lp biochimie generala
TRANSCRIPT
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
1/67
BIOCHIMIE
GENERAL
A
LP 1
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
2/67
LP 1
PROBLEME DECONCENTRATII
PROCENTUALE,MOLARE,
NORMALE,DILUTII
!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
3/67
Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,
dilutii
1. Determinarea masei moleculare
M H2SO4 = 2X1+32+4X16 = 98 u au u!a!m! "unitati atomice de maa#
2. Determinarea numarului de moli (n)
n= m$M
%ati moli e &aec in 49 & H2SO4'n = 49(98 = )!* moli
3. Concentratia procentuala (c%): grame de substanta dizolvate in 100 g solutie
m = md+mH2O
m = maa olutiei
md = maa ubtantei diolate
%-="md$m#X1))
Problema 1( %e concentratie are olutia obtinuta prin diolarea a 3) & are in 2.) & H 2O'
md = 3) &
mH2O = 2.) &
m = 3) + 2.) = 3)) &
%- = "3) ( 3))# X 1)) = 1)-
!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
4/67
Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,
dilutii
Problema 2( %oncentratia procentuala de critalo/idrati e raporteaa la area an/idra!0( %e concentratie procentuala a aea olutia obtinuta prin diolarea a 2* & %uSO4X*H2O in 2.* & H2O'
md = 2* &
mH2O = 2.* &
M %uSO4X*H2O = M %uSO4 + M H2O = 16) + 9) = 2*) u!a!m!
2*) & %uSO4X*H2O!!!!!!!!!! 16) & %uSO42* & %uSO4X*H2O! & %uSO4
= 16 & %uSO4m= 2* + 2.* = 3)) &
%- = "16(3))#X1))= *!33 -
Problema 3( Solubilitatea iodurii de potaiu ete 4*&$1))& H2O! %are e concentratia procentuala a olutiei'
md = 4* &
MH2O = 1)) &
m = 14* &c- = "4*(14*# X 1))= 31!)3-
Problema 4( Preparati o olutie de 2- a&aroa in 4)) & olutie inala!
c- = 2
c- = "md(m# X 1)) 2= "md(4))# X 1)) md = 8 & a&aroa!
!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
5/67
Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,
dilutii
Problema *!
Preparati o solutie de 1! % glucoza in 200 g "2#.
5ormulata in acet mod problema e a reola atel(
c- = "md $ m# 1))
m = md + mH2O = m = md + 2))
1,* = "md $ md + 2))# 1)) = 1,* "md + 2))# = 1)) md = 98,*md = 3)) = md = 3,)4 & &lucoa 7plicabilitatea acetei probleme in laborator ete mai redua deoarece maa olutiei inale nu ete cunocuta!
5recent in laborator ne preapram olutii ale caror mae inale dorim a le cunoatem, e(
Preparati o solutie de 1!% glucoza in apa ast$el incat masa $inala a solutiei sa $ie 200 g.
c- = "md $ m# 1))
m = 2)) & olutie "&lucoa in apa#md = "c- m# $ 1)) = md = "1,* 2))# $ 1)) = md = 3 & &lucoa
7tel ormulata, problema conduce la un reultat dierit, dierentele intre reultate iind cu atat mai mari cu cat
concentratia de olutie dorita "c-# ete mai mare!
!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
6/67
Problema 6! %e concentratie procentuala are olutia obtinuta prin diolarea a 1) & &lucoa in 24) & H2O'
c- = "md $ m# 1))
m = md + mH2O
md = 1) & &lucoa mH2O = 24) &
m = 1) + 24) = 2*) & olutiec- = "1) $ 2*)# 1)) = 4-
Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,
dilutii!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
7/67
Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,
dilutii
. Concentratia molara (&olaritatea): numarul de moli dizolvati intr'un litru de solutie
C& n:s
n m:&
C& m : (&*s)
Problema 1( Se diola 8) & aOH in 4 l olutie! eterminati % M!
M aOH = 4) u!a!m!cM = "8)(4)#(4 = )!* M
Problema 2( %alculati cantitatea de aOH neceara obtinerii unei olutii 2 M intr:un olum de 3 l!
2 = m ( "4)X3# m = 24) &
7lternati(
; Maa moleculara M< "Molecular
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
8/67
Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,
dilutii
Problema 3! %alculati cantitatea de a%l neceara obtinerii unei olutii 4M intr:un olum de *))
ml!
cM = m $"M >#= m = cM M > = m = 4 *8,* ),* "?# = 11. & a%l
M a%l = 23 + 3*,* = *8,* uam
!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
9/67
Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,
dilutii
!. +c,ivalentul c,imic (ec,ivalentul gram) ete cantitatea de ubtanta ce reactioneaa cu 1 & H 2 i 8 & O2!
?e&ea ec/ialentilor c/imici( 2 ubtante reactioneaa intre ele in cantitati proportionale cu ec/ialentii lor c/imici!
0& metal = M ( alenta metal
0( 0& %a@@ = 4) ( 2 = 2) &
0& acid = M ( alenta radicalului
0( 0& H2SO4 = 98 ( 2 = 49 &
0& baa( M ( nr de &rupari OH
0& 5e"OH#3 = 1). ( 3 = 3*!66 &0& are = M ( alenta metal X indice metal
0( 0& 5e@@@2"SO4#3 = 4)) ( "3 X 2# = 66!6. &
-. Concentratia normala (c)( numarul de ec/ialenti &ram la 1 l de olutie
%= e ( >!
e = nr de ec/ialenti &rame = md ( 0&
% = md ( "0& X >#
Problema( Se obtin 2 l olutie prin diolarea in apa a 3. & %a"OH#2! Sa e determine c a olutiei!
md = 3. &
> = 2 l
0& %a"OH#2 = .4 ( 2 = 3. &% = 3. ( "3.X2# = )!*
!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
10/67
Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,
dilutii
/. egula dreptung,iului (egula amestecurilor)
a c A b "2):* = 1* & = #
b a A c "3):2) = 1) & = #
c
Problema( %ate &rame de aOH trebuie ametecate pentru a e obtine 2)- aOH dintr:o olutie
de aOH 3)- i o olutie de aOH *-'
Bapun( Se ameteca 1) & aOH *- i 1* & aOH 3)- i e obtin 2* & aOH 2)-!
>eriicare( + = a:b 1*+1) = 3):*=2*
3)
2)
*
a = 3)
b = *
c = 2)
!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
11/67
Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,
dilutii
. Dilutii:
Problema 1! %e olum de a%l ete necear pentru a prepara 2,* ? de olutie de a%l 2 M, aand la
dipoitie o olutie toc de a%l 1) M!
%i >i = % >
%i = 1) M >i necunocut % = 1) M > = 2,* ?
1) >i = 2 2,* = >i = ),* ? a%l
au
1) M = 2 M = olutia concentrata trebuie diluata de 1)(2 = *X
1 parte "?# olutie concentrata :::::: 4 parti "?# H2O :::::: * parti "?# olutie diluata
parti "?# olutie concentrata::::::: parti "?# H2O :::::: 2,* ? olutie diluata
= "1 2,*# $ * = ),* ? olutie concentrata 1) M
C = "4 2,*# $ * = 2 ? H2O
!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
12/67
Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,
dilutii
Problema 2( iluati un anticorp 1(1) intr:un olum de 2 ml olutie tampon!
1(1)
1 Dl anticorp9 Dl olutie tampon1) Dl olutie inala
Dl anticorp Dl olutie tampon2))) Dl olutie inala
= 2)) Dl anticorp i pana la 2 ml e adau&a olutie tampon " = 2))):2))= 18)) Dl olutie tampon#!
Problema 3(Se da o olutie 2M a%l! Preparati o olutie )!* M a%l intr:un olum de *)) ml!
2M )!*M "2 ( )!* = 4 olutia initiala e dilueaa de 4X#
1 ml a%l 2 M3 ml H2O!4 ml olutie )!* M a%l
ml a%l 2 M ml H2O!*)) ml olutie )!* M a%l
= "1X*))#(4 = 12* ml a%l 2M
= "3X*))#(4 = 3.* ml H2O
Problema 4( 7metecati trei ubtante in raport de 1(*(12 intr:un olum de 1 l!
1 ml ubtanta 7!!* ml ubtanta E!12 ml ubtamta %!18 ml olum total
ml ubtanta 7!! ml ubtanta E!! ml ubtanta %1))) ml olum total
= **!*6 ml 7 = 2..!.8 ml E = 666!6. ml %
!!!
!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
13/67
DETERMINAREACONCENTRATIEI UNEIPROBE DE INTERES
(PROTEINA, GLUCIDA,LIPIDA)
UTILIZAND
CURBA ETALON(CURBA STANDARD)
!!!
!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
14/67
F Curba etalon se realizeaza pentru a determina un parametru (ex.concentratia) pentru o proba de interes, care poate f o proteina, oglucida, o lipida, etc.
F Exemplu: Deem"#$e$ %%e#$"e" u#e" p&e"#e 'e "#eeF Se utilizeaza un blanc (numit uneori si Reerinta, Standard sau
Martor): substanta de reerinta ata de care se realizeaza celelaltemasuratori, care contine toate substantele prezente si in celelalteprobe, mai putin proteina
F Se realizeaza dilutii seriale de proteina standard, ale caror concentratiisunt cunoscute (ex. 0. mg!ml, ". mg!ml, mg!ml, #. mg!ml, $0mg!ml)
F %n masurarea proteinelor se utilizeaza de regula ca proteina standard&lbumina Serica 'oina &'S ('oine Serum &lbumin * 'S&)
F'lancul, proteinele standard de concentratie cunoscuta si proteina deinteres sunt amestecate cu acelasi reacti de analiza si sunt procesatein acelasi timp.
F +entru realizarea unei determinari cat mai precise a concentratieiproteinei de interes se recomanda pregatirea unui numar cat maimare de dilutii seriale de proteina standard (*$0 dilutii pentru o
determinare exacta a concentratiei)F -umarul minim de dilutii seriale de proteina standard utilizat in
Curba etalon (standard)!!!
C b t l ( t d d)!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
15/67
F Reactiul ormeaza impreuna cu probele proteice (proteinelestandard, proteina de analizat) complexe care absorb lumina pe uninteral al lungimilor de unda din spectrul 12!2%S, ex. /3 (densitateaoptica) 4 00*#0 nm.
F 5ste recomandabil ca probele sa se masoare la lungimea de unda lacare prezinta absorbanta maxima, ex 60 nm.
F /e asemenea, proteinele care au aminoacizi aromatici in structura
lor, pot absorbi lumina 12, putand f masurate la "70 nm ara a fnecesara amestecarea lor cu un alt reacti.F &bsorbanta (&) sau 5xtinctia (5) probelor se masoara cu a8utorul unui
spectrootometru.F &bsorbanta nu prezinta unitate de masura.F &bsorbanta este direct proportioanla cu concentratia probelor
(conorm 9egii 9ambert*'eer), permitand astel determinareaconcentratiei probei de interes.F +robele de analizat nu trebuie dizolate intr*o solutie tampon care
absoarbe la aceeasi lungime de unda ca si complexele proteina*reacti, deoarece absorbanta solutiei tampon interera cu cea acomplexelor proteice, conducand la identifcarea eronata a
concentratiei proteiceF /upa prepararea probelor se masoara la spectrootometru
Curba etalon (standard)!!!
C b t l ( t d d)!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
16/67
F Masurarea la spectrootometru trebuie sa aiba in edere urmatoareleaspecte:
F Spectrootometrul sa aiba un fltru 12 sau 2%S care sa permitamasurarea la lungimea de unda doritaF Spectrootometrul sa permita masurarea absorbantei
corespunzatoare probelor de analizat (ex sa permita determinareaabsorbantei pana la ")
F Se utilizeaza cuete de cuart cu drum optic de $ cm (care se spala
dupa fecare masuratoare) sau cuete de unica olosintaF Cuetele trebuie umplute cu solutia de analizat pe cel putin "!
din olumF 9ic;idul din cuete nu trebuie sa contina bule de aer sau spuma,
care pot inuenta masurareaF Cuetele nu trebuie sa fe umede sau murdare pe supraata
exterioaraF Masurarea la spectrootometru se realizeaza astel:
F +ornirea aparatuluiF Setarea lungimii de unda la care se realizeaza masuratoarea (ex.
60 nm)F Selectarea parametrului care se a masura la spectrootometru:
&bsorbantaF
Curba etalon (standard)!!!
C b t l ( t d d)!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
17/67
+roba Concentratie (mg!ml) &bdorbanta la /360nm
+rot standard $ 0. 0.$"
+rot standard " ". 0."#
+rot standard .0 0.70
+rot standard 6 #. 0.60
+rot standard $0 0.
+rot de interes < 0.0
5xemplu:F %n urma masuratorilor la o anumita lungime de unda (ex. /360nm), se
obtin urmatoarele alori ale absorbantelor:
Curba etalon (standard)
F /atele obtinute arata ca absorbanta probei de interes (0.0) se
gaseste intre alorile absorbantelor probelor standard (0.$"*0.),deci aceste date pot f olosite pentru determinarea concentratieiproteinei de interes.
F 1neori complexele proteice sunt colorate, apt care permiteestimarea izuala a concentratiei probei.
F Cu cat culoarea probei este mai intensa, cu atat concentratia
acesteia este mai mare.F %n exemplul de mai sus intensitatea culorii proteinei de interes,
!!!
C b t l ( t d d)
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
18/67
Curba etalon (standard)
0
F Pe $*$ e*ul$el& &"#ue e %u"ee %u$e$l pe +$"e m"l"me"%$
F +e axa x se marc;eaza concentratiile proteinelor standard(mg!ml)
F+e axa = se marc;eaza alorile absorbantelorcorespunzatoare concentratiilor proteinelor standard
F 1nde aloarea absorbantei probei $ intalneste aloareaconcentratiei probei $ se marc;eaza primul punct de pegrafc
F %n mod similar se marc;eaza restul punctelorcorespunzatoare probelor standard ", , 6,
F Se traseaza o dreapta care trece prin sauprintre punctele obtinute, dreapta care nu
trebuie neaparat sa treaca prin punctul 0de intersectie al axei x cu =.
F /reapta se traseaza astel incat sa treacaprin cat mai multe puncte, iar daca treceprintre puncte, acestea sa se ae, pe catposibil, la distante egale de*o parte si dealta a dreptei.
F 9a trasarea dreptei prin!printre puncte seomit punctele prea indepartatecomparati cu celelalte (outliars).
F Se marc;eaza pe grafc aloareaabsorbantei proteinei de analizat si printr*o paralela la axa x se marc;eaza punctul
de intersectie cu dreapta. /in acest punctse traseaza o paralela la axa = care a
!
C b t l ( t d d)!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
19/67
Curba etalon (standard)
F C$#' %%e#$""le p&e"#el& $#'$' $u $l&"$p&p"$e (ex. 0. mg!ml, ". mg!ml, mg!ml, #. mg!ml, $0mg!ml), punctele de pe grafc sunt unite, pentru simplitate,printr*o dreapta (regresie liniara).
F C$#' %%e#$""le p&e"#el& $#'$' $u $l&""#'ep$$e sau pentru determinarea concentratiei cu preciziemai mare, grafcul este o ;iperbola (regresie curbilinie).
!!!
C b l ( d d)
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
20/67
F Deem"#$e$ %%e#$"e" p&e"%e p&$e - e$l"*$$ u"l"*$#'p&.$mul Ex%el
F C$#' .$-%ul ee & e.e"e l"#"$$:
F %n cazul regresiei liniare, ecuatia matematica care descrie relatia dintreabsorbanta si concentratie este = 4 ax>b 4? x 4 (=*b)!a
F = 4 absorbanta (cunoscuta pentru proba de interes)F x 4 concentratia (necunsocuta pentru proba de interes)F a, b 4 alori numerice care dau inormatii despre pantaF R" 4 cat de aproape sunt punctele de linie (corectitudinea experimentului)
F R"
4 $ * caz ideal, grafcul este perect, linia trece prin punctele de pegrafcF R" 4 0.*0. alori oarte buneF R" 4 0.6*0.7 alori acceptabileF R" 4 0.76 masuratorile contin erori si trebuie repetate, determinarea
concentratiei probei de analizat nu e recomandabila utilizand acesteexperiment
F @utorial 5xcel: ;ttps:!!AAA.=outube.com!Aatc;
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
21/67
Curba etalon (standard)
C$l%ul$e$ %%e#$"e" p&e"#e" 'e "#ee:
= 4 este aloarea absorbantei probei necunsocute (determinata
experimental ca 0.0)x (conc probei necunoscute) este calculata ca:= 4 ax > bR" 4 0.#6" (masurare oarte buna)= 4 0.066x > 0.$60.0 4 0.066x > 0.$6x / 02 m.3ml
P&$ # A%
(m.3ml)+rot st $ 0,$" 0,+rot st " 0,"# ",+rot st 0,7 +rot st 6 0,6 #,+rot st 0, $0+rot deinteres 0, 6,7
) 2 4 6 8 1) 12
)
)!1
)!2
)!3
)!4
)!*
)!6
"# = )!)4 + )!13BG = )!9.
&etoda 4iuret ' regresie liniara
concentratia (mg5ml)
6bsorbanta la D#!0 nm
2alorile proteinei standard au ost bine alese simasuratorile au ost realizate corect dacaconcentratia proteinei de interes se aa in interaluldin mi8loc al dreptei
C b t l ( t d d)
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
22/67
F C$#' .$-%ul ee & e.e"e %u"l"#"e:
F C$#' %%e#$""le p&e"#el& $#'$' $u $l&" "#'ep$$e sau pentrudeterminarea concentratiei cu precizie mai mare, grafcul este o ;iperbola (regresie
curbilinie).F %n cazul regresiei curbilinii, ecuatia matematica care descrie relatia dintre absorbanta siconcentratie este:
= 4 ax">bx>c. +entru determinarea concentratiei se determina x.
F Realizeaza un tabel in 5xcel cu alorile de concentratie si alorile corespunzatoare aleabsorbantelor
F C;art*Scatter*MarDed Scatter * ClicD dreapta Select /ata * &dd Series * x alues *Selecteazaconcentratiile din tabelul acut in excel * = alues * Selecteaza aloarea absorbantelor dintabelul acut in 5xcel 3E * +e grafc apar punctele de intersectie ale alorilor deconcentratie si absorbanta * Sterge FseriesG de pe grafc (select, delete) * Sterge liniileorizontale de pe grafc (Select, /elete) * C;art la=out *Horizontal axis title * @itle beloA axis */enumeste axa x (concentratie mg!ml) *2ertical axis * Rotate title * /enumeste axa =(&bsorbanta 60 nm) * C;art title */enumeste titlul grafcului (Metoda 'iuret) * ClicD dreaptape unul din punctele de pe grafc * &dd trendline P&l4#&m"$l 3rder " sau sau 6 pana
cand se obtine o curba care trece cel mai bine prin!printre puncte * 3ptions C;ecD /ispla=ecuation on c;art si /ispla= R * sIuared alue on c;art
Curba etalon (standard)
P&$ # A%
(m.3ml)
+rot st $ 0,$" 0,+rot st " 0,"# ",+rot st 0,7 +rot st 6 0,6 #,+rot st 0, $0+rot deinteres 0, x
) 2 4 6 8 1) 12
)
)!1
)!2
)!3
)!4
)!*
)!6
"# = : )2 + )!). + )!)9BG = 1
&etoda 4iuret ' regresie curbilinie
concentratia (mg5ml)
6bsorbanta la D#!0 nm
R"40.76$ (masurare oarte buna)=4*0.00"x">0.0#$7x>0.07
=40., se calculeaza x.
C b t l ( t d d)
!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
23/67
F /aca aloarea absorbantei proteinei de interes este mai mica sau mai maredecat absorbantele proteinei standard, atunci experimetrul trebuie repetat.
F %n urmatorul experiment se are in edere alegerea unor concentratii aleproteinei standard care sa includa concentratia probei de interes.
F /aca timpul sau cantitatea probelor nu permit repetarea experimentului seopteaza pentru determinarea concentratiei proteice prin urmatoarele metode,care insa scad din precizia determinarii concentratiei:
F /aca se obtine o absorbanta a proteinei de interes mai mare (0.#0) decatcea mai mare aloare a absorbantei proteinei standard (0.), atunciproteina de interes se dilueaza (ex. de "x), se masoara absorbanta (ex. se
obtine 0."), se determina concentratia corespunzatoare absorbantei de0.", iar la fnal se determina aloarea reala a concentratiei inmultind*o cuactorul de dilutie (ex. x".)
F /aca se obtine o absorbanta a proteinei de interes mai mica (0.$00) decatcea mai mica aloare a absorbantei proteinei standard (0.$"), atunciproteina de interes se concentreaza (ex. pana la 8umatate din olum,utilizand tuburi preazute cu membrane care retin proteina si lasa sa treaca
solutia tampon), se masoara absorbanta proteinei concentrate (ex. seobtine 0.00), se determina concentratia corespunzatoare absorbantei de0.00, iar la fnal se determina aloarea reala a concentratiei impartindaloarea obtinuta la ", conorm modalitatii in care a ost concentrata.
F 1neori se preera realizarea unei masuratori estimatie a concentratiei proteicela "70 nm, iar dupa determinarea concentratiei estimatie a proteinei se alegalori ale concentratiei proteinelor standard care sa o includa si se opteazapentru o metoda colorimetrica precisa (ca metoda 'radord sau 9oAr=) in
Curba etalon (standard)!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
24/67
DOZARE DE
PROTEINEMETODA BIURET
& t d d d ( ti$i ) t i l
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
25/67
&etode de dozare (cuanti$icare) a proteinelor
C$#"$e$ &$l$ 'e p&e"#$
Cantitatea de proteina prezenta intr*o ractie este obtinuta prindeterminarea concentratiei unei parti din ractie si apoi multiplicandcu olumul total al ractiei
Me&'e 'e '&*$e $ p&e"#el&$. Masurarea absorbantei 12 la "70 nm a aminoacizilor aromatici
din compozitia proteinelor * metoda de dozare estimatia aconcentratiei proteice". Metoda 'iuret * metoda de dozare a proteinelor aate in
cantitati de ordinul mg!ml in proba de analizat. Metoda de dozare cu acidul bicinconinic ('C&)6. Metoda &mido 'lacD
. Metoda 'radord * metoda exacta de dozare a proteinelor aatein cantitati de ordinul Jg!ml in proba de analizat
. Metoda 9oAr= * metoda exacta de dozare a proteinelor aate incantitati de ordinul Jg!ml in proba de analizat
D t i l i & t d 4i t
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
26/67
P"#%"p"ul me&'e"F Metoda de determinare a cantitatii de proteina totala din solutieF Concentratia de proteina totala este eidentiata prin sc;imbarea
culorii probeiF %n conditii alcaline compusii care contin legaturi peptidice ormeaza
un complex "&le cu sarurile de cupru din compozitia Reactiului'iuret, care se masoara spectrootometric la 60 nm.
F %ntensitatea culorii este proportionala cu aloarea concentratieiproteinelor: cu cat culoarea iolet a complexului ormat este mai
intensa, cu atat mai concentrata este proteina de analizat.F /enumirea metodei proine de la compusul c;imic biuret, care
prezinta legatura peptidica C3*-H si da acelasi raspuns ca sipeptidele si proteinele.
F Metoda 'iuret sau Reactiul 'iuret nu contin compusul c;imic biuret.
'iuret
Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuret
F A$#$6eF Metoda rapidaF Reactia nu este dependenta de tipul aminoacizilor care compun
peptidele sau proteinele de analizat.F De*$$#$6e
F Metoda de cuantifcare a peptidelor si proteinelor mai putinsensibila in raport cu alte metode (9oAr=, 'radord)
Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuret
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
27/67
Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuret
Cu78SO087N$OH
Cu78(OH)78N$7SO0
+eptida sauproteina
+
legaturapeptidica
Reacti'iuret
P&e"#$ 'e %upu:complex colorat iniolet, in care ionul Cu8 este unit prin legaturicoordinatie cu
;eteroatomi aiaminoacizilor anga8ati
Lormarea proteinatuluide cupru prin reducereaCu78 (din sulatul decupru, in mediu alcalin),la Cu8 prin ormarea de
complexe cu legaturilepeptidice din proteine
78
8
Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuret
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
28/67
Re$%"" u"l"*$9"
$)Reacti 'iuret: g CuS36 x H"3 si g tartrat de sodiu i potasiu in $00 ml solutie -a3H0," M, la care se adauga g E% si se aduce la un litru cu solutie -a3H 0,"
MN
") Solutie standard proteica (solutie stoc):&lbumina serica boina * &'S ('oine serum albumin 'S&) $0 mg!mlN
) +roba de interes (poate f reprezentata de: peptide, proteine purifcate,
extract proteic total) a carei concentratie trebuie determinata
Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuret
Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuret
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
29/67
M&' 'e lu%u
4lancProteina
de analizatProteina standard (476)
Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuret
8
ozarea pro e ne or pr n e o a ure
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
30/67
ozarea pro e ne or pr n e o a ureM&' 'e lu%u
F %n # eprubete se pipeteaza urmatorii reactii:F +roba $ * 'lanc : &pa > Reacti 'iuretF +robele "* * /ilutii seriale de +roteina Standard ('S&):
F +roba ": (&pa > +roteina standard) c40. mg!ml > Reacti 'iuretF +roba : &pa > +roteina standard) c4". mg!ml > Reacti 'iuretF +roba 6: (&pa > +roteina standard) c4 mg!ml > Reacti 'iuretF +roba : (&pa > +roteina standard) c4#. mg!ml > Reacti 'iuretF +roba : (&pa > +roteina standard) c4$0 mg!ml > Reacti 'iuret
F +roba #: +roteina de interes, de concentratie necunoscuta > Reacti 'iuretF
Cele # probe se omogenizeaza prin agitare energicaF Cele # probe se incalzesc $0 min la #0C, pentru a permite ormarea complexelorde proteinat de Cu
F Se masoara la spectrootometru la /360nm, ata de blanc, probele "* (dilutiiseriale de proteina standard) si proba # (proteina de interes)
F 5xemplu:F 'lanc40 Culoare albastra de la Reactiul 'iuretF &+roba "(0.mg!ml)4 0.$"F &+roba (".mg!ml)4 0."#F &+roba 6(.0mg!ml)4 0.6#F &+roba (#.mg!ml)4 0.00
F &+roba ($0mg!ml)4 0.#0F &+roba #(proteina de analizat, de concentratie necunoscuta)4 0.0
F Creste intensitatea culorii iolet, care e directproportionala cu concentratia de proteina din proba
F +robele au culoare iolet, datorita ormariiproteinatului de cupru prin reactia dintre proteina siReactiul 'iuret +roba are culoare iolet, a carei
intensitate sa poata f plasataintre probele "* (pt exemplul dat
ElancProteina+
Beacti Eiuret
Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuret
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
31/67
Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuretepe$e$ e*ul$el&
F +e baza rezultatelor obtinute se construieste curba etalon(curba standard) pe ;artie milimetrica
F +e axa x se marc;eaza concentratiile proteinelor standardF +e axa = se marc;eaza alorile absorbantelor
corespunzatoare concentratiilor proteinelor standardF 1nde aloarea absorbantei probei " intalneste aloarea
concentratiei probei " se marc;eaza primul punct de pegrafc
F %n mod similar se marc;eaza restul punctelor
corespunzatoare probelor , 6, , F Se traseaza o dreapta care trece prinsau printre punctele obtinute, dreaptacare nu trebuie neaparat sa treaca prinpunctul 0 de intersectie al axei x cu =
F Se marc;eaza pe grafc aloareaabsorbantei probei # (proteina deinteres) si printr*o paralela la axa x se
marc;eaza punctul de intersectie cudreapta. /in acest punct se traseaza oparalela la axa = care a intalni axa xintr*un punct care reprezinta aloareaconcentratiei probei de analizat(exprimata, in cazul exemplului dat, in
mg!ml).F 2aloarea concentratiei si grafcul
4
x
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
32/67
BIOCHIMIE
GENERAL
A
LP ;
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
33/67
DOZARE DE
PROTEINEMETODA LO
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
34/67
P"#%"p"ul me&'e" > L&?4, 1@0
F Metoda de determinare a cantitatii de proteina totala din solutieF Concentratia de proteina totala este eidentiata prin sc;imbarea
culorii probeiF +roteinele ormeaza un complex cu ionii de Cu"> in solutie alcalina
(Reactia biuretului)F %onii de Cu"> din complex sunt redusi la Cu>, iar acestia ormeaza un
complex instabil de culoare albastra cu reactiul Lolin*Ciocalteu.F &cest complex sereste ca o masura a concentratiei proteinei: cu cat
proteina este mai concentrata, cu atat culoarea este mai intensa
F &anta8e:F
5ste de aproximati $00 de ori mai sensibilO decPt reacQia 'iuretF Metoda optima pentru determinarea unei concentratii proteice intre:0.0$ * $.0 mg!m9.
F /ezaanta8e:F Mai laborioasa ca metodele 'iuret sau 'radord
Dozarea proteinelor prin &etoda 9or
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
35/67
Dozarea proteinelor prin &etoda 9or
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
36/67
Dozarea proteinelor prin &etoda 9orM&' 'e lu%u$. Se prepara dilutii seriale de proteina standard ('S&) conorm tabeluluide mai 8os, aand la dispozitie o solutie stoc de $00 Jg!ml. 2olumul
fnal al fecarei probe este $ ml.
". %n blanc ($ml apa distilata), in fecare proba proteica continand proteinastandard ($ml) si in proteina de analizat ($ml) se adauga $ ml Re$%"$l%$l"# 'e %upu (inainte de utilizare se amesteca $0 parti reacti & cu $parte reacti ' ) si se omogenizeaza. %ncubare $0 min la temperatura camerei pentru ormarea proteinatuluide cupru in probele proteice.+rin incubarea Reactiului alcalin de cupru cu probele proteice, ionul deCu"> din reacti este redus la Cu> deoarece se ormeaza complexe cu
Dozarea proteinelor prin &etoda 9or
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
37/67
M&' 'e lu%u
Dozarea proteinelor prin &etoda 9or
6. %n fecare proba (blanc, probe proteice standard, proteina de analizat) seadauga ml reacti Lolin*Ciocalteu (diluat $:$0 cu min inainte de utilizare) sise omogenizeaza
. %ncubare $0 min la 00C, se raceste aproximati min la temperaturacamereiReactia dintre +roteinatul de cupru si Reactiul Lolin Ciocalteu:F ReacVia de reducere a acidului osomolibdenic*osotungstenic (reactiul
Lolin*Ciocalteu) de cOtre %&mplexele Cu8 > le.u$ $m"'"% Kn principal,dar i de cOtre eu"le 'e "&*"#$ " "p&5$# '"# p&e"#$.
F %n timpul acestei reacQii Cu> este oxidat la Cu> care reacQioneazO maideparte cu sc;eletul peptidei i ormeazO imino peptide (R$*C3*-4C(R")*C3*R) i Cu">, iar reactiul Lolin*Ciocalteu este redus la molibden*Aolram, deculoare albastra, detectat spectrootometric la 0 nm (sau alta aloare dininteralul 00*#0 nm).
. Masurarea absorbantei proteinelor standard si a proteinei de analizat la 0
nm ata de blanc.#. Se realizeza o curba etalon trasand pe abscisa µg!ml proteina, iar peordonata absorbanta (&) probelor. 2aloarea absorbantei corespunzatoareproteinei de analizat este extrapolata pe grafcul curbei etalon pentru aareaconcentratiei acesteia (pe ;artie milimetrica) sau se poate determina utilizand5xcel.
!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
38/67
PROTEINE TOTALE SERICE > ALORINORMALE ADULTF >2F .3'l
2ariatii patologice:F 2alori crescute ale proteinelor totale sunt intalnite in bolile
inectioase, in pierderi de apa (diaree, arsaturi), poliurie,des;idratare, diabet insipid, mielom multiplu, boala UaldenstrWm
F 2alorile scazute ale proteinelor sunt intalnite in edeme nerotice,anemii, ;emoragii, inanitie, supuraQii cronice, ciroze ;epatice, tumorimaligne.
!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
39/67
BIOCHIMIE
GENERAL
A
LP 0
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
40/67
METODA DESEPARARE A
PROTEINELORDINTR>UN
AMESTECSDS>PAGE
;e,nici de separare a proteinelor
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
41/67
ELECTROOREZA
ectrooreza natia (nedenaturanta: in absenta unui agent denaturant pentru prectrooreza denaturanta in gel de poliacrilamida (S/S*+&X5):
a. ara gradient de concentratie de acrilamidab. in gradient de concentratie de acrilamidac. electrooreza discontinua (disc electrooreza)
;e,nici de separare a proteinelor
;e,nici de separare a proteinelor
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
42/67
Ele%&5&e*$ 'e#$u$#$ "# .el 'e p&l"$%"l$m"'$S&'"um D&'e%"l Sul5$e>P&l4$%4l$m"'e Gel
Ele%&5&e" (SDS>PAGE)
+rincipiul electroorezei:F /eplasarea moleculelor cu o anumita sarcina electrica catre polul opus
sub actiunea unui camp electric.
F Campul electric este aplicat astel incat proteinele migreaza de laelectrodul negati spre electrodul poziti, miscarea realizandu*se deobicei pe erticala.
Xelul de poliacrilamida:F 5lectrooreza proteinelor se realizeaza de regula intr*un gel subtire de
poliacrilamida.F Xelul de poliacrilamida: polimerii de acrilamida ormeaza o retea
;e,nici de separare a proteinelor
;e,nici de separare a proteinelor
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
43/67
F %nainte de incarcarea in gelul de poliacrilamida,
probele proteice trebuie denaturate (se distrugestructura lor secundara, tertiara, cuaternara)pentru a se putea deplasa cu usurinta prin poriigelului de poliacrilamida.
F /enaturarea proteinelor se realizeaza prinincubarea lor cu o solutie tampon care contineS/S, βM5 (sau /@@), urmata de incalzire:
$. S/S (dublu rol):- a. +articipa la denaturarea proteinelor natie,
prin distrugerea interactiilor necoalente;idroobe din structura acestora
- b. S/S este un detergent anionic careFimbracaG proteinele (indierent de incarcarea
lor anterioara) intr*o sarcina electrica negatia,acandu*le sa migreze catre polul poziti intimpul electroorezei.
- I# %$*ul SDS>PAGE p&e"#ele m".e$*$ 'el$ (>) l$ (8)
- S/S care s*a legat de proteine are o masamoleculara mica, ce nu modifca masa
moleculara a acestora*
Ele%&5&e*$ 'e#$u$#$ "# .el 'e p&l"$%"l$m"'$S&'"um D&'e%"l Sul5$e>P&l4$%4l$m"'e Gel
Ele%&5&e" (SDS>PAGE)
p p
;e,nici de separare a proteinelor
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
44/67
Ele%&5&e*$ 'e#$u$#$ "# .el 'e p&l"$%"l$m"'$S&'"um D&'e%"l Sul5$e>P&l4$%4l$m"'e Gel
Ele%&5&e" (SDS>PAGE)
F I# %'""" 'e#$u$#e, p&e"#eleu# ep$$e pe $*$ m$e" l&m&le%ul$e
F +roteinele mici se misca mai repede
prin gel comparati cu proteinelelargi.
F +roteinele largi raman in parteasuperioara a gelului, aproape depunctul de incarcare
F +rocenta8 poliacrilamida in solutie: creste
;e,nici de separare a proteinelor
;e,nici de separare a proteinelor
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
45/67
Ele%&5&e*$ 'e#$u$#$ "# .el 'e p&l"$%"l$m"'$S&'"um D&'e%"l Sul5$e>P&l4$%4l$m"'e Gel
Ele%&5&e" (SDS>PAGE)
F 2izualizarea benzilor proteice din gelul de poliacrilamida princolorarea gelului de +&&:
$. Colorare cu Coomassie 'rilliant 'lue R*"0 sau X*"0Senzitiitate: 0.$ Jg proteina banda distincta pe gel
&l&$e %u $."# me&'$ m$" e#*""$ 'e%$ C&&m$"eenzitiitate: 0.0" Jg proteina banda distincta pe gel
. Au&$'"&.$-e3m$%$e u&e%e#$ "# %$*ul "# %$ep&e"#ele %"# #u%le&"'e m$%$e $'"&$%"3u&e%e#
MarDeri proteici:&mestec de proteine cumase moleculare cunoscute,care a8uta la identifcareamasei moleculare aproteinei de interes
F S/S*+&X5 distinge proteine care diera prin $0 aa
;e,nici de separare a proteinelor
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
46/67
;e,nici de separare a proteinelor
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
47/67
Ele%&5&e*$ 'e#$u$#$ "# .el 'e p&l"$%"l$m"'$S&'"um D&'e%"l Sul5$e>P&l4$%4l$m"'e Gel
Ele%&5&e" (SDS>PAGE)Ele%&5&e*$ '"%"#u$
ariatii experimentale comparati cu electrooreza conentionala:$) " straturi de gel: un gel de concentrare (sus) si un gel de migrare (8os)") Solutiile tampon olosite pentru a prepara cele " straturi de gel au
tarii ionice si pH*uri dierite) Xelul de concentrare (sus) are o cantitate mai scazuta de acrilamida,
deci are porii mai largi decat gelul de migrare (8os).&ceste ariatii cauzeaza ormarea unor benzi proteice oarte concentratein gelul de sus, in timp ce cand a8ung in gelul de migrare proteinele aparsub orma unor benzi clare.
;e,nici de separare a proteinelor
+lectro$oreza discontinua ' Protocol
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
48/67
@ampon gel de migrare: $. M @ris HCl pH 7.7, 0.6 S/S2t 4 00 ml0.7 g @ris
" g S/Sadauga "0 ml H"3stabileste pH 7.7adauga H"3 pana la 00 ml
@ampon gel de concentrare: 0. M @ris HCl pH .7, 0.6 S/S2t 4 00 ml0." g @ris
" g S/Sadauga "0 ml H"3stabileste pH .7adauga H"3 pana la 00 ml
@ampon de migrare
(din camera electrooretica): 0.$" M @ris, 0. M Xlicina, 0. S/S, pH 7.2t 4 $000 ml$ g @ris#" g Xlicina g S/Sadauga H"3 pana la $000 ml(Loloseste $ pentru migrarea gelului)
@ampon de incarcare (pentru denaturarea probei):
@ampon gel de concentrare: mlS/S: $ gβ*mercaptoetanol ". mlglicerol: ". ml
bromenol: ". mg
@ampon de colorare cu
Coomassie 'rilliant 'lue:2t 4 $000 ml0 %zopropanol (Metanol, 5tanol): 00 ml#. &cid acetic: # ml0." Coomassie R"0: " gadauga pana la $000 ml H"3
Solutie de decolorare gel %:60 5tanol$0 &cid acetic
Solutie de decolorare gel %%:$0 &cid acetic
+lectro$oreza discontinua Protocol
+lectro$oreza discontinua ' Protocol
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
49/67
Se poate utiliza un sistem de electrooreza de la B"&>R$'
$. Se prepara gelul de migrare- Solutiile componente se pipeteaza de preerat in ordinea indicata mai sus- @5M5/ si &+S realizeaza initierea si cataliza reactiei de polimerizare a acrilamidei si -,
-Y bis*acrilamidei, cu ormarea retelei tridimensionale de poliacrilamida.- &tentie: /upa adaugarea &+S si @5M5/ gelul polimerizeaza in scurt timp (aprox $
min), asadar compozitia trebuie turnata rapid intre cele " geamuri (asamblate cuspaceri de 0.# mm), inainte ca acesta sa polimerizeze
". Cu o pipeta se adauga apa dupa turnarea gelului de migrare, pentru a il ace sapolimerizeze drept la limita dintre cele " geluri. /upa polimerizarea gelului de migrare se arunca apa6. Se prepara gelul de concentrare si se toarna intre geamuri, deasupra gelului demigrare. Se adauga pieptanul in gelul de concentrare, aand gri8a sa nu se ormeze bule de aerin gel
. /upa polimerizarea gelului de concentrare se scoate pieptanul#. Xeamurile care contin in interior gelul polimerizat se monteaza in camera de
Pep$$e$ " u#$e$.elulu"
Xel de migrare $"2t 4 0." ml$. H"3: $0. ml
". @ampon gel de migare pH 7.7: #. ml. &crilamida!'isacrilamida: $" ml6. @5M5/: $00 Jl. +ersulat de amoniu (&+S) $0: $00 Jl
el de concentrare t 4 $".77 ml. H"3: # ml
. @ampon gel de concentrare pH .7: ml. &crilamida!'isacrilamida: " ml
. @5M5/: 7 Jl
. +ersulat de amoniu (&+S) $0: 70 Jl
/aca se doreste realizarea unuigel cu alta concentratie decat$", de ex $, se calculeazaprin regula de trei simplaconcentratia corespunzatoare de
acrilamida ($ml), se scadeconcentratia de apa (#.ml),olumele pentru celelaltecomponente ramanandnesc;imbate, iar olumul fnalramane acelasi (0,"ml).
+lectro$oreza discontinua ' Protocol
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
50/67
F +roba proteica: poate f extract proteic total, proteina pura, peptidaF 5xemplu
F Se prepara dilutii seriale de albumina serica boina dintr*o solutie stoc $0mg!ml (0. g 'S& si pana la 0 ml apa distilata) conorm urmatorului tabel:
N p&$3Re$%"(ml)
1 7 ; 0
'S& ($0 mg!ml) 0.$ 0. $ $.
H"3 $. $. $ 0.Conc proteica 0. mg!ml ". mg!ml mg!ml #. mg!ml
I#%$%$e$ " m".$e$p&el&
F /enaturarea probelor proteice:F "0 Jl din fecare proba proteica se transera in
cate un tub 5ppi si se amesteca cu . Jl tamponde incarcare
F +robele proteice > tampon incarcare aate intuburile 5ppi se incalzesc *$0 min la 0CF +robele proteice denaturate (", Jl) se incarca, cu o
seringa Hamilton in godeurile gelului de poliacrilamidaF Camera electrooretica este conectata la sursa de curentF Conditii de migrare a proteinelor in gel: #0*70 2, timp de
migrare $*" ;, in unctie de dimensiunea proteinei deinteres (de regula migrarea se intrerupe cand linia albastra* *
+lectro$oreza discontinua ' Protocol
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
51/67
I#epe$e$ e*ul$el&$. Xelul este scos dintre geamuri si introdus intr*o solutie de colorare (ex.
Coomassie 'rilliant 'lue), 0*0 min, cu agitare usoara. Reactiul Coomassie
se leaga la proteine, permitand izualizarea acestora, dar nu le modifcastructura sau dimensiunea.". Xelul este introdus in solutia de decolorare, cu agitare usoara. Xelul este decolorat pana cand benzile proteice de interes sunt izualizate6. /upa decolorare, gelul poate f stocat $* saptamani in apa distilata sau
poate f uscat
P&e"#ele m".e$*$ 'e l$ (>)l$ (8) pe $*$ m$e"m&le%ul$e:F +roteinele cu masa moleculara
mica (ex. *" D/) migreazaprimele si se gasesc in marteade 8os a gelului
F +roteinele cu masa molecularaintermediara ("*$00 D/) segasesc in partea din mi8loc agelului
F +roteinele cu masa molecularamare($00*"0 D/) se gasesc inpartea de sus a gelului,aproape de punctul de
+lectro$oreza discontinua ' Protocol
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
52/67
Xodeuri $, 7: MarDer de greutate molecularaXodeuri ", : +roteina purifcataXodeuri 6, : &mestec de proteine, purifcatpartialXodeuri , #: 5xtract proteic total (amestecde proteine), una din proteine, cu masamoleculara mica, este in exces
T"p:$. Complexele proteice sau proteinele cu structura cuaternara sunt denaturate si
or migra intr*un gel S/S*+&X5 ca benzi separate. /e exemplu, un complexproteic ;omotrimeric, cu masa moleculara 0D/ a migra pe gel sub orma de benzi suprapuse de 0D/. 1n complex proteic ;eterodimeric, alcatuit dintr*oproteina cu masa de 60 D/ si o proteina cu masa de 70 D/, aand o masamoleculara totala de $"0 D/, a migra pe un gel S/S*+&X5 sub orma a "benzi distincte cu masa moleculara de 60 D/ si 70 D/
". 3 proteina cu masa moleculara mica (7D/) se a separa mai bine de alteproteine din amestec daca este migrata pe un gel cu concentratie mare depoliacrilamida ($#). <ernati, o proteina cu masa moleculara mare ("00D/), se a separa mai bine daca este migrata pe un gel S/S*+&X5 cu o
concentratie mica de poliacrilamida (7). 3 proteina cu masa molecularaintermediara (0 D/) se recomanda sa sa migreze pe un gel de $0*$"
BIOCHIMI
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
53/67
BIOCHIMIE
GENERAL
A
LP
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
54/67
IDENTIICARE
GLUCIDEMETODA
BENEDICT
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
55/67
g p
P"#%"p"ul me&'e"F &cesta metoda este utilizata pentru testarea za;arurilor reducatoare,
care reduc ionii de Cu"> la Cu>, conducand la ormarea unui precipitat
rosu de oxid de cupru.F Xlucide reducatoare:F Xlucide care au o grupare alde;idica sau cetonica liberaF &ceste glucide contin grupari libere la atomii de C anomericiF 5xemple: glucoza, ructoza, maltoza, lactoza, etc.
Xlucide nereducatoare:
F Xlucide care nu au o grupare alde;idica sau cetonica liberaF &ceste glucide nu contin grupari libere la atomii de C anomericiF 5xemple: za;aroza, tre;aloza, etc.
Za;aroza
9actozaXlucoza Lructoza
Glu%"'e e'u%$&$e Glu%"'$ #ee'u%$&$
capatreducator
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
56/67
g p
Re$%"" u"l"*$"$. Reacti 'enedict:
F Se dizola $.# g citrat de sodiu si $0 g carbonat de sodiu inaproximati 70 ml apa distilata, solutia rezultata se fltreaza si seaduce la un olum fnal de 7 ml cu apa distilata.
F %ntr*un alt as se dizola $.# g sulat de cupru in $ ml apa.F Cele doua solutii se amesteca sub agitare.". Solutii de glucide reductoare si nereducatoare:
F Xlucoza $F Lructoza $F 9actoza $F Za;aroza $
(0. g glucida si pana la 0 ml apa distilata)
M&' 'e lu%uF %n trei eprubete, cu cate $ ml din solutiile de testat (glucoza, ructoza,
lactoza, za;aroza) se adauga cate " ml Reacti 'enedict si seincubeaza timp de minute pe o baie de apa la ferbere.
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
57/67
F +rezenta unui precipitat rosu sau galben indica prezenta za;arurilorreducatoare.CuS36 > " -a3H Cu(3H)" > -a"S36
Reacti 'enedict (solutie albastra)Reactie generala:RCH3 > " Cu78(OH)7 RC33H > " H"3 > Cu87OXlucida
reducatoare, cugr. alde;idica
libera
&cid aldonicCompus dinReactiul'enedict
3xid de Cu (%) sau 3xid cupros 4precipitat de culoare rosie, galbena, in unctie de tipulglucida 4marDer pentru prezenta unei glucide reducatoare+rezenta unui precipitat de Cu"3 in urma reactiei cu o glucida 4 solutie Le;li
5xemplu * Reactia glucozei cu Reactiul 'enedict:CH$"3 > " Cu78(OH)7 CH$"3# > " H"3 > Cu87O
Xlucoza4Xlucida
reducatoare
&cid gluconicCompus dinReactiul'enedict
3xid de Cu (%) sau 3xid cupros 4precipitat de culoare &"e4marDer pentru prezenta unui glucid reducator
epe$e$ e*ul$el&
J H""#$Bue%u
1 2 3 $. Xlucoza". Lructoza. 9actoza6. Za;aroza 4 Xlucida nereducatoareN in tub
se ormeaza un precipitat albastru
deoarece precipita compusii din reactiul'enedict
Xlucide reducatoare, in tub seormeaza un precipitat deculoare rosie, datoritaprezentei Cu"3
!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
58/67
GLUCOZA > ALORI NORMALE ADULTF F>1 m.3'l
HIPOGLICEMIE
F K m.3'lHIPERGLICEMIE (DIABET ZAHARAT)F 17 m.3'l
!
BIOCHIMI
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
59/67
BIOCHIMIE
GENERAL
A
LP
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
60/67
Dozarea colesterolului total seric
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
61/67
C&lee&lul
F C"#H63
F Sterol sintetizat in organism
F 5ste transportat prin sange de la intestin sau fcat catre organele careau neoie de el in procesele metabolice
F +entru ca transportul sa fe efcient, colesterolul se uneste culipoproteine:
F LDL (l&? 'e#"4 l"p&p&e"#) $u %&lee&l $u:transporta colesterolul nou ormat de la fcat catre toate celuleleorganismului. &cest tip de colesterol se numeste si colesterol rau
deoarece cand depaseste nielul acceptat normal in sange sedepoziteaza pe peretele arterelor ateroscleroza
F HDL (+".+ 'e#"4 l"p&p&e"#) $u %&lee&l u#:preiau excesul de colesterol ramas neutilizat si il transporta lafcat pentru depozitare sau pentru eacuarea lui in bila
!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
62/67
COLESTEROL > ALORI NORMALE >ADULTF COLESTEROL TOTAL: K 7 MG3DLF LDL: K 1 MG3DL
F HDL: MG3DLF RAPORT NOMAL STABILIT INTRE
COLESTEROLUL TOTAL SI HDL ESTE:COLESTEROL TOTAL:HDL/;,:1
TRIGLICERIDE > ALORI NORMALE >ADULT:
F K1 MG3DL
!
Dozarea colesterolului total seric
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
63/67
P"#%"p"ul me&'e"F
Colesterolul ormeaza cu an;idrida acetica, acidul acetic glacial siacidul suluric concentrat un complex colorat in albastru.F %ntensitatea culorii complexului rezultat are un maxim de absorbtie
la $ nm si este direct proportionala cu concentratia colesteroluluiseric.
Re$%"" u"l"*$"F Reacti de culoare:F $. acid acetic glacial ($00): 6 mlF ". an;idrida acetica: mlF . acid suluric concentrat (*#): "0 mlF substantele se adauga in aceasta ordine si se amesteca usor
F Standard de colesterol: "00 mg!dl (mg sau mg!$00ml) in acidacetic glacialF Ser obtinut din sange enos
Dozarea colesterolului total seric
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
64/67
M&' 'e lu%u 'up$ Me&'$ L"em$##>Bu%+$'
$. %n eprubete se pipeteaza urmatorii reactii:
Re$%" (ml)Bl$#%(ml)
S$#'$' %&lee&l(ml)
P&$ 'e$#$l"*$ (ml)
Re$%" 'e %ul&$e " " "S&lu"e $#'$'
%&lee&l * 0.$ *Se * * 0.$
2! 7&itare puternica pana la aparitia culorii albatre
3! Bepau 1) min!
4! Probele e citec la 61* nm ata de Elanc
*! Beactia ete poitia pentru Standardul de coleterol i pentru
Proba de er, care e coloreaa in albatru:erui
Dozarea colesterolului total seric
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
65/67
$ $le#$"$ 'e '&*$e $ %&lee&lulu" e"%:e lu%u 'up$ Me&'$ R$pp$p&>E"%++&#
P&$ (ml) Bl$#%(ml)
S$#'$'%&lee&l (ml)
P&$ 'e $#$l"*$ >e (ml)
&pa distilata 0.$ * *
Standardcolesterol
* 0.$ *
Ser * * 0.$&cid sulosalicilic 0. 0. 0.
&n;idrida acetica $. $. $.
3mogenizare sirepaus $0 min.
H"S36 0." 0." 0."3mogenizare sirepaus $0 min.
Citire $0 nmata de 'lanc
Dozarea colesterolului total seric!!!
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
66/67
I#epe$e$ e*ul$el& %u $6u&ul 5$%&ulu" 'e p$#$F Metoda actorului de panta este o curba etalon simplifcata, deoarece se
utilizeaza un singur standard, a carui concentratie este apropiata dealoarea pe care ne asteptam sa o obtinem pentru proba de analizat.
F Metoda recent olosita in clinicaF %n exemplul de mai 8os a ost utilizata o concentratie de colesterol
standard de "00 mg!dl, aloare descrisa ca find limita maxima aconcentratiei normale de colesterol seric la adult.
F 5xemplu:5s (la /3$nm) ****************** Cs4"00 mg!dl5p (la /3$nm) ****************** Cp4< mg!dlCp (m.3'l) / Ep x (C : E)
F Cp: Concentratia probei de colesterol de analizatF 5p: &bsorbanta probei de analizat
F Cs: Concentratia de colesterol standard ("00 mg!dl)F 5s: &bsorbanta probei de colesterol standardF (Cs : 5s) 4 (5$%& 'e p$#$)
F +entru a se elimina erorile de identifcare se recomanda realizarea induplicat sau triplicat atat a probei de colesterol standard, cat si a probeide ser de analizat.
F /aca s*au realizat mai multe determinari de absorbanta pentru proba
!
Dozarea colesterolului total seric
-
8/16/2019 Lp Biochimie Generala
67/67
5xemplul $:5s: 0."Cs: "00 mg!ml5p: 0."$Cp4<
Cp (mg!dl) 4 5p x (Cs : 5s)Cp (mg!dl) 4 0."$ x("00:0.") 4 $70 mg!dl
%ndiidul are o aloare normala a colesterolului total seric (["00mg!dl).
5xemplul ":5s: 0.00Cs: "00 mg!ml
5p: 0.Cp4<
Cp (mg!dl) 4 5p x (Cs : 5s)Cp (mg!dl) 4 0. x("00:0.00) 4 " mg!dl%ndiidul are ;ipercolesterolemie (aloarea colesterolului total seric