UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE CIENCIAS

BIOLOGA MOLECULAR DE LA CLULA 2

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO

NOMBRE DEL ALUMNO: __________________________________________________________________

PROFESOR: ________________________________________________________________________________

GRUPO: _________________________________________

SEMESTRE: _____________________________________

ndice ndice ................................................................................................................................................... 2

REGLAMENTO INTERNO DE HIGIENE Y SEGURIDAD DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR

DE LA CLULA II ................................................................................................................................... 5

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO .................................................................................. 6

SOLUCIONES PARA EL CURSO DE BMC 2 ............................................................................................. 8

PRCTICA 1: PROPIEDADES GENERALES DE LOS LPIDOS ................................................................. 11

CUESTIONARIO ........................................................................................................................ 11

Introduccin ................................................................................................................................. 11

Objetivos ................................................................................................................................... 12

Mtodo ......................................................................................................................................... 12

A. Extraccin de colesterol de la yema de huevo. .................................................................... 12

B. Deteccin cualitativa de esteroides. .................................................................................... 13

C. Deteccin cuantitativa de colesterol .................................................................................... 13

D. Solubilidad del aceite de oliva. ............................................................................................. 14

Discusin ..................................................................................................................................... 14

Referencias ................................................................................................................................. 14

MATERIAL ................................................................................................................................... 15

Reactivos ................................................................................................................................... 15

PRCTICA 2: MEBRANAS Y OSMOSIS. ............................................................................................... 16

CUESTIONARIO ........................................................................................................................ 16

Introduccin ................................................................................................................................. 16

Objetivos ...................................................................................................................................... 17

Mtodo ......................................................................................................................................... 17

I. Clula Vegetal ......................................................................................................................... 17

Procesamiento de Datos: .......................................................................................................... 18

2. Estructura y fragilidad osmtica de eritrocitos. .................................................................... 19

Procesamiento de Datos: .......................................................................................................... 20

BIBLIOGRAFA ........................................................................................................................... 21

Material......................................................................................................................................... 21

PRCTICA 3: TRANSPORTE TRANSMEMBRANAL............................................................................... 22

CUESTIONARIO ........................................................................................................................ 22

Introduccin ................................................................................................................................. 22

Objetivo ........................................................................................................................................ 23

Hiptesis. ..................................................................................................................................... 23

Procedimiento ............................................................................................................................. 23

A. INCUBACIN DE LAS CLULAS .............................................................................................. 23

B. DETERMINACIN DE AZCARES EN CADA MUESTRA ........................................................... 24

Resultados y Procesamiento de los Datos ............................................................................. 24

Discusin ..................................................................................................................................... 25

Conclusin ................................................................................................................................... 26

Bibliografa ................................................................................................................................... 26

Mtodo ......................................................................................................................................... 27

PRCTICA 4: FERMENTACIN DE LA GLUCOSA POR LA LEVADURA DE PANIFICACIN .................... 28

CUESTIONARIO ........................................................................................................................ 28

Introduccin ................................................................................................................................. 28

Objetivo ........................................................................................................................................ 28

Mtodo ...................................................................................................................................... 29

Discusin ................................................................................................................................... 29

Referencias. ............................................................................................................................... 30

Material......................................................................................................................................... 30

Reactivos ..................................................................................................................................... 30

PRCTICA 5: METABOLISMO DE LPIDOS: CONVERSIN DE GRASAS A SACAROSA ......................... 31

Introduccin ................................................................................................................................. 31

Objetivos ...................................................................................................................................... 31

Hiptesis ...................................................................................................................................... 31

Mtodo ......................................................................................................................................... 31

Germinacin de las semillas. ..................................................................................................... 31

SESIN 1 .................................................................................................................................... 32

Material que llevar el alumno ................................................................................................. 32

Soluciones y reactivos ............................................................................................................... 33

SESIN 2: ................................................................................................................................... 34

Cuantificacin de protenas. ..................................................................................................... 34

Cuantificacin de carbohidratos. .............................................................................................. 34

Material que llevar el alumno.................................................................................................. 35

Soluciones y reactivos ............................................................................................................... 35

Cristalera y equipo .................................................................................................................... 35

PRCTICA 6: ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS ............................................. 36

CUESTIONARIO ........................................................................................................................ 36

Introduccin ................................................................................................................................. 36

Objetivos ...................................................................................................................................... 37

Hiptesis ...................................................................................................................................... 37

Mtodo ......................................................................................................................................... 37

Experimento 1 (control) ............................................................................................................. 37

Experimento 2 (dinitrofenol) ..................................................................................................... 37

Experimento 3 (azida de sodio) ................................................................................................. 38

Experimento 4 (Reduccin de MTT) .......................................................................................... 38

Anlisis de Resultados .............................................................................................................. 38

Referencias ................................................................................................................................. 38

Material......................................................................................................................................... 39

PRCTICA 7: ACTIVIDAD FOTOSINTTICA ......................................................................................... 40

Introduccin: ................................................................................................................................ 40

Objetivo ........................................................................................................................................ 40

Material......................................................................................................................................... 40

A. Obtencin de cloroplastos: .................................................................................................. 40

B. Cuantificacin de clorofila: .................................................................................................... 41

C. Determinacin de la reduccin del DCPIP............................................................................. 41

REGLAMENTO INTERNO DE HIGIENE Y SEGURIDAD DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR DE LA CLULA II

ART. 1 La observancia del presente reglamento es obligatoria para el personal acadmico,

alumnos y personal administrativo que labora en el laboratorio de Biologa Molecular de la

Clula II. Este reglamento deber darse a conocer a cada uno de los integrantes.

ART 2 Se deber conocer el sistema de alertamiento, las zonas de seguridad, las rutas de

evacuacin y las medidas de seguridad establecidas en el laboratorio.

ART. 3 Mientras se est en el laboratorio es obligatorio el uso de bata. Usar guantes y

lentes de proteccin cuando maneje material txico por contacto, radioactivo o

contaminado infeccioso.

ART. 4 Mientras se est en el laboratorio, queda estrictamente prohibido fumar, beber,

comer, aplicarse cosmticos y el uso de celulares.

ART. 5 Queda prohibido sentarse en las mesas de trabajo.

ART. 6 Se debern conservar limpias y ordenadas las mesas de trabajo.

ART. 7 Es obligacin del alumno revisar y contar perfectamente el material de cristalera

que le sea entregado para la realizacin de la prctica as como revisar el buen

funcionamiento de los aparatos elctricos. Lo mismo aplica para la devolucin del material.

Cualquier anomala presentada del material o los equipos debida al mal uso de ste

(prdida, rotura o descompostura) ser responsabilidad del alumno.

ART. 8 Se deber evitar pipetear lquidos con la boca. Tambin se deber evitar dejar las

pipetas dentro de los frascos de reactivos y / o soluciones.

ART. 9 Es deber del alumno consultar con el profesor que imparte la prctica, cualquier

duda en el procedimiento y/o en el manejo del equipo.

ART. 10 Es obligatorio que se sigan las recomendaciones del uso de aparatos e

instrumentos de laboratorio, las cuales se les sern indicadas por el profesor que imparte la

prctica.

ART. 11 Es deber del profesor de la materia nombrar una comisin de seguridad, la cual

estar encargada de vigilar el seguimiento de este reglamento as como de evitar dejar sin

vigilancia el laboratorio durante el periodo que abarque la clase.

ART. 12 Las personas a las quienes se le sorprenda haciendo mal uso de los equipos,

materiales, instalaciones, etc. propios del laboratorio sern sancionados conforme a la

Legislacin Universitaria segn la falta cometida.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

1. Conocer el sistema de alertamiento, zonas de seguridad, rutas de evacuacin y medidas de seguridad establecidas en el laboratorio.

2. En caso de incendio: Ponerse a salvo. Activar el servicio de Bomberos de la UNAM, extensiones 20565 20566 o a la Central de Emergencias 55 (red digital UNAM). Dar aviso.

3. En caso de presentarse un lesionado grave: Activar de inmediato al Servicio Mdico de Urgencias, extensiones 20202, 20140 o marcar la Red de Emergencias 55.

4. Regla del yo-yo. Primero mi seguridad. 5. Al activar el servicio mdico de urgencias. Proporcionar la ubicacin. Dar

referencias de vas de acceso. 6. Mecanismo de lesin. 7. Nmero de lesionados. 8. Solicitar apoyo a Bomberos, vigilancia, etc. 9. Mantener el rea de trabajo, el equipo y los aparatos tan limpios como sea posible. 10. Se deber trabajar con bata obligatoria. 11. Mientras se est en el laboratorio queda prohibido comer, beber y fumar. 12. No arrojar a los desages o lavaderos residuos slidos (grasa, papel, cerillos, etc.),

depositarlos en los botes de basura. 13. Para desechar cidos fuertes y otras sustancias corrosivas, abrir primero la llave del

agua hasta tener un flujo conveniente para diluir y arrastrar la sustancia y vaciar lentamente el material que se desee eliminar.

14. No arrojar a la tubera de desage varias sustancias simultneas ya que podrn reaccionar entre s, hgalo de una en una, dejando correr el agua para espaciarlos.

15. Muchos productos qumicos son peligrosos porque son txicos o inflamables por lo que antes de iniciar un experimento, se debe revisar las etiquetas de los reactivos que se van a emplear, en busca de cualquier advertencia de peligro, prestando especial atencin a las precauciones indicadas para su manejo.

16. Nunca dejar sustancias sin identificar con una etiqueta, y si se trata de reactivos preparados, anotar tambin la fecha de su preparacin.

17. Utilizar una esptula cuando manipulemos sustancias slidas para evitar el contacto con la piel y no las llevemos a la boca en ningn momento.

18. Para percibir el olor de un material, no acercarlo directamente a la nariz, hay que aproximar los vapores a la cara soplando con la mano sobre la boca del recipiente que se mantendr a unos 20 cm de distancia.

19. Cuando mida lquidos peligrosos, utilizar una probeta, pero si se requiere de mayor precisin, colocar el lquido dentro, de un recipiente estrecho (probeta) y llenar la pipeta por inmersin o utilizando una pera de hule.

20. Nunca pipetear lquidos con la boca, sino usando propipetas. 21. Para cada reactivo utilizar una pipeta diferente y de ser posible enjuagarla con agua

inmediatamente despus de terminar de usarla. 22. Cuidar el no derramar en las mesas cidos o lcalis fuertes, pero si esto ocurre,

limpiar y enjuagar bien con agua tanto la mesa como el exterior de los frascos. 23. El mismo cuidado debe tenerse cuando se trabaje con solventes voltiles ya que la

mayora son inflamables. 24. Cuando se trabaje con vapores irritantes, txicos o inflamables utilizar la campana

de extraccin. 25. No mantener el mechero encendido al trabajar con sustancias inflamables como son

el ter, alcohol, acetona, benceno, thiner, etc. 26. Para preparar una disolucin de un cido o de una base concentrada y muy

especialmente el cido sulfrico, vierta SIEMPRE EL CIDO SOBRE EL AGUA y nunca al revs, ya que el calor generado para la disolucin, puede hacer hervir el agua con la consecuente salpicadura del cido a la cara y manos de operador.

27. Al calentar lquidos en tubos de ensaye no apunte la boca del mismo hacia ninguna persona ya que el lquido puede hervir violentamente y ser proyectado a gran distancia.

28. La vidriera es frgil por lo que debe manejarse con cuidado. El material de medicin (probetas, buretas, pipetas o matraces aforados) no deben someterse a calentamiento. Si se necesita insertar un tapn de hule en un tubo de vidrio o un termmetro, lubrquelo con unas gotas de agua y haga girar el tubo dentro del tapn mientras lo va introduciendo (proteja su mano con un trapo).

29. Todo producto qumico aunque no lo sea, debe ser manejado como si fuera txico. 30. No dejar quemadores, mecheros, parrillas, lmparas. etc. encendidos sin que alguien

que los atienda. 31. Las manos y la ropa, as como el piso y los bancos del laboratorio debern estar

secos cuando se utilicen aparatos elctricos. 32. Se deber consultar al profesor responsable para efectuar el desecho adecuado de

sustancias como la acrilamida sin polimerizar, bromuro de etidio, ter, istopos radiactivos o cualquier sustancia que sea considerada peligrosa.

33. Todos los accidentes por triviales que parezcan, deben comunicarse inmediatamente al profesor.

SOLUCIONES PARA EL CURSO DE BMC 2

MATERIAL POR EQUIPO

1 esptula

1 vidrio de reloj

1 vaso pp 250 mL

1 vaso pp 500 mL

1 embudo de filtracin

1 probeta 250 mL

1 probeta de 10 mL

1 matraz aforado de 250 mL

1 matraz aforado de 100 mL

1 balanza granataria

1 propipeta

1 pipeta de 1 mL

1 pipeta de 5 mL

1 pipeta de 10 mL

10 tubos de ensaye y gradilla

Agitador magntico y plancha de calentamiento con mosca

Potencimetro y buffers de referencia pH 4,0 y 7,0

REACTIVOS POR GRUPO

Carbonato de sodio anhidro (Na2CO3)

Tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O64H2O)

Bicarbonato de sodio (NaHCO3)

Molibdato de amonio [(NH4)2MoO4]

Arseniato sdico heptahidratado (Na2HAsO47H2O)

Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO45H2O)

cido sulfrico (H2SO4)

Fosfato monocido (dibsico) de sodio (Na2HPO4)

Fosfato dicido (monobsico) de potasio (KH2PO4)

Cloruro de sodio (NaCl)

Citrato de sodio (C6H7NaO7)

Acetato de sodio (C2H3NaO2)

cido actico

Dicromato de potasio K2Cr2O7

Sacarosa

Tricina

Cloruro de potasio (KCl)

Cloruro de magnesio (Mg2Cl)

Azida de sodio (NaN3)

Cianuro de potasio (KCN)

Hidrxido de potasio (KOH)

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PREPARACIN: indicaciones generales Cada solucin deber ser guardada en frascos de vidrio debidamente etiquetados con el nombre de la solucin (aparece subrayado), fecha de preparacin, una marca que identifique quin la prepar y grupo/nombre del profesor. Los amortiguadores sern guardados en refrigeracin.

EQUIPO 1

REACTIVO DE SOMOGYI Se preparan las dos soluciones por separado, y justo antes de usar se deben mezclar en una proporcin de 25 volmenes de 1 con 1 volumen de 2.

Somogyi Solucin 1 Disolver en 150 mL de H2O destilada

6,25 g de carbonato de sodio anhidro

6,25 g de tartrato doble de sodio y potasio

5 g de bicarbonato de sodio Aforar a 250 mL. Para disolver mejor las sales puede calentarse un poco.

Somogyi Solucin 2 Disolver en 8 mL de H2O destilada 1,5 g de sulfato de cobre. Agregarle 2 gotas de cido sulfrico al 10% v/v. Aforar a 10 mL.

EQUIPO 2

REACTIVO DE ARSENOMOLIBDATO Arsenomolibdato solucin 1 Disolver 2,5 g de molibdato de amonio en 45 mL de H2O ms 2,5 mL de cido sulfrico concentrado

Arsenomolibdato solucin 2 Disolver 0,3 g de arseniato sdico heptahidratado en 2.5 mL de agua destilada

Agregar la solucin 2 a la 1, mezclar y colocar en incubacin a 37 C durante 24 h. A esto se le llama maduracin de la solucin. Guardar en frasco mbar.

EQUIPO 3

AMORTIGUADOR DE FOSFATOS Preparar 200 mL de fosfato monocido de potasio (K2HPO4) y 200 mL de fosfato dicido de

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potasio (KH2PO4) a una concentracin 100 mM cada uno. Almacenar por separado y mezclar en las proporciones adecuadas para el pH y concentaciones requeridas.

REACTIVO DE BENEDICT En 60 mL de agua disolver 17.3 g de citrato de sodio y 10 g de Na2CO3 anhidro. Esta mezcla se aade lentamente y con agitacin a una solucin previamente preparada de 1.73 g de CuSO4 pentahidratado en 15 mL de agua. La solucin final se afora a 100 mL.

REACTIVO DE FEHLING Fehling Solucin A: 3.5 g de CuSO4 en agua y aforar a 50 mL Fehling Solucin B: 17.5 g de tartrato de sodio y potasio, y 5 g de NaOH en agua y aforar a 50 mL

EQUIPO 4

AMORTIGUADOR DE ACETATO 12.112 g de acetato sdico cristalizado y 0.78 ml de cido actico glacial en 500 ml de agua destilada. Hervirlo, dejar enfriar y guardar bien cerrado.

SOLUCIN SULFOCRMICA 1 g de dicromato potsico en 50 ml de cido sulfrico 0.5 N

REACTIVO DE BIURET Colocar en un vaso de precipitados 0.75 g de CuSO4 y 3 g de tartrato de sodio y potasio. Adicionar 250 ml de agua destilada y aadir 150 ml de NaOH al 10 % Aforar a 500 ml con agua destilada

EQUIPO 5

MEDIO DE AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS Preparar 500 ml de una solucin con agua desionizada, que contenga sacarosa 400 mM, tricina 20 mM, KCl 20 mM, MgCl2 5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH. Aadir azida de sodio a una concentracin final de 0.1% m/v y guardar en refrigeracin.

MEDIO DE REACCIN Preparar 500 ml de una solucin con agua desionizada, que contenga sacarosa 100 mM, MgCl2 5 mM, KCl 10 mM, tricina 15 mM, KCN 0.5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH. Aadir azida de sodio a una concentracin final de 0.1% m/v y guardar en refrigeracin.

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PRCTICA 1: PROPIEDADES GENERALES DE LOS LPIDOS CUESTIONARIO 1. Defina los siguientes trminos:

Lpido Lpido compuesto Aceite secante

Triacilglicerol Lpido derivado Maragarina

Triacilglicerol simple Ranciedad Esterol

Triacilglicerol mixto Jabn Lecitina

cido graso saturado Secuestrante Antioxidante

cido graso insaturado Micela

2. Contraste las estructuras de la fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatildilcolina y la esfingomielina A qu subclase de fosfolpidos pertenece cada compuesto?

3. Qu se sabe acerca del funcionamiento de los fosfolpidos? Qu es una cefalina? Cul es su funcin en el cuerpo?

4. Los fosfolpidos son considerablemente ms solubles en agua que los triacilgliceroles. Explique.

5. Dibuje la frmula del ncleo esteroidal y numere los tomos de carbono. De l nombre de tres compuestos que posean esta estructura y mencione sus funciones principales en el cuerpo.

6. Cul es el fundamento de la prueba de Salkowski?

7. Cul es el fundamento de la prueba de Liebermann-Burchard?

Introduccin Los lpidos son un grupo de biomolculas que se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza. Desde el punto de vista qumico, son el grupo ms heterogneo y, de hecho, no responden a ninguna composicin general. Su caracterstica general es la apolaridad o hidrofobicidad, aunque dentro de ellos existen diferentes grados: desde lpidos totalmente apolares e insolubles en agua hasta los que tienen parte de su estructura altamente polar y son por ello, capaces de interactuar con el agua a travs de dicha zona.

Hablando desde un punto de vista general, los lpidos apolares cumplen funciones de almacn de energa metablica, lubricacin y proteccin, mientras que los polares tienen funciones estructurales, esto es, que participan en la composicin de las membranas biolgicas. Adems de stos, otros lpidos cumplen otras funciones ms especficas, como vitaminas, hormonas, etc.

Debido a esa caracterstica fundamental, su grado de hidrofobicidad, los lpidos pueden

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extraerse de materiales que los contienen mediante disolventes orgnicos ms o menos apolares. Por otra parte como los procesos biolgicos en los que participan tienen lugar en medios acuosos, el cuerpo humano se vale a veces, de mecanismos que facilitan su transporte, como la construccin de lipoprotenas, o la utilizacin de emulsionantes (sales biliares) que facilitan el contacto con las enzimas que participan en la digestin. Acerca de alguno de estos puntos trata esta prctica.

Numerosos productos naturales son ricos en lpidos. El aceite empleado normalmente en la alimentacin, sea de oliva, girasol, soya, etc., es una mezcla hidrofbica de triacilglicridos y de cidos grasos libres, entre los que destaca el cido oleico. Otra buena fuente de lpidos es la yema de huevo. Un huevo de gallina, cuyo peso oscila entre 55 y 60 g, consta de clara (65 % del peso) y yema (35 %), y su composicin aproximada en gramos es la siguiente:

Peso total (g)

Agua (g) Protenas (g)

Lpidos(g) totales

Colesterol (g)

Yema 19-20 9-10 3-3.5 6-6.5 0.2-0.25

Clara 35-36 31-32 3.5-4 0.01 ---------

Los lpidos presentes en la yema son de naturaleza variada, destacando los triacilglicridos, el colesterol y los fosfolpidos. Mediante una extraccin fraccionada se pueden separar los menos polares, solubles en acetona (triacilglicridos y colesterol) de los ms polares (fosfolpidos), que seran solubles en disolventes como la mezcla cloroformo/metanol.

Objetivos

1. Aislar el colesterol de la yema de huevo, utilizando acetona como disolvente.

2. Determinar cualitativamente el colesterol mediante una reaccin especfica.

3. Estudiar la solubilidad del aceite de oliva en el disolvente polar, el agua y en otro disolvente ideal para lpidos apolares, la acetona.

Mtodo

A. Extraccin de colesterol de la yema de huevo.

1. Cascar un huevo de gallina con precaucin y separar la clara de la yema, teniendo cuidado de no romper esta. Decantar la clara.

2. Aadir sobre la yema 10 ml de acetona fra y agitar con la varilla, hasta obtener una suspensin homognea.

3. Verter el contenido en dos tubos de centrfuga y equilibrarlos.

4. Centrifugar a la mxima velocidad en la centrfuga de mesa durante 15 minutos.

5. Concluida la centrifugacin (cuando la centrfuga este totalmente parada) sacar los

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tubos con sumo cuidado, retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.

6. Guardar el sobrenadante, al que llamaremos extracto acetnico A1.

7. Agregar 10 ml de acetona al pellet (pastilla), agitar con una varilla y repetir todo el proceso otra vez para una segunda extraccin de colesterol. El segundo extracto obtenido se llamar extracto acetnico A2.

NOTA: Los tiempos de espera en las centrifugaciones pueden emplearse en ir realizando el apartado D de la prctica.

B. Deteccin cualitativa de esteroides.

1. Rotular adecuadamente los tubos del 1 al 4.

2. Pipetear en cada uno de los tubos los siguientes volmenes (en ml) de las soluciones que se te piden:

Prueba de Salkowski

# TUBO 1 2 3 4 Colesterol 0 1 mL 0 0

Agua destilada 1 mL 0 1 mL 1 mL

cido Sulfrico* 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Extracto A1 0 0 1 mL 0

Extracto A2 0 0 0 1 mL

* Resbalar por el tubo para formar una capa en el fondo NUNCA HAY QUE DARLE DE BEBER AL CIDO

3. Se mueven los tubos en el plano horizontal, con el fin de conseguir un buen mezclado en la zona de contacto, pero sin llegar a mezclar totalmente ambas fases.

4. La reaccin es positiva, indicando la presencia de colesterol cuando se observa una coloracin azul-verde.

C. Deteccin cuantitativa de colesterol

1. Rotular 7 tubos de ensayo del 1 al 7.

2. Pipetear (usar una propipeta) en cada uno de los tubos los siguientes volmenes (ml) de los reactivos, de acuerdo al orden que se ndica en la tabla.

NOTA: REACCIONES MUY EXOTRMICAS CUIDADO!

Prueba de Liebermann-Burchard

# TUBO 1 2 3 4 5 6 7

Colesterol 0 0.25 0.5 0.75 1 0 0

Agua destilada 1 0.75 0.5 0.25 1 0 0

cido Sulfrico** 1 1 1 1 1 1 1

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Anhdrido actico 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Extracto A1 0 0 0 0 0 1 0

Extracto A2 0 0 0 0 0 0 1

** Se mezclan bien con una varilla de vidrio NUNCA HAY QUE DARLE DE BEBER AL CIDO

Se dejan los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos. La aparicin de un color azul-verdoso indica prueba positiva para esteroides.

3. Leer la densidad ptica a 625 nm despus de 30 minutos de reaccin

4. Graficar Absorbancia contra concentracin de colesterol, calcular la pendiente y ordenada al origen, utilizando la ecuacin de la recta calcular la concentracin del colesterol en las muestras problema.

5. Observar los colores del estndar, el blanco, y los extractos acetnicos (A1 y A2). Anotar los resultados.

D. Solubilidad del aceite de oliva.

1. Etiquetar 2 tubos de ensayo limpios y aadir 5 ml de agua al primero y 5 ml de acetona

al segundo.

2. Agregar a cada uno de los tubos 60 gotas de aceite de oliva con una pipeta Pasteur limpia y seca.

3. Agitar los tubos y observar los resultados. Anotar las observaciones.

Discusin 1. Por qu desde el inicio se desecha la clara de huevo?

2. De qu est compuesta la yema de huevo? Y qu se disuelve de sta al agregar acetona?

3. Por qu escoger acetona y no otro solvente como por ejemplo etanol?

4. De qu tipo de lpidos est formado el aceite de oliva?

Referencias

Burke RW, Diamondstone BI; Velapoldi RA & Menis O (1974) Mechanisms of the

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Liebermann Burchard and Zak color reactions for cholesterol. Clin Chem 20:794-801.

Mathews C.K.; Van Holde K.E.; Ahern K.G. 2002. Bioqumica. 3a edicin. Pearson Addison wesley.

Modenese A, Carobene A, Ferrero C, Cariotti F, Franzini C, De Giorgi E, Franzin M, Giorgio A & Baldo L (1996) Reference method for serum total cholesterol measurement: does substituting enzymatic step for Liebermann-Burchard reaction improve specificity? Clin Chem 42:475-477

Whitby GS (1923) Some new reactions for the detection of cholesterol. Biochem. J:5-12

MATERIAL *1 Huevo por equipo Centrifuga *Aceite de oliva por equipo Espectrofotmetro 1gradilla Papel milimtrico* 2 celdas de vidrio para espectrofotmetro recipiente para hielo 2 vasos de precipitado de 50 ml 1 pipeta de 10 ml 2 vasos de precipitado de 100 ml 1 varilla de vidrio 2 pipetas Pasteur 1 propipeta 1 Micropipeta de 1000 l 2 tubos de centrfuga para solventes 12 tubos de ensayo Hielo 1 probeta de 10 ml 2 pipetas de 1 ml *material que deber traer el alumno.

Reactivos

Acetona 20 ml por equipo (poner la acetona en hielo antes de usarse). Colesterol 5 mg/ml (disolver en etanol) 25 ml por grupo cido sulfrico concentrado 10 ml por equipo. Anhdrido actico 4 ml por equipo.

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PRCTICA 2: MEBRANAS Y OSMOSIS. CUESTIONARIO

1. Defina los siguientes trminos: Micelas bicapa Liposoma osmosis turgencia plasmolisis Isotnico hipertnico Hipotnico

2. Realice un esquema de los principales componentes de la membrana celular del eritrocito.

3. Describa tres experimentos que permitieron discernir la estructura de la membrana lipdica

4. Qu es el modelo de mosaico fluido de la membrana y que experimentos permitieron dilucidarlo?

5. Cmo es el lquido intracelular respecto al extracelular? 6. Qu es el tejido? 7. Qu son las acuaporinas y cual es su papel en el intercambio de lquidos

en la clula? Introduccin La sustancia ms abundante, con diferencia, que difunde a travs de la membrana celular es el agua. Es preciso recordar que, a travs de la membrana del eritrocito, en condiciones normales difunde por segundo en ambos sentidos una cantidad de agua equivalente a unas 100 veces el volumen de la propia clula. Aun as, normalmente, la cantidad que difunde en ambas direcciones est tan exactamente equilibrada que se produce prcticamente un movimiento neto de agua nulo. Por tanto, el volumen de la clula permanece constante. Sin embargo, en ciertas condiciones, se puede desarrollar una diferencia de concentracin para el agua a travs de una membrana, al igual que se pueden producir diferencias de concentracin para otras sustancias. Cuando esto ocurre, se produce un movimiento neto de agua a travs de la membrana celular, lo que hace que la clula se hinche o se contraiga, dependiendo de la direccin del movimiento neto. Este proceso de movimiento neto de agua causado por una diferencia de concentracin de la misma se denomina smosis. Desde que, Pfeffer en 1887 fue el primero en describir la conducta osmtica de las clulas vivas, esto ha sido un punto central en la Biologa. En 1908 Nernst reconoce que el agua puede pasar a travs de las membranas biolgicas libremente pero no los iones, introduciendo as el concepto de la membrana "semipermeable". Para la investigacin de las propiedades osmticas de las clulas vegetales, Overton empleo el mtodo de plasmolisis, desarrollado largamente por Nageli, de Vries y Pfeffer. Este mtodo se basa en la observacin de la reduccin y aumento del protoplasma en la pared celular (plasmolisis) por la accin de una solucin hipertnica de solutos inocuos (ej. sacarosa). Este fenmeno es reversible al remover el soluto. Por otra parte, la barrera osmtica de clulas viables es tambin impermeable a pigmentos de plantas (ej. antocianinas) y en el caso de clulas daadas, con venenos, se anulan estas propiedades osmticas. Overton tambin midi los cambios de peso producido por

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variacin de la tensin del soluto externo. La ms sencilla interpretacin de estas observaciones fue que el agua es permeable a la barrera osmtica, mientras los solutos adicionados eran impermeables. Objetivos 1. Observar la membrana que delimita a la clula. 2. Identificar el proceso de smosis mediante la observacin en el microscopio de los

cambios que sufre la clula vegetal y animal al modificar la concentracin del lquido extracelular.

3. Distinguir las soluciones hipotnica, hipertnica e isotnica, basndose en los cambios en masa o volumen que cada solucin provoque en la clula vegetal.

4. Realizar una prueba de fragilidad osmtica de eritrocitos. Mtodo

I. Clula Vegetal

Cebolla 1. Hacer dos cortes transversales y paralelos en una cebolla con una separacin de

un poco ms de un centmetro de longitud. 2. En los extremos de los cortes, seccionar longitudinalmente, formando una

ventana, desechar las dos primeras hojas y conservar la tercera. 3. En la cara interna de esta ltima hoja, se le deber de desprender una

membrana transparente. No utilice la membrana de la parte externa (que parece ms brillosa).

4. Monte un fragmento de epidermis en el portaobjetos y coloque una gota de rojo neutro.

5. Coloque un cubreobjetos y vea al microscopio. 6. Observar al microscopio y dibujar 7. Reemplazar la solucin en que esta disuelto el rojo neutro de la preparacin por

una solucin de cloruro de sodio al 4%. 8. Para efectuar esta maniobra se toma un poco de solucin de cloruro de sodio al

4% con una pipeta Pasteur y se deposita una gota sobre un lado de la preparacin, entre el portaobjetos y el cubreobjetos se coloca un pedacito de papel filtro en el lado opuesto a fin de aspirar, por capilaridad, la solucin amortiguadora de fosfatos con rojo neutro.

9. Realice un dibujo de los cambios que se observan 10. Reemplazar la solucin de cloruro de sodio al 4% por la de cloruro de sodio al

6%. 11. Observar al microscopio y dibujar 12. Para finalizar, reemplazar la solucin de cloruro de sodio al 6%, por agua

destilada, utilizando la tcnica indicada anteriormente. 13. Observar al microscopio y dibujar.

Papa 1. Utilizando un horadador (#11) realice perforaciones sobre una papa fresca

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2. Obtenga varios cilindros de papa y realice cortes de 1 cm de largo de ste, hasta obtener 15 piezas. Nota: escoger la mejor porcin de papa que no tenga entrenudos y quitar la cascara.

3. Medir (dimetro y largo) y pesar cada cilindro de papa y anotarlos en la tabla 1. 4. Colocar 5 trozos de papa en cada uno de los siguientes tratamientos:

Vaso con 50 ml solucin isotnica (NaCl 0.9%). Vaso con 50 ml solucin hipertnica (NaCl 6%). Vaso con 50 ml solucin hipotnica (Agua destilada).

5. Dejarlos por 30 minutos a temperatura ambiente. 6. Transcurrido el tiempo sacar los trozos, secarlos con papel absorbente. 7. Volver a medir y pesar. 8. Anotar los datos de cada cilindro en la siguiente tabla:

Tabla 1. Datos individualizados

Dimetro (cm) Largo (cm) Masa (gr) inicial final inicial final inicial final

Solucin isotnica

Solucin hipertnica

Solucin hipotnica

Procesamiento de Datos: Calcular los promedios y desviaciones estndar (DE) para cada tratamiento de los cilindros de papa al inicio y al final del experimento. Elaborar una tabla con los datos anteriores con el formato que se muestra a continuacin Tabla 2. Promedio DE de cada tratamiento

Tratamiento

dimetro (cm) largo (cm) Masa (gr) inicial

Promedio DE

final Promedio DE

inicial Promedio DE

final Promedio DE

inicial Promedio DE

final Promedio DE

Calcular los cambios relativos que sufrieron los cilindros de papa. Para hacer esto se

1cm (2)

(1)

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tomar como valor de referencia el valor inicial de cada magnitud, como en el ejemplo siguiente:

Cambio relativo en masa (%)= 100*(masa final)/ (masa inicial) Obtener los valores promedios de cada tratamiento y su desviacin estndar correspondiente. Tabla 3. Cambios relativos (%) Tratamiento % dimetro % largo % masa

Elaborar graficas de barras con los datos de ambas tablas (2 y 3)

independientemente. Cada barra deber estar al lado de su contraparte, por ejemplo la barra que

represente la longitud inicial en agua destilada deber estar junto a la barra de longitud final de esa misma solucin. Incluir los valores de desviacin estndar en cada barra.

Hubo diferencias en los parmetros medidos antes y despus del tratamiento? En qu casos? Por qu? En que tabla o grafica se aprecian mejor estas diferencias? Fueron significativas las diferencias en todos los casos?

2. Estructura y fragilidad osmtica de eritrocitos.

a. Eritrocito

1. En tres portaobjetos colocar una gota de sangre y una gota de la solucin como se indica a continuacin: Sangre total + agua destilada.

Sangre total + sol. de NaCI al 6%. Sangre total + sol. salina fisiolgica.

2. Colocar un cubreobjeto y observar al microscopio. 3. Dibujar lo observado

b. Fragilidad osmtica de eritrocitos

1. Solicitar en el bioterio de su facultad 5 ml de sangre de algn animal (rata, cobayo hmster) utilizando como anticoagulante EDTA heparina y colocarla a 4C hasta su uso.

2. Numerar 7 tubos del #1 al #7 3. Pipetear las soluciones en los tubos como lo indica la siguiente tabla:

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 El % concentracin de NaCl resultante en cada tubo es:

0 0.1 0.4 0.46 0.5 0.6 0.86

Sol. NaCl 1% pH 7.4 ml 0 0.5 2.0 2.3 2.5 3.0 4.3

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Agua destilada ml 5 4.5 3.0 2.7 2.5 2.0 0.7 Mezclar por inversin

Sangre total ml 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 Mezclar por inversin

4. Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. 5. Mezclar nuevamente y centrifugar a 2000 r.p.m. durante 5 minutos. 6. Leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm, utilizando el

tubo 7 como blanco. 7. El tubo 1 equivale al 100% de hemlisis, mientras que el nmero 7 equivale al

0%. 8. La lectura del espectrofotmetro de cada tubo, dividido entre las unidades de

lectura del tubo 1, multiplicado por 100, indica el porcentaje de hemlisis. Procesamiento de Datos: En el caso de la prueba de fragilidad osmtica de eritrocitos. En los sujetos normales se obtiene una curva sigmoidea casi simtrica. El extremo inferior de la curva corresponde al comienzo de la hemlisis, la porcin media corresponde a la salida de la hemoglobina en gran cantidad y el extremo superior a la hemlisis total. Un aumento de la fragilidad osmtica desplaza la curva haca la derecha, mientras que una disminucin la desplaza hacia la izquierda.

Se ha sugerido que los dos parmetros ms significativos son: a) La concentracin de solucin salina en la cual se obtiene 10% de hemlisis. b) La concentracin de solucin salina que produce 90% de hemlisis. Normalmente se obtiene un 10% de hemlisis a una concentracin de solucin salina que vara de 0.48% a 0. 44% mientras que el 90% de hemlisis se produce a una concentracin que va de 0.44% a 0.36%. La relacin entre la concentracin de la solucin salina y el porcentaje de hemlisis en condiciones normales es la siguiente:

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% Solucin salina 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.85

% Hemlisis 97-100 90-99 50-95 5-45 0-6 0

La fragilidad osmtica de eritrocitos se incrementa en algunos padecimientos como esferocitosis congnita, anemia hemoltica adquirida, enfermedad hemoltica del recin nacido debido a la incompatibilidad ABO y puede estar disminuida en talasemia, anemia de clulas falciformes, ictericia y anemia por deficiencia de fierro. Realizar una grfica de Absorbancia contra concentracin de NaCl y otra de %

hemlisis contra concentracin de NaCl. BIBLIOGRAFA Kleinzeller, A. Ernest Overtons Contribution to the Cell Membrane Concept: A Centennial Appreciation. News Physiol Sci 1997; 12:49-53. Guyton C y Hall J. Tratado de fisiologa Mdica. Mxico, 2001, 1280 p. Material Por equipo: 14 tubos de ensaye de 12 X 15 cm 2 tubos de ensaye de 1.5 X 15 cm 3 pipetas de 5 ml 3 pipetas de 1 ml 2 pipetas Pasteur Papel filtro 5 vasos de precipitado de 250 ml 2 vasos de precipitado de 500 ml 1 probeta de 100 m

1 probeta de 50 ml 1 esptula 1 horadador del #11 1 piceta Balanza granataria Espectrofotmetro Centrifuga Microscopio ptico Micropipeta de 100 l y 1 ml con puntas

Reactivos Por grupo: 300 ml NaCl al 4%, 6% y 0.9% 500 ml Amortiguador de fosfato 1mM con NaCl al 1%, pH 7.4 Material que debe traer el alumno:

10 ml Rojo Neutro al 0.5% preparado en amortiguador de fosfatos 1 mM Agua destilada

Solicitar en el bioterio de su facultad 5ml sangre total (rata, cobayo, etc.) con EDTA heparina (por grupo) 1 cebolla fresca 1 papa fresca 1 cronometro

6 portaobjetos 1 cuchillo 6 cubreobjetos sanitas 1 Navaja de un filo 1 par de guantes desechables 5 reglas graduadas o vernier

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PRCTICA 3: TRANSPORTE TRANSMEMBRANAL CUESTIONARIO

1. Explique en que se basa la determinacin de azcares reductores por el mtodo de Nelson-Somogyi?

2. Defina los siguientes trminos: a) Difusin simple f) Desacoplante b) Permeasas g) Cotransporte c) Difusin facilitada h) Uniporte d) Simporte i) Antiporte e) Transporte activo primario j) ionforos f) Transporte activo secundario 3. Qu son los transportadores de glucosa y cual es su importancia para la clula? 4. Describa como se lleva a cabo el transporte de glucosa al interior de las clulas

eucariticas. 5. Que tipos de compuestos inhiben el transporte de glucosa al interior de la

clula? 6. Realice un esquema de los diferentes tipos de ATPasa que existen y mencione la

funcin, localizacin y el tipo de elementos que transporta.

Introduccin

El transporte a travs de la bicapa lipdica de las membranas es un requerimiento universal entre los organismos vivos. Sin embargo, el agua no puede pasar realmente a travs de bicapas lipdicas sintticas y solo difunde a travs de tales barreras muy lentamente con una alta activacin de energa (Ea> 10 kcal/mol). En contraste algunas membranas de clulas son altamente permeables al agua tal que el movimiento total del agua a travs de la membrana es como si no estuviera presente en absoluto y la energa de activacin (Ea< 5 kcal/mol) es equivalente a la difusin del agua en solucin. Adicionalmente, desde hace mucho tiempo se sabe que el transporte de agua a travs de la membrana vara enormemente entre tipos celulares y aun dentro de un tipo celular la permeabilidad del agua puede cambiar dramticamente en la presencia de ciertos compuestos.

Las clulas mantienen sus actividades biolgicas importando y exportando varias sustancias tales como iones y molculas polares. Las membranas biolgicas son intrnsecamente impermeables a estos compuestos pero stos son capaces de cruzar las membranas para la funcin normal de la clula. Existen dos factores principales que determinan si una molcula puede atravesar la membrana: 1) la permeabilidad de la molcula en una bicapa lipdica y, 2) la disponibilidad de una fuente de energa. La permeabilidad es conferida por dos clases de protenas de membranas: las bombas y los canales. Las bombas usan una fuente de energa para transportar iones o molculas (ejem. transporte activo). Lo canales, en cambio, permiten que los iones fluyan rpidamente a travs de la membrana (por ejem. Transporte pasivo o difusin facilitada).

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La levadura Saccharomyces cerevisiae puede usar diferentes fuentes de carbn para su crecimiento, pero evolutivamente ha seleccionado mecanismos para utilizar eficiente y preferencialmente a la glucosa y fructuosa. En estos organismos, la glucosa regula la utilizacin del carbn principalmente por la represin o activacin de la transcripcin de numerosos genes que codifican enzimas implicadas en el metabolismo del carbn, adems una molcula puede afectar la fisiologa de la levadura en muchos niveles (cambios en la concentracin celular de metabolitos, modificacin y eventualmente degradacin de algunas enzimas y alteracin en la estabilidad de un nmero de RNAm.

Existen sensores de glucosa en la membrana de la levadura como son los transportadores de glucosa (HeXose Transporter: HXT). En la membrana plasmtica de S. cerevisiae, existen al menos 20 transportadores de glucosa. Los ms relevantes son Hxt1 y Hxt3, con una baja afinidad por la glucosa, con una alta capacidad de transporte y Hxt2, Hxt4 y Hxt7 con una alta afinidad y una capacidad baja de transporte.

Objetivo Establecer el tipo de transporte por el cual las clulas de un cultivo aerobio de levaduras de Saccharomyces cerevisiae introducen la glucosa.

Hiptesis. Planteada por el alumno, basndose en el objetivo y considerando los tratamientos que recibi cada lote de clulas (con venenos, calentamiento, control), as que debern partir de una suposicin sobre cul lote de clulas habr transportado ms glucosa.

Redactar siguiendo el esquema de Si ... entonces ...

Procedimiento NOTA: Para la determinacin de glucosa en el medio, se determinar por el mtodo de Nelson-Somogyi que es especfico para azcares reductores.

A. INCUBACIN DE LAS CLULAS

Los pasos 2 al 5 deben realizarse en esterilidad, trabajando junto al mechero.

Pesar 50 mg de levadura seca - activa para c/u de las 4 condiciones experimentales.

1. Preparar los siguientes tubos:

levadura + 1 mL de solucin de glucosa.

levadura + 1 mL de solucin de glucosa + 0.1 ml de solucin de dinitrofenol.

levadura + 1 mL de solucin de glucosa + 0.1 mL de KCN

levadura + 1 mL de solucin salina glucosada. A continuacin este tubo debe esterilizarse 20 min en agua hirviendo.

2. Resuspender las clulas con el vrtex

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3. Agregar las suspensiones a 4 matraces Erlenmeyer que contengan 100 ml de sol glucosada. Etiquetar los matraces. Tomar 1 alicuota de 10 ml (tiempo cero) y proceder con el paso 5

4. Tapar los matraces y colocar en incubadora a 37C y con 200 rpm de agitacin tomar alicuotas de 10 ml a los 15, 30, 45 y 60 min.

5. Centrifugar a 2500 rpm durante 5 min.

B. DETERMINACIN DE AZCARES EN CADA MUESTRA

Mtodo de Somogyi para determinacin de azcares

Con los sobrenadantes se preparan los tubos enlistados a continuacin:

Tubo: Testigo i ii iii iv v vi vii viii ix

Sobrenadante 0.0* 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

Glc 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

H2O 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

Reactivo Somogyi 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

COLOCAR ESTOS TUBOS TAPADOS DURANTE 20 min EN BAO MARA. DESPUS, ENFRIARLOS CON AGUA DE LA LLAVE

R. Arsenomolibdato 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

AGITAR UNA VEZ QUE HAYA CESADO LA EFERVESCENCIA, DEBE DILUIRSE CADA TUBO CON AGUA DESTILADA HASTA OBTENER UN VOLUMEN TOTAL DE 10 ml.

*Los nmeros indican el volumen en mililitros

Calibrar el espectrofotmetro con el tubo testigo. Leer la absorbancia a 540 nm de longitud de onda.

Conociendo la absorbancia de cada tubo experimental, calcular la concentracin de glucosa, utilizando la ecuacin de la curva patrn (tubos v al ix)

Graficar absorbancia contra cantidad de glucosa en microgramos, tomando como referencia las lecturas de los tubos 1 al 6. Trazar una lnea recta, calcular su pendiente y ordenada al origen, escribir la ecuacin que relacione cantidad de glucosa contra la absorbencia.

Calcular la cantidad de glucosa presente en los tubos 7 al 10 con base en la ecuacin de la curva patrn obtenida.

Resultados y Procesamiento de los Datos Conociendo la absorbancia de cada tubo experimental, calcular la concentracin de glucosa, utilizando la ecuacin de la curva patrn.

Presentar una serie de tablas con los resultados obtenidos

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Tabla 1. Densidad ptica a 526 nm.

Tratamiento

Absorbancia

Tiempo (min)

0 15 30 45 60

Control

DNP*

KCN**

calor

Tabla 2. Cantidad de glucosa remanente en el medio de crecimiento.

Tratamiento

Absorbancia=A526 interpolada de la curva patrn

Glucosa (mg)

0 15 30 45 60

Control

DNP*

KCN**

calor

Con estos datos calcular los moles de glucosa transportada, teniendo en cuenta los moles tericos iniciales del experimento. Indicar la cantidad en masa y mol de glucosa inicial.

Tabla 3. Cantidad transportada de glucosa por lote de clulas (hacer el clculo correspondiente por matraz, no por tubo)

Tratamiento Glucosa (mol)

0 15 30 45 60

Control

DNP*

KCN**

calor

Calcular el transporte de glucosa para 0, 15, 30, 45 y 60 min.

Discusin Hubo diferencias notables entre la cantidad de glucosa remanente en los lotes

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tratados con venenos comparados con el control?

A qu se debieron las diferencias? Fue diferente el efecto del KCN y el DNP?

Qu tipo de mecanismo de transporte opera en la levadura para el caso de la glucosa? Haciendo los clculos para cada uno de los matraces experimentales, pueden hacerse inferencias sobre el tipo de transporte para glucosa en la levadura. La suposicin de transporte activo y pasivo sern confirmadas o rechazadas de acuerdo con las definiciones planteadas en la introduccin contrastadas por los resultados experimentales.

Cules otros factores influyen en el transporte de glucosa y otros solutos al interior de las clulas? Hacer una investigacin adicional sobre el transporte de glucosa en la levadura.

Conclusin 1. Se cumpli el objetivo? 2. Presentar un modelo del transporte de glucosa y los sitios de accin de los venenos utilizados. Bibliografa 1. Berg J. M., Tymoczko J. L. y Stryer L. 2007. Biochemistry. Sexta edicin. Editorial

W. H. Freman and Company. N. Y. EUA.

2. Gancedo M. J. (2007) The early steps of glucose signalling in yeast. FEMS Microbiol. Rev.32(4): 673-704

3. Rintala E, Wiebe MG, Tamminen A, Ruohonen L, Penttil M. (2008) Transcription of hexose transporters of Saccharomyces cerevisiae is affected by change in oxygen provision.BMC Microbiol. 8:53.

4. Somogyi M (1952) Notes on sugar determination. J Biol Chem 195:19-23

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Mtodo NOTA: Para el reporte hacer una descripcin de lo que se hizo. No repetir la lista Material

1 matraz Erlenmeyer de 1000 ml

4 matraces Erlenmeyer de 250 ml

15 tubos de ensayo

5 tubos de espectrofotmetro

2 propipetas

4 tubos de centrfuga

4 pipetas de 5 mL

4 pipetas de 10 mL

1 vaso de precipitados de 250 mL

algodn y papel aluminio de distintos tamaos*

Soporte, anillo metlico y tela de alambre con asbesto.

2 mecheros

Probeta 10 ml

1 micropipeta de 100 L y 1ml con puntas

Sanitas servitoallas*

Guantes y cubrebocas*

Canicas de diferente tamao limpias*

*Lo debe traer el alumno

Soluciones

Reactivo de arsenomolibdato

500 ml de solucin de glucosa 0.3 % (abreviado como Glc)

1 mL de 2, 4 - dinitrofenol 0.05 % (abreviado DNP)

Reactivo de Somogyi (sol. 1 y 2)

Sol. de glucosa 0.15 mg/ml

Material biolgico

Un sobre de levadura seca activa (Fleischmann)

Equipo

Vrtex

Incubadora con temperatura controlable

Espectrofotmetro

Autoclave

Centrfuga

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PRCTICA 4: FERMENTACIN DE LA GLUCOSA POR LA LEVADURA DE PANIFICACIN

CUESTIONARIO 1. Defina los siguientes trminos gluclisis Anaerobio facultativo Dador de electrones Fermentacin homolctica Aceptor de electrones Fermentacin alcohlica Anaerobio estricto 2. Dibuje la estructura del 2,6 diclorofenol-indofenol sdico y mencione los usos que

se le da en investigacin? 3. Describa el fundamento para determinar la presencia de etanol empleando la

solucin sulfocrmica? 4. Predecir si la adicin de cantidades significativas de los compuestos que se

especifican a continuacin a un extracto de levadura que fermenta glucosa podran provocar un incremento (+), o un decremento (-), o no inducir ningn cambio (0), en la velocidad de conversin de glucosa en etanol: a) iodoacetato, b) ATP, c) ADP, d) AMP, e) fosfato, f) fluoruro, g) bisulfito (reacciona con los aldehdos), h) citrato, i) arseniato.

Introduccin Hay dos diferentes vas en la clula que pueden ser llevadas a partir de los alimentos: la fermentacin y la respiracin celular. Ambas vas inician con los mismos pasos, a este proceso se le llama gluclisis, la cual es el rompimiento de los tomos de glucosa (6 carbonos) en dos molculas de tres carbonos llamadas cido pirvico. La gluclisis es conocida probablemente como la va ms vieja en donde se produce ATP. Hay varios tipos de procesos de fermentacin, dos de las tipos ms conocidos de fermentacin son: la fermentacin del cido lctico y la fermentacin alcohlica. La fermentacin alcohlica es realizada por las levaduras y algunas especies de bacterias. El producto final de este va fermentativa es el etanol y el dixido de carbono (CO2). La levadura de panificacin Saccharomyces cerevisiae es capaz de efectuar la gluclisis a partir de la glucosa hasta etanol en condiciones anaerobias y hasta anhdrido carbnico en condiciones aerobias. Los humanos han utilizado esta va para producir de manera industrial bebidas y vinos. En el caso que nos ocupa, se estudiar el transcurso de la gluclisis en condiciones anaerobias, observando la produccin de una cantidad considerable de gas, lo que nos permitir seguir la reaccin con respecto al tiempo Objetivo Que el alumno observe y conozca la produccin de etanol por medio de la fermentacin alcohlica.

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Mtodo

Pesar 1 gramo de la levadura y disolverla en 10 mililitros de la solucin de

glucosa al 5% en buffer de acetato. La suspensin se prepara agitando con una varilla la levadura hasta que la suspensin sea homognea, es conveniente efectuar el procedimiento de mezclado con relativa rapidez procurando que no entre aire en la disolucin, A esta suspensin adicionarle 1 ml de 2,6 diclorofenol-indofenol sodico.

Inmediatamente despus de preparada, tomar 3 ml. de la suspensin con una

jeringa de 5 ml, posteriormente se coloca la aguja de la jeringa en la parafina para evitar la entrada de oxigeno.

A intervalos de 10 minutos (1 hora de incubacin), se va tomando la nota del

volumen del contenido de la jeringa y el color de la suspensin. Es importante utilizar jeringas cuyos mbolos cierren hermticamente y sean de fcil desplazamiento, ya que, de lo contrario, las lecturas de gas producido pueden resultar alteradas. La produccin de gas no es inmediata, ya que la levadura consume el poco oxgeno disponible, primero, mediante la oxidacin aerobia de la glucosa. El color del indicador de xido-reduccin indica el ambiente rdox del interior de la jeringa (azul = alcalino; rosa = cido; coloreado = oxidado; incoloro = reducido).

Hacer una grfica de los mililitros de gas producidos (ordenadas) frente al tiempo

(abscisas), indicando en el mismo los cambios de color observados.

Despus de 1 hora de fermentacin se filtra y se toma una alcuota de 1 ml en un tubo para la determinacin de etanol. A este mililitro (1 ml) se le adiciona 0.5 ml de solucin sulfocrmica diluida, se mezcla y se calienta en bao de agua hirviendo; aparece un color verde, percibindose el olor caracterstico del acetaldehdo. Por otra parte en otro tubo colocar 1 ml de etanol (10 mM ) y adicionar 0.5 ml de solucin sulfocrmica diluida, se mezcla y se calienta en bao de agua hirviendo esto corresponde al control positivo de la produccin de etanol por la fermentacin alcohlica. La presencia de etanol se puede comprobar mediante su oxidacin con cido sulfocrmico a acetaldehdo.

Discusin

1. Explique por qu la formacin de gas no se produjo inmediatamente en el experimento.

2. Por qu se debe hervir la solucin de acetato de sodio y cido actico? 3. Describe brevemente la gluclisis y sita el experimento dentro de este proceso 4. Qu nos indica el cambio de color en la reaccin? 5. Para qu es la solucin 2,6 diclorofenol-indofenol sodico y la sulfocrmica? 6. Cules son las reacciones que son irreversibles en el proceso de la gluclisis? 7. Qu gas es el que se produce durante el experimento?

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8. En la industria, qu importancia tiene esta levadura?

Referencias.

David L. Nelson; Michael M. Cox. LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUMICA. Ediciones Omega. ISBN: 8428212082. ISBN-13: 9788428212083. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL. Fourth edition. 2002.

Material *1 g de levadura fresca 2 pipetas de 10 ml y 1 ml 1 vaso de precipitado de 50 ml y 100 ml gradilla 1 mechero, tripe, malla de asbesto, 2 tubos de ensayo de 10 ml propipetas 1 varilla de vidrio *2 jeringas de plstico de 10 ml con aguja, nuevas. *1 o 2 bloques de parafina (veladora). *guantes y cubrebocas *material que deber de traer el alumno por equipo. Reactivos

1. 10 ml de glucosa al 5% en amortiguador de acetato (se debe hervir antes de usarse para reducir el contenido de oxgeno disuelto)

2. Amortiguador de acetato: 12.112 g de acetato sdico cristalizado y 0.78 ml de cido actico glacial en 500 ml de agua destilada

3. Solucin de 2,6-diclorofenol-indofenol sdico al 2% 4. Solucin sulfocrmica: 1 g de dicromato potsico en 50 ml de cido sulfrico 0.5 N 5. Etanol 10 mM. Medir 0.29 ml de etanol y aforar en 50 ml de agua destilada.

Felipus1 vso pp 100 ml1 micropipeta H10001 probeta 50 ml1 probeta 10 mlglucosa1 balanza granatariabalanza digital

1 esptula1 vidrio de reloj1 embudopapel filtro

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PRCTICA 5: METABOLISMO DE LPIDOS: CONVERSIN DE GRASAS A SACAROSA

Introduccin Germinacin. Definicin fisiolgica y tipos. Sustancias de reserva en las semillas Ciclo del glioxilato

La - oxidacin Cuantificacin de lpidos por diferencias en peso Objetivos

Examinar las diferencias bioqumicas de las semillas de ajonjol (Sesamum indicum) sometidas a distintas condiciones en cuanto a composicin de materiales de reserva, y con ello proponer un modelo fisiolgico de la transformacin de sustancias de reserva en distintos metabolitos durante la germinacin.

Observar las diferencias morfolgicas de las semillas durante la germinacin en presencia y en ausencia de luz

Hiptesis Elaborada por el alumno, considerando: Las sustancias de reserva particulares que contiene el ajonjol (Sesamum indicum) Los requerimientos fisiolgicos, ambientales y estructurales de las semillas para germinar (i. e. compuestos tiles como combustibles y componentes de vas biosintticas) De qu manera obtiene una semilla su energa siendo prcticamente incapaz de realizar la fotosntesis? Mtodo NOTA: La prctica ser realizada en dos sesiones, una para la extraccin y la segunda para la cuantificacin. La germinacin deber ser iniciada entre 3 y 7 das de anticipacin

Germinacin de las semillas.

1. Pesar 4 lotes de semillas de ajonjol de 2.5 g cada uno. Apartar una cantidad de

semillas sin germinar para el da de la prctica. 2. Lavar 2 lotes de las semillas con 50 ml de sol. de hipoclorito de sodio (cloro

comercial 1:10 con agua) y enjuagarlas con agua previamente hervida y enfriada. 3. Colocar en cada uno de dos frascos de boca ancha, 2.5 g de semillas, tapar con

2 capas de gasa sostenindolas con una liga. Guardar los dos lotes de semillas restantes.

4. En una bandeja con un poco de agua colocar los dos frascos boca abajo. Mantenerlos frascos en la bandeja con agua durante 4 das tapados con papel aluminio, a temperatura ambiente.

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Las plantas que germinan en la oscuridad, se les llama etioladas.

SESIN 1 Elegir las plntulas o semillas para hacer las determinaciones y repartirlas en dos mitades: una para la extraccin de lpidos y otra para la extraccin de componentes solubles. Las extracciones B y C deben hacerse de manera simultnea. Hay que observar las propiedades fisicoqumicas de los materiales y anotar todo lo que sea relevante. Extraccin y cuantificacin de lpidos.

1. Pesar aproximadamente 5 g de material biolgico. 2. Colocar en un vidrio de reloj cada muestra y secar con papel o meter las semillas

en la estufa a 50-60 C por 3 minutos. 3. Moler en mortero hasta obtener una pasta fina (el aspecto y consistencia ser

diferente de las plntulas y de las semillas). 4. Transferir a matraces independientes y agregar 10 mL de cloroformo : metanol

3:1 y calentar a bao mara a 70C por 10 min. 5. Enfriar con agua corriente y centrifugar 7 min a 2500 rpm. 6. Filtrar en papel y agregar 5 mL ms de solvente. 7. Etiquetar y tarar vasos de pp de 50 mL. 8. Transferir los filtrados a sus vasos respectivos y eliminar el solvente por

evaporacin usando bao mara. 9. Pesar los lpidos obtenidos.

Extraccin de protenas y carbohidratos.

1. Pesar en balanza analtica ~5 g de tejido de cada lote experimental. 2. Moler en fro en 3 morteros independientes las plntulas y semillas no

germinadas de ajonjol, agregando poco a poco 10 mL de MgCl2 3 mM. 3. Centrifugar 15 min a 1500 rpm. 4. Filtrar el sobrenadante usando papel filtro en embudo buchner y matraz kitazato

conectado a vaco y en hielo. 5. Etiquetar este filtrado como "extracto crudo" del cual se tomarn alcuotas para la

cuantificacin de protenas y carbohidratos. 6. Guardar en el congelador los extractos en frascos etiquetados.

Material que llevar el alumno

Semillas y plntulas de ajonjol en

tres frascos Gerber Masking tape Marcador

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Franela Detergente lquido

Soluciones y reactivos

3 mM MgCl2 (20 mL)

Cloroformo Metanol

............................................................................................................................... Cristalera y equipo 1 vidrio de reloj 2 morteros 1 cristalizador o hielera 1 matraz Erlenmeyer

de 125 mL 4 tubos de centrfuga 2 probetas 25 50 mL

2 vasos pp 50 mL y 2 de 100 mL

1 embudo de filtracin 1 embudo buchner y

tapn de hule horadado

2 matraces kitazato

Balanza analtica Papel filtro Termmetro Agitador magntico y

mosca Centrfuga Bao de incubacin

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SESIN 2: Descongelar el extracto crudo y preparar una dilucin 1:10 y otra 1:100

Cuantificacin de protenas.

Limpiar y etiquetar 10 tubos por duplicado. Agregar en orden las siguientes sustancias (en mL). Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Leer absorbencia a 550 nm, usando como blanco el tubo 1 y para la curva patrn usar los datos de los tubos 1 al 7. Las muestras para los tubos 8 a 10 debern ser: extracto crudo, extracto diluido 1:10, extracto diluido 1:100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H2O 6.0 5.8 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 5.5 5.5 5.5 BSA 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0 0 0 Extracto 0 0 0 0 0 0 0 0.5 0.5 0.5 Biuret 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0

Cuantificacin de carbohidratos.

Segn el protocolo de fenol sulfrico detallado en la tabla. Hacer una curva patrn con sacarosa: preparar 100 mL de una solucin 1 mg/mL. 1. Preparar una solucin de bicarbonato al 10%. 2. Numerar los tubos del 1 al 10 por duplicado. Mantener los tubos en hielo. Los tubos 7 al 12, llevarn 0.5 mL 3. Agregar los reactivos (en ml) en el siguiente orden: a todos los tubos se agrega el agua en primer lugar y el cido al ltimo. Los tubos 7 al 9 llevan el volumen indicado de los extractos crudo y diluidos 1:10 y 1:100

# Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 H2O 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8 0.8 0.8 Sacarosa 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0 0 0 Extracto 0 0 0 0 0 0 0.2 0.2 0.2 0.2 5% Fenol 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Ac. sulfrico

5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

4. Agitar los tubos 5. Dejar en reposo 10 min a temperatura ambiente 6. Agitar de nuevo y dejar en reposo a 30C otros 10 min. 7. Leer Absorbencia a 490 nm, usando el tubo 1 como blanco. 8. Neutralizar y desechar los residuos cidos con el bicarbonato

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Material que llevar el alumno Masking tape Marcador Franela Detergente lquido Soluciones y reactivos 1 mg/mL de Albmina srica bovina en agua destilada (BSA) Sacarosa (1 mg/mL) en agua destilada Fenol al 5% (m/v) Bicarbonato de sodio al 10% (m/v; 200 mL) cido sulfrico fumante Reactivo biuret CuSO4 tartrato de sodio y potasio NaOH ...................................................................................................................... Cristalera y equipo 20 tubos de ensaye y gradilla 1 piceta 1 cristalizador o hielera 3 pipetas de 10 mL 3 pipetas de 1 mL 1 propipeta 2 celdas para espectrofotmetro de vidrio o 4 desechables 3 vasos pp: 500, 250 y 100 mL 1 esptula 1 vidrio de reloj 3 probetas: 500, 100 y 50 mL Vrtex Balanza analtica Termmetro Agitador magntico y mosca Espectrofotmetro Bao de incubacin

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PRCTICA 6: ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS EFECTO DE LOS INHIBIDORES DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES Y DE LOS DESACOPLANTES CUESTIONARIO 1. Cules son las fuentes de carbono que usa la levadura? 2. Cules son las vas metablicas que catabolizan a los carbohidratos? 3. Describir la gluclisis y la fosforilacin oxidativa. 4. Cules son los productos finales del catabolismo de los carbohidratos en las

levaduras? 5. Enliste los inhibidores de la cadena respiratoria de los sitios I, II y III. Describa

su efecto sobre el consumo de 02 y la sntesis de ATP. 6. Explique brevemente el mecanismo por medio del cual los protonforos

desacoplan la fosforilacin oxidativa; describa su efecto sobre el consumo de O2 y la sntesis de ATP.

7. En que se basa el ensayo de Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT)

Introduccin

El metabolismo energtico es la base de las funciones celulares. Una adecuada transferencia de electrones a travs de una serie de reacciones redox garantiza la obtencin de sustratos energticos necesarios para el ptimo funcionamiento de las clulas.

En la membrana interna mitocondrial se encuentran la cadena respiratoria, que est formada por protenas que se ensamblan en complejos multiproticos denominados I, II, III y IV. El complejo I denominado NADH-deshidrogenasa recibe los electrones de la oxidacin del NADH y los transfiere a la coenzima Q, la cual se desplaza libremente a travs de la membrana interna mitocondrial; el complejo II, succinato deshidrogenasa se encarga de transferir los electrones del succinato a la coenzima Q, sin translocar protones; el complejo III, citocromo c-coenzima Q oxidoreductasa recibe los electrones de la coenzima Q y los transfiere al citocromo c, un transportador electrnico protico soluble que se encuentra en el espacio intramembranal; y el complejo IV o citocromo oxidasa acopla la oxidacin del citocromo c con la reduccin del oxgeno molecular a agua. Las reacciones globales de los complejos I, II, III y IV son exergnicas y la energa liberada en ellas crea un gradiente de protones a travs de la membrana interna mitocondrial al resultar los protones bombeados al espacio intermembranal. Este gradiente de protones libera la energa suficiente para que tenga lugar la sntesis de ATP por la ATP-sintasa.

Un mtodo indirecto el cual se utiliza ampliamente para evaluar la funcionalidad mitocondrial es el desarrollado por Mosmann en 1983, el cual se basa en la reduccin de MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) por las

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deshidrogenasas mitocondriales. En trminos generales, las sales de tetrazolio al reducirse pasan al estado formazn, el cual es un compuesto de color azul e insoluble en agua. El empleo de esta tcnica nos permite evaluar la actividad de los complejos de la cadena respiratoria bajo diferentes condiciones experimentales. Objetivos 1. Relacionar el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las

levaduras 2. Evaluar el efecto de diferentes inhibidores y los desacoplantes de la cadena de

transporte de electrones en la funcionalidad mitocondrial a travs de la reduccin de MTT.

3. Correlacionar los cambios de pH con la reduccin de MTT. Hiptesis Si las levaduras consumen glucosa entonces se observar una disminucin progresiva de su concentracin en el medio de cultivo con el tiempo y estarn relacionados con los cambios en el pH extracelular. Si las deshidrogenasas mitocondriales reducen al MTT, entonces el empleo de algn inhibidor de la cadena de transporte de electrones disminuir la capacidad reductora de estas enzimas, reflejndose as una disminucin en la reduccin del MTT, la cual estar relacionada con la funcionalidad mitocondrial. Mtodo

Experimento 1 (control)

1. Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada 2. Determinar el pH de la solucin repitiendo la medicin dos veces (total tres)

con intervalos de 3 minutos para obtener la lnea basal 3. Adicionar 5ml de glucosa al 10%, agitar y medir el pH 4. Determinar el pH de la solucin cada 5min (4 veces) y luego cada 10min (2

veces ms)

Experimento 2 (dinitrofenol)

1. Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada 2. Aadir por decantacin (no pipetear) 0.2 ml de la solucin de dinitrofenol

40mmol/ L, concentracin final de 200 mol/L 3. Determinar el pH de la solucin repitiendo la medicin dos veces ms con

intervalos de 3 minutos para obtener la lnea basal 4. Esperar 5minutos 5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control

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Experimento 3 (azida de sodio)

1. Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada 2. Aadir por decantacin (no pipetear) 0.5 ml de la solucin de azida de

sodio 400mmol/L, concentracin final de 5mmol/L. Agitar con cuidado 3. Determinar el pH de la solucin repitiendo la medicin dos veces ms

con intervalos de 3 minutos para obtener la lnea basal 4. Esperar 5 minutos 5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control

Experimento 4 (Reduccin de MTT)

1. Tomar 1.5 mililitros de las soluciones de levaduras de los experimentos 1, 2, 3,

15 minutos despus de haber adicionado los inhibidores y colocarlo en un tubo eppendorf de 2 mL (Todo se realiza por duplicado).

2. Agregar a cada tubo 12L de MTT (5mg/mL) e incubar los tubos 20 min a 37C.

3. Pasado el tiempo de incubacin, sacar los tubos y observar la coloracin. 4. Centrifugar los tubos a 12000 rpm durante 3 min. 5. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 mL de isopropanol-cido. 6. Leer las muestras a 570nm. Anlisis de Resultados

1. Hacer una grfica de los experimentos 1, 2 y 3, usando los valores de las lecturas de pH contra tiempo.

2. Discutir el significado de los cambios de pH en el experimento control, con dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio como inhibidor.

3. Para el experimento 4 hacer una curva en porcentaje considerando la absorbancia de los tubos control como el 100% de la capacidad de las mitocondrias de las levaduras de reducir el MTT y ver que efecto tienen los inhibidores y/o desacoplantes empleados.

4. Hacer una relacin de las vas que producen estos cambios, tomando en cuenta que las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se encarga de sintetizar ATP; y que tienen otra ATPasa de protones en la membrana plasmtica cuya funcin es similar a la bomba de Na+/K+ en las clulas de los mamferos.

Referencias 1. Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Methods 65: 5563. 2. Pea A.1975. Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch.

Biochem Biophys 167:397-409. 3. Pardo JP.1990. La ATPasa de H+ de la membrana plasmtica de los hongos.

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Mensaje Bioqumico. 13:119-172. Material 4 vasos de precipitado de 100 ml 2 Pipetas de 5 y l0 ml 6 tubos eppendorf de 2 mL 1 micropipeta de 100 L y 1ml con puntas Espectrofotmetro Potencimetro Celdas de espectofotmetro Piceta *Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ml Solucin de glucosa al 10 % Solucin de dinitrofenol 40 mmol/L en etanol Solucin de azida de sodio 400 mmoI/L Agua destilada Solucin MTT (5mg/mL) Isopropanol cido (192ml de isopropanol + 8ml de HCl) *base de unicel *lo debe traer el alumno

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PRCTICA 7: ACTIVIDAD FOTOSINTTICA REDUCCIN DEL 2-6 DICLOROFENOL-INDOFENOL (DCPIP) DEPENDIENTE

DE LA ACTIVIDAD FOTOSINTTICA DE CLOROPLASTOS AISLADOS DE Spinacea oleraceae (espinaca)

Introduccin: En los vegetales superiores los cloroplastos se presentan generalmente como cuerpos ovales de aproximadamente 5 a 10 m de largo. Es en los cloroplastos donde se llevan a cabo las reacciones fotosintticas de las clulas eucariticas. El proceso fotosinttico en plantas superiores, lo podemos separar en dos fases: la primera, llamada fase luminosa fotoqumica, requiere de la energa luminosa y sus productos principales son: ATP, NADPH y O2. La segunda fase, tambin llamada la fase obscura de la fotosntesis, requiere del ATP y de NADPH para transformar, por medios bioqumicos, al C02 en carbohidratos y otros productos. En 1937, Roberto Hill observ que un homogenizado de hojas conteniendo cloroplastos intactos, tena la capacidad de reducir el oxalato de potasio frrico (un aceptor artificial de electrones) en presencia de la luz con desprendimiento de O2. La reaccin podra representarse de la siguiente manera:

Luz

H2O + Aceptor de electrones 1/2 de O2 + Aceptor de e- reducido

La absorcin de la luz por los pigmentos fotosintticos es el primer evento de la fotosntesis, siendo la clorofila el principal pigmento en bacterias fotosintticas, algas y plantas superiores. Actualmente se sabe que las reacciones fotoqumicas de la fotosntesis se llevan a cabo en el sistema de membranas tilacoidales, que se encuentran en el interior de los cloroplastos, mientras que en las reacciones de la fase obscura se realizan en el estroma. Objetivo Determinar colorimtricamente la actividad fotosinttica de los cloroplastos en diferentes condiciones mediante la reduccin del DCPIP. Material Procedimiento Precaucin: El aislamiento de los cloroplastos debe realizarse a una temperatura entre 0C y 5C y en obscuridad.

A. Obtencin de cloroplastos:

1 Seleccionar aprox. 40 g de hojas frescas de espinaca, lavarlas con agua de la llave, procurando que el agua no caiga directamente sobre las hojas y secarlas con toallas de papel

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2. Cortar el tallo, la nervadura principal y el pice de cada hoja y desecharlos 3. Colocar los en un vaso de licuadora previamente enfriado en hielo y agregar

100 ml de medio de aislamiento fro, homogenizar a la velocidad ms alta por unos segundos, destapar la licuadora y con una esptula mover los pedazo de hoja de arriba hacia abajo, para cuando se mjense de nuevo no daar los cloroplastos por dao mecnico, homogenizar nuevamente por unos segundos, hasta obtener pedacitos muy pequeos de hoja de aprox. 3 Mm de dimetro.

4. Filtrar la suspensin usando 8 capas de gasa, recoger el filtrado en dos tubos de centrfuga de 15 ml cada uno, previamente enfriados en hielo, repartir equitativamente el filtrado y balancear los tubos.

5. Centrifugar por 5 min. a 4000 rpm, decantar el sobrenadante y desecharlo. 6. El sedimento se resuspende con 2.0 ml de medio de aislamiento de

cloroplastos. Durante toda la prctica se mantienen los cloroplastos en bao de hielo.

10. Tomar, con una pipeta Pasteur, una gota de la suspensin de cloroplastos y observarla al microscopio.

11. Tomar 0.5 ml de la suspensin de cloroplastos en un tubo de ensaye y ponerla durante 10 minutos en agua hirviendo Suspensin de cloroplastos hervidos, y observarlos al microscopio.

B. Cuantificacin de clorofila:

1. Para determinar la concentracin de clorofila, colocar en dos tubos de

centrifuga (los tubos deben ser de vidrio) 5 ml de acetona al 80% y 20 L de la suspensin de cloroplastos

2. Cubrir con parafilm, los tubos, agitarlos bien e incubar el tubo en la obscuridad por 5 minutos.

3. Centrifugar los tubos a 5000 r.p.m. durante 5 minutos, y colocar el sobrenadante en tubos de espectrofotmetro.

4. Leer su absorbancia a 645 y 663 nm calibrando el cero de absorbancia con acetona al 80% (Esto se hace por duplicado)

5. La clorofila total en g/ml se calcula con la siguiente frmula: [Chl en g] = [ 8.05 (Abs663) + 20.29 (Abs645)] 5 Recuerde que la cuantificacin se realizo por duplicado

C. Determinacin de la reduccin del DCPIP

1. Para determinar la reduccin del DCPIP preparar 5 tubos de espectrofotmetro

como se indica en la tabla siguiente:

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Tubos de espectrofotmetro 1 2 3 4 5

Medio de reaccin con DCPIP (300 M)

ml

0 3 3 3 3

Medio de reaccin sin DCPIP

ml

3 0 0 0 0

Herbicida comercial ml

0 0 0 0 50 l

Suspensin de cloroplastos ml

60 g

0 g

60g

60 g

60 g

2. Colocar los tubos en una gradilla de unicel. 3. Tapar los tubos con papel parafilm y mezclar su contenido invirtindolo

suavemente. Evitar la formacin de burbujas 4. Tapar el tubo 4 con papel aluminio 5. Medir inmediatamente la absorbancia de cada uno de los tubos a la longitud

de onda de 660 nm de. Ajustar acero con el tubo 1. Anotar los resultados tiempo cero.

6. Colocar todos los tubos frente a una lmpara de 150 watts a 10 cm de distancia durante 1 minuto y tomar nuevamente lectura en el espectrofotmetro. Repetir este proceso 4 veces ms

7. Hacer una grfica de Absorbancia contra tiempo, interpretarla y discutirla. Soluciones: Las siguientes soluciones se prepararn para todos los equipos, a excepcin de la acetona al 80% que es por equipo. Medio de aislamiento de cloroplastos. Preparar 500 ml de una solucin con agua desionozada, que contenga sacarosa 400 mM, tricina 20 mM, KCl 20 mM, MgCl2 5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH Medio de reaccin. Preparar 500 ml de una solucin con agua desionizada, que contenga sacarosa 100 mM, MgCl2 5 mM, KCl 10 mM, tricina 15 mM, KCN 0.5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH. Medio de reaccin con DCPIP. Tomar 400 ml de medio de transporte de electrones y agregar la cantidad necesaria para obtener una solucin 0.3 mM de DCPIP en el medio de transporte de electrones. 10 ml de acetona al 80% (por equipo) Herbicida comercial, DCMU (dicloro metil urea) 3 mM.

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NOTA: Se prepararn 10 ml de DCMU 3mM disueltos en etanol, el DCMU preparado se encontrar en el congelador, en donde se guardara nuevamente para los siguientes grupos que realicen la prctica. Matraz de 250 ml 2 vasos de precipitado de 50 ml 6 tubos de centrfuga 7 tubos de ensaye 6 tubos de espectrofotmetro 1 probeta de 100 ml y 50 ml Micropipeta de 100ml y 1 l con puntas 1 embudo 2 pipetas graduadas de 10 ml 2 pipetas graduadas de 5 ml 2 pipetas graduadas de 1 ml recipiente metlico para hervir Soporte, anillo, mechero y tela de asbesto Agitadores de vidrio *Material que debe traer el alumno

Pipeta Pasteur Agua destilada y desionizada *Cubreobjetos y portaobjetos *1 lmpara de luz incandescente de 150 watts Hielo picado 1 mortero o una licuadora *1 reloj (cronmetro) 1 charola grande *Papel aluminio *Toallas de papel o sanitas *Parafilm *Gasa *Papel filtro *Hojas frescas de espinaca *base de unicel *Espejo *tela negra