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3. PROCEDIMIENTO I. Obtención de Sangre por Punción Venosa a) Utilizando jeringa 1. Identificar el sitio de punción 2. Verificar que el émbolo de la jeringa no se trabe (esto sin romper el empaque que

la contiene), asegurar la aguja para que no se separe. 3. Con una torunda impregnada de alcohol al 70%, limpiar la zona a puncionar con

un movimiento circular 4. Colocar la ligadura a unos 10 cm por arriba del sitio de punción. 5. Quitar el tapón de la aguja y con el bisel hacia arriba introducir la aguja en la vena

en un ángulo de 15°. Cuando aparezca una gota de sangre en el interior del porta-aguja, jalar el émbolo hasta completar la cantidad de sangre deseada.

6. Retirar la ligadura cuidando de no lastimar al paciente. 7. Una vez obtenida la cantidad de sangre deseada, extraer la aguja y con otra

“torunda” limpia, aplicar presión en el sitio de punción, al cabo de 2 o 3 minutos retirar la “torunda”.

b) Utilizando tubos al vacío 1. Identificar sitio de punción. 2. Armar el sistema: Conectar la aguja de toma múltiple al soporte de plástico. 3. Con una torunda impregnada de alcohol al 70%, limpiar la zona a puncionar con

un movimiento circular 4. Colocar la ligadura a unos 10 cm por arriba del sitio de punción. 5. Quitar el tapón de la aguja y con el bisel hacia arriba introducir la aguja en la vena

en un ángulo de 15°. Sosteniendo con firmeza el soporte de plástico, presionar el tubo al vacío contra el extremo posterior de la aguja hasta conseguir que ésta perfore el tapón de goma del tubo. El tubo se va llenando de sangre debido a la succión producida por el vacío que existe en el mismo.

6. Retirar el tubo cuando éste se haya llenado casi por completo con sangre. Si se requiere, siguiendo el procedimiento indicado, llenar un segundo tubo de sangre.

7. Retirar la ligadura cuidando de no lastimar al paciente. 8. Extraer la aguja y con una “torunda” limpia aplicar presión en el sitio de punción,

al cabo de 2 o 3 minutos retirar la “torunda”. 9. Tapar la aguja de extracción, retirarla del soporte plástico y proceder a

desecharla. Limpiar el soporte plástico y guardarlo. II. Obtención de sangre por punción capilar 1. Seleccionar un punto adecuado para la punción. 2. Calentar la zona de punción con una compresa húmeda (42°C). 3. Limpiar la zona de la punción con una torunda impregnada con alcohol al 70%. 4. Dejar secar la piel. 5. Llevar a cabo la punción con una lanceta estéril, realizando un único movimiento

con el instrumento. 6. Desechar la primera gota de sangre enjugándola con una gasa estéril. 7. Regular el flujo de sangre mediante presión con el pulgar. 8. Recoger la muestra en un microtubo y en un tubo capilar 9. La recolecta en el tubo capilar, deberá sellarse uno de los extremos

introduciéndolo en plastilina. 10.Etiquetar el recipiente de la muestra con los datos completos del paciente. III. Separación de Suero 1. En caso de haber obtenido la muestra con jeringa, retirar la aguja de la jeringa,

verter la sangre a un tubo seco y limpio, dejar resbalar la sangre por las paredes

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del tubo, evitando que se forme espuma. Este paso no es necesario en el caso de tubos al vacío.

2. Dejar el tubo con sangre en baño de agua a 37°C por 10-15 minutos ( a esta temperatura la coagulación se hace con mayor rapidez y la retracción del coágulo es máxima).

3. Cuando la coagulación sea completa, con un aplicador de madera limpio y seco, desprender el coágulo por las paredes del tubo, cuidando de no romperlo.

4. Centrifugar el tubo durante 5 minutos a 2500 r.p.m., después de este proceso se obtiene un líquido limpio, transparente y libre de hemólisis (el suero).

5. Separar el suero con una pipeta Pasteur y colocarlo en otro tubo limpio y seco. IV. Separación de Plasma 1. Si la muestra fue obtenida con jeringa, retirar la aguja de la jeringa, verter la

sangre en un tubo con anticoagulante. En el caso del tubo al vacío, este ya contiene el anticoagulante.

2. Con suavidad invertir el tubo varias veces, con el fin de mezclar uniformemente la sangre con el anticoagulante, cuidando de no agitar para que no se presente hemólisis de la sangre.

3. Para separar la capa globular centrifugar a 2500 r.p.m. durante 5 minutos. 4. Terminada la centrifugación, separar el sobrenadante (plasma) con una pipeta

Pasteur y colocarlo en otro tubo limpio. Notas: 1. En caso de que la vena no haya podido ser puncionada al primer intento, utilice el

dedo índice para localizarla de nuevo, puede ser que el pinchazo no haya sido lo suficientemente profundo, o que la aguja se haya desviado ligeramente de la vena.

2. Es muy importante presionar el lugar de punción sin frotar para evitar la formación de hematomas (derrame de sangre en los tejidos).

3. Cuando se emplea jeringa para extraer la muestra, se debe evitar la inyección de aire en la vena, comprobar que el émbolo se encuentre completamente hasta el fondo del cuerpo de la jeringa antes de la punción.

4. Una vez puncionada la vena, jalar suavemente el émbolo de la jeringa, nunca aspirar bruscamente ya que esto puede hemolizar la muestra.

5. Cuidar el retroceso del émbolo, la fuerza de retroceso puede hacer que la pared venosa se pegue sobre el bisel de la aguja y detenerse el flujo de sangre o bien la aguja puede deslizarse inadvertidamente fuera de la vena.

4. RESULTADOS

Nombre: Fecha de toma: Fecha de análisis: Edad:______. Analito:

ANALITO ASPECTO OBSERVACIONES

SUERO

PLASMA

SANGRE TOTAL

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5. CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la punción venosa, punción capilar y punción arterial?

2. ¿Cuál es el fundamento de la obtención de suero y de plasma en una muestra sanguínea?

3. ¿Cuál es la ventaja del uso de plasma sobre el suero? 4. ¿Cómo puede interferir la hemólisis en los resultados? 5. ¿Cuáles son las recomendaciones para mantener conservadas las muestras

sanguíneas? 6. REPORTE TÉCNICO. a)- MARCO TEÓRICO. b)- DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS. c)- RESULTADOS d)-DISCUSIÓN DE RESULTADOS. e)- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. f)- BIBLIOGRAFÍA.

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3 CITOMETRÍA

ALUMNO

OBJETIVO

El alumno realizará el montaje y conteo de eritrocitos, determinación de la concentración de hemoglobina e índices eritrocitarios, e Identificará las células presentes en sangre periférica de un individuo, relacionando estos parámetros con el estado de salud del mismo.

1. INTRODUCCION

La biometría hemática (citometría) comprende una serie de estudios que permiten tener una visión bastante precisa del estado de todos los elementos formes de la sangre, incluye la cuantificación de hemoglobina, determinación de hematocrito, conteo eritrocitario, leucocitario y diferencial e índices eritrocitarios. La hemoglobina (Hb) es una proteína conjugada con peso molecular de 64,5450 daltones, cuya función es transportar bióxido de carbono (CO2) de los tejidos a los pulmones y oxígeno (O2) de los pulmones a los tejidos. La Hb totalmente saturada contiene alrededor de 1.34 ml de oxígeno por gramo de Hb. La masa de eritrocitos de un adulto contiene 600g de Hb capaz de transportar 800 ml de O2. El hematocrito de una muestra de sangre es la relación del volumen de eritrocitos con el de la sangre total y se expresa como un porcentaje (%). El valor del hematocrito es una cuantificación de uso frecuente y de carácter fidedigno que se practica junto con los estudios de Hb y recuento eritrocítico, para calcular los índices eritrocíticos. El recuento de eritrocitos se expresa como concentración (células por unidad de volumen de sangre). La unidad de volumen para los recuentos celulares se expresó originalmente como milímetros cúbicos (mm3) debido a las dimensiones lineales de la cámara hemocitométrica, pero puede expresarse también en litros. Índices eritrocitarios. VCM, HCM y CMHC Volumen corpuscular medio (VCM), es el valor medio del volumen de los hematíes. Se calcula a partir del hematocrito (HCT) y del recuento del número de hematíes (RBC). Hemoglobina corpuscular media (HCM), es el valor medio del contenido en hemoglobina de los hematíes. Se calcula a partir de la concentración de hemoglobina (Hb) y del número de hematíes. Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM), es el valor de la cantiodad de hemoglobina (en g) contenida en un dl de hematíes. Se calcula a partir de la concentración de hemoglobina y del hematocrito.

El examen de la extensión de sangre es una parte importante de la evaluación hematológica. La fiabilidad de la información obtenida depende en gran parte de lo bien teñidas que estén las extensiones. La extensión de sangre una vez preparada se tiñe con colorante de Wright que permite estudiar la morfología de las células hemáticas y establecer la fórmula leucocitaria. Los núcleos y algunas otras estructuras de las células sanguíneas se tiñen con los colorantes básicos y se denominan basófilos, las estructuras celulares que se tiñen con los colorantes ácidos

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se denominan acidófilas (eosinófilas), las estructuras de las células sanguíneas que se tiñen por una combinación de ambos colorantes se denominan neutrófilas. 2. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS



1 Tubo al vacío tapón lila 100 ml Alcohol etílico al 70%

1 Ligadura 100 ml Reactivo de Drabkin (Ferricianuro, cianuro de potasio)

1 Torundero 100 ml Solución de Hayem (Sulfato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de mercurio y agua destilada)

1 Ajuga de doble filo para tubo al vacío

100 ml Solución de Turk (Acido acético glacial, azul de metileno)

1 Jeringa de 5 ml 100 ml Colorante de Wright (Eosina, azul de metileno, metanol)

1 Tubo al vacío con EDTA 100 ml Solución amortiguadora de fosfatos pH 6.6

1 Tubo de wintrobe MATERIAL BIOLÓGICO

1 Pipeta de Thoma para recuento de eritrocitos

cantidad Descripción

1 Manguera de succión con boquilla

5 ml Sangre total

1 Gradilla

1 Cámara de Neubauer

1 Microscopio

1 Pipeta de Sahli

1 centrífuga

1 Espectrofotómetro

1 Contador de células

3. PROCEDIMIENTO I. Determinación de Hemoglobina Principio: El ferricianuro de potasio oxida la hemoglobina a metahemoglobina y el cianuro de potasio proporciona los iones cianuro (CN-) para formar cianometahemoglobina, que tiene una absorción máxima a una longitud de onda de 540 nm. 1. Poner 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensaye de 13 x 100 mm. 2. Con la pipeta de Sahli tomar 0.02 ml de sangre y agregar al tubo que contiene el reactivo de Drabkin. Mezclar bien. 3. Mantener a temperatura ambiente durante al menos 3 minutos. 4. Leer en el espectrofotómetro a 540 nm frente al blanco de reactivos 5. Criterio de lectura: La absorbancia del problema x 36.8, corresponderá a la concentración de Hb en g/dl.

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Nota: Se debe tener cuidado con la solución de Drabkin ya que las soluciones de cianuro son venenosas. II. Determinación de Hematocrito Principio: Al centrifugar la sangre con anticoagulante en un tubo capilar, los eritrocitos se sedimentan y el plasma queda como sobrenadante, con lo cual se puede conocer el porcentaje total de glóbulos rojos. Procedimiento 1. Llenar un tubo capilar con sangre, hasta aproximadamente las ¾ partes de su capacidad. 2. Sellar el capilar por la parte contraria al llenado del tubo. 3. Centrifugar a 3,500 r.p.m. durante 30 minutos. 4. Terminada la centrifugación leer y anotar el resultado. Criterio de lectura: El volumen ocupado por los eritrocitos entre el volumen total de sangre corresponde al % de hematocrito. Nota: Si el tubo de hematocrito es sellado en forma incompleta el resultado será erróneo y anormalmente bajo ya que al girar los tubos en la centrífuga se produce una pérdida de hematíes que es mayor que la pérdida de plasma. III. Conteo de eritrocitos Principio: La sangre se diluye con la solución de Harem ó en solución salina a 0.85% que conserva los eritrocitos y destruye el resto de las células, permitiendo cuantificar el número de eritrocitos por mm3 (µl) de sangre entera. Procedimiento 1. Con la pipeta de Thoma para glóbulos rojos, aspirar sangre hasta la marca de 0.5. 2. Con la pipeta inclinada 45°, llenar con el líquido diluyente hasta la marca de 101. 3. Tapar los extremos de la pipeta con papel parafilm. 4. Agitar por 1-2 minutos en agitador para pipetas. 5. Con la muestra diluida, llenar la cámara de Neubauer. Dejar reposar durante un minuto. 6. Colocar la cámara de Neubauer en la platina del microscopio, localizar la cuadrícula central (con el objetivo 10X) y con el objetivo 40 X contar los eritrocitos en 5/25 cuadros (de la cuadrícula central). Criterio de lectura: El número de eritrocitos/mm3, será igual al número de células contadas x el factor de corrección (No. de células contadas x 10000). Nota: El líquido diluyente no debe contener restos de sangre u otros factores que puedan alterarlo. Tanto las pipetas de Thoma, como la cámara de Neubauer y el cubreobjetos deben estar escrupulosamente limpios. IV. Conteo Leucocitario Principio: La sangre se diluye con la solución de Turk, la cual lisa a los eritrocitos y conserva a los leucocitos, permitiendo cuantificar éstos últimos mm3 de sangre completa. Procedimiento Con la pipeta de Thoma para glóbulos blancos, aspirar sangre hasta la marca de 0.5. Con la pipeta inclinada 45°, llenar con el líquido diluyente hasta la marca de 11 Tapar los extremos de la pipeta con papel parafilm. Agitar durante 1-2 minutos en agitador para pipetas. Llenar la cámara de Neubauer. Dejar reposar durante un minuto. Colocar la cámara de Neubauer en la platina del microscopio. Con el objetivo 10x localizar la cuadrícula y con el objetivo 40x contar los leucocitos en las cuatro cuadrículas de los extremos.

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Criterio de lectura: El número de leucocitos/mm3, será igual al número de células contadas x el factor de corrección (No. de células contadas x 50). Notas: Es importante evitar la contaminación del líquido diluyente con sangre ya que pequeñas cantidades de ella, pueden afectar la precisión del recuento y hacer difícil la diferenciación de los leucocitos. El recuento debe hacerse lo más rápido posible. Si transcurre demasiado tiempo, el líquido de la cámara puede comenzar a evaporarse, con lo que los resultados no serán confiables. V. Determinación Morfológica de las Células Sanguíneas (Frotis Sanguíneo) Principio: Cuando una extensión de sangre es teñida con el reactivo de Wrigth, los núcleos y algunas otras estructuras de las células sanguíneas se tiñen con el colorante básico (azul de metileno) y se denominan basófilos; las estructuras celulares que se tiñen con el colorante ácido (eosina), se denominan eosinófilas, y las estructuras de las células sanguíneas que se tiñen por una combinación de ambos colorantes se denominan neutrófilas. Lo anterior permite identificar y diferenciar las células sanguíneas, dadas la morfología y características ácido-básicas de cada una. Procedimiento Colocar una gota de sangre en un portaobjetos. Con otro portaobjetos de borde liso hacer un ángulo de 45° y recorrerlo hasta que el borde toque la gota. Dejar que por capilaridad, la muestra se extienda entre los dos portaobjetos Con un movimiento suave hacer la extensión de sangre lo más delgada posible. Secar al aire y cubrir la extensión con colorante de Wright, durante 4 minutos. Sin eliminar el colorante, añadir sobre el portaobjetos un volumen igual de solución amortiguadora de fosfatos y dejar reposar durante 7 minutos. Lavar con agua corriente, limpiar el dorso del portaobjetos con un pedazo de papel secante y dejar secar. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100X). Contar 100 células blancas, anotando el número de eosinófilos, basófilos, neutrófilos segmentados, linfocitos, neutrófilos en banda y monocitos encontrados. Revisar también la morfología eritrocitaria (anotando anormalidades) y plaquetas. Criterio de lectura: El número de cada tipo celular contado, corresponderá al porcentaje de ese tipo de células en la muestra. Notas: Los portaobjetos deben estar escrupulosamente limpios. La extensión debe efectuarse tan pronto como la gota de sangre se deposite sobre el portaobjetos ya que si se deja más tiempo la distribución de los leucocitos en la extensión no será uniforme. Un mal lavado del portaobjetos para eliminar la mezcla del colorante y la solución amortiguadora causará precipitados en la extensión. 4. RESULTADOS Nombre: Fecha de toma: Fecha de análisis: Edad:______. Analito:

FORMULA ROJA RESULTADO VALORES DE REFERENCIA

HEMOGLOBINA

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HEMATOCRITO

ERITROCITOS

C.M.H.C.

C.M.H.

V.C.M.

Método:

Observaciones:

5. PROCESAMIENTO DE LOS DATOS

Valores de referencia

Parámetro Hombres Mujeres Unidades

Hemoglobina 14 – 18 12 – 16 g/dl

Hematocrito 42 – 54 38 – 46 %

Leucocitos 5,000-10,000 5,000-10,000 Leucocitos/mm3

Eritrocitos 4.0 – 6.2 x 106 4.0 – 5.5 x 106 Eritrocitos/mm3

VCM 80 – 100 fl

HCM 27 – 31 pg

CHCM 32 - 36 g/dl

Conteo Diferencial Adultos

Basófilos 0.3 – 2 %

Eosinófilos 0.3 – 0.7 %

Linfocitos 16 – 43 %

Monocitos 0.6 – 9.6 %

Neutrófilos segmentados 47 – 78 %

Neutrófilos en banda %

Cálculos:

Interpretación de resultados Hemoglobina: Aumento: Hemoconcentración o deshidratación. Disminución: Anemia, hemorragia reciente o retención de líquidos. Hematocrito: Aumento: Policitemia o hemoconcentración. Disminución: Anemias o hemodilución.

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Eritrocitos: Aumento: Policitemia, deshidratación. Disminución: Anemias, sobrecarga de líquidos o hemorrágia reciente. VCM: Si es menor de 80 fl, se dice que hay una microcitosis. Si es mayor de 100 fl, se habla de macrocitosis. HCM: Si es menor de 27 pg, se dice que hay una tipocromía. Si es mayor de 31 pg, se habla de hipercromía relativa. CHCM: Si es mayor de 36 g/dl se habla de hipercromía absoluta. Disminución: hidrocitosis o estomatocis congénita. Aumento: esferocitosis hereditaria, deshidratación eritrocitoria o xerocitosis. Leucocitos: Aumento (Leucocitosis): Infección, absceso, meningitis, apendicitis, leucemia o infarto. Disminución (Leucopenia): Depresión de médula ósea dada por infecciones vírales o reacciones tóxicas como las que aparecen después de tratamientos con antineoplásicos, ingestión de mercurio u otros metales pesados, fiebre tifoidea o hepatitis infecciosa. Neutrófilos: Aumento: Infecciones, necrosis (por infarto del miocardio, quemaduras o carcinoma), trastornos metabólicos o en enfermedades inflamatorias. Disminución: Depresión de la médula ósea por radiación o citotóxicos, infecciones, deficiencia de ácido fólico o vitamina B12 Eosinófilos: Aumento: Trastornos alérgicos, parasitosis, dermatosis, enfermedades neoplásicas. Disminución: Estrés por traumatismo (quemaduras, cirugía o alteraciones mentales), síndrome de Cushing. Basófilos: Aumento: Policitemia vera, enfermedad de Hodghkin, mixidema, colitis ulcerosa, nefrosis. Disminución: Hipertiroidismo, ovulación, embarazo, estrés. Monocitos: Aumento: Infecciones, endocarditis bacteriana subaguda, tuberculosis, hepatitis, paludismo, artritis reumatoide, carcinomas, leucemia monocitica, linfomas. Linfocitos: Aumento: Infecciones, leucemia linfocítica, enfermedades inmunológicas. Disminución: Enfermedades debilitantes graves (insuficiencia cardiaca congestiva, insuficiencia renal y tuberculosis avanzada), defectos de circulación linfática, niveles elevados de corticoides suprarrenales, inmunodeficiencia por acción de inmunosupresores. 6. CUESTIONARIO.

1. ¿Qué importancia tiene el determinar la hemoglobina a un paciente? 2. ¿Qué es la anemia, y cómo es que esta puede producirse? 3. ¿Qué indica un valor de VCM menor de 80 fl? 4. ¿Al aumentar la concentración de anticoagulante en una muestra de sangre

qué sucede con el valor del hematocrito? Explique. 5. ¿En qué circunstancias puede disminuir el hematocrito?


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4 CARBOHIDRATOS

ALUMNO

OBJETIVO

Conocer la importancia que tiene la determinación de glucosa en sangre para la evaluación del metabolismo de carbohidratos.

1. INTRODUCCION

Los carbohidratos, compuestos orgánicos formados por carbono, oxígeno e hidrógeno, son fuente importante de energía; funcionan como reserva energética y sirven de base para la formación de otras estructuras. Se ingieren en la dieta en forma de polisacáridos, disacáridos o monosacáridos y una vez digeridos son absorbidos a nivel intestinal en forma de monosacáridos. Cuando el monosacárido absorbido no es glucosa, se transforma en ella a nivel hepático. Por tanto, el metabolismo de los carbohidratos, es en última instancia el metabolismo de la glucosa, que se encuentra regulado a nivel hormonal, mediante la insulina, glucagón, glucocorticoides, catecolaminas y la hormona del crecimiento. Tras la absorción de la glucosa ingerida en la dieta, esta pasa a sangre y entonces, los niveles normales (70 – 110 mg/dl) se elevan hasta valores de 120-150 mg/dl o más. En las personas cuyo metabolismo hidrocarbonado funciona adecuadamente, éstos niveles de glucosa bajan enseguida de manera que entre una y media o dos horas, regresa a los valores obtenidos en ayunas. Los estudios que miden la tolerancia del organismo respecto a los carbohidratos, esto es, la capacidad de metabolizarlos, tienen gran importancia clínica y constituyen algunas de las pruebas de laboratorio que se realizan con mayor frecuencia. Las alteraciones más importantes en el metabolismo de los carbohidratos, son aquellas en las que se altera la tolerancia y que conducen a un aumento del nivel de glucosa en sangre, ocasionando un síndrome clínico denominado diabetes mellitus, del cual los niveles altos de glucosa plasmática es solo su expresión más característica. La disminución en los niveles plasmáticos de glucosa, se produce como consecuencia de un desequilibrio entre la glucosa que llega al torrente sanguíneo (proveniente de la absorción intestinal, glucogenolisis y gluconeogénesis) y la que sale del mismo como consecuencia del consumo por parte de los tejidos. Las pruebas diagnósticas más utilizadas para evaluar el metabolismo de la glucosa son: glucemia en ayunas, glucemia posprandial y pruebas de sobrecarga de glucosa. Valores de glucosa en ayunas superiores a 130 mg/dl, son idicativos de diabetes mellitus, mientras que los que se encuentran entre 110-120 mg/dl, se consideran valores dudosos y hay que confirmarlos mediante alguna prueba de sobrecarga de glucosa. La determinación de la glucemia postprandial, se realiza cuando la determinación de glucosa en ayunas no aporta un diagnóstico definitivo. Consiste en determinar los niveles de glucosa un una muestra de sangre obtenida dos horas después de haber ingerido una dosis conocida (100 g) de glucosa. Previo al análisis, es importante llevar a cabo una dieta rica en carbohidratos (mínimo 300 g diario) e interrumpir medicamentos que puedan interferir con el metabolismo de carbohidratos. Cuando la prueba posprandial no aporte datos

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suficientes para el diagnóstico, se requiere realizar la de sobrecarga oral, realizando determinaciones de glucosa sanguínea a intervalos regulares de tiempo. Principio de la determinación La determinación de glucosa puede llevarse a cabo por diferentes métodos. Uno de los más empleados es el método enzimático con glucosa oxidasa (GOD). La glucosa es oxidada por la enzima glucosa oxidasa (GOD) liberando peróxido de hidrógeno, este reacciona con fenol y 4-aminofenazona en presencia de peroxidasa (POD), dando un color rojo-violeta de antipirilquinonimina en cantidad proporcional a la glucosa presente en la muestra. 2. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS



1 Gradilla 1 Equipo comercial para determinación de Glucosa

1 Jeringa de 5 ml 1 Estandar de Glucosa: 100 mg/dl

1 Torundero 100 ml Agua destilada

1 Ligadura 1 Suero control


MATERIAL BIOLOGICO

2 Tubos de ensaye de 13 x 100 cantidad Descripción

2 Tubos de ensaye de 12 x 75 2 ml Suero

1 Tubo al vacío tapón rojo

1 Pipetas pasteur

1 Bulbo gotero

1 Micropipeta graduable con puntas

1 Pipeta de vidrio graduada de 1.0 ml


1 Guantes de latex

1 Centrífuga

1 Incubadora


3. PROCEDIMIENTO I. Glucosa Plasmática en Ayunas 1. Indicar al paciente que debe de tener un ayuno de 8 a 12 horas. 2. Tomar una muestra de sangre y procesarla para obtener suero. (como se índica

en la práctica No.2). Separar el suero y pasarlo a un tubo limpio y seco. 3. Para la cuantificación de glucosa, se deben seguir los procedimientos indicados

por el profesor, ya que las cantidades de muestra y reactivos a emplear, varían dependiendo de la marca de los reactivos. Sin embargo, puesto que la mayoría de las determinaciones se realizan por espectrofotometria, se debe proceder como sigue:

4. Preparar una serie de 3 tubos y rotularlos de la siguiente manera: Tubo 1= Blanco, Tubo 2= Estándar, Tubo 3= Muestra problema.

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5. Con las pipetas adicionar en cada tubo la cantidad indicada (X) de: agua destilada, solución estándar y suero problema. A continuación, adicionar la cantidad de reactivo (Y) indicada para cada determinación, como se muestra a continuación:

Nota: todos los tubos deberán contener el mismo volumen final = X + Y. 6. Mezclar cada tubo, como lo indique el profesor. 7. Seguir las condiciones de incubación indicadas. 8. Conectar y poner en marcha el espectrofotómetro. 9. Elegir la longitud de onda de acuerdo a la determinación que se vaya a realizar. 10. Calibrar el espectrofotómetro a cero de absorbancia. Esto se hace empelando el

contenido del tubo 1. 11. Realizar las lecturas de los tubos 2 y 3, anotando las absorbancias de cada uno. 12. Realizar por triplicado las lecturas. 13. Terminadas las lecturas, verificar que no quede ninguna celda dentro del

espectrofotómetro, apagar el equipo y revisar que no queden celdas sucias. 14. Realizar los cálculos correspondientes para obtener la concentración de glucosa

en la muestra. Notas 1. Para la obtención de resultados exactos y precisos, seguir estrictamente la

metodología propuesta. 2. Se debe tener cuidado de no hemolizar la muestra, ya que la hemólisis interfiere

en los resultados. 3. Preparar siempre un blanco y patrón para tener una lectura confiable. 4. La concentración de glucosa plasmática disminuye a una velocidad aproximada

del 5 % por hora en los casos en que no se realiza de inmediato la separación del coágulo.

Las pipetas y el material de vidrio empleados deberán ser lavadas y enjuagadas perfectamente, con agua destilada.

4. RESULTADOS

Nombre: Fecha de toma: Fecha de análisis: Edad:______. Analito:

RESULTADO VALORES DE REFERENCIA

GLUCOSA

Método:

Tubo 1 Tubo2 Tubo3

Agua destilada X ml _____ _____

Solución estándar _____ X ml _____

Suero del paciente _____ _____ X ml

Reactivos indicados

Y ml Y ml Y ml

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Observaciones:

5. PROCESAMIENTO DE DATOS Valores de referencia Glucosa basal: 70 – 110 mg/dl

Glucosa

Repeticiones Absorbancia del estándar

Absorbancia de la muestra

1

2

3

Media

DE

C.V.

%E

Cálculos Interpretación de resultados El incremento en los valores normales de glucosa indica diabetes mellitus, por deficiencia absoluta de insulina o con relativa sensibilidad de los órganos efectores a esta hormona. El diagnóstico de diabetes mellitus implica reconocer un mayor riesgo del paciente para tener enfermedades coronarias, padecimientos cerebro-vasculares, complicaciones durante el embarazo, enfermedad renal, edema, hipertensión, cataratas, glaucoma, ceguera. 6. CUESTIONARIO

1. ¿Cómo se determina la glucosa posprandial? 2. ¿Cómo se determina la curva de tolerancia a la glucosa? 3. ¿En qué tipo de pacientes se debe realizar la prueba de glucosa posprandial

y la curva de tolerancia a la glucosa? 4. ¿Cuál es la finalidad de la prueba de hemoglobina glicosilada? 5. Si llega un(a) paciente solicitando una curva de tolerancia a la glucosa con

una carga de 75 g, se le toma la muestra para glucosa basal y se obtiene una concentración de 180 mg/dl,¿ le daría la carga? ¿Por qué?

6. ¿Qué factores pueden influir en los resultados de la concentración de glucosa?


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5 PROTEÍNAS

ALUMNO

OBJETIVO: Conocer la importancia de las proteínas en el organismo, determinar su concentración plasmática y asociarla con posibles alteraciones en los órganos encargados de metabolizarlos. 1. INTRODUCCION

Las proteínas son macromoléculas constituidas por las polimerización de aminoácidos, que se unen entre si por medio de enlaces peptídicos. Las proteínas pueden ser clasificadas en función de aspectos tan diversos como su composición, disposición espacial, función biológica y localización. Atendiendo a su composición, pueden ser simples (albúmina) o conjugadas (nucleoproteínas, glucoproteínas, etc.). De acuerdo a sus funciones biológicas, pueden clasificarse en: estructurales, de transporte, catalizadores biológicos, mensajeros químicos y de defensa inmunológica. Por último, en función de su localización pueden clasificarse en hísticas y hemáticas. Las proteínas presentes en el suero (que son los componentes que más abundan en dicho líquido) poseen enorme importancia en el diagnóstico, debido a las funciones que desempeñan; de entre cuales destacan: fuente de nutrición para los tejidos, participación activa en el metabolismo osmótico, amortiguadores fisiológicos, transporte de diversas sustancias dentro del organismo, unión a fármacos y destoxicación de los mismos, síntesis de anticuerpos, enzimas y hormonas y conservación de la estabilidad física de la sangre. Las principales proteínas del suero son la albúmina (comprende más del 50% de las proteínas en el suero) y las globulinas (alfa1, alfa2, beta y gamma). El hígado sintetiza casi toda la albúmina, así como las globulinas alfa y beta. El sistema retículo endotelial y los plasmocitos inmaduros en bazo, ganglios linfáticos y médula ósea, producen las gammaglobulinas. El fibrinógeno, que es la principal proteína del plasma, no aparece en el suero, porque es transformado en fibrina durante la coagulación. La determinación de proteínas totales puede proporcionar cierta información sobre el estado nutricional del paciente o la presencia de alguna enfermedad. Aparte de la determinación de proteínas totales, resulta de gran importancia clínica, la determinación cualitativa y cuantitativa de los diferentes tipos de proteínas presentes en el plasma. Los fraccionamientos posteriores aportan una información clínica mucho más precisa. La cuantificación adicional de albúmina ofrece información en relación a la capacidad sintética del hígado. Además la diferencia entre las proteínas totales y la albúmina, informa sobre el valor de todas las globulinas. Finalmente, la determinación del patrón electroforético de una paciente (proteinograma) es de utilidad para diagnosticar un gran número de trastornos metabólicos.

Principio de las determinaciones

Proteínas Totales El procedimiento clínico más generalizado para la medición de la concentración de proteínas totales en el suero es sin duda la técnica de Biuret. La determinación se basa en que las proteínas y sus péptidos, a diferencia de otros compuestos nitrogenados, forman, en solución alcalina con iones cobre, un complejo

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químico de color violeta (reacción de Biuret) que es proporcional a la concentración de proteínas en el suero. Albúmina Entre las técnicas para la medición de albúmina, la más empleada es la que se basa en la fijación de ciertos colorantes a ésta proteína. Cuando la Albúmina del suero se encuentra en un medio amortiguador y a pH adecuado, tiene la propiedad de unirse a través de puentes de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals a ciertos colorantes e indicadores como el verde de bromocresol, formando complejos coloridos cuya intensidad es proporcional a la concentración de la albúmina presente en suero. Globulinas La fracción globulínica en el suero puede determinarse de manera sencilla, por la simple diferencia entre las concentraciones de proteínas totales (PT) y albúmina (A). De este modo la concentración de globulinas (G) será: G = PT - A 2. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS



1 Gradilla 1 Equipo comercial para determinación de Proteínas totales y Albúmina.

1 Jeringa de 5 ml 1 Estandar de proteínas totales: 100 mg/dl

1 Torundero 1 Estandar de Albúmina:

1 Ligadura 1 Suero control


100 ml Agua destilada

2 Tubos de ensaye de 13 x 100 MATERIAL BIOLOGICO


1 Tubo al vacío tapón rojo 2 ml Suero

1 Pipetas pasteur

1 Bulbo gotero




1 Guantes de latex

1 Centrífuga

1 Incubadora


3. PROCEDIMIENTO Al igual que en la determinación de glucosa, se deben seguir los procedimientos indicados por el profesor, ya que las determinaciones varían dependiendo de la marca de los reactivos. 1. Indicar al paciente que debe de tener un ayuno de 8 horas. 2. Tomar una muestra de sangre y procesarla para obtener suero. (como se índica

en la práctica No.2). Separar el suero y pasarlo a un tubo limpio y seco.

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3. Para cada determinación, preparar una serie de tubos rotulados: blanco, estándar y muestra problema. Para la cuantificación de proteínas totales y albúmina, se deben seguir los procedimientos indicados por el profesor, ya que las cantidades de muestra y reactivos a emplear, varían dependiendo de la marca de los reactivos.





en la muestra.

Notas 1. Para evitar la contaminación de las soluciones reactivas, se recomienda vaciar

en otro recipiente la cantidad requerida para uso. 2. Preparar siempre un blanco y patrón para tener una lectura confiable. 3. Tener en cuenta los valores de linearidad en caso de obtener valores

incrementados.

4. RESULTADOS Nombre: Fecha de toma: Fecha de análisis: Edad:______. Analito:


PROTEÍNAS TOTALES

ALBÚMINA

GLOBULINAS

Tubo 1 Tubo2 Tubo3




Reactivos indicados

Y ml Y ml Y ml

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Método:

Observaciones: 5. PROCESAMIENTO DE DATOS Valores de referencia

Parámetro Concentración sérica

Proteínas totales 6.7 – 8.7 g/dl

Albúmina 3.6 – 5.1 g/dl

Globulinas 1.8 – 3.6 g/dl

ANALITO

Absorbancia del

estándar

Absorbancia de

la muestra problema

Cálculos

estadísticos

1° 2° 3° 1° 2° 3° M D.E C.V. %E

Proteínas totales

Albúmina

Globulinas

Cálculos:

Interpretación de resultados

Proteínas totales

El aumento en la concentración total de proteínas sérica se relaciona por lo general con deshidratación o con el aumento de una de las fracciones globulínicas. La baja concentración de las proteínas totales del suero se pude presentar en el síndrome nefrótico o en casos de desnutrición. Albúmina La hipoalbuminemia es un hallazgo característico de las enfermedades hepáticas evolucionadas, el síndrome nefrótico o desnutrición.

Globulinas

Un aumento de globulinas es característico de inflamaciones agudas, en tanto que su disminución esta relacionada con problemas hepáticos o inmunosupresión.

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6. CUESTIONARIO 1. ¿Qué datos nos ofrece la determinación de proteínas en suero sobre las

siguientes alteraciones: gastrointestinales, hepáticas, hematológicas, inmunológicas y renales?

2. ¿En qué consiste el estudio electroforético de proteínas? 3. ¿Qué es un proteinograma? 7. REPORTE TÉCNICO a)- MARCO TEÓRICO. b)- DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS. c)- RESULTADOS d)-DISCUSIÓN DE RESULTADOS. e)- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. f)- BIBLIOGRAFÍA.

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6 COMPUESTOS NITROGENADOS NO PROTÉICOS

ALUMNO

OBJETIVO: Conocer la importancia de determinar los compuestos nitrogenados no proteicos y su asociación con alteraciones en el metabolismo de proteínas y aminoácidos, así como con problemas renales.

1. INTRODUCCION

El metabolismo es la suma de los procesos bioquímicos que tienen lugar en el interior de una célula viva; para que se lleve a cabo es necesario que surjan una serie de fenómenos (metabolismo intermediario) a fin de que los diversos sustratos lleguen y se incorporen a las células. El mecanismo de incorporación es complejo y con numerosas variantes. En el organismo, las células seleccionan los sustratos que van a utilizar, almacenan los que requieren y eliminan los que no pueden aprovechar (productos finales del metabolismo). Los productos finales del metabolismo de importancia clínica son: Urea, creatinina y ácido úrico. La urea constituye el principal producto de excreción del metabolismo proteico. Es sintetizada en el hígado a partir de los aminoácidos, de allí pasa a sangre y finalmente es eliminada vía renal en la orina. La urea constituye el 80 - 90 % del nitrógeno excretado (el nitrógeno ureico constituye aproximadamente el 45% del nitrógeno no proteínico total del suero o plasma). La concentración de nitrógeno ureico en la sangre representa el equilibrio entre la velocidad de síntesis de la urea en el hígado y la de excreción de esta sustancia por el riñón. Los niveles sanguíneos de urea incrementan (uricemia) cuando la excreción glomerular disminuye, por lo que constituye un indicador de insuficiencia renal. Los métodos para la determinación de urea pueden clasificarse en dos grupos: a) Métodos directos: los cuales consisten en la condensación de la urea con diacetilo para formar un cromógeno cuantificable (medible). b) Métodos Indirectos: consisten en la determinación de amonio resultante de la reacción de la ureasa sobre la urea. La creatinina es un producto final que deriva de la creatina (compuesto nitrogenado no proteico, que se encuentra en forma de fosfocreatina) del tejido muscular. Durante el ejercicio la fosfocreatina es desfosforilada, manteniendo el aporte de ATP que es la fuente inmediata de energía para la contracción muscular. La creatinina libre, no se utiliza en el metabolismo y funciona únicamente como producto de excreción de la creatina. Tras pasar a la sangre, se elimina en su mayoría a nivel renal. Por lo tanto, todas las causas de lesión renal pueden ser responsables de la elevación de creatinina sérica, ya que evitan su excreción. La medición de la excreción de creatinina es una medición específica, muy útil para determinar función renal, en especial la filtración glomerular. la mayoría de los métodos para la determinación de cratinina se basan en la reacción de Jaffé, desafortunadamente este método tan simple es inespecífico, existiendo algunas sustancias en la sangre que también reaccionan con el reactivo. El ácido úrico es un ácido orgánico débil que constituye el producto terminal de la degradación de las purinas, procedentes del catabolismo de los ácidos nucleicos. En el organismo existen alrededor de 1200 mg de ácido úrico, se encuentra en sangre y articulaciones como sal de sodio, urato monosódico.

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Diariamente son elminados unos 700 mg de ácido úrico, el 60% lo hace a través de la orina y el resto es eliminado con la bilis (vía hepática) y los jugos gástrico y pancreático. La elevación en los nivles séricos de ácido úrico (hiperuricemia), puede estar originada por: incremento en la síntesis de ácido úrico (hiperuricemia metabólica) o un déficit de su excreción a nivel renal (hiperuricemia renal); lo anterior trae como consecuencia el depósito de ácido úrico en forma de uratos, que provocan una reacción inflamatoria en diversas localizaciones (“gota”). El ácido úrico se mide en sangre, orina u otros líquidos corporales mediante técnicas colorimétricas o bien por métodos enzimáticos.

Principio de las determinaciones

Urea (método enzimático) La hidrólisis de la urea, por la enzima ureasa produce amoníaco y ácido carbónico; el amoníaco se cuantifica por medio de la cetoglutarato catalizada por la enzima glutamato aminación reductiva del deshidrogenasa, con la oxidación simultánea del nicotinamin-adenin-dinucleótido reducido (NADH) (Fig. ). La disminución en la extinción debida al consumo de NADH, es directamente proporcional a la concentración de urea presente en la muestra. Creatinina (reacción de Jaffé) La creatinina y otros cromógenos presentes en el plasma; en medio alcalino, reaccionan con el ión picrato dando un complejo de color amarillo. La concentración del complejo colorido producido en un determinado tiempo de reacción corresponde a la concentración de creatinina. Ácido Úrico (método enzimático) El ácido úrico se transforma en presencia de oxígeno y la enzima uricasa, en alantoína y peróxido de hidrógeno. Este último reacciona simultáneamente con el ácido 2-OH-3,5-diclorobencensulfónico (2-OH-3,5-DCBS) y con 4-aminoantipirina (4-AAP), formando una quinonimina roja. La absorbancia de la quinonimina producida es proporcional a la concentración de ácido úrico presente en la muestra. 2. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS



1 Gradilla 1 Equipo comercial para determinación de urea

1 Jeringa de 5 ml 1 Equipo comercial para determinación de creatinina

1 Torundero 1 Equipo comercial para determinación de ácido úrico

1 Ligadura 1 Estandar de urea


1 Estandar de creatinina

2 Tubos de ensaye de 13 x 100 1 Estandar de ácido úrico

2 Tubos de ensaye de 12 x 75 1 Suero control

1 Tubo al vacío tapón rojo 100 ml Agua destilada

1 Pipetas pasteur

1 Bulbo gotero



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1 Guantes de latex

1 Centrífuga

1 Incubadora


MATERIAL BIOLOGICO


2 ml Suero

3. PROCEDIMIENTO 1. Indicar al paciente que debe de tener un ayuno de 8 horas. 2. Tomar una muestra de sangre y procesarla para obtener suero. (como se índica

en la práctica No.2). Separar el suero y pasarlo a un tubo limpio y seco. 3. Para cada determinación, preparar una serie de tubos rotulados: blanco,

estandar y muestra problema. Para la cuantificación de urea, creatinina y ácido úrico se deben seguir los procedimientos indicados por el profesor, ya que las cantidades de muestra y reactivos a emplear, varían dependiendo de la marca de los reactivos.





en la muestra.



incrementados. 4. RESULTADOS Nombre:

Tubo 1 Tubo2 Tubo3




Reactivos indicados

Y ml Y ml Y ml

32

Fecha de toma: Fecha de análisis: Edad:______. Analito:


CREATININA

UREA

ACIDO URICO

Método:

Observaciones:

5. PROCESAMIENTO DE DATOS

Valores de referencia en suero

Parámetro Resultado

Urea 20 - 40 mg / dl

Cratinina 0.5 –1.5 mg / dl

Ácido úrico 2.5 - 7.3 mg / dl

ANALITO

Absorbancia del

estándar

Absorbancia de

la muestra problema

Cálculos

estadísticos

1° 2° 3° 1° 2° 3° M D.E C.V. %E

Urea

Creatinina

Ácido úrico

Cálculos:

33

Interpretación de resultados

Urea Aumentado: Causas prerenales (descompensación cardiáca, deshidratación ocasionada por ingesta reducida o pérdida excesiva de agua, aumento del catabolismo proteico). Causas renales (glomerulonefritis aguda, nefritis crónica, riñón poliquístico, necrosis tubular). Causas postrenales: Cualquier tipo de obstrucción del tracto urinario. Disminuido: Es menos frecuente y ocurre primariamente en enfermedad hepática avanzada. Creatinina La concentración de creatinina en suero es una excelente prueba para valorar la función renal. En pacientes con nefropatías conocidas, la existencia de concentraciones permanentes de 2.5 a 4.9 mg/dl. significa una grave disminución de la función renal. Las concentraciones de 5.0 a 9.9 mg/dl demuestran la existencia de enfermedad renal muy grave. Las concentraciones por encima de 100 mg/dl ponen en evidencia que es el momento de considerar el tratamiento de reemplazo crónico ya sea bajo la forma de diálisis permanente o de un transplante renal. Acido úrico Aumentado: Gota, leucemia, anemia Disminuido: Acromegalia, tratamiento de salicilatos. Orientación hacia el diagnóstico de enfermedades primarias como: trastornos de los túbulos proximales del riñón; en enfermedad de Wilson. Deficiencia hereditaria de xantinaoxidasa 6. CUESTIONARIO

1. ¿Qué refleja el incremento de urea y creatinina en el suero de un paciente? 2. ¿Qué padecimientos incrementan los valores de creatinina y de urea? 3. ¿Qué factores influyen en los resultados de un examen de ácido úrico?


34


7 METABOLISMO DE LÍPIDOS

ALUMNO

OBJETIVO: Conocer la importancia de los lípidos en el organismo, así como las alteraciones que se pueden presentar en su metabolismo y la manera de identificarlas.

1. INTRODUCCION

Los lípidos son un grupo heterogéneo de compuestos, que tienen la propiedad común de ser relativamente insolubles en agua y solubles en los solventes no polares como el éter, cloroformo y benceno. Los principales lípidos en la bioquímica corporal son: triglicéridos, ácidos grasos, colesterol y fosfolípidos. Entre las variadas funciones de los lípidos destacan: fuente energética del organismo, forma de almacenamiento de energía, constituyentes de las membranas celulares y de las lipoproteínas plasmáticas, agentes emulsificantes (del colesterol, proceden los ácidos biliares), compuestos funcionales (hormonas esteroides, prostaglandinas, vitaminas, etc.). Los lípidos, para ser transportados en el cuerpo, deben combinarse con proteínas plasmáticas formando un complejo lípido-proteínico (lipoproteína). De este modo, los ácidos grasos libres se unen a albúmina, en tanto que el colesterol libre y esterificado, triglicéridos y fosfolípidos se unen a una globulina. La alteración en las fracciones de lípidos circulantes en el torrente sanguíneo, es un fiel reflejo de una serie de alteraciones orgánicas de diversa etiología y gravedad, cuya importancia clínica está relacionada fundamentalmente con la arterioesclerosis. En la actualidad, ha quedado bien establecido que las alteraciones en el metabolismo de lípidos, constituyen el factor causal más importante en el origen de las enfermedades cardivasculares. En general, las determinaciones a realizar para el estudio de los lípidos son: colesterol, triglicéridos y lipoproteínas (colesterol-HDL y colesterol-LDL). La mayor parte del colesterol del cuerpo se origina por síntesis (cerca de 1 g/día) mientras la dieta promedio, suministra 0.3 g/día; prácticamente todos los tejidos son capaces de sintetizar colesterol, teniendo particular importancia el hígado e intestino. El colesterol es el precursor de las hormonas esteroides y de los ácidos biliares, así como un constituyente esencial de las membranas celulares. El colesterol, circula en la sangre unido a las lipoproteínas: las LDL transportan el 35 - 45% del colesterol, las HDL del 15 – 20% y el resto circula unido a las VLDL y los quilomicrones. Los triglicéridos, también llamados grasas neutras, son ésteres de ácidos grasos y glicerol; constituyen alrededor del 95% del tejido adiposo y representan la principal forma de almacenamiento de lípidos. Los triglicéridos son transportados en el plasma fundamentalmente en forma de quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Las lipoproteínas, son macromoléculas compuestas por: triglicéridos, colesterol, fosfolípidos y proteínas (apoproteínas). La proporción en que se encuentran cada uno de sus componentes, determina las propiedades fisicoquímicas y funcionales de las lipoproteínas. En base a su densidad, las lipoproteínas se han clasificado en: quilomicrones (Q), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta

35

densidad (HDL). La densidad y composición de cada una de las lipoproteínas se muestran en el siguiente cuadro:

Lipoproteí

na

Densidad g./ml

Composición %

Proteínas Triglicéridos

Colesterol Fosfolípidos

Q < 0.950 0.5-2.0 80.0-95.0 2.0-5.0 3.0-6.0

VLDL 0.950-1.006 12.0 40.0-80.0 10.0-40.0 15.0-20.0

LDL 1.006-1.063 25.0 10.0 45.0 20.0

HDL 1.063-1.210 50.0 1.0-5.0 20.0 30.0

El colesterol en las lipoproteínas de baja y alta densidad es la fracción más importante, pues se ha demostrado que dicho alcohol en éstas lipoproteínas guarda relación con el riesgo a presentar arteriopatía coronaria. Principio de las determinaciones Colesterol El colesterol y sus ésteres se librearan de las lipoproteínas por los detergentes. La colesterol-estearasa hidoliza los ésteres. A continuación se lleva a cabo la oxidación enzimática por la colesterol-oxidasa, con la producción de H2O2. El peroxido formado, por acción de la peroxidasa, reacciona con 4-aminoantiporina y fenol, dando origen al colorante 4- (p-benzoquinona-monoamino)-fenazona, cuya formación es proporcional a la cantidad de colesterol presente en la muestra. Triglicéridos Se han desarrollado una amplia gama de métodos para medir los triglicéridos plasmáticos, pero los más utilizados con fines clínicos son los basados en la hidrólisis de los triglicéridos y la determinación del glicerol liberado en la reacción. Las reacciones pueden llevarse a cabo química o enzimáticamente. Los triglicéridos son hidrolizados enzimáticamente con lipasas a glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol liberado, en presencia de glicerol cinasa (GC) y ATP, produce glicerol-3-fosfato, que a su vez en presencia de la glicerol-fosfato-oxidasa (GPO), produce dihidoxiacetona fosfato más peróxido. El peróxido formado, en presencia de peroxidasa (POD), por reacción con 4-aminoantipirina y 2-clorofenol, forman el colorante: 4- (o-benzoquinona-monoamino)-fenazona, cuya formación es proporcional a la cantidad de triglicéridos presentes en la muestra. Colesterol HDL y LDL La determinación de lipoproteínas de alta y baja densidad, se puede realizar por separación de las mismas, empleando un reactivo precipitante (ácido fosfotúngstico o policationes) y la posterior determinación de colesterol ( por técnica enzimática). Aunque también existen equipos para la determinación de colestero-HDL sin precipitación, empleando método colorimétrico. 2. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS



1 Gradilla 1 Equipo comercial para determinación de triglicéridos

1 Jeringa de 5 ml 1 Equipo comercial para determinación de colesterol

1 Torundero 1 Equipo comercial para determinación de LDL y HDL-colesterol

1 Ligadura 1 Estandar de triglicéridos

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1 Estandar de colesterol

2 Tubos de ensaye de 13 x 100 1 Estandar de LDL y HDL-colesterol

2 Tubos de ensaye de 12 x 75 1 Suero control

1 Tubo al vacío tapón rojo 100 ml Agua destilada

1 Pipetas pasteur

1 Bulbo gotero




1 Guantes de latex

1 Centrífuga

1 Incubadora


MATERIAL BIOLOGICO


2 ml Suero

3. PROCEDIMIENTO

1. Indicar al paciente que debe de tener un ayuno de 12 horas. 2. Tomar una muestra de sangre y procesarla para obtener suero. (como se

índica en la práctica No.2). Separar el suero y pasarlo a un tubo limpio y seco. 3. Para cada determinación, preparar una serie de tubos rotulados: blanco,

estandar y muestra problema. Para la cuantificación de triglicéridos, colesterol, LDL y HDL-colesterol se deben seguir los procedimientos indicados por el profesor, ya que las cantidades de muestra y reactivos a emplear, varían dependiendo de la marca de los reactivos.


Nota: todos los tubos deberán contener el mismo volumen final = X + Y.

5. Mezclar cada tubo, como lo indique el profesor. 6. Seguir las condiciones de incubación indicadas. 7. Conectar y poner en marcha el espectrofotómetro. 8. Elegir la longitud de onda de acuerdo a la determinación que se vaya a

realizar. 9. Calibrar el espectrofotómetro a cero de absorbancia. Esto se hace empelando

el contenido del tubo 1.

Tubo 1 Tubo2 Tubo3




Reactivos indicados

Y ml Y ml Y ml

37

10. Realizar las lecturas de los tubos 2 y 3, anotando las absorbancias de cada uno.

11. Realizar por triplicado las lecturas. 12. Terminadas las lecturas, verificar que no quede ninguna celda dentro del

espectrofotómetro, apagar el equipo y revisar que no queden celdas sucias. 13. Realizar los cálculos correspondientes para obtener la concentración de

glucosa en la muestra. Notas 1. Para evitar la contaminación de las soluciones reactivas, se recomienda vaciar


incrementados.

4. RESULTADOS Nombre: Fecha de toma: Fecha de análisis: Edad:______. Analito:


COLESTEROL

TRIGLICÉRIDOS

HDL- colesterol

LDL- colesterol

Método:

Observaciones:



Colesterol 150 - 250 mg/dl

Para la determinación del riesgo de hipercolesterolemia se considera: Sospechoso a partir de 220 mg/dl Elevado a partir de 260 mg/dl

Triglicéridos 10 – 150 mg/dl Para la determinación del riesgo de hipertrigliceridemia se considera:

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Sospechoso a partir de 150 mg/dl Elevado a partir de 200 mg/dl

Lipoproteínas HDL-coelsterol 29 – 77 mg/dl

LDL-coelsterol 62 –185 mg/dl

ANALITO

Absorbancia del

estándar

Absorbancia de

la muestra problema

Cálculos

estadísticos

1° 2° 3° 1° 2° 3° M D.E C.V. %E

Colesterol

Triglicéridos

HDL- colesterol

LDL- colesterol

Cálculos: Interpretación de resultados Colesterol Hipercolesterolemia: Puede denotar riesgo de arteriopatía coronaria así como de hepatitis insipiente, trastorno de lípidos, bloqueo de conductos biliares, pancreatitis e hipotiroidismo. Hipocolesterolemia: Suele guardar relación con desnutrición, necrosis celular del hígado e hiperiroidismo. Triglicéridos Niveles elevados de triglicéridos se consideran riesgo extraordinario de sufrir arteriopatía coronaria. El incremento moderado puede significar obstrucción de vías biliares, diabetes o síndrome nefrótico. Los niveles extraordinariamente incrementados pueden significar hiperlipoproteinemia congénita. La disminución de los niveles séricos es rara y se observa en casos de desnutrición o abetalipoproteinemia. Lipoproteínas Los niveles elevados de LDL aumentan el riesgo de arterioparia coronaria. Niveles altos de HDL indican menor frecuencia a sufrir la cardiopatía antes señalada, pero también pueden denotar hepatitis crónica, cirrosis biliar o alcoholismo.

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6. CUESTIONARIO 1. ¿Cuáles son las vías del metabolismo de los lípidos? 2. ¿En qué condiciones debe presentarse el paciente al laboratorio para realizar la

determinación de lípidos? 3. ¿Cómo puede interferir en los resultados una muestra hemolizada, ictérica y

lipémica? 4. ¿Por qué el suero es la muestra de elección para realizar la determinación de

lípidos? 7. REPORTE TÉCNICO a)- MARCO TEÓRICO. b)- DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS. c)- RESULTADOS d)-DISCUSIÓN DE RESULTADOS. e)- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. f)- BIBLIOGRAFÍA.

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8 EXÁMEN GENERAL DE ORINA

ALUMNO

OBJETIVOS: Con base en la composición normal de la orina, detectar alteraciones en vías urinarias o poner de manifiesto la existencia de alteraciones metabólicas de diversa etiología, realizando un examen general de orina, teniendo en cuenta todos los cuidados que requiere el estudio, desde la toma de muestra hasta la obtención e interpretación de resultados.

1. INTRODUCCION

El tracto urinario representa la vía de eliminación de los derivados metabólicos y químicos no esenciales disueltos en agua. De las estructuras que constituyen el tracto urinario, los riñones son los de mayor interés, éstos poseen la notable propiedad de seleccionar y retener las sustancias esenciales, excretando al mismo tiempo los productos de desecho del metabolismo y el exceso de los ingeridos con la dieta; mantienen el equilibrio del agua y los electrolitos, contribuyendo de manera fundamental en la homeostasia ácido-básica. El Examen General de Orina es el conjunto de pruebas que se realizan para descubrir sustancias o componentes que normalmente no se encuentran en la misma. El estudio de muestras de orina puede plantearse desde dos puntos de vista: diagnóstico y tratamiento de enfermedades metabólicas o sistémicas, no directamente relacionadas con el sistema urinario. El examen general de orina incluye la evaluación de sus características físicas (color, olor, aspecto, densidad), estudio químico (pH, proteínas, glucosa, cuerpos cetónicos, sangre, bilirrubina, urobilinógeno, nitritos) y la evaluación microscópica del sedimento urinario (células, cristales, cilindros). Para el estudio rutinario de la orina, es mejor una muestra concentrada que una diluida, la concentración de solutos y de elementos formes varía a lo largo del día y depende de la ingesta de líquidos. La primera orina eliminada por la mañana, al levantarse, suele ser la más concentrada, ya que el paciente no ha bebido agua; en consecuencia es la más adecuada para el estudio. Para realizar un examen general de orina deben emplearse muestras recientes (dentro de la primera hora de la micción) o bien refrigerarlas y estudiarlas tan pronto como sea posible. La muestra de orina debe ser colectada en un recipiente limpio de boca ancha, tomando en cuenta las siguientes consideraciones: Sexo masculino: Si no presenta circuncisión, desplazar hacia atrás el prepucio, y limpiar la porción anterior del glande (desde el orificio uretral hacia fuera). Desechar la primera porción de orina en el migitorio y recoger directamente en el recipiente, una muestra de 20 a 50 ml. Sexo femenino: Colocarse en cuclillas o parada a horcajadas sobre el excusado. Separar con los dedos los labios menores, de manera que exponga el meato uretral. Limpiar la zona alrededor del meato (desde el orificio del meato hacia fuera). Orinar manteniendo la separación de los labios y se desechar la porción inicial de orina, dejándola caer en el interior del excusado. Colocar el recipiente para la recolección de la muestra bajo el chorro y recoger de 20 a 50 ml de orina. Liberar los labios menores y se desechar el resto de la orina en el excusado. En niños que todavía no han adquirido el control sobre la micción, se utilizan métodos especiales que proporcionen muestras aceptables, evitando en lo posible

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técnicas invasivas. El método más empleado consiste en utilizar bolsas de poliestireno estéril, que se adhieren a la piel perineal envolviendo completamente los genitales externos del niño. 2. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS



1 Gradilla 1 Equipo comercial de tiras reactivas para urianálisis


100 ml Agua destilada

1 Guantes de latex MATERIAL BIOLOGICO

1 Centrífuga cantidad Descripción

1 Microscopio 50 ml Orina reciente

1 caja Portaobjetos

1 caja Cubreobjetos

1 Frasco estéril para recolección de orina

3. PROCEDIMIENTO I. Examen físico 1. Homogeneizar perfectamente la muestra. 2. Anotar el volumen obtenido de la muestra. 3. En un tubo limpio y seco, colocar 10 ml de orina y observarla a contraluz. 4. Reportar el color, olor y aspecto observados. II. Análisis químico Principio: El análisis se basa en el empleo de la química “seca”, mediante el uso de tiras reactivas multipruebas de lectura visual. Las tiras reactivas comerciales contienen en los cojines de prueba indicadores que al entrar en contacto con la muestra de orina, permiten identificar la presencia diversos metabolitos. Procedimiento 1. Retirar una tira reactiva del frasco, cerrando enseguida el mismo. 2. Sumergir la tira en un tubo de ensaye que contenga 10 ml de la muestra de orina,

procurar que se cubran todas las áreas reactivas y retirar la tira inmediatamente para evitar la disolución de los reactivos. Eliminar el exceso de orina rasando el canto de la tira en el borde del tubo.

3. Mantener la tira en posición horizontal para evitar la mezcla de las sustancias químicas en áreas adyacentes.

4. Comparar las áreas reactivas con los correspondientes cuadros de color en la carta de lectura que acompaña al frasco.

5. Sostener la tira reactiva lo más cerca posible de la carta de colores y comparar cuidadosamente, en el tiempo que se indica. Evitar tocar la carta de colores con la tira, ya que esto ocasiona contaminación.

6. Registrar sus resultados. Notas: 1. La lectura de la tira reactiva al tiempo exacto es esencial para obtener óptimos

resultados. 2. El empleo de orina de reciente emisión, bien mezclada y sin centrifugar es muy

importante para el buen desarrollo de la prueba. 3. El reporte es cualitativo o semicuantitativo, reportándose con cruces que van

desde una hasta cuatro como máximo.

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III. Análisis de sedimento

1. Centrifugar 10 ml de orina a 2000 r.p.m. durante 5 minutos. 2. Descartar todo el sobrenadante, dejando en el tubo un volumen no mayor de 0.5

ml. 3. Resuspender el sedimento residual. 4. Montar una preparación en fresco, colocando en un portaobjetos una gota del

sedimento resuspendido. 5. Cubrir con un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas. 6. Observar la muestra al microscopio con el objetivo 40X. Es necesario emplear

intensidad lumínica media, para ayudar a localizar los diferentes tipos de estructuras en la muestra. Revisar 10-15 campos y registrar sus observaciones.

Nota Los portaobjetos y cubreobjetos deben estar escrupulosamente limpios, para permitir una mejor identificación de las estructuras contenidas en la muestra. 4. RESULTADOS Nombre: Fecha de toma: Fecha de análisis: Edad:______. Analito: EXAMEN FISICO-QUIMICO RESULTADO VALORES DE

REFERENCIA

COLOR

OLOR

ASPECTO

DENSIDAD

pH

EXAMEN MICROSCOPICO

LEUCOCITOS POR CAMPO

ERITROCITOS POR CAMPO

CELULAS EPITELIALES

CILINDROS POR CAMPO

CRISTALES

FILAMENTO MUCOSO

LEVADURAS

BACTERIAS

PARÁSITOS

EXAMEN QUÍMICO

PROTEÍNAS

GLUCOSA

CUERPOS CETÓNICOS

HEMOGLOBINA

UROBILINÓGENO

BILIRRUBINA

NITRITOS

Método:

Observaciones:

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Parámetro Resultado

Color Amarillo claro

Olor Característico

Aspecto Cristalino o transparente

Densidad 1.025 – 1.030

PH 4.5 – 8.0

Proteínas, glucosa, cuerpos cetónicos, sangre, bilirrubina, nitritos.

Negativo

Urobilinógeno 0.1 - 1.0 mg/dl

Eritrocitos 0 – 3 / campo 40x

Leucocitos 0 – 4 / cmapo 40x

Células epiteliales Escasas

Cilindros Ocasionales

Cristales Ocasionales

Levaduras Negativo

Parásitos Negativo

Interpretación de Resultados

Color: El color de la orina puede ser afectado por componentes como pigmentos, colorantes, sangre u otras sustancias. Aspecto: La orina normal de reciente emisión es usualmente clara o transparente. Una apariencia turbia o lechosa, indica alguna alteración por enfermedad. Densidad: La densidad y el índice de refracción permiten apreciar la concentración relativa de solutos en la orina. Estos datos constituyen indicadores bastante precisos del equilibrio hídrico y osmótico del organismo cuya conservación es la principal función del riñón. Una densidad baja se presenta en casos de diabetes insípida, glomerulonefritis e insuficiencia renal entre otros. Una densidad alta puede presentarse en casos de trastornos hepáticos, insuficiencia congestiva cardiaca o deshidratación. PH: Acido: Síndrome de Fanconi, alcalosis metabólica o respiratoria. Alcalino: Tuberculosis renal, pirexia, fenilcetonuria. Urobilinógeno: Aumentado: Anemia hemolítica, anemia perniciosa, malaria, hepatitis infecciosa, hepatitis tóxica, cirrosis portal, insuficiencia cardiaca congestiva, mononucleosis infecciosa. Disminuido: Obstrucción parcial o total de los conductos biliares (colelitiasis, enfermedades inflamatorias, enfermedades neoplásicas, terapia antibiótica).

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Leucocitos: En abundancia denotan inflamación de vías urinarias, especialmente cistitis y pielonefritis. Generalmente se ven neutrófilos en infecciones, donde el urocultivo generalmente es positivo. Se pueden observar eosinófilos y linfocitos, donde la presencia de eosinófilos indicaría nefritis intersticial aguda, y de los últimos, una infiltración renal, como en la enfermedad túbulo-intersticial crónica. Células epiteliales: El número excesivo de células epiteliales denota la fuerte posibilidad de degeneración tubular activa en casos de necrosis tubular. Son producto del barrido que hace la orina por el tracto urinario. Son de relevancia clínica las células epiteliales de los túbulos renales, que son generalmente 1.5 a 3 veces más grandes que las células de la serie blanca, y tienen un gran núcleo redondo. Debido a que es difícil distinguir las células de origen tubular, de aquellas que se originan en el tracto urinario inferior, sólo es relevante el hallazgo de cilindros de células epiteliales para indicar el origen renal de las células. Éstos sugieren múltiples enfermedades, entre las que se incluye necrosis tubular aguda, pielonefitis y Sd. nefrótico. Cilindros: Son aglomeraciones de proteínas que se forman en los túbulos renales (lo que les da la forma cilíndrica). Tienen una matriz orgánica, compuesta principalmente de las mucoproteínas Tamm-Horsfall. Hay muchos tipos, algunos de ellos pueden verse en individuos sanos, mientras que otros pueden ser diagnóstico de enfermedad renal. Cilindros hialinos: No son indicadores de enfermedad, y se observan en personas post ejercicio, fiebre, deshidratación, uso de diuréticos y métodos de contraste. Se observan poco refringentes, de bordes rectilíneos, y extremos redondeados. Cilindros hemáticos: Están formados por eritrocitos o restos de ellos. Son diagnósticos de glomerulonefritis aguda o vasculitis. Cilindros de glóbulos blancos: Se forman por leucocitos principalmente. Se originan en enfermedades túbulo-intersticiales o pielonefritis aguda. Pueden verse en alteraciones glomerulares también. Cilindros de células epiteliales: Se asocian a necrosis tubular aguda y glomerulonefritis aguda en los cuales se descaman las células epiteliales de los túbulos renales. Cilindros grasos: Generalmente son cilindros de células epiteliales que en sus citoplasmas poseen gotas de colesterol o colesterol ester, o se pueden ver libres en la orina. Se observan en varias glomerulopatías, especialmente en Sd. nefrótico. Cilindros granulosos: Son cilindros de proteínas agregadas o de células antiguas que se han desintegrado. Se ven principalmente en necrosis tubular aguda. Cilindros céreos: Son la última etapa de degeneración de los cilindros granulosos, y de observa en nefrones con flujo muy disminuido, por lo que se asocian a insuficiencia renal avanzada. Cristales: En general la presencia de cristales en la orina reviste poca importancia clínica. Aunque en abundancia permanente pueden sugerir presencia de cálculos renales, para la identificación exacta de los cristales es importante conocer el pH, esto es útil para la separación preliminar. El hecho que se formen cristales en la orina dependen de muchos factores, como el grado de sobresaturación de sus constituyentes, pH, la presencia de inhibidores de cristalización, etc. Hay muchos tipos de cristales que pueden ser observados en pacientes con distintas alteraciones: Cristales de ácido-úrico: se observan solo en orinas ácidas, que favorece la conversión de sales úricas relativamente solubles en ácido úrico que es insoluble. Tienen forma romboidea o de rosetas, y se ven en pacientes con gota, o con nefropatía aguda y crónica por uratos.

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Cristales de fosfato de calcio u oxalato de calcio: la formación de los cristales de oxalato de calcio no depende del pH de la orina, en cambio los de fosfato de calcio se forman en orina alcalina. Su formación es idiopática y se asocia a variados factores de riesgo, como son bajo volumen urinario, hipercalciuria, hiperuricosuria, factores dietéticos como baja ingesta de líquidos y calcio, alta ingesta de sal y proteínas, y antecedentes de cálculos de calcio, entre otros. Cristales de fosfato de magnesio: cuando aumenta el pH de la orina (en infecciones de bacterias que producen ureasa como Klebsiella o Proteus) disminuye la solubilidad del fosfato lo que causa la cristalización del fosfato de magnesio. Levaduras: Los elementos levaduriformes indican una moniliasis urinaria especialmente en pacientes con diabetes mellitus. Parásitos: Usualmente Trichomona vaginalis causando vaginitis. Bacterias (bacteriuria): La orina normal no contiene, si se utilizó la técnica adecuada para obtener la muestra y si se protegió de una contaminación; la presencia de cantidades importantes (bacteriuria) indica infección del tracto urinario. Proteinuria: Indica Nefropatías (glomerulonefritis aguda o crónica, riñón poliquístico, insuficiencia renal aguda o crónica). Eritrocitos (hematuria): La presencia de más de eritrocitos (hematuria) puede indicar enfermedad renal, también se pueden encontrar después del ejercicio exagerado, del paso de cálculos, o por contaminación menstrual. Se puede observar orina de color cefé-rojiza sin la presencia de eritrocitos, como es en el caso de hemoglobinuria y mioglobinuria. La hematuria microscópica se define como la presencia de más de 5 eritrocitos por campo microscópico de gran aumento. Se puede originar en cualquier segmento del tracto urinario. Cuando se presenta con dolor son causadas por nefrolitiasis, infarto renal o ITU. Se presentan en forma sin dolor si son por coagulopatías, tumores (en cualquier parte del tracto), enfermedad poliquística, enfermedades glomerulares o tubulares, daño post traumático, post ejercicio, entre otras. Por todas estas causas es que el significado de hematuria aislada varía según el contexto clínico. La evaluación de las formas de los eritrocitos puede ayudar en un paciente con hematuria. Generalmente en enfermedades glomerulares adquieren forma dismórfica, con pérdida segmentaria de la membrana celular resultando en variadas formas celulares y en una disminución del tamaño celular. Hematuria: Traumatismo de riñón o aparato urinario, enfermedades hemorrágicas, tratamiento con anticoagulantes, esfuerzo excesivo Glucosuria: Diabetes mellitus, síndrome de Cushing, hipertensión intercraneal Cetonuria, Diabetes mellitus, inanición, diarrea, vómito. Bilirrubinuria: Obstrucción de flujo biliar (cálculos en colédoco y carcinoma en páncreas), fibrosis, inflamación peritoneal, tumefacción de los hepatocitos, hepatítis vírica aguda y colestasis por fármacos. Sd. Nefrótico: orina en escasa cantidad, densidad alta o normal, proteinuria mayor de 3.5 gramos, cilindros escasos, aunque pueden ser de tipo hialino, granuloso o graso, lipiduria y glucosuria discreta. Sd. Nefrítico: orina en escasa cantidad, densidad normal-alta, proteinuria leve (menor a 3.5 g/24 horas), cilindros hemáticos, hematuria macro o microscópica. Infección (ITU): aspecto turbio y mal oliente, leucocitos urinarios, placas de pus y bacteriuria. El origen alto o bajo de la infección estará dado por la clínica, aunque la presencia de cilindros leucocitarios indica que la infección compromete el parénquima renal. La presencia de nitritos indica un origen bacteriano. Diabetes Mellitus: orina en gran cantidad, con densidad elevada, de color normal o ligeramente oscuro. Puede existir glucosuria. Se encuentra cetonuria en casos de

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diabetes descompensada (generalmente tipo 1). Se encuentra microalbuminuria en casos de nefropatía inicial, y proteinuria si es más avanzada. 6. CUESTIONARIO

1. ¿Qué es la orina? 2. Describa la composición química de la orina normal. 3. Defina cada uno de los trastornos siguientes: gota, glomerulonefritis, pielitis,

pielonefritis, cistitis, nefrosis, riñones poliquísticos, insuficiencia renal e infecciones de las vías urinarias.

4. ¿Cómo puede influir en los resultados las siguiente condiciones: - Muestra de orina recolectada en frasco no estéril. Por ejemplo “frascos

gerber”, “topers”, “botellas de refresco”. - Muestra de orina refrigerada por un lapso de 3-5 horas. - Muestra de orina recolectada directamente del inodoro. - Ingesta de medicamentos al momento de la recolección. - Muestra de orina con residuos de semen y con la menstruación.


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9 ELECTROLITOS

ALUMNO

OBJETIVO: Conocer la importancia de los electrolitos en el organismo y los métodos empleados para cuantificarlos.

1. INTRODUCCION De todas las sustancias disueltas en los distintos compartimientos corporales, los iones libres (electrolitos), contribuyen de forma decisiva al mantenimiento de la composición del medio interno (homeostasis), regulando la osmolaridad, el estado de hidratación y el pH del mismo. Los electrolitos son sustancias que se disocian en iones cuando se disuelven en la sangre. Los que poseen carga positiva se denominan cationes y los que tienen carga negativa, aniones. Fuera de la célula los electrolitos más importantes son: sodio (catión más abundante), cloruro (anión más numeroso), calcio y bicarbonato. Los principales electrolitos intracelulares son: potasio (catión más abundante), magnesio y fosfato (anión que se encuentra en mayor proporción). El organismo funciona adecuadamente sólo si los riñones y pulmones, con la participación de hormonas, conservan el equilibrio de electrolitos entre los compartimientos intra y extracelular. Los riñones pueden intercambiar hidrógeno por sodio o potasio, y absorber o excretar iones de bicarbonato o de cloruro para conservar el pH adecuado. Además, las concentraciones séricas de electrolitos influyen en la entrada y salida de líquidos de los compartimentos corporales. En condiciones normales, existe un estado de neutralidad eléctrica, de manera que todo aumento en un determinado anión, va acompañado de la disminución de otro, o de un aumento en uno o más cationes. El mantenimiento del equilibrio hidro-electrolítico, depende sobre todo, del equilibrio entre ingresos y pérdidas. Agua y electrolitos ingresan normalmente en el organismo con la comida y la bebida y son excretados con la orina, las heces, el sudor y el aire expirado. Por su gran accesibilidad, el suero, es el fluido biológico de elección para evaluar aniones y cationes del organismo. Las determinaciones de electrolitos se pueden hacer empleando técnicas colorimétricas o bien empleando fotometría de llama (muy empleado en las determinaciones de sodio y potasio). El principio que sirve de base a la fotometría de llama implica la excitación de los electrones de un átomo por la energía térmica de una llama. Los electrones, al resultar inestables en este estado excitado, ceden su exceso de energía al ambiente al pasar de un estado de mayor energía (excitado) al de menor. Si la energía se disipa en forma de luz, ésta puede constar de uno o más niveles de energía y, por tanto, poseer diferentes longitudes de onda o líneas de espectro, que resultan individualmente características para cada elemento. Los metales alcalinos son relativamente fáciles de excitar en la llama de un mechero del laboratorio. En una llama, el litio produce un color rojo, el sodio un color amarillo, el potasio un color violeta y el magnesio un color azul. En condiciones constantes y controladas, la intensidad luminosa de la onda típicamente producida por cada uno de los átomos resulta directamente proporcional al número de átomos que emiten energía lo cual a su vez es directamente proporcional a la concentración del electrolito en la muestra.

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2. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS



1 Gradilla 1 Equipo comercial para determinación de electrolitos: Na, Cl, K, Ca y P.

1 Jeringa de 5 ml 1 Equipo comercial de estándares de electrolitos: Na, Cl, K, Ca y P.

1 Torundero 1 Suero control

1 Ligadura 100 ml. Agua destilada


MATERIAL BIOLOGICO


1 Tubo al vacío tapón rojo 2 ml Suero

1 Pipetas pasteur

1 Bulbo gotero



1 Guantes de latex

1 Centrífuga

1 Incubadora


3. PROCEDIMIENTO

1. Indicar al paciente que debe de tener un ayuno de 8 horas. 2. Tomar una muestra de sangre y procesarla para obtener suero. (como se

índica en la práctica No.2). Separar el suero y pasarlo a un tubo limpio y seco. 3. Para cada determinación, preparar una serie de tubos rotulados: blanco,

estandar y muestra problema. Para la cuantificación de los electrolitos se deben seguir los procedimientos indicados por el profesor, ya que las cantidades de muestra y reactivos a emplear, varían dependiendo de la marca de los reactivos.


Nota: todos los tubos deberán contener el mismo volumen final = X + Y.

5. Mezclar cada tubo, como lo indique el profesor. 6. Seguir las condiciones de incubación indicadas. 7. Conectar y poner en marcha el espectrofotómetro.

Tubo 1 Tubo2 Tubo3




Reactivos indicados

Y ml Y ml Y ml

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8. Elegir la longitud de onda de acuerdo a la determinación que se vaya a realizar.

9. Calibrar el espectrofotómetro a cero de absorbancia. Esto se hace empelando el contenido del tubo 1.

10. Realizar las lecturas de los tubos 2 y 3, anotando las absorbancias de cada uno.

11. Realizar por triplicado las lecturas. 12. Terminadas las lecturas, verificar que no quede ninguna celda dentro del

espectrofotómetro, apagar el equipo y revisar que no queden celdas sucias. 13. Realizar los cálculos correspondientes para obtener la concentración de

glucosa en la muestra.



incrementados. 4. RESULTADOS Nombre: Fecha de toma: Fecha de análisis: Edad:______. Analito:

ELECTROLITO RESULTADO VALORES DE REFERENCIA

SODIO

CLORO

POTASIO

CALCIO

FOSFORO

Método:

Observaciones:

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Sodio 1.6 – 2.6 mg/dl

Cloro 98 – 109 mmol/l

Potasio 3.6 – 5.5 mmol/l

Calcio 8.5 – 10.5 mg/dl

Fósforo 1.6 – 5.6 mg/dl

ANALITO

Absorbancia del

estándar

Absorbancia de

la muestra problema

Cálculos

estadísticos

1° 2° 3° 1° 2° 3° M D.E C.V. %E

Sodio

Cloro

Potasio

Calcio

Fósforo

Cálculos: Interpretación de Resultados Hiponatremia. Concentración anormalmente baja de sodio en sangre. Se caracteriza por debilidad muscular, dolores de cabeza, hipotensión taquicardia y choque circulatorio. Hipocalemia. Déficit de potasio en sangre, puede derivarse de vómito, diarrea, ingestión excesiva de sodio, neuropatías y uso de algunos diuréticos. Hipocloremia. Déficit de cloro en sangre, suele derivarse de vómito excesivo, deshidratación y uso de ciertos diuréticos.

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Hipomagnesemia. Concentración subnormal de magnesio en sangre. Abarca aumento de irritabilidad neuromuscular y del SNC originando temblores, tetania y posibles convulsiones. Hipermagnesemia. Concentración excesiva de magnesio en sangre. Se acompaña de depresión del sistema nervioso, coma e hipotensión. 6. CUESTIONARIO 1. Defina los conceptos de sustancia no electrolítica y electrolito. Indique ejemplos

específicos de cada una. 2. ¿Cómo se expresa la concentración de iones en un líquido? 3. Calcule la concentración iónica de sodio en un líquido corporal. 4. Indique el mecanismo de regulación de los electrolitos. 5. Defina el concepto de edema. ¿Cuáles son algunas de sus causas? 7. REPORTE TÉCNICO a)- MARCO TEÓRICO. b)- DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS. c)- RESULTADOS d)-DISCUSIÓN DE RESULTADOS. e)- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. f)- BIBLIOGRAFÍA.

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10 ENZIMAS

ALUMNO

OBJETIVO: Conocer la importancia de las enzimas de interés clínico en el organismo.

1. INTRODUCCION

Las enzimas, son proteínas especializadas que catalizan innumerables reacciones bioquímicas necesarias para conservar a las células vivas y con sus funciones. Los diferentes tipos de células del organismo, producen enzimas distintas, y casi todos los tejidos contienen sustancias de muy diversa índole de esta categoría. Cuando los tejidos sufren lesión por enfermedad o por algún defecto, liberan enzimas específicas en la corriente sanguínea, sitio en el que pueden detectarse fácilmente. Por ejemplo, en caso de infarto al miocardio, hepatitis infecciosa y otras enfermedades, la salida de enzimas desde las células “en trance de muerte” es la causa de su incremento en suero. El nivel de una sola enzima en el suero, posiblemente no identifique el sitio de origen, pero la comparación de los niveles de varias enzimas puede aportar datos diagnósticos significativos. Algunas enfermedades que producen síntomas semejantes ocasionan anormalidades perfectamente discernibles en algunas enzimas, razón por la cual la determinación de éstas últimas puede ser útil en el diagnóstico diferencial. En la determinación de enzimas, es sumamente importante el procesamiento adecuado de las muestras, a fin de garantizar la integridad de la estructura proteica. En general no se determina la concentración de las enzimas en los tejidos, sino su actividad. El motivo es que la concentración de las enzimas en el suero (muestra biológica más comúnmente usada) es baja. Sin embargo, dada su elevada capacidad catalítica, es posible determinar su actividad con fiabilidad y, se presupone que, por lo general, la actividad es proporcional a la concentración. Para determinar la actividad de las enzimas es necesario conocer: La estequiometría de la reacción que cataliza, si necesita o no cofactor, la concentración mínima se sustrato y cofactor para alcanzar la máxima velocidad de reacción, las condiciones óptimas de reacción (pH, tiempo de incubación, procesado de la muestra y los reactivos, temperatura) y las características de la técnica analítica. La actividad enzimática se puede determinar analizando: la aparición de algún producto, la desaparición del sustrato y la variación del cofactor o de algún componente de la reacción en el transcurso de la misma. Existen enzimas que aparecen en formas múltiples (isoenzimas) difiriendo en detalles moleculares, pero sin perder su identidad básica. Algunos órganos o tejidos contienen cantidades mayores o menores de una isoenzima en vez de otra, razón por la que la determinación de las isoenzimas aporta mayor información, que medir todo un grupo enzimático. Las isoenzimas pueden ser separadas y cuantificadas por métodos de laboratorio como electroforesis, cromatografía en columna, termoestabilidad, alteraciones del sustrato y empleo de inhibidores. Las técnicas aprovechan algunas de las propiedades fisicoquímicas de la molécula de la isoenzima. Dentro de las enzimas de interés diagnóstico se encuentran: la aspartato aminotransferasa (ASAT), alanino amino transferasa (ALAT), gama glutamil

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transpeptidasa, alfa-amilasa, lipasa, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, lactato deshidrogenasa (LDH) y cratin fosfocinasa (CPK), las dos últimas con sus respectivas isoenzimas. 2. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS



1 Gradilla 1 Equipo comercial para determinación de TGO.

1 Jeringa de 5 ml 1 Equipo comercial para determinación de TGP.

1 Torundero 1 Equipo comercial para determinación de FA.

1 Ligadura 1 Equipo comercial para determinación de TGG

10 Tubos de ensaye de 13 x 100 1 Equipo comercial para determinación de LDH

1 Tubo al vacío tapón rojo 1 Estandar de TGO

1 Pipetas pasteur 1 Estandar de TGP

1 Bulbo gotero 1 Estandar de FA


1 Estandar de TGG


1 Estandar de LDH

1 Guantes de latex 100 ml. Agua destilada

1 Centrífuga MATERIAL BIOLOGICO

1 Incubadora cantidad Descripción

1 Espectrofotómetro 2 ml Suero

3. PROCEDIMIENTO 1. Indicar al paciente que debe de tener un ayuno de 8 horas. 2. Tomar una muestra de sangre y procesarla para obtener suero. (como se índica

en la práctica No.2). Separar el suero y pasarlo a un tubo limpio y seco. 3. Para cada determinación, preparar una serie de tubos rotulados: blanco,

estandar y muestra problema. Para la cuantificación de los enzimas se deben seguir los procedimientos indicados por el profesor, ya que las cantidades de muestra y reactivos a emplear, varían dependiendo de la marca de los reactivos.


Nota: todos los tubos deberán contener el mismo volumen final = X + Y. 5. Mezclar cada tubo, como lo indique el profesor.

Tubo 1 Tubo2 Tubo3




Reactivos indicados

Y ml Y ml Y ml

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6. Seguir las condiciones de incubación indicadas. 7. Conectar y poner en marcha el espectrofotómetro. 8. Elegir la longitud de onda de acuerdo a la determinación que se vaya a realizar. 9. Calibrar el espectrofotómetro a cero de absorbancia. Esto se hace empelando el



en la muestra.



incrementados. 4. RESULTADOS Nombre: Fecha de toma: Fecha de análisis: Edad:______. Analito:

ENZIMA RESULTADO VALORES DE REFERENCIA

TGO

TGP

FA

TGG

LDH

Método:

Observaciones:

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ASAT: 12- 37 U / L (37°C) ALAT: 12 - 31 U / L (37°C) Fosfatasa alcalina: 0 – 138 U / L (37°c) LDH: 90 – 187 U/L (38°C) TGG: HOMBRES 5 – 32 U/L (37°C) MUJERES 9 – 52 U/L (37°C)

ANALITO

Absorbancia del

estándar

Absorbancia de

la muestra problema

Cálculos

estadísticos

1° 2° 3° 1° 2° 3° M D.E C.V. %E

TGO

TGP

FA

TGG

LDH

Cálculos: 6. CUESTIONARIO 1. ¿A qué se debe el aumento de la concentración de las enzimas en el plasma? 2. ¿Cuál es la finalidad de las pruebas de funcionamiento hepático? 3. ¿Qué enzimas al aumentar indican daño celular hepático? 4. ¿Qué enzimas al aumentar indican obstrucción del sistema biliar? 5. Buscar la clasificación de las enzimas séricas según su utilidad clínica 6. ¿En qué unidades se expresa la actividad enzimática? 7. REPORTE TÉCNICO a)- MARCO TEÓRICO. b)- DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS. c)- RESULTADOS d)-DISCUSIÓN DE RESULTADOS. e)- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. f)- BIBLIOGRAFÍA.

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MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

El trabajo en cualquier laboratorio siempre implica un cierto grado de riesgo para la salud. Los principales riesgos a los que se expone el personal que trabaja en el laboratorio son: Incendio y explosión, infecciones, salpicadura de productos corrosivos, irradiación, inhalación de vapores tóxicos, exposición a agentes cancerígenos, cortaduras y pinchazos. Existen reactivos y disolventes que son inflamables, corrosivos, teratogénicos o carcinogénicos, de manera que se deben manipular con precaución. En todos los laboratorios se desechan residuos tóxicos, cuya eliminación se debe realizar por cauces que reduzcan su peligrosidad, para el operador, la población en general y el ambiente.

Una de las maneras de minimizar los riesgos en el laboratorio, es establecer en el personal hábitos higiénicos y seguros en su quehacer diario así como mantener una actitud de alerta y celo en la práctica de laboratorio para evitar los riesgos hacia uno mismo y hacia los demás. Sin normas específicas en el trabajo de laboratorio, se adquieren malos hábitos o vicios en la manipulación de muestras y reactivos, que luego son muy difíciles de corregir y que aumentan el riesgo al que se expone el individuo y el resto del personal del laboratorio o incluso el resto de la población, cuando la mala práctica afecta el desecho de residuos.

Por lo anterior, resulta de gran importancia ser responsable y exigir el cumplimiento de algunas normas básicas dentro del laboratorio de análisis clínicos: 1. Debe usarse bata blanca de manga larga (de algodón) y cambiársela con

frecuencia. 2. Las superficies de trabajo deben limpiarse y desinfectarse diariamente, al inicio y

al final de la jornada de trabajo. 3. Se debe evitar inhalar, ingerir o tener contacto directo con los reactivos. 4. Esta prohibido pipetear con la boca, debiendo usar pipeteadores manuales o

automáticos y tener cuidado de no dejar reactivos destapados o mal cerrados. 5. Los procedimientos que entrañen riesgo de salpicadura deben realizarse en

cabinas de seguridad. 6. Se pondrá especial cuidado en el material punzo cortante, el cual deberá ser

desechado en contenedores especiales. 7. Todos las muestras biológicas se consideran infecciosas y para su manipulación

se requiere el uso obligatorio de guantes de látex; protegiéndose en especial de cortes y rozaduras. Si se llegase a tener contacto con las muestras, se deben lavar las manos y superficies expuestas, con jabón desinfectante y agua abundante.

8. Esta prohibido fumar, comer o beber dentro del laboratorio. 9. No se permite cambiarse o ponerse lentes de contacto en el laboratorio. 10. El vaciado de muestras biológicas debe realizarse con pipetas Pasteur u otro tipo

de pipeta. 11. Los residuos deben descontaminarse antes de su desecho. 12. Se debe desechar el material que ha estado en contacto con muestras

infecciosas. En caso de re usarlo, debe lavarse cuidadosamente. Una infección no se confirma de forma inmediata, por tanto, las medidas de prevención deben de ser estrictas y exigir su riguroso cumplimiento.

Procedimientos de aseo. Siguiendo un esquema por escrito, se debe descontaminar todo el equipo y superficies de trabajo con un germicida como por ejemplo cloro diluido al 10%:

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1. Después de finalizar los procedimientos especificados. 2. Cuando las superficies están ostensiblemente contaminadas. 3. Inmediatamente después del derrame de cualquier material

potencialmente infecciosos. 4. Al final de cada turno de trabajo.

Deben instruirse los procedimientos de limpieza rutinarios para el manejo de recipientes de basura y otros envases. La cristalería rota que puede estar contaminada se maneja usando medios mecánicos para desecharlos en forma apropiada. Los derrames de material biológico se descontaminan tan pronto como sea posible con material absorbente como toallas de papel o gasas, inundando el área contaminado con cloro o frotándola con una toalla humedecida en cloro y limpiando entonces con gasas o toallas limpias. Todos los artículos contaminados son colocados en bolsas para materiales de riesgo biológico y desechados de acuerdo a los lineamientos del laboratorio. La limpieza de derrames requiere del uso de equipo de protección personal. Disposición de desechos Los desechos médicos regulados (desechos infecciosos) deben ser eliminados de acuerdo con las regulaciones locales y estatales. Los materiales contaminados deben ser clasificados al momento de uso en categorías tales como objetos con agujas y otros objetos filosos. Los recipientes deben ser a prueba de fugas y cerrados cuando el contenido llegue a ¾ de su capacidad. Cualquier desecho de riesgo biológico que se desinfecta por medio de la autoclave está exento de estas regulaciones, y puede ser eliminado por los procesos estándar. Hay ahora varios sistemas disponibles para el tratamiento de desechos que los reduce a un producto irreconocible; estos incluyen procesos de pulverización o alto calentamiento. La legalidad de los mismos esta determinada por cada estado. Referencia:

United States department of health and Human services: Recommendations for prevention of HIV transmisión in health care setting, morbidity, Mortality Weekly Report 56(25), Aug 21, 1987.

Norma Oficial Méxicana 878 (NOM 0878 Ecol.)

manual de bioquimica clinica version 2007 farmacia uaem

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