c%?aabiertadt#mpo UNIVERSIDAD AUTóNOMA METROPOLITANA DIVISIÓN DE CIENCIAS B I O L ~ G I C A S Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL

M. en C. Rosaura Grether G. DIRECTORA DE LA DIVISIÓN C.B.S.

P R E S E N T E :

El que suscribe, Dr. Héctor Garduño Argueta miembro del personal académico de esta universidad, hago constar la finalización del Servicio Social del alumno:

NOMBRE: Hernández Nájera Felipe

MATRICULA: 88336529

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LICENCIATURA: Hidrobiología. Unidad Iztapalapa. División: C.B. S.

TITULO DEL TRABAJO? Criopresenlación de semen en la especie Oreochromis n iloticus N

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LUGAR DONDE SE REALIZó EL TRABAJO: Instalaciones de la Planta Experimental de Producción Acuícola. UAM-Iztapalapa.

FECHA DE INICIO: Enero 2 de 1995.

FECHA DE TERMINACIóN: Julio 2 de 1995.

Los objetivos así como los resultados obtenidos por el alumno durante el proyecto. se supervisaron y evaluaron concluyéndose satisfactoriamente los rubros establecidos en los artículos 17 y 18 del Reglamento de Servicio Social de esta Universidad.

A t e n t a m e n t e "CASA ABIERTA AL TIEMPO"

Dr. Héctor Garduño Argueta Investigador Titular "B" tiempo completo, Titular de la Planta Experimental de Producción Acuicola UAM-Iztapalapa.

S:

UNIVERSIDAD AUT~NOMA METROPOLITANA D M S I ~ N DE CIENCIAS BIOL~GICAS Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL

M. en C. Rosaura Grether G. DIRECTORA DE LA DMSIÓN C.B.S.

P R E S E N T E :

El que suscribe, Dr. Alejandro Córdova Izquierdo miembro del personal académico de esta universidad, hago constar la finalización del Servicio Social del alumno:

NOMBRE: Hemández Nájera Felipe

MATRICULA: 88336529

LICENCIATURA: Hidrobiología. Unidad Mapalapa. División: C.B.S.

TITULO DEL TRABAJO: Criopreservación de semen en la especie Oreochromis niloticus

LUGAR DONDE SE REALIZó EL TRABAJO: Instalaciones de la Planta Experimental de Producción Acuícola. UAM-Iztapalapa.

FECHA DE INICIO: Enero 2 de 1995.

FECHA DE TERMINACIóN: Julio 2 de 1995.

Los objetivos así como los resultados obtenidos por el alumno durante el proyecto, se supervisaron y evaluaron concluyéndose satisfactoriamente los rubros establecidos en los artículos 17 y 18 del Reglamento de Servicio Social de esta Universidad.

A t e n t a m e n t e "CASA ABIERTA AL TIEMPO"

, "7

Profesor dtular del Departamentdde Producción Agrícola y Animal UA" Xochimilco.

UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y b hisima. Col. Vicentinr 1Zl.pllapa. D.F. C.P. 09340. Te1 686-03-22 TE1-a: (5) 686-89-5'9 TELEX: UAhfME: I76196

CRIOPRESERVACI~N DE SEMEN EN LA ESPECIE

Oreochromis niloticus 1

I. INTRODUCCI~N: ,

. , Los primeros ensayos por mantener materiales biológicos a baja '. temperatura se realizaron durante la Segunda Guerra Mundial, en donde ya se

disponía de las primeras técnicas para poder preservar lotes de hemoglobina, así como proteínas e insulina (Greaves, 1968). Posteriormente los avances permiten depurar técnicas para la criopreservación de diversos materiales tales como: tejidos, órganos, fluidos, material genético, así como de semen. La gran ayuda que nos brinda la preservación de tejidos a bajas temperaturas al utilizar nitrógeno líquido (criopreservación) es la disponibilidad indefinida de material biológico sin que se deteriore por descomposición.

Se han realizado avances en la criopreservación de semen en mamíferos terrestres entre los que se encuentran los bovinos (Foote, 1978); caballos (Sullivan, 1978); cerdos (Larsson, 1978); aves (Lake, 1978), así como el hombre (Harrison y Sheppard, 1980. Sin embargo, los avances en las técnicas para organismos acuáticos no son tan numerosos como los anteriores.

La criopreservación de esperma es una técnica muy útil en el control de la reproducción en acuacultura, su aplicación soluciona fácilmente los problemas relacionados con la falta de sincronización en la maduración de las poblaciones. Por lo tanto, en este caso, la criopreservación de semen en peces, resulta conveniente para la producción de híbridos, ya que muchas de las especies utilizadas presentan procesos de desove en diferentes épocas, así por ejemplo, se pueden encontrar especies que producen huevos en marzo y otras especies en abril, debido a diferentes requerimientos de fotoperiodo; o si una especie requiere de un flujo constante de agua para inducir el desove,

-U. A. M. IZTAPALAPA BIBLIOTECA

mientras que otras tienen preferencias por ambientes estáticos. Al tratar de producir un híbrido de estas dos especies resultaría imposible bajo conhciones naturales. Otro caso de gran importancia en estas técnicas, es conservar grandes cantidades de material genético a bajo costo.

El almacenaje indefíido por congelación a -1 96 "C en nitrógeno líquido, permite al acuicultor y al investigador mayor flexibilidad en la elaboración de cruzas genéticamente seleccionadas, o en última instancia comercializar aquellos lotes de material genético con un alto valor por sus características. El almacenaje de gametos a bajas temperaturas nos facilita tener un control en poblaciones de peces. Las piscifactorias criadoras de alevines podrían acrecentar su mercado disminuyendo gastos. En este caso, la producción dependerá de la presencia simultánea de adultos saludables viables, con excelentes características, facilitando así la obtención de esperma y huevos seleccionados.

El objetivo principal en las prácticas de congelamiento de semen en peces es la de poder tener un control sobre la reproducción artlficial. Dependerá de la especie seleccionada aplicar alguna de las técnicas que más recomendable para la misma. Los enfoques, finalidades o interés particular pueden ser los de investigación, producción acuícola, comercial o e ,Ibgicos, resumiendose como proponen Cloud (1 990) y Ciereszko, et al., (1 9 m los puntos siguientes:

1.

2. 3.

4.

Oportunidad de introducir genes de poblaciones naturales o nativas dentro de lotes de piscifactorias cuando los desoves no se encuentran coordinados. Disponibilidad de semen para programas de cruzas seleccionas. Disponibilidad de bancos de genoma para producir peces cuando exista un número reducido de machos. Accesibilidad de esperma de machos con una historia clínica conocida, presencia de enfermedades y su fiecuencia, con lo que la calidad del semen criopreservado aumentará pudiendo ser intercambiado entre países en lugar de los organismos, cuando la importación de animales vivos es prohibida.

2

11. ANTECEDENTES:

Existen bastantes trabajos sobre criopreservación de semen realizados en especies terrestres incluyendo al hombre, siendo menos los realizados en peces. Tras una revisión de publicaciones científicas en los últimos quince años, se observa que están enfocados hacia especies de salmónidos, esto se debe al mayor el conocimiento de la biología y de las cruzas en estas especies, así como por su importancia comercial. Estos avances dan impulso a la investigación en criopreservación de material proveniente de peces de especies de aguas templadas (Holtz, 1993). Por lo que actualmente ya se disponen de técnicas desarrolladas para diferentes especies.

El primer estudio con la utilización de técnicas de criopreservación, reportó la obtención del 80% de fertilidad durante pruebas realizadas en gónadas seccionadas de arenque del Atlántico (Clupea harengus), congeladas a una temperatura de -79 "C (Blaxter, 1953). En 1968 Moniub, et al. reportaron un promedio de fertilidad del 36% para esperma de bacalao del Atlántico (Gadus morhua), congelados a la temperatura de -1 96°C. En 1969 Truscott e Idler experimentaron con salmón del Atlántico, reportando valores de fertilidad de 5 a 19% en semen congelado. Graybill y Horton obtuvieron 18% de fertilidad usando esperma congelado de trucha "cabeza de metal'' (Salmo gairdneri). En 197 1 Ott y Horton reportaron fertilidades máximas en un 38% para el salmón barbado y 79% para salmón coho, y un promedio de fertilidad de 59% para trucha cabeza de metal con semen congelado, siendo estudios de los más relevantes en su época. En 1978 Erdahl y Graham realizaron estudios sobre semen congelado en salmónidos.

La criopreservación de semen en peces, provee una poderosa herramienta útil para incrementar la talla poblacional genética efectiva, especialmente cuando se tienen nuevas poblaciones establecidas; también para mantener la diversidad genética y características de las poblaciones silvestres, así como en los casos de especies en peligro de extinción, como por ejemplo la trucha café (Salmo trutta m. lacustris L.) y una especie del Mico (Salvelinus alpinus L.) de las cuales ya se están recolectando organismos para el establecimiento de un banco de genoma para repoblar los sistemas de agua dulce de Finlandia (Piironen, 1993). Además en

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acuacultura la criopreservación es de gran importancia cuando se desea realizar cruzas selectivas con gametos seleccionados independientemente del tiempo y del espacio así como la crianza de peces a gran escala.

Los estudios que se realizan actualmente tienen la fmalidad de depurar las técnicas y así disminuir los problemas técnicos en el proceso de criopreservación a -1 96 "C con nitrógeno líquido. El principal problema es que al someter el semen a temperaturas bajo cero, los espermatozoides presentarán la formación de cristales que lo dañan hasta su destrucción, ocasionado por los solutos intracelulares de los mismos (Greaves, 1968), por lo que es necesario la utilización de crioprotectores, estos son reactivos químicos, que en adición de sales y proteinas naturales en diferentes proporciones van a protejer a los espermatozoides evitando la formación de cristales intracelulares. El siguiente problema es que el uso de estos ocasiona alteraciones biológicas y fisicoquímicas, es decir son tóxicos y su efecto se observa al no obtenerse una sobrevivencia del 100% (Fahy, 1986; Kruuv, et- al, 1990 y Arakawa, et-al, 1990). Ambos problemas no permiten una sobrevivencia total de los espermatozoides aún así los crioprotectores propuestos proporcionan porcentajes de sobrevivencia aceptables.

En el caso de crioprotectores para semen de peces se tiene como antecedentes los experimentos realizados en huevos no fertilizados de salmónidos a temperaturas bajo cero, reportando sobrevivencia de ellos al utilizar Dimetil-sulfóxido (DMSO) con valores de 180 mCi/mmol, glicerol con valores de 5-10 mCi/mmol de y metano1 con valores de 2-5 mCi/mmol mezclados con 5% v/v de solución Ringer (Harvey y Ashwood-Smith, 1982). Otro caso con resultados positivos, fue el experimento realizado en embriones de pez cebra (Brachydanio rerio) en el cual se utilizó glicerol y DMSO, siendo reactivos ideales para su utilización como crioprotectores que permiten una sobrevivencia aceptable de los espennatozoides (Harvey, Kelley y Ashwood-Smith, 1983). Y para el caso de semen se realizó un experimento con la "perca amarilla" (Perca flavescens). Se obtuvieron los siguientes resultados en fertilización de huevos con semen tratado DMSO con valores de 23.2%, con solución glucosa glicerol un 3% y con esperma fresco un 53.4 %. Se concluyó que para este caso uno de los mejores criprotectantes es el DMSO a diferencia de la solución glucosa-glicerol y que

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para aumentar el éxito es recomendable utilizar semen congelado en una proporción de 10, y así aumentar el porcentaje de fertilizaciones (Ciereszco; Ramseyer; Dabrowsky, 1993).

El problema siguiente es disminuir el gasto de energía ocasionado por la motilidad del esperma, por lo que se utiliza una mezcla de sales con agua destilada llamada solución fertilizante o solución Ringer (Ginsburg, 1963). Se deben mezclar los crioprotectores con la solución Ringer para formar un diluyente que se mezclará con el semen antes de criopreservarlo.

Otro problema que debe de tomarse en consideración es evitar la proliferación de bacterias por lo que se ha propuesto la aQción de antibióticos, aumentando así periodo de almacenaje (Stoss y Refistie, 1983). Los antibióticos más recomendados son la estreptomicina y penicilina ( Harvey, et al, 1984).

Es necesario enfatizar que para cada especie se deberá de realizar una técnica apropiada porque resulta imposible estandarizar una para todas ellas, siendo necesario realizar modficaciones en las técnicas existentes y para que se adapte una a la especie de interés (Piironen, 1993).

Las técnicas de salmónidos son adaptaciones hechas para las diferentes especies de Sarotherodon spp. y Tilapia spp. por la importancia de éstas en la producción de monosexos o de híbridos estériles principalmente para la acuacultura en varios países según Hickling (1 97 1) mencionado por Harvey (1983). Los trabajos más sobresalientes para estas especies son los realizados por Harvey, et al ( 1983, 1984) así como Chao et al. (1987).

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111. OBJETIVOS:

Aplicar técnicas de criopreservación de semen en la especie Oreochromis niloticus dentro de las instalaciones de la Planta Experimental de Producción Acuícola de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa, con la finalidad de demostrar que son aplicables en México y dar un impulso en la aplicación de técnicas para la producción acuícola de especies nativas o comerciales.

IV. MATERIALES Y METODOS:

A continuación se listan los materiales y metodos técnicas originales, se mencionan algunas modificaciones y el material que se utilizó se marca en negritas.

MATERIALES:

I. Organismos:

Reproductores machos y hembras en excelente estado de la especie Oreochromis niloticus con la fialidad de tener la certeza de la calidad de los ejemplares y como consecuencia la calidad del semen congelado. Los reproductores seleccionados deben de presentar un hstorial que indique su procedencia, línea genética, edad, enfermedades que haya tenido y evaluar el semen en los distintos meses para saber cuando es la mejor temporada para colectarlo y congelarlo.

II. Antibióticos:

1. Estreptomicina 1 O00 UI/l O0 d. 2. Penicilina 1 mg/lOO ml.

6

III. Crioprotectores:

1. Dimetil-sulfóxido (DMSO). 2. Glicerol 3. Metano1 4. Leche descremada en polvo 5. Yema de huevo 6. Agua destilada

IV. Solución Ringer:

La solución Ringer (Ginsburg, 1963) desarrollada como solución fertilizante para aumentar la motilidad de los espermatozoides ya que estos al entrar en contacto con el oxigeno va a existir desgaste (Inoda et al., 1988) Además cuando estos están inmóviles.

REACTIVO

2. KC1 1.28 mM (750 mg) l . NaCl

CANTIDAD

2.0 mM (20 mg) 4. NaHC03 1.8 mM (20 mg) 3. 3.CaC12 2.7 mM (20 mg)

6. Tricina 20.0 mM I 7. Buffer pH 7

5. H20 100 m1

La solución Ringer se preparó mezclando las sales con agua destilada, no fue necesario utilizar la tricina. Se homogeneizó quedando un líquido un poco turbio envasándose en una botella color ámbar para evitar su alteración.

V. Materiales Complementarios:

1. Alcohol polivinilico 2. Centrífuga 3. Contenedor de Nitrógeno líquido de 25 litros 4. Crisol

7

5. Cubreobjetos 6. Envases criogénicos de 250-p1 de plástico 7. Envases criogénicos de 100-p1 de plástico 8. Hielo 9. Hielo seco (C02) 1 O. Líquido celómico, NaHC03 O. 12 M o NaCl O. 12 M. 11. Microscopio de contraste de fases 12. Papel filtro 13. Parrilla eléctrica 14. Peine 15. Pipeta automática 16. Pipetas Pasteur 17. Portaobjetos 18. Refrigerantes 19. Termómetro 20. 2-Fenoxietanol.

METODOS:

Para la parte de congelamiento de semen se tomó como base la técnica de Harvey (1983) aplicada en la especie Sarotherodon mossambicus y en la parte de descongelamiento y fertilidad, se tomó como base la técnica de Chao et al. (1987) aplicada en las especies Oreochromis aureus, O. mossambicus, O. niloticus, Tilapia zilli, Oreochromis sp y los hibridos de O. niloticus x O. aureaus.

Previamente se preparan los diluyentes antes de procesar el semen. Harvey (1983), propone seis diluyentes para la especie Sarotherodon mossambicus, siendo éstos mismos seleccionados para la especie Oreochromis niloticus. Solo tres de los seis se probaron y uno más fue propuesto. Se evaluaron los cuatro para la optimización de alguno de ellos. Todos se doraron con la solución Ringer.

8

1 5.

7.

05% DMSO 10% DMSO 05% DMSO 05% Metanol 05% Metanol 10% Glicerol 10% Glicerol

DILUYENTES 15% de leche en polvo. 15% de leche en polvo 15% de yema de huevo. 15% de leche en polvo. 15% de yema de huevo. 15% de leche en polvo. 15% de yema de huevo. propuesto

Cada diluyente se debe mezclar con el semen extraído en una proporción de 1 parte de semen por 5 partes del diluyente (1 :S).

* Dimetil sulfóxido “DMSO” (grado de reactivo v/v) * Metanol (grado de reactivo v/v) * Glicerol (grado de reactivo v/v) * Leche en polvo descremada (w/v) * Yema de huevo (v/v)

PROCESAMIENTO DEL SEMEN, SEGÚN HARVEY (1983):

l. El ejemplar seleccionado se anestesiará con 0.75% de 2-fenoxietanol.

2. El semen se obtiene con presiones ligeras en la vejiga, colectándolo en los envases criogénicos de 100 pl. Un espécimen de aproximadamente 20 cm. nos provee una cantidad de 400 a 500 pl. muchas veces por semana. Es importante que el semen no se contamine con orina ya que causan la activación y desgaste de los espermatozoides; si en la muestra se presenta una motilidad menor del O. 1 %, ésta se descarta. Para observar la motilidad que muestran los espermatozoides se utilizará un microscopio de contraste de fases (400X).

3. El semen se mantiene en helo hasta que se diluya para bajar su temperatura cercana a 0°C.

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4. El semen se mezcla con cada uno de los diluyentes a 0°C y se toman alícuotas de 5 pl que se vierten en capilares con capacidad de 10 1-11. Se utilizará una pipeta automática.

5. Los envases con el semen se introducen dentro de canales hechos previamente en el helo seco con la longitud y anchura de éstos, durante 15 min. tiempo suficiente para alcanzar la temperatura de -79°C.

6. Inmediatamente los capilares se transfieren al envase con nitrógeno para que alcancen la temperatura de -1 96°C. Como mínimo deben de transcurrir 26 horas para que el semen pueda ser evaluado.

DESCONGELAMIENTO Y FERTILIDAD DEL SEMEN SEGÚN CHAO et al. (1987):

1: Hembras listas para ovopositar, se anestesiarán con 0.75% de 2- fenoxietanol y se le aplicarán presiones suaves en la papila para extraer los óvulos maduros 30 minutos antes del descongelamiento del semen.

2. Simultáneamente se descongelará el semen en baño María utilizando el llamado fluido celómico de hembras maduras al cual se le denomina solución descongeladora; o se pude recomendar NaHC03 O. 12 M o NaC1. 0.12 M. El equivalente de 100 1-11 de semen fresco son 600 pl del congelado.

3. Por cada capilar, se debe de utilizar 1 m1 de solución descongeladora.

4. La temperatura de la solución descongeladora debe de ser cuando menos a 20°C y no mayor a 40°C.

5. Es importante que el contacto entre el esperma y los óvulos se realice unos 30 m i n . después de haber sido descongelado (Holtz, 1993). Debe llevarse un grupo control de fertilización, con semen fresco.

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Actividades Realizadas:

Aquí se explicaran las actividades realizadas y modificaciones hechas por conveniencia a la técnicas original de Harvey (1983). En tanto la parte técnica de Chao et al (1 987), solo se llevo a cabo la descongelación de semen y se suprimió la prueba de fertilización artdkial de óvulos maduros, por no contar con material, tiempo y principalmente con hembras reproductoras. La prueba de fertilidad se anuló por no contar con hembras reproductoras, tiempo, equipos, materiales y reactivos.

Obtención de los ejemplares:

l . En la obtención de los ejemplares se trató de consegw un lote de la especie Oreochromis niloticus con calidad de reproductores, tanto machos como hembras seleccionados pero no se logró, por lo que solo se pudo disponer de un lote existente de aproximadamente 80 ejemplares entre machos y hembras con una edad de 7 meses, procedentes de Zacatepec en el estado de Morelos, los cuales ya se encontraban en las instalaciones de la Planta Experimental de Producción Acuícola dentro de la UAMI. Siendo que estos no presentaban las características idóneas para los ensayos se requirió de seleccionarlos en primera instancia por tamaño, apariencia fisica y salud. Se seleccionaron solamente 10 machos inicialmente por la poca disponibilidad de acuarios calentadores y filtros para mantenerlos por separado.

2. Con la fialidad de evitar estres entre ellos y tenerlos confortables se trató de mantenerlos bajo las mismas condiciones de espacio temperatura, alimento y sanidad ya que es una especie muy agresiva.

3. Para diferenciarlos se marcaron los acuarios con letras de la A - J, se les trató de mantener durante 4 semanas con la misma temperatura (26 "C) para inducirlos a la reproducción, pero por defecto del termostato en los calentadores no se mantuvo la temperatura homogénea en los 10 acuarios, fluctuando esta entre 26-28.5.

4. Se proporcionó la misma cantidad de alimento balanceado (10 g.), en la mañana (9:OO a.m.) y en la tarde (3:OO p.m.).

2 2 2 7 6 4

11

5. Se asearon los acuarios con filtro de diatomeas cada semana.

6. Para poder estar convencidos del estado de salud de cada uno de los organismo se les hzo un monitoré0 cada semana en su peso, longitud total, apariencia fisica así como extracción y evaluación del semen de cada uno de ello s.

Evaluación del semen

l. Se notaron cambios en su comportamiento y en su coloración de pálida a rojiza. Esto se logró en un tiempo de 7 días, pero para mejores resultados se dejaron 10 días bajo las mismas condiciones antes de la extracción de semen.

2. Cuando se decidió colectar el semen se mantuvieron en ayuno durante un día completo para que limpiaran sus estómagos y así se evitó contaminar las muestras.

3. Se evaluaron las primeras muestras extraídas (peso, volumen, densidad y motilidad), para saber en que condiciones reproductivas se encontraban y sacar un promedio y clasificarlos. La metodología se explica con detalle en el punto siguiente.

Selección de los reproductores:

Para la selección de 5 de los 10 ejemplares como reproductores, se extrajo y se evaluó el semen de cada uno de ellos una vez por semana, durante 4 semanas. Se tomaron en cuenta algunos parámetros como son el volumen, peso, densidad y motilidad. Otros parámetros que se utilizan no fueron adicionado por razones de tiempo y equipo, más adelante se mencionaran para dar una explicación de cada uno, su fíalidad y método.

l. El Volumen se midió con una pipeta automática o micropipetas en mililitros o 1.

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2. Para obtención del peso, se taró el tubo Ependoff previamente y después se pesó con el semen en una balanza analítica. El valor se da en gramos. Saad y Billard (1 987).

3 . Para la densidad se utilizó la formula para densidad D = W/V. Donde W es igual al peso de la muestra y la V es igual al volumen. D = gr./ml.

4. Con los valores obtenidos se seleccionaron solo los 5 más aptos como reproductores.

Preparación de los ejemplares y materiales:

l. Los ejemplares se mantuvieron sin alimento un día antes de la extracción para limpiar sus estómagos y evitar que se contaminaran las muestras.

2. El lugar de trabajo debió de estar limpio ya que no fue posible dentro de una campana de esterilización y con todos los materiales en orden y al alcance de la mano, reactivos, materiales, equipo etc.

3. Previamente se colectó una yema de huevo eliminando totalmente la clara, después se centníügó a 2500 R.P.M. durante 15 minutos. En la utilización de leche solo se homogeneizó lo más posible.

Extracción:

1. Si se tiene experiencia en el manejo de “tilapias” no será necesaria la utilización de anestésicos. Debe de tomarse el ejemplar con una red y posterionnente envolverlo con un pedazo de tela húmeda, dejando libre la región abdominal, se debe de sujetar firmemente para que las espinas de las aletas no nos lastimen por un mal manejo.

2. Se localizó el poro genital, y se colocó un vial (tubo Ependoff) para colectar la muestra. Se comenzó a dar un masaje desde los opérculos hacia el poro genital, con ligeras presiones para no lastimar el ejemplar. Algunas veces se extrajo primero excretas y orín del ejemplar por lo que tuvo que ser limpiado con gasas empapadas en agua destilada, con lo que se evitó la contaminación de las muestras y se activaran los espermatozoides. Se desecharon la muestra

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contaminadas. La muestra presentó un color blanco traslucido y en ocasiones muy espeso.

Evaluación de la muestra:

l . Para la motilidad se tomó con una pipeta Pasteur una pequeña gota de semen y se colocó en un portaobjetos adicionándole unas gotas de solución fertilizante, se le pone un cubreobjetos y se montan en el microscopio, observándose a 40X ubicando bien el área de observación. Para determinar esta prueba se cronometró el inicio de la observación, hasta decremento de la actividad de los espermatozoides en un 50% aproximadamente. Ese fue el tiempo de motilidad que nos interesó.

Adición del diluyente y crioprotector:

l. Se repartió en dos tubos de ensaye y/o centríhga, la yema o leche, según el diluyente (I, 11, 111, IV), las cuales se les llamó a cada una solución A y B, marcándose los tubos para evitar cualquier confusión. En la solución A se agregó la mitad del total de la solución Ringer según el diluyente seleccionado, se mantuvo a temperatura ambiente para que se pudiera mezclar con el semen a la misma temperatura. En la solución B se adicionó el crioprotector (DMSO o Glicerol) y el resto de la solución Fhger, esta se mantuvo en un baño de helo.

Envasado de las muestras:

1. Se utilizaron pajillas criogénicas de 250 1. y se marcaron con una pequeña etiqueta. Estas por un extremo presentan un tapón de fibra sintética, que se distingue a contra luz, es por este extremo donde se succionó hasta el tope o hasta que hubo resistencia al succionar, esto indicó que la pajilla estaba llena. Se decidió por congelar 4 pajillas o 1 ml de cada ejemplar.

2. Se eliminó de la pajilla un poco de muestra para que hubiera un espacio de aire que ayudara a “no” reventarla al congelar bajo cero. Esto se realizó con un “peine” especial con el cual introduciendo sus dientes en el otro extremo de la pajilla se eliminó el exceso.

14

3. Se selló el extremo libre de la pajilla con alcohol polivinílico haciendo presiones hacia abajo con la pajilla, se limpió el exceso.

Congelación de -75"c a -196"~:

l . Una vez que se logró que las pajillas se acercaran a 0°C (de 5 a 2.5"C), se colocaron en las cañas del contenedor, para que entraran en contacto con el vapor de nitrógeno, procurando no tocarlo directamente; esto se logró manteniendo la caña a aproximadamente 5 centímetros arriba del nivel del nitrógeno, durante 15 minutos. Esto se realizó porque no se utilizó luelo seco.

2. Pasados los 15 minutos se sumergió la caña que contenía las pajillas y se cerró el contenedor. Para poder descongelar las muestras estas debieron de haber permanecido más de 26 horas mínimo. Por calendarización se esperó una semana.

Descongelamiento de las pajillas:

l . Se calentó agua con una parrilla eléctnca y en un crisol. La temperatura para descongelar fue de 5OoC, que fue la recomendada por el asesor. Al mismo tiempo en un tubo de ensayo se colocó solución Ringer listo a una temperatura de 25"C, en donde se drenaron las pajillas.

2. Se extrajeron del contenedor la caña que contienen las pajillas a descongelar y se seleccionan. Inmediatamente se sumergen en el agua, cronometrándose 20 segundos exactamente. Se sacaron las pajillas para drenarse.

3. Se sostienen las pajillas en el extremo que contiene el tapón. Con unas tijeras se cortaron los extremos sellados de la parte inferior de las mismas pajillas, que por el vacío existente en ellas "no drenaron", solo hasta que se cortaron los extremos superiores. Se drenó el contenido en la solución Ringer.

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Evaluación del semen criopreservado:

En esta parte se hzo una evaluación fínal al semen descongelado.

l. Se toma una muestra con una pipeta Pasteur y se repite el procedimiento de observación al microscopio a 40 X. Se evalúa la motilidad y el porcentaje de sobrevivencia.

2. La prueba de sobrevivencia del semen, es una prueba subjetiva en la que se calculó de forma aproximada el porcentaje de células vivas (con motilidad) y las muertas (inmóviles).

3. El semen descongelado si se desea utilizar deben de estar en una proporción de 6: 1, es decir el equivalente de 1 O0 pl de semen fresco son 600 p1 del congelado.

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V. RESULTADOS:

Los resultados se presentan en tablas, el asterisco indica ejemplares muertos.

1) RESULTADOS DEL MONITORÉ0 DE LA TALLA Y PESO DE LOS EJEMPLARES DURANTE 4 SEMANAS:

Tabla 1A. Peso de los ejemplares en gramos.

Tabla 1B. Talla de los ejemplares en cm.

2 2 2 7 6 4

c

I B I

I C I

I D I

I E I

I F I G I

I H

SEMANA 1 SEMANA2 SEMANA 3 SEMANA4 19.0 19.2 19.5 19.5

I

I

17

2) RESULTADOS DE LA EXTRACCI~N Y EVALUACI~N DEL SEMEN (VOLUMEN, PESO, DENSIDAD Y MOTILIDAD) DURANTE LAS 4 SEMANAS:

Tabla 2A. Volumen del semen en 1.

Tabla 2B. Peso del semen en g.

18

"

I

Tabla 2C. Densidad del semen gr./ml.

I J - 0.7995 O. 8789 0.7862 I

Tabla 2D. Motilidad del semen en segundos utilizando solución fertilizante.

19

3) SELECCI~N DE LOS REPRODUCTORES.

Los resultados de la densidad y motilidad durante las 4 semanas se promediaron y fueron los criterios utilizados para la selección de los reproductores. Esto se basó en que los valores de la densidad cercanos a 1 son los de mayor motilidad y por consiguiente los de mayor poder fecundante en las muestras.

Tabla 3A. Promedio de la densidad y motilidad del semen.

EEMPLAR

0.8215 J 0.7580 I

H O. 805 1 G 0.7990 F

E 0.7781 D 0.7990 C 0.8030 B 0.8010 A

Densidad gr./ml.

*

*

Motilidad seg. Selección 287 311 278 270 *

280 276 *

286 303

Los 5 ejemplares más aptos como reproductores por sus características fueron: A, B, F, G y J.

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4) RESULTADOS DE LA MOTILIDAD Y SOBREVIVENCIA DEL SEMEN DESCONGELADO:

Tabla 4A. Diluyente: 10% DMSO + 15% de leche en polvo.

I organismo I motilidad 1 sobrevivencia1 ~ ~ ~~~~

(seg .) A 35 % 154 B

30 % 170 J 30 % 166 G 25 % 155 F 40 % 163

Tabla 4B. Diluyente: 05% DMSO + 15% de yema de huevo.

I organismo 1 motilidad I sobrevivencia I 20 % I

I 1

1 B I 137 1 15 Yo I I I I

I F I 125 I 10 Yo I I I

G 20 % J 127 15 % 132

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Tabla 4C. Diluyente: 10% Glicerol + 15% de leche en polvo.

organismo sobrevivencia motilidad

A 178

55 Yo 174 J 65 % 196 G 60 Yo 185 F 65 % 185 B 60 %

(seg.)

Tabla 4D. Diluyente: 10% Glicerol + 15% de yema de huevo (propuesto).

organismo sobrevivencia motilidad

A 135

30 % 128 G 35 % 129 F 40 % 139 B 35 Yo

(seg.)

J 35 % - 138

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5) LOS VALORES FINALES DE CADA ANÁLISIS SE PROMEDIÓ PARA UNA MAYOR APROXIMACI~N:

Tabla 5A.

Diluyentes aforados con Solución Ringer. Motilidad Sobrevivencia seg.

I 10% DMSO + 15% yema de huevo. 161.6 32 % 11 05% DMSO + 15% leche. 130.8 16 % III 10% Glicerol + 15% yema de huevo. 183.6 61 % IV 10% Glicerol + 15% leche. 133.8 35 Yo

VI. DISCUSI~N:

La disminución o aumento en la motilidad y en el porcentaje de sobrevivencia de semen criopreservado se ven afectados por el tipo de diluyente utilizado. Para el caso de los diluyentes aplicados en la especie Sarotherodon Mossambicus (I, I1 y IV) desarrollados por Harvey (1 983) que se adaptaron a la especie Oreochromis niloticus para los ensayos de criopreservación tienen valores mínimos en el porcentaje en la motilidad y el porcentaje de sobrevivencia en comparación con el diluyente propuesto (III 10% Glicerol + 15% yema de huevo.). Los 4 diluyentes utilizados en los ensayos demostraron efectividad, aunque los valores fueron muy distintos a los esperados no quiere decir que los diluyentes desarrollados por Brian Harvey no tengan resultados satisfactorios en su aplicación, simplemente no fueron los apropiados para Oreochromis niloticus. Esto se debe a que la susceptibilidad del semen a los crioprotectores va a depender de factores biológicos y fisiológicos de cada especie, así como las interacciones fisicoquímicas entre el semen y los crioprotectores, por lo que el éxito en estas prácticas depende de la técnica apropiada para cada una.

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VII. CONCLUSIONES:

Los objetivos de criopreservación y descongelamiento de semen en la especie Oreochromis niloticus se cumplió. Los resultados de sobrevivencia heron aceptables por lo que se demostró la facilidad y viabilidad de aplicar e impulsar estas técnicas en nuestro país. En tanto la parte de fertilización fracaso por factores cualitativos del lote de reproductores hembras, así como la ksponibilidad de espacio y equipo.

De los resultados se concluye que de los 4 diluyentes el más adecuado para la criopreservación de semen en la especie Oreochromis niloticus es el diluyente propuesto:

III 10% Glicerol + 15% yema de huevo.

Teniendo como resultados:

Motilidad con valores de 183.6 segundos. Sobrevivencia del 61 YO.

En la práctica de estas técnicas se concluye que resulta factible la práctica de técnicas de criopreservación de semen. Para la obtención de un mayor éxito en los resultados anteriores es de suma importancia contar con todos los equipos, materiales y reactivos necesarios, así como de lotes de reproductores seleccionados que presenten un hntorial que nos inQque su procedencia, línea genética, edad, enfermedades que haya tenido, evaluación del semen en los distintos meses para saber cuando es la mejor temporada para colectarlo. Con estos datos se tendrá la seguridad de contar reproductores seleccionados y como consecuencia semen con características óptimas para criopreservarlo.

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VIII. RECOMENDACIONES:

Debido a que estos ensayos se realizaron de forma experimental, se suprimieron algunos puntos que son de importancia aplicar para el desarrollo más formal de un proyecto científico o de un banco de semen.

Para un mayor éxito en la aplicación de técnicas de criopreservación de semen en cualquier especie Garza y Gutién-ez (1988) proponen:

1. Lote de reproductores tanto hembras y machos con historial que contenga: procedencia, línea genética, edad, enfermedades padecidas y su control, época en la cual la calidad del semen es de mayor calidad etc.

2. Además de realizar las pruebas anteriormente mencionadas para la evaluación del semen, se recomiendan las siguientes para determinar la calidad y cantidad del mismo:

Prueba de viabilidad. Lynch, et al., (1 972) Prueba de morfología. Lynch, et al., (1 972) Prueba de número de espermatozoides. Coffin, (1986)

3. Por último los siguientes indices para determinar la madurez del pez que se destinará como reproductor:

Factor de (K) o índice pondera1 (P). Weatherley, (1 978); Ricker, (1 958) Factor de condición múltiple (Km). Kuri-Nivón, (1978); Garza et al., (1988). h&ce gonadosomático (IGH). Rossenblum, et al., (1 987)

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I

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