LINFOMAS CANINOS

Estudio ptico, electrnico e inmunohistoqumico

Proferacin y ploida

Tesis presentada por:Cannen Sanz Rivas

Directores:Maa CastaoHoracio Oliva

Dpto. de Patologa Animal IIFacultad de Veterinaria

Universidad Complutense de Madrid

Dpto. de Anatoma PatolgicaFundacin Jimenez Daz

Universidad Autnoma de MadridFacultad de Medicina

Madrid, 1998

UNIVERSiDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE VETERINARIA

>Fundacin Jimnez DazCLNICA DE NUESTRA SEORA DE LA CONCEPCION

Avda. de los Reyes Catlicos, 2 (Ciudad Universitaria>28040- MADRID

INFORME SOBRE EL TRABAJO:

LINFOMAS CANINOS. EstudioProliferacin y ploida.

ptico, electrnico e inmunohistoquinnico.

Presentado por Carmen Sanz Rivas para optar al titulo de Doctora en Veterinaria

Los linfomas constituyen una de las neoplasias frecuentes en perros. Su estudio,al igual que en humanos, necesita de una metodologa mltiple y de una correlacinclnico-evolutiva.

En el presente trabajo se han abordado los distintos aspectos de diagnsticomorfolgico e inmunofenotipico. As mismo se han estudiado dos factores pronsticointeresantes, la proliferacin y la ploidia con distintos anticuerpos y diferentes citometrias.

Dada la alta agresividad en el grupo de tumores elegido, la correlacin clnico-evolutiva ha sido acorde con la presentada en las neoplasias agresivas y el estudioestadstico ha sealado puntos de inters a considerar en nuevos enfoques.

El presente trabajo ha sido realizado con metdica actualizada y rigor cientfico,por lo que creemos que rene las condiciones exigidas para ser presentado como TesisDoctoral.

Madrid, octubre de 1998

CiMaria CastaoCatedrtica de Anatoma PatolgicaDirectora de Tesis

Horacio OJivaCatedrtico de PatologaDirector de Tesis

AGRADECIMIENTOS

Agradecimientos

Es dificil, despus de realizarun trabajo largo y complejo canoes una TESIS DOCTORAL, recordary citar a todas las personas que habra que incluir en los agradecimientos finales,ya que cualquier olvidopodra ser mal interpretado.

Por esa razn es quizs ms adecuado hacerlo en principio a las Instituciones que me han permitidoy proporcionado material y metodologa para la realizacin del estudio.

La Facultad de Veterinaria de la UCM y a su Departamento de Patologa Animal II, en especialAnatoma Patolgica e Histologa con todos los facultativosy tcnicos, como Elena de Patologa Mdica, hande ser los primeros citados, por la faclitacin en la realizacin de necropsias y la recogida de historiasclnicas. Soy consciente de que sin el apoyo de Pedro, Pilar, Beln, Antonio, Eduardo, Laura y los dems todohubiera sido ms costoso.

En segundolugar el Departamento de Patologa de la Fundacin Jimnez Daz UAM, donde realictoda la metodologa aplicada, al Servicio de Inmunologia por los datos de la CMF y a la Fundacin ConchitaRbago que fmanci parte de mi estancia en dicho Centro.

En cuanto a las personas, sin olvidar a los directores de Tesis, Horacio Oliva y Mara Castao,quisiera recordara todos: facultativos veterinarios, mdicosy bilogos, tcnicos de laboratorio general e IHQ,sobre todo a Trinidad Carrizosa, por sus consejos, enseanzas y simpata.

A Pilar Ralicio por su eterna sonrisa, cario, constancia y confianza incondicional. Sin ella el pasopor la Fundacin no habra tenido t punto de comparacin.

Mis mejoresdeseos y total gratitud para las onclogas Ana Ageitos y Lola Prez de Alenza, las cualesme ensearon a comprender la correlacin clnico-patolgica de la enfermedad con seriedad cientfica y elrespeto por el enfermo. Espero que la Sanidad, tanto humana como animal, se llene de personas asi.

Un recuerdo especial para las amigas Beatriz y Gema (las mejores para el desarrollo tcnico) y lafamilia, en especial a ini hermana Elena, porque un trabajo de Tesis es tarea que a veces dificulta lasrelaciones normalesy slo gandes dosis de tolerancia y cario pueden llevarla a buen fin. Tambin recordara todos mis amigos que han soportado mis rarezas durante casi cuatro aoscon gran paciencia. En conato,gracias a Macarena por dar forma a todos estos textos realizando la edicin final del manuscrito y por estarsiempre ah.

Ami ta Fanfl por la confianza que ha puesto en mi desde el principio y todas las enseanzas en elarte de la citologa y de la vida

Agradecimientos

Mi madre es la ltima citada, porque no creo que existan palabras para definir lo que ha hecho porestelrabajoypormi. Hasidolanicaenconflarenquetodoesteesfuerzoseplasmaraenalgo,yenpodercombinar con xito la ecuacin madre-jefa-profesora. Fue mi principal impulsora y espero que esta tesiseonstituya lo que ella habra esperado.

Soy veterinaria por el amor que siento hacia los animales. Agradezcoa todos ellos lo que me hanenseado y espero que este trabajo, unido a los muchos actuales, les proporcionen a cortoplazo mejoresposibilidades de supervivencia.

A todos los que de alguna forma han cooperado conmigo y he olvidado nombrar.

ABREVIATURAS

Abreviaturas

Ag = AntgenoABC> Complejo ABC: Avidina-Biotina.c = Anticuerpo.AcMo Anticuerpo monoclonal.AcPo = Anticuerpopoliclonal.ADN = cido desoxirribonucleico.El = Clula B sin memoria inmunolgica.B2 = Clula B con memona inmunolgicabcl-l = Oncogen.bcl-2 Oncogen.CD = Centroblasto.CC = Centrocito.CME= Citrometria esttica.CMF Citometria de flujo.C3b = Fraccin 3b del complemento.DRC = Clulas dendriticas del centro del folculo.

drc = Clulas dendriticas del manto folicular.EBV Virus de Ebstein-Barr.ELISA = Enzyme linked immunosorbent assay.FAIDS = Ver SIDA.FeLV Virus de la Leucemia felina.FeSV Virus del sarcoma felino.flV= Virus de la imnunodeficienca felina.FOCMA = Antgeno de la membrana celular del oncoinavirus felino /.Feline oncornavirus cel membraneantigen.HM = Clulas histiomonociticas.IB = Inmunoblasto.IDC = Clulas interdigitantes.ff1 = mmunofiuorescencia indirecta.lg = Inmunoglobulina.IgFC = Zona de fijacin antignica de las inmunoglobulinas (fraccin constante).gil = Cadena pesada de Ig.IHQ = Inmunolstoquimica.IL = Interleukina.L = Linfoma.LO!! = Lctico-dehidrogenasa.LLA = Leucemia aguda linfoblstica.

al

Abreviaturas

LLC = Leucemia linftica ermea.LMF = Linfoma del manto folicular.LNH-B = Linfoinas no Hodgkin B.LpI = Linfoplasmocitario.MALT Tejido linfoide asociado a mucosas.ME = Microscopia electrnica.MF = Micosis fiangoide.PAAF= Puncin aspiracin con aguja fina.PI = indice proliferativo (?Proliferation mdcx).PO = Peroxidasa.QDA= Programa de Anlisis del ADN (Quantitative DNA Analysis Programme).QT = Quimioterapia.RC = Remisin completa.RP = Remisin parcial.RN = Receptores nucleares.RER = Retculo endoplsmico rugoso.RP = Remisin parcial.SIDA = Sndrome de Inmunodeficiencia adquirida (FAJUS: PeIne adquired immunodefiiciency syndrome-SIDA Felino).SNC = Sistema Nervioso Central.SN? = Sistema Nervioso Perifrico.STABC= Complejo Streptavidina-Biotina.TVT = Tumor venreo transmisible.VIII = Virus de la inmunodeficiencia humana (HlV: human mmunodefficiency virus).

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NDICE

Indice

AGRADECIMIENTOS

ABREVIATURAS

1.- PROPSITOS Y OBJETIVOS . 1

11.-INTRODUCCIN:A.- SISTEMA LINFOIDE; ORGANIZACION

B.- AREA B; FOLCULO LINFOIDE SECUNDARIOC.- EL REA T O INTERFOLICULAR..D.- CONTRAPARTIDAS TUMORALES

Dl.LinfomasBD2. Linfoznas T

E.- BIOPATOLOGA DE LAS NEOPLASIAS LINFOIDESF.- PROCESOS LINFOPROLIFERATIVOS EN ANIMALES DOMESTICOS

F. 1. Presentacin en e/perroF.2. Presentacin en otras especies; linfoma-leucemia en elgatoF.3. Clasificacin clnico-anatmica en animales domsticosF.4. Estadiosclnicos en mam4ferosF.5. Historia clnicay diagnsticoF.6. Tratamiento. Quimioterapia

G.- TECNICAS ESPECIALES DE ESTUDIO

III.- MATERIAL Y MTODOSA.- CASUISTICA

B.- MORFOLOGIA PTICA.C.- MICROSCOPIA ELECTRNICA. .D.- INMIJNOHISTOQUMICA. ..

Dl. Procedimiento manualD.2. Procedimiento automticoD.3. Consideraciones tcnicas para la realizacinyvaloracin de la JHQD.4. Anticuerpos utilizados en 1119

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Indice

E.- ACTIVIDAD PROLIFERATIVANUCLEAR 35

E. 1. Anticuerpos inonoclonales de prohferacn. 36E.2. Analizador de imagen 37

F.- ESTUDIO CITOMETRICO 39

F. 1. Citometria esttica 40F.2. Citometria deflujo 433. Valoracin del ciclo celular en cirometria .. 44

O.- ANLISIS ESTADSTICO 45

IV.- RESULTADOS

A.- HALLAZGOS CLNICOS 46

B.- AFECTACIN NECRPSICA TUMORAL 47C.- MORFOLOGA PTICO-ELECTRONICA 50D.- PATRONES DE TINCIN EN INMUNOHISTOQUIMICA 51E.- CINETICA TUMORAL 54

F.- ESTUDIO ESTADSTICO 55

y.- ICONOGRAFA

A.- TABLAS 58

B.- FIGURAS . 65

VI.- DISCUSIN.A.- CONSIDERACIONES GENERALES 107

B.- CONSIDERACIONES DEL GRUPO DE ESTUDIO 111

C.- CONSIDERACIONES BIODINMICAS ... . 113

VII.- CONCLUSIONES ... 118

VIII.- BIBLIOGRAFA 120

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1.- PROPSITOS Y OBJETIVOS

Propsitos y Objetivos

Los procesos linfoproliferativos, dentro de las neoplasias malignas muestran una incidenciaascendente en los humanos, que se rolaciona en partecon el aumento de la inmunodepresin, sobretodo laadquirida: trasplantes y SIDA. La dificultad que acompaa a este grupo tumoral englobadistintos conceptosde diagnstico y tratamiento; a pesar de una investigacin continua, los linfomas continan siendo actualidadporque su conocimiento completoest unido al avance inmunolgico y teraputico.

La semejanza del sistema linfoide humano y animal, no slo mamferos sino tambin especiesinferiores,hace a priori muy interesante la consideracin comparativa de sus neoplasias. As mismo puedeservir para constatar la ayuda que los datos a nivel humano aportan en cl conocimiento de estos tumores.

El presente trabajo estudia los linfomas en la raza canina, de una incidencia superior a la humanaycon etiologa y epidemiologa no conocidas. No se han encontrado en ellos oncogenes causantes detraslocaciones repetitivas, pero s una probable implicacinde los genes supresores. Ninguno de los viruslinfotropos responsables de linfomas en el hombre acta en el perro (t el virus de Epstein-Barr (EBV)relacionado con el linfoma endmico africano dc naturaleza B o linfoblstico tipo Burkitt, ni el HTLV-I,retrovirus condicionante del linfoma-leucemia agresivo de linfocitos T, endmico del Japne islas del Caribe).Aunque en el gato se conoce que los virus de la leucemia felina (FeLV) y de la inmunodeficiencia felina (FW)estn implicados en linfomas y leucemias por la induccin previade un estado de inmunodeficiencia, sedudade una etiologa viral relacionada con los tumores linfoides del perro.

Para la consideracin de estapatologa animal, interesante y dificil, seutilizan conceptos semejantesa los descritos en patologa humana. Existen discretas variantes en la clnica, estadiaje y terapia, y para sucorrecta evaluacin morfolgica se han de incluir de forma necesarianuevas metodologas.

En cuanto a la clasificacin dc los tumores, en el presentetrabajo se ha seguido la modalidad humana,quizs no totalmente adecuada, porque estas neoplasias en la mayora de las sedes publicadas y en los casosque aqu se consideran, son casi siempre de alta agresividad. No obstante, las clasificaciones de Le yWorking-Fonnulation, que consideran los linfomas segn los distintos grados de malignidad, parece quecumplen de forma adecuada los objetivos de esta tesis.

Dado que no hay que olvidar que parte de los linfomas caninos no slo surgen en ganglios, sino enpiel, timo o aparato digestivo, se recogen tambin los conceptos de la escuela inglesa de los linfomasextraganglionares (Isaacson), la revisin europea-americana REAL, y la ltima propuesta de la OMS &araclasificar los linfomas) que engloban linfomas nodales y extranodales. No obstante,dado que los distintossubtipos descritos en las clasificaciones generales humanas, resultan con frecuencia poco superponibles conlos hallazgos encontrados a nivel animal, parece que los linfomas animales, todos no Hodgkinianos, sedeberan considerar porel lugar anatmico donde surgen, por la semejanza con las clulas que los originan

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Ikqp4sitas y Objetivos

y por las caractersticas biolgicas de las mismas, las cuales incluyen mtodos biodinmicos para lavaloracin objetiva de la agresividad.

Los estudios de linfomas animales realizados hasta la actualidad, abarcan las caractersticas clnicas,morfolgicas e inmunohistoquimicas (1H03 con anticuerpos monoclonales (AcMo) en congelacin, dirigidosanti-anilgenos (Ag) animales. Faltan trabajos en los que la IHQ serealice con mtodosy anticuerpos (Ac) encortes parafinados, semejantes a los utilizados en patologa humana, casi todos comerciales y con altadefinicin, que por su probable reaccin cruzada, o por ser extensivos a mamferos, pennitan un mejorreconocimiento celular y as una correcta tipificacin del tumor.

El presente estudio tiene como objeto entender la biologa neoplsica en el annal y saber silosdistintos linfomas muestran rasgos diferenciales o comunes en su presentacin clnica, diagnsticomorfolgico, inmunofenotpico, biodinmico y respuesta al tratamiento. Para ello se han elegido casosrepresentativos que anen material idneo para el diagnstico morfolgico multidisciplinario, lo que exigetomas rpidas post mortem o bipsicas, as como protocolos completos clnico-evolutivos.

El material procede del Departamento de Patologa Animal II de la Facultad de Veterinaria de laUniversidad Complutense de Madrid-UCM Si las tcnicas se han realizado en el Departamento de AnatomaPatolgica de la Fundacin Jimnez Din, Universidad Autnoma de Madrid-UAM, Centro de Referenciade Patologa Linfoide, con experiencia adecuada en el diagnstico actualizado morfolgico ganglionar.

Los objetivos concretos especificados se citan a continuacin:

1.- Estudio clnico - evolutivo2.- Estudio morfolgico necrpsico, con tcnicas de rutina, microscopia electrnica e

inmunohistoquimica, con marcadores mono y policlonales.3.- Estudio biodinmico de las biopsias con marcadores proliferativos para posterior cuantificacin

en un analizadorde imagen CAS 200.4.- Estudio del ADN con citometra de flujo y esttica.5.- Estudio estadstico de los resultados.

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II. - INTRODUCCIN

Introduccin

- SISTEMA LINFOIDE; ORGANIZACIN.

Para una correcta comprensin de la inmunopatologa de los procesos linfoproliferativos, se debenconocer los cambios tanto morfolgicos como inmunofenotpicos que ocurren durante la transformacinlinfocitaria, la anbriognesis y diferenciacin fisiolgica as como la divisin de los linfocitos en subgruposfimcionales, con el patrn de circulacin y anidamiento de los mismos /Taylor CR, 1982].

Desde que se hicieron las primerasdescripciones del linfocito en 1774 hasta los ltimos aos, se haavanzado mucho en el conocimiento dinmico del sistema celular linfoide, no hay que olvidar que hacia 1958scdudaba de la funcin linfocitaria, o aquella clulacon atributos morfolgicas poco definidos /MchellJet al, 1978].

Las clulas del sistema inmune, sobre todo los linfocitos, se distribuyen en rganos linfoides, dondeforman micr~ambientes intercomunicados con alta especializacin, que facilitan el atrapamiento antignico,su catabolismo, cl trfico linfocitario y la estimulacin y diferenciacin ordenada de clulas efectoras [KayNR a al, 1979; Banks WJ, 1993].

Se pueden diferenciar tres compartimentos dc maduracin linfoide: A) clulas germinales, B) rganoslinfoides centrales de maduracin linfocitaria T oB antgeno-independientes (timo y equivalentes humanosde la Bm-sa de Fabricio de las aves) y C) rganos linfoides perifricos, de generacin y dbsin de respuestainmune post-estimulo antignico (ganglios linfticos, bazo y sistema linfoide asociado a mucosas: MALT)[LinchPC et al, 1982; Isaacson PG et aL 1983; Spencer Jet al, 1986].

La clula madre, totipotencial hematopoyticao clula STEM, se origina en los islotes hematopoyticosdel saco vitelino del embrin, en el hgado fetal y despus del nacimiento en la mdula sea (MO), dandolugaralas diferentes series hematopoyticas, incluida la linfoide, objeto de este trabajo [RyseriEetal, 1974;Mitchelliet al, 1978; KayNEetaL 979; Miller JFA.P, 979; QuesenberryPet al, 1979; Magrithflj981; Sanchez FayosJet al, 1982;Nichols WSet al, 1983;Kempin U 1984; Sanchez Fayos Jet al, 1984;FialkowPj 1988; Ban/cs WJ 1993].

La serie linfoide T madura en el timo. El contacto precoz de los linfocitos con las clulas epitelialestimicas esfundamental para la adquisicin de la autotolerancia. Alrededorde un 5% de la produccin diariatmica surge de la zona crtico-medular para despus salir a la sangre y ser distribuida en las regiones T-dependientes de los rganos linfoides perifricos. Esta distribucin ocurre en virtud de factoresmicroambientales no totalmente conocidos, que en parte dependende las agresinas o molculas de adhesiny de la accin del endotelio de las vnulas de las reas T. Los linfocitos T constituyen un 70-80% del totallinfocitario de sangre perifricay un 90% dc la linfa del conducto torcico [Lewne (3D etal, 1975; Rosai Jeta), 1976, Mflhler-HermelinkHx, 1986, Knapp Wc a), 1989; Henry X, 1992].

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Introduccin

Scdiscute cuales el equivalente de la Bursa,rgano linfOide central de la serie B. En rasgos generalesse acepta que debe su la MO sobre todo niel individuo adulto. En ella maduran linfocitos B que constituyenun 12-15%de los linfocitos circulantes en sangre perifrica, un 50% dc los linfocitos esplnicos y un 75%deles de laMO /MitchellJflal, 1978; KayNA etal, 1979;MIIIerJFA.P, 1979;Nehols HS e: aL 1983;Parks DE et al, 1983; Roitt1, 1988).

Los rganos linfoides perifricos presentan reas B y T dependientes, con una disposicin especficaen cada rgano. En el ganglio linftico el rea T corresponde a las zonas paracorticales, centradas por lavnulapostoapilar; el rea B-dcpendiente corresponde a los folculos linfoides y a los cordones medulares,y en ella las clulas B muestran distinta morfologa, modulaciny funcin. En el bazo (dentro de la pulpablanca o folculos de Malpighio) las reas 1 son las varnas celulares periarteriolares, y las B las rodeanformando folculos distintos a los del ganglio, ya que presentan un cenizo con vascularizacin capilaro-arteriolar, mantoy rea marginal. En el sistema MALT los folculos o reas B se estructuran como en el bazo(sin vasos en su interior) y el rea T es perifrica a los mismos, con una disposicin semejante a la que existeen los ganglios linfticos [RivasC etaL 1975; Rivas C et al, 1980; lsaacson PC et al, 1983; Rivas C et al,1983; Fujita Tet al, 1985].

En cada rgano sealado, las clulas linfoides estn en una malla o estromacon distintos tipos celulares,que a su vez tienen diversas funciones. La funcin de sostn corresponde a elementos de hbito fibroblstico.Otras clulas, de estirpemonocitaria, o fagocitan o inducen la respuestay los cambios linfoides de alrededoral atrapar en su superficie los antgenos; son las clulas presentadoras de antgeno, dendrticas foliculares(DRC) en el rea B,o los complejos interdigitantes-clulas de Langerhans (DC) de las reas T [LinchDCet aL 1982; Rivas C et aL 1983; FellerAC, 1985; Fujita Tet al, 1985].

B.- REA B; FOLCULOLINFOIDE SECUNDARIO.

Como ya se ha comentado, los folculos linfoides son unos agregados nodulares situados en la corticalde los ganglios linfticos u otros rganos linfoides. Para su desarrollo se necesita una poblacin 1 timo-dependiente nomial. No ocurre una activacin completa o correcta en estado alterado de la inmunidad [Roa1, 1988].

Cuando no ha existido un estimulo antignico previo, el folculo es homogneo y est constituido porclulas linfoides de pequeo tamao y aspecto maduro (celulas B 1 sin memoria inmunolgica), es el llamadofolculo primario. Post accin del antgeno se constituyen los folculos secundarios, de mayor tamao, condos zonas bien definidas: una perifrica estrecha de clulas pequeas con ncleos densos, que constituye elmanto folicular, y otra central o ncleo claro porposeer clulas mayores, de ncleos con menor densidadcromatrca, por lo que se destaca claramente del resto de la pulpa. Esta zona se llamaba antes germinal,porque se interpretaba como el lugardonde nacan en su mayor parte los linfocitos B [Fupta Te: al, 1985].

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Introduccin

En el sistema MALT o en loo ganglios mesentricos el folculo se rodea de una tercera capa concntricasemejantea la que prwannlas zonas B de los folculos de Malpighio esplnicas, el rea marginal /MillkinPD, 1969;Lnch DC e: al, 1982; FellerAC, 1985; Fujila Tet al, 1985; WoJfBC e: aL 1989].

Centro FolicularPresenta clulas linfoides de gran tamao resultado de la modulacin de los elementos vrgenes

linfocitarios B1, con una morfologa caracterstica que las identifica como clulas del centro folicular. Lasms pequeas o ms maduras son los cites (centrocitos CC) que miden de lOa 12 micras. Las mayores oblastos (centroblastos CB) miden de 15 a 25 micras. Los CC tienen un ncleo hendido o de contornoirregular con cromatinadensa, nucleolo pequeo y escasas cisternas de retculo endoplsnco rugoso (RER)intracitoplsmicas. Los CB tienen ncleos de contorno liso, forma ovalada, cromatina lan y nucleoloshiperplsicos generalmente marginados; el citoplasma es escaso con mnima cuanta de RE [RivasC etal,1980].

La inmunohistoquimica en tejido humano demuestra positividad para los anticuerpos monoclonales(AcMo) pan-B (CD19, CD2O, CD79a) as como para los Ac policlonales (Po): IgM, kappa y lambda,expresando tambin el AcMo CD 10 . En tejido animal fimciona bastante bien el AcMo CD79a y los AcPokappa y Lambda.

Las clulas de estirpe histiomonoctica (HM) modificada constituyen las dendrticas del centroo DRC.Comparten marcadores con esa estirpe as como otros especficos (CD2 l-CD23). En tejido animal exhibencasi en su totalidad la protena S-100, ya que otros Ac HM como el MAC 387 tien histiocitos sinusales.

Son en las DRC donde comienzan los cambios del centro folicular. Ante la llegada de ciertos antgenos,cambian su morfologa y se hacen estrelladas, con cuerpopequeo y largas prolongaciones que atrapan ensuperficie abundantes complejos antgeno-anticuerpo (gracias a que poseen receptores para IgFc de lasinmunoglobulinas y complemento C3b) los cuales permanecen largo tiempo en su membrana, y facilitan latransformacin de los linfocitos a blastos del centro: centroblastos y centrocitos (CB y CC) como un primerpaso para 1 formacin de la clula plasmtica o elemento especializadopara la formacin de anticuerpos.

Probablemente existen otras clulas intermedias en la respuesta B, como son los inmunoblastos (IB) ylas clulas linfoplasmocitarias (Lpl); tambin hay una serie de clulas B que tras su contactocon las DRCquedan sin transfonnar, pero conservando la memoria inmunolgica (B2) y presentando la morfologa delinfocito maduro. Las clulas CB mueren rpidamente y sus restos apoptticos son fagocitados pormacrfagos, responsables de la imagen en cielo estrellado del centro reactivo.

En estos foliculos secundarios ocurre la activacin B timo-dependiente. El macrfago capta el antgeno(pormedio de sus receptores de membrana) y lo elabora en su citoplasma, presentndolo despus a la clula

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Introduccin

CD4 a colaboradora, en su superficie est unido al complejo de histocompatibilidad clase II (clase 1 silopresenta al linfocito CDS citotxico). Con estos procesos as como con laproduccin de interleukina (IL)-!,cl macrfago estimula al linfocito cooperador, que a su vez produce la IL-il, determinando la proliferacinB y T. Este es un mecanismo inmunolgico general Roitel, 1988; OrflzMasllorens F 1997], que estausente en estados de inmunodefletenca

Tambin se admite una activacin timo-independiente que ocurre con algunos tipos especiales deartgenos (polmeras D-aminocidos, polisacridos, polivinilpirrolidona, etc...) que son capaces de estimularlas clulas E sin que las T estn involucradas. Parece que en concentracin suficiente, algunas sustanciaspersisten durante un tiempo prolongado en la superficie de macrfagos especializados (probablementesituados en el seno subcapsular ganglionar y en la zona marginal esplnica) consiguiendo transformacionesE efectivas pero no cuantitativamente suficientes.

En el ganglio linftico no se conoce exactamente silos cambios descritos se producen en la pulpasubsinusal o en la periferiade los folculos, en la zona del manto, donde las clulas HM (drc) constituyen latrama dendrtica del mismo, actuando tambin como clulas presentadoras antignicas [RoJa!, 1988].

Manto FolicularEn el folculo secundario la zona clara central se rodea de una periferia densa, con peculiaridades

morfolgicas e inmunofenotipicas. Si la morfologa ptica era suficiente para definir las clulas CE, CC yDRC del centro, no ocurre lo mismo con los tres elementos del manto. Su clula dendritica (clic) es menoscaracterstica que la DRC, con prolongaciones ms cortas y gruesas, ms vecinas a los histiocitos; las clulaslinfoides parecen elementos mayores que un linfocito, con ncleo de contorno irregular, cromatinadensa ynucleolo llamativo.

La inmunohistoquniicaproporciona en tejido humano un inmunofenotipo distintivo del manto. Las drcson positivas con AcMo HM y negativas o dbilmente positivas con AcMo anti-DRC aunque, en ocasionesmuestranpositividad con desminay vimentina, careciendo, como las DRC, de fenmenos de fagocitosis. Lasclulas linfoides son positivas para IgM, pero adems muestran IgD, as como kappa y lambda, siendonegativas con CD1O. Dichas clulas linfoides del manto pueden marcarse con el anticuerpo T restrictivo CD5[VteisemburgerDet aL 1985].

La actividad proliferativa tras el estmulo antignico difiere en centro y manto: en el primero lapositividad con ciclinas MIB1 (Ki67 en parafma) o PdO puede ser casi de un 100%y en el segundo de un5 a un 10%. Los valores obtenidos en tejido animal son algo ms bajos [Gerdes.1, Dallenbach Fe:aL 1984;Cerdes Lemke He: al, 1984; Gerdes Sabartiniketa 1993].

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Introduccin

LaMicroscopia Electrnica (ME)malta las diferencias celulares entrecl centroy el manto. Las DRCson de cuerpo pequeo y triangular, a veces doble, con cromatina fina y nucleolo poco llamativo; sucitoplasma es escaso y no muestra lisosomas secundarios, prolongndose en finas extensiones unidas pordesinosomas o hemidesmosomas que rodeanestrechamente cada CB y CC. Las dendrticas del manto, drc,son menores, con prolongaciones anchas que siguen a un citoplasma ms amplio que el de las DRC, conocasionales microflbrillas o cuerpos densos que recuerdan a mioflbrablastos; en las zonas ms perifricasdichas prolongaciones se entremezclan tanto con las extensiones de las DRC como con los procesoscitoplsmicos de las clulas interdigitantes (DC) del rea T.

Las clulas linfoides del manto (10 micras) tienen ncleo redondo o hendido, cromatinadensa y nucleolollamativo con citoplasma moderado y escasas cisternas de RER Se diferencian ultraestructuralmente de losCC del centro, que son mayores (12 micras), con cromatina ms dispersa y nucleolo menor, siendoexcepcional el RER El CB del centro esel blasto mayor (15-18 micras) con ncleo liso de cromatina dispersay nucleolos prominentes, nicos o mltiples, generalmente marginados; su citoplasma es escaso conabundantes polirribosomas y despolarizacin mitocondrial [Man Y et aL 1966; Millikin PO, 1969;Kaiserling E. 1977; Rivas C, 1980].

La formacin del folculo secundario es la expresin morfolgica de la activacin del sistema inmuneen respuesta al contacto con el antgeno. La estimulacin de la clula B supone una proliferacin ydiferenciacin hacia la clula plasmtica, especializada en la formacin de anticuerpos especificas para elantigeno en cantidad suficiente. La secuencia celular que va desde un linfocito virgen, sin contacto con elantgeno, hasta la plasmtica, es discutida. Probablemente un linfocito B 1 pequeo da lugar a un CB querpidamente muere, siendo sus restos eliminados por macrfagos del centro reactivo. Los inmunoblastos (IB)son muy similares a los CB pero poseen ms cisternas de RER y nucleolo central; parece que estas dos clulasestn muy relacionadas tanto por su morfologa como por su inmunofenotipo. El CC es probablemente laprimera clula efectora, aunque de corta duracin. El siguiente escaln es la clula linfoplasmocitaria. Lasclulas del manto tienen un desarrollo inicial de retculo endoplsmico rugoso RER, adoptando unamorfologa similar a la linfoplasmocitaria.

Experimentos animales han determinado que en las DRC permanecen los complejos antgeno-anticuerpoque condicionaran los cambios CB y CC. Clulas B2 de memoria llegaran al manto contactando con unnuevo antgeno en las drc, lo que a su vez estimulara los cambios hacia clula plasmtica. Estos resultadosen conejos no parecen totalmente extrapolables al hombre [KaiserlingE 1977].

El manto es una zona polimorfa donde, adems de las mencionadas, existen otras B 1 y algunas B2recirculantes. Podra ser el lugar de la transformacin B timo-independiente, donde antgenos especialespermaneceran en las dic condicionando la diferenciacin a plasmtica. Es evidente que, en parte es un rearesidual del folculo primario, pero la morfologa descrita implica una funcin activa, y que es tanto mayor

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Introduccin

cuantoms grande es la respuesta centrofolicular.

En cuanto a las clulas efectoras o plasmticas, en ganglio son muy escasas en el folculo, msabundantes en el manto y predominantes en la pulpa terciaria. Van de la cortical a los senos medulares donde,probablemente por un mecanismo holocrino, segregan inmunoglobulinas al sistema de senos medulares y deah al torrente linfticoy sanguneo.

El folculo espredominantemente B, pero tambin tiene clulas T. stas se sitan entrecentro y manto;las CIX (Helper cooperadoras) son aproximadamente el doble de las CDB (Citotxicas - supresoras) enrespuestas ganglionares inespecificas, pudiendo invertirse este cociente en situaciones no tumorales otumorales. No se conoceexactamentecul es su funcin [WofBCet aL 1989]. Es importante recordar quela activacin morfoinmunolgica no es superponible a la inmunolgicamente conocida, de las clulas B oT[Roa 1, 1988; Ortz-Masllorens F, 1997].

Area Marginal.En reas extranodales, bazo (pulpa blanca) y sistema asociado a mucosas (MALT - placas de Peyer),

se observa una tercera zona externa al manto: la zona marginal [lsaacsonPC et al, 1983; Spencer i, FnnTet

Introduccin

La vnula post-capilar est revestida por clulas endoteliales altas de forma trapezoidal, con riqueza enorgnulos citoplsmicos y microfibrillas semejantes a las de los elementos que revisten los sinusoidesganglionares. Parece que estos endotelios contienen un receptor de ubiquitina [Roa1. 1988] que acta comouna lectma que reconoce complejos fosfatados de la superficie del linfocito, por lo cualexiste una interaccinentre ellas y los linfocitos que lleva a un adhesin de ambos elementos. Despus de la unin y merced a laformacin de pseudpodos,el linfocito se introduce en el citoplasma endotelial, serodea del mismo, desciendea la basal, y sale a la pulpa por debajo del pericito. Este paso intraendotelial o emperipolesis que ocurretambin en los capilares venulares Rivas C, 1980], es caractersticodel linfocito, ya que los polinuclearesatraviesan la pared por las uniones inter-endoteiales.

Los linfocitos llegados por va venular colonizan la pulpa T y se modifican por los antigenos expresadosen superficie por las clulas interdigitantes.

El complejo de clulas interdigitantes-Langerhans (DC) son a la zona 1 lo que las DRC al centrodelfolculo. Estn constituidos por un grupo de clulas monocitarias transformadas cuya funcin es mantenerdistintos complejos antignicos en la superficie de sus prolongaciones. Dichas proyecciones son gruesas ycortas y se extienden en ocasiones hasta los linfocitos del manto folicular [Rivas C, 1991]. El citoplasma esamplio, con abundantes organelas, lisosomas sin signos de fagocitosis y cuerpos de Birbeck(caractersticosde este elemento, de funcin discutida, situados en las vecindades de la membrana plasmtica o en lascercanias del Ciolgi).

Las DC expresan en membrana el antgeno CDL que comparten con los timocitos corticales, y se tientambin con el Ac anti-protena S- 100. Su dinmica es grande y cuando se introducen en la luz de los senosse hablade las clulas veiled o escondidas, slo detectadas por IHQ. Fue descrita porVeldman [LennertKa aL 1978] en conejos y su nombre se debe a las interdigitaciones que relacionan estos elementos entre siy con los lmfocitos vecinos.

Entre las clulas 1 hay abundantes elementos B transformndose a plasmticas que caminan a los senosmedulares para vertir en ellos los anticuerpos secretados; hay una clula no totalmente conocida, la llamadaclula T plasmocitoide, caracterstica en algunas respuestas del rea 1 en linfadenitis (sobre todo ladermatoptica), que separece a las plasmticas desde el punto de vista electrnico, por el desarrollo del RERaunque no forma inmimoglobulinas, y que es una modificacin de los linfocitos 1, que expresan anticuerposCD3 y CD4 [Lennert K a aL 19781.

9

Intmduccin

O.- CONTRAPARTIDAS TUMORALES

D.1) LINFOMASR

En patologahumana el centro, manto y reamarginal dan lugar a distintas neoplasias:

1. Del centro y por la accin del oncogen bcl-2, que en un porcentaje alto lleva a la traslocacin t(14,18),surgen los linfomas CENTROFOLICULARES de bajo y alto grado [Peralta Eet aL 1990]. Es probable quepuedan tambin originarse los linfomas II4MUNOBLASTICOS ya que CB e IB, como se ha comentadopreviamente, son dos clulas relacionadas. Asimismo, se ha cuestionado si los linfomas LB tipo Burkittpudieran serdel centrofolicular, ya que los blastos EBV relacionados son parecidos al CB de menor tamaoque el reactivo con el mismo inmunofenotipo [LennerrK, 1978; Rivas C, 1982].

2. En el manto, debido a la traslocacin (11,14) por la accin del oncogen bcl- 1 surgen las neoplasiasaceptadas slo en humanos [JaifeES 1987; Weisenburger DD, 1987] conocidas como linfomas del manto,llamados de diferenciacin intermedio , no comprobadas en animales. Esta neoplasia corresponde allinfoma centrocitico de la clasificacinde Kiel [Lennert K et aL 1983].

3. Parece que el rea marginal es la responsable de los linfomas extranodales del MALI (de los cuales losgastrointestinales son los ms ftecuentes). De reacciones extranodales inflamatorias o inmunes queestructuran tejido linfoide extranodal reactivo en el seno de distintos rganos (como piel, tejido tiroideo,pulmonar etc..), surgen as mismo linfomas superponibles a los MALI de predominio B. Sus clulas sondiferentes a las del rea marginal reactiva, modulndose desde linfocitos y plasmticas a blastos medianoshendidos (CC-like) y otros de mayor tarnalio (CB-like) que reciben esa denominacin porque recuerdanal centrocitoy al centroblasto con microscopia ptica. No obstante, con ME exhiben un desarrollo del RERsuperior a cualquier linfoma nodal de esa morfologa, siendo los blastos mayores, semejantes a plasmablastos.Las clulas ms maduras muestran epiteliotropismo en el cuello de las glndulas (estmago e intestino)constituyendo las lesiones linfoepiteliales, caractersticas para el diagnstico flsaacson et aL 1983; Spencerji McDonald Ter aL 1986; Isaacson PC eral, 1989; Castrillo .LVI el al, 1990 ; Isaacson PC, 1990; RivasCer aL 1990, Rivas Cer aL 1991; Rivas CetaL 1991; Castrillo JMetaL 1992; NortonAier al, 1994;Norron XI etaL 1994; Montalbn C et aL 1995].

4. Clulas B precursoras semejantes a las de la MO seran las responsables de los linfomas-leucemias Blinfoblasticas. El linfoma LB B tipo Burkitt se consider en un principio constituido por estos mismoelementos; en la actualidad y como sc ha comentado previamente, parece relacionado con el centro folicular[LennertKetal 1978 y 1981].

lo

Introduccin

A2) LINFOMAS E

Los lnlbmas 1 son neoplasias polimorfas de clulas 1 perifricas o precursoras /SteinJI 2olksdorfGer aL 1981; Rivas C et aL 1982; Vicente J, 1982;Montalbn C etal, 1993], de localizacin primitiva onodal, o extranodal. Para su identificacin es imprescindible el estudio inmunohistoquimico, ya que lamorfologa citolgica por s misma puede llevar a entres diagnsticos. No se puede hablar de alto y bajogrado de forma comparativa a los t2~lH-B, dado que globalmente son siempre ms agresivos. Entre los LNH-1 perifricos, CD4+ y CDS+, hay que destacar: 1) Los NODALES, de mayor o menor agresividad, conclulas semejantes al linfocito 1 perifrico pero con ncleo irregular, y 2) Los EXTRANODALES depredominio cutneo, entre los cuales hay que incluir en la actualidad parte de los linfomas citotxicos, algunosCDS [FranksPTetal, 1986; WellmanML etaL 1989;MoorePFetal, 1994; WJJO 1997].

E.- BIOPATOLOGIA DE LAS NEOPLASIAS LINFOIDES.

Se dice que los procesos linfoproliferativos, leucemias o linfomas, suelen presentarse exhibiendo uninmunofenotipo que reproduce en cierta manera a la biologa de las clulas normales, dentro de la secuenciade modulacin funcional de los sistemas linfoides B y 1. De ahi parten las hiptesis de que las neoplasiasconstituyen una expansin clonal de un elemento celular mutado con un stop madurativo a nivel de unmomento de su ontogenia [SnchezFayos Jet al, 1982; WrightDHetat 1983; HabeshawiA eta! 1988].

Esta idea que resulta de utilidad para la comprensin de los linfomas, no es siempre exacta. Es bienconocidoque en la mayora de las neoplasias linfoides de clulas pequeas o bien diferenciadas, los elementostumorales suelen reproducir la morfoinmunologia normal o reactiva (aunque se demuestra que las clulaspresentan alteraciones citogenticas importantes),pero no sucede as en las ms agresivas o desdiferenciadas,donde se observan fenotipos aberrantes o defectivos. As mismo la citogentica expresa alteracionescromosmicas importantes incluso en las ms diferenciadas [Gardo R et aL 1994].

Para considerar todas estas neoplasias, durantemucho tiempo sehan establecido distintas clasificaciones[RappaporH,1966; Gerard-MarchantRetaL 1974; KimHet al, 1974; LennertKet al, 1975; LukesRi,1975; Dorfman R~ 1977; Lennert 1< eta!. 1978; Weissman IL eta!, 1978; Lennert K et aL 1981; Robb-Smith AHet aL 1981;WeisenburgerDD etaL 1981; Working Formulation

Introduccin

su evolucin natural sin terapia, que aade junto a los grados bajo y alto, el concepto de agresividadintennedia, aunque engloba sin embargo, de forma unitaria, los linfomas de estirpe B, T nodales yextranodales [CattoretfiGeta), 1992] (labias 1,11 y III>.

Un infamo de bajo grado o & evolucin favorable es aquel que, desde su diagnstico hasta que causala muerte, tiene una evolucion lenta; se presenta con extensinconsiderable y en estadios avanzados. Losportadores (datos en medicina humana) no responden totalmente a la terapia mltiple; los casos de edadavanzada o mal estado general pueden manejarse con tratamientos poco agresivos o sintomticos, dado queel pacientepuede convivir con su neoplasia.

El lmnfoina de alto grado sin tratamiento provoca la muerte en un plazo corto; puede estar localizadoen el momento del diagnstico, si el individuo acude pronto a consulta (estadios bajos), responde rpidamentea las terapias, pero tiende a recidivar si no se utilizan protocolos agresivos. Puede alcanzar remisionescompletas en un 60%de los casos.

El grado intermedio remneda en la clnica ms a los linfomas de bajo grado, con una dinmica mayor queellos y poca respuesta a terapias convencionales, con recidivas mltiplesy curso trpido.

El conocimiento de estos linfomas en la actualidad, se ha perfeccionado gracias a la aportacin delmmunofenotipo o expresin en sus clulas de marcadores monoclonales de ncleo y citoplasma, indicativosde la estirpey agresividad tumoral asi como de la proliferaciny diferenciacin. Muchos casos, sobre todoen los de bajo grado se puede conservar el inmunofenotipo habitual de las contrapartidas celulares notumorales, pero en el alto grado, los tumores presentan un inmunofenotipo variable que puede ono recordara las clulas originarias o tan slo expresar la estirpe B, 1 y signos proliferativos de agresividad.

La dinmica tumoral estudiada con marcadores proliferativos [CenSesji Dallenbach En aL 1984;Gerdesi, LemkeHe al, 1984; Srein H, Gerdes Jet al, 1987;GarciaRL eraL 1989; ial! PA eraL 1990;

KameOFVer al, 1991; Gerdesi SabaninlEetaL 1993; Fournel-FleuryCetaL 1991] es importante paraconocer la respuesta a la terapia, la tendencia a las recidivas y la correlacin con el estudio del ADN. Estaparte, ms experimental seconsiderar con citometrade flujo y esttica [JoensuuHet al, 1990; Manen 4eraL 1993; BraylanRC, 1993;Marcos B etal, 1993; WojcikEMet al, 1993;GarciaR etaL 1994; LeeSa aL 1994; Marcos RetaL 1998; SanzC etaL1998]. A priori, si serelacionan los conocimientos y avancesde las diploidas y aneuploidias en el pronstico de estos linfomas, intuiramos peor pronstico en los casosaneuploides y mejor en los diploides, pensando que deberan corresponder a tumores linfoides ms o menosagresivos respectivamente.

La correlaciny los valores estadsticos de agresividad, morfologa y posible supervivencia sern datosconsiderados y valorados dado que su conocimiento es imprescindible como factor pronstico en la evolucin

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Introduccin

de laenfermedad.

F) PROCESOS LINFOPROLIFERATIVOS EN ANIMALES DOMSTICOS

FJ) PRESENTAClON EN EL PERRO

El linfoma en el perro es una de las neoplasias ms ftecuentes con una presentacin anual de 30:100.000, lo que supone el doble de la incidencia humanay 2/3 de la presentada en gatos. Segn los datospublicados fl-Jardyir WD a aL 1989;Moulton JE eta?, 1990; Keller E?, 1992; Teske E, 1993; Vall VEOet aL 1993; Conto GC et aL 1995], existe una predisposicin racial en el caso del Boxer, Basset Hound, SanBernardo, Scottish Ten-ier, Airedale terrier y Bulldogs. La edad media de presentacin es de 6-7 aos (edadmedia adulta) a diferencia de la presentacinjoven del gato, con un rango desde los 6 meses hasta los 15 aos.No se observa una mayor incidencia por sexo que sea conclusiva, con una presentacin similar en ambos[1-lardyir WD a al, 1989;Mmdfon JE et a!, 1990; Teste E, 1993; Va/li VEO a al, 1993]. Aunque laetiologa exacta del linfoma y leucemia linfoide canina es an desconocida, sehan hecho numerosas hiptesisde sus distintas posibilidades: infecciosas (sobre todo vricas), ambientales (carcingenos y co-carcingenos:herbicidas en linfomas [CotranR et aL 1990; Teske E et aL 1993]), deficiencias en el sistema mmune,genticas, etc.... Parece que los retrovirus estn implicados en el desarrollo de linfoma/leucemia en numerosasespecies como peces, serpientes, aves, roedores, gatos, vacas, primates y humanos. Diversos estudiosmuestran con ME partculas retrovricas y niveles superiores a los normales de transeriptasa inversa encultivos celulares de estos linfomas, hallazgos que podran relacionarse con una posible etiologa vrica,aunque no de forma concluyente [1-Jardyir 7/1) et aL 1989; Teske E, 1993], ya que parecen haberseencontrado tambin en tejido linfoide de animales sanos.

E 2) PRESENTACIN EN OTRAS ESPECIES; LINFOMA/LEUCEML4 EN GATO.

La presentacin del linfoma en otras especies es, en unos casos espontanea, y en otros inducida por virus.Vamos a centrar el inters en la especie felina, la cual, junto a la humanaha sido tomada como elementocomparativo, para as intentar encontrar semejanzas morfolgicas, clnicas o cinticas, con respecto a tumoreslinfoides caninos [Hardyir WD eta), 1989; Couto GC eta), 1995].

En el gato la etiologa del linfoma/leucemia viene dada por la infeccin persistente, e incluso latente, delvirus de la Leucemia Felina (EeLV), perteneciente a la familia Retroviridae, que se caracterizapor tener lacapacidad de copiar su cadena simple de ARN a una doble de ADN gracias a la accin de una enzimaconocida como rranscriptasa inversa. La copia de ADN vrico se integra dentro del genoma de la clulainfectada. Hay dos subfamilias con trascendencia clnica,los oncovirus y los lentivirus. La subfamilia deoncovirus incluye virus inductoresde leucemiasy sarcomas en diversas especies como aves, mridos, flidos

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Intrtduccin

(FeLVy FeSV), primates y hombre, y tambin carcinomas en mridos y primates. Los lentivirus englobandistintas acciones: ananiognica (quidos), nairotrpica (virusVisna&Maedi en vidos) e inmunosupresora,de gran importancia actual porel sndrome de inmunodeficencra adquirida (SIDA) por el virus H1V humano[Cui LX et al, 1995], con su homnimo en flidos, primates y bvidos. El cuadro de inmunodeficrenciaadquirida sepresenta en gatos asociado a la infeccin por dos retrovirus, aislados o combinados: el oncovirusFeLVy el lentivirus flV.

NOCIONES GENERALES DEL VIRUS FeL V

* VIROLOGIA DEL FeLV: Existen dos grupos de formas vricas: las formas endgenas y exgenas.Las secuencias endgenas se transmiten genticamente y no tienen ciclo de replicacin en el hospedador,pero se pueden combinar con la forma ms comn del virus (FeLVA) para dar las otras variantes (B,C).Estn presentes en el genoma d.c todos los individuos. Las formas infectivas exgenas del virusprobablemente se formaron por infeccin cruzada de un retrovirus de rata con un ancestro del gato domstico,como ya se ha demostrado en medicinahumana. Hay tres formas principales de virus FeLV, identificadas porla proteina gp7O de la envuelta. Se forman por recombinacin de la forma A con las secuencias endgenasrelacionadas, El virus, en s mismo, no tiene un oncogen transformadorconocido. El genoma est formadopor tres grupos de genes que transcriben las protenas estructurales, Iranscriptasa inversa y envuelta,respectivamente /1-Jardyir 7/1) etal, 989; Moulton JE etal, 1990; Buracco 1> etaL 1992; Teste E, 1993;Va/Ii VEO eta?, 1993; Cal/unanJier aL 1996].

* CICLO BIOLGICO: Las formas de exposicin, y tipos de infeccin se detallan en el siguienteesquema [Hardyir 7/1) et al, 1989]:

VIRUS F.LV

Fones de apoaioiMraalivu, Ihgtn aln nasal

EXPOSICIN DEL CATO -Multwlioacin en linfocito.dcl ganglio regional

GATO INMUNIZADO INFECCIONACNV,ACFQCMA en .anglt

PERSISTENTE LATENTE

.Extansina MOy ganglio.. ?to,in,a;,mdt~lincin ncluis LINFOMAFLV .2nucleadas d. la amialinfoide. anieblas ytolde.

aalh~ aacno, nasal EXTENSION GENERALIZADA - tu~ ledasTRMSMISION HORIZONTAL TRANSMISION VERTICAl.

Para la deteccin de Acen sangre se utilizan dos mtodos: la IFI (inmunofluorescencia indirecta)y la

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Introduccin

ELISA (enzimelinked immunosorbcnt assay). La ff1 indica positividad (infecciosidad) en un 97% de loscasos, y la ELISA produce un 30-50% de falsos positivos, ya que no tienen el virus en plasma ni en saliva,por lo que no se transmite.

* RESPUESTA INMUNE AL FeLV: Para una correcta valoracin de la respuesta inmune delhospedador frente a la infeccin por FeLV, hay que teneren cuenta los ttulos del anticuerpo neutralizadordel virus y del antgeno FOCMA.

a An&wapofrenteal antgeno FOCMA (Felineoncornavirus ce]] membrane antigen / Antgeno enmembrana celular del onconiavirus felino): Se aisl de la superficie de clulas del linfoma B y T (FeLV+/-),leucemia linfoide, nneloide y entrode, y tambin en la superficie de las clulas del fibrosarcoma inducido porFeSV (Feme Sarcoma virus). No seencontr en los linfocitos normales ni incluso en los infectados por FeLVA/B. Se supuso que dicho Ag se podra considerarcomo un Ag especifico tumoral inducido porel FeLV 1FeSV. Serolgicamente era distinto, aunque relacionado, a la glicoproteina gp7O de la envoltura del virus.Pareca que altos ttulos de Ac frente al FOCMA produca resistencia frenteal desarrollo de tumor FeLV- oFcSV-inducido, pero no frente a las infecciones virus-dependientes y enfennedades no neoplsicas. Hoy endia tambin sehan aisladoen tejidos del animal mfectado (de forma activa o latente) en tejidos no tumorales[Hardyir 7/1) etal, 1989; Mou/on JE e: al, 1990; ValIl VEO e: al, 1993].

it Anticuerpo neutralizador del virus (VNntihody): corresponde al Ac contra la glicoproteina viralgp7O. Ttulos altos generan resistencia al efecto inmunosupresor y, por tanto, a las infecciones secundarias,pero no frente al desarrollo de tumor virus-inducido.

* ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR EL FeLV: En la siguiente tabla sc detallan las posibles

enfermedades producidas por el FeLV, tanto prohferativas como degenerativas y los rganos que msfrecuente implica.

a. Mecanismo de induccin tunsoral del FeL 4 No es del todo conocido; estudios molecularesmuestran que los FeLV aislados del tumor contienen genes celulares progenitores c-myc (proto-oncogen)transducidos o transformados a Y-mr (con secuencias de codificacin para el gen celular). Ya que e]retrovirus en s tiene una transformacin lenta y que carece de oncogen propio para una tumorognesis, lacapacidad de adquirir oncogenes celulares adquiere gran importancia para la posible tranformacin malignasin que necesariamente produzca inmunosupresin, asimismo ocurre con el lugar de insercin en el ADNcelular, activacin de genes vecinos y tipo de secuencias (p.c. altamente repetitivas, regionesconstantes, quese expresen en gran medida,.. etc). Dicho proceso se ha verificado en el caso de linfomas B tipo Burkitthumano EBV relacionado y plasmocitomas de ratn; en el caso de linfomas B humanos se conocen lastraslocaciones que envuelven al cromosoma 8 donde se localiza el c-myc y los que contienen los genes paralas cadenaspesadas y ligeras lambda y kappa de las inmunoglobulinas (14, 2 y 22 respectivamente). El c-myc

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Introduccin

se sita en la banda q24 del cromosoma 8; la protena codificada (myc protein) tiene una funcindesconocida; se ha visto que aumenta en clulas en estado quiescente por estimulacin con factores deaccnmento, aunque permanece constante en divisin celular. La induccin turnoral se produce con variosmecanismos, como la transduccin del c-myc a un cus no funcional de la cadena pesada de las Ig. Otraexplicacin sera por la accin de la protena myc, nunca alterada en las traslocaciones y encontrada a altosmveles en los linfomas tipo Burkitt, y que es capaz de estimular a las clulas en estado quiescente; otrosupuesto es la proximidad del c-myc a los genes de las Ig: as podran influenciarse de los puntos de roturade la traslocacin, la orientacin de los genes, uso de los promotores de las Ig para el c-myc,... etc. Laexplicacin ms plausible de la implicacin constante de los genes de las Ig con el c-myc en la induccintumoral es que dichos genes son muy activos a nivel transcripcional, y las traslocaciones ocurren muyfrecuentemente en los mecanismos de recombinacin para la reconstruccin de los genes de las Ig[HopkinsN~ 1988; Hardy ir WD et al, 1989; Mange AP et al, 1990; Mou/ton iR et al, 1990; Va/li VEO a al,1993].

El virus de la Leucemia T humano HTLV 1 es tambin un oncovinis, pero tiene un mecanismo demduccin tumoral totalmente distinto; no se integra en zonas concretas del ADN ni cerca de proto-oncogenes,sino pormedio de un gen transformador conocidocomo 0

Introduccin

inmunosupresin; in vito las protenasde la envuelta como la piSE disminuyen la transformacin blsticae mtaten en la produccin de 1L2, con consiguiente supresin de las clulas T helper. Hardy JrWD et al,1989]

Aunque el mecanismo expuesto se ha demostrado slo en gatos, nos ha parecido interesante insistir ensu dinmicaya que las especiescanina y felina estn ntimamente relacionadas, a pesar de que como ya se hacomentado, no est demostrado a nivel canino.

F.3) CLASIFICACIN CLNICO-ANATMICA ENANIMALES DOMSTICOS.

* Multicntrico* Alimentaria* Tmico o mediastiruco* leucemia verdadera (mdula sea-sangre slamente)* Solitario (Cutneo, renal, SNC-SNP, ocular,...)

Orden segn frecuencia de aparicin:PERRO: multicntrico, Alimentario, Timico y extranodal (cutneoGATO: tmico, alimentario, multicntrico, forma leucmica y resto de presentaciones extranodales : ocular,del tracto respiratorio superior, renal, cutnea, SNC y SNP,. . etc [Cauto CG a al, 1989; Hardy ir *7) aal, 1989; Moukon iRel al, 1990;Teske E, 1993; Va/li VEO e: al, 1993; Couto CGel al, 1995].

E 4) ESTADIOS CLNICOSEN MJ4MFERO&

ESTADIAJE EN VETERINARIA:1: Afectacin de un ganglio, o tejido linfoide de un rgano, sin incluir la mdula sea.II: Afectacin de varios ganglios dentro de un rea regional (con/sin afectacin amigdalar).III: Mectacin generalizada de ganglios linfticos.IV: Afectacin de hgadoy/o bazo (con/sin estadio III).V: Extensin a sangre y mdula sea (con/sin los estadios 1-1V).

Y cada estadio se divide a su vez en: A) sin sntomas sistmicos, B) con sntomas sistmicos [Hardyir VI) et aL 1989; Maulton JI? et al, 1990; Teske E, 1993; ValIl VEO et al, 1993; Cauto CG ej aL 1995].

ESTADIAJE EN MEDICINA: (Clasificacin de Ann Arbor)1: Enfermedad limitada a una nica regin ganglionar o una localizacinextralinftica (E).II: Enfermedad que afecta a dos o ms regiones ganglionares a un lado del diafragma o con afectacin limitadade un rgano o tejido extralinftico adyacente.

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Intmduooin

III: Enfermedad que afecta a regiones ganglionares a ambos lados del diaagina (110, lo que puede incluirafectacin del bazo (lll~) o afectacin limitada de un tejido u rgano linftico adyacente (ffl~).IV: Enfermedad diseminada, que afecta a uno o ms rganos exlralinfticos, con o sin afectacin linftica[CarbonePP et al, 1971; PetoR gr al, 1977; Fis/ter RL 1981; DIaz Rubio Eet al, 1991; GonzlezBaronAL 1992; Espaa P, 1993; Sauham RL et al, 1993].

ES) HISTORL4 CLNICA YDL4GNSTICO

Para el diagnstico correcto de esta neoplasia y su fbrma de presentacin, se valora la exploracin fisica,la citologa por puncin aspiracin con aguja fina (PAAF) [CarterRFet al, 1988; DelverderM etal, 1988;Hawkins EGet aL 1993; flsherD.Jet aL 1995; CannianiMer al, 1996], la analtica sangunea, radiografla,ecografla abdominal y en ltimo caso la biopsia.

Las formas muticdJdrica, alimentaria y mediastin ca del linfoma son las ms frecuentes, suponiendocl 90% de todas las presentaciones [DobsonJMet al, 1993]. Las fonnas cutnea, epiduraly renal son pocofrecuentes en ambas especies, constituyendo un 10%de todas las formas de presentacin. En su totalidad laslocalizaciones extranodales que aparecen en perro y gato son: cutnea, renal, ocular, del tracto respiratoriosuperior, del sistema nervioso central y perifrico -linfoma epidural- [Spodnic/c0.1 a al, 992], o decualquier rgano o tejido del organismo.

En la exploracin fsica, e! animal con la forma mulucntrica del linfoma presenta infadenopatasuperficial generalizada de todos los ganglios palpables (submandibular, cervical, preescapular, axilar,inguinal y poplteo, y ms excepcionalmente del facial, retrofarngeo e ilaco) con extensin frecuente aamgdalas incluidas las palatinas. Al tacto los ganglios son duros e indoloros, con un aumento de 5 a 10 vecessu tamao original, con temperatura normal (linfadenopata fra)y frecuentemente se presentan adheridosa planos profundos. La linfadenopatia generalizada puede asociarse a otros sntomas como apata, cansancio,anorexia, prdida de peso y actividad fisicaEn la necropsiade un linfoma multicntrico se observa que losganglios mesentricos, sublumbares y frecuentemente el bazo suelen tener las mismas caractersticas, aunquesu afectacin depende del estadio clnico de linfoma en el que sea diagnosticado. Es frecuente que el animalacuda a consultaen un estadio filo IV, donde todos los ganglios internos, bazo e hgado estn afectados, oincluso en estadio y, con extensin a rganos vecinos, mdula sea y/o sangre [Dobson.JMet al, 1993;TeskeEet al, 994].

La forma alimentaria o digestiva suele presentar malabsorcin, obstruccin intestinal, vmitos, ydiarrea (en un 80%de los casos, incluso hemorrgica con sangre en heces). Los ganglios superficialesy el bazo pueden no estar involucrados. En estadios avanzados puede afectar todo el tacto digestivo,bazo, hgado, rin, corazn,amgdalas, pncreas y mdula sea. Hay descritas metstasis en piel, ojo,msculo esqueltico, SNC,... etc [CouroCGer al, 1989; HartiR eraL 1994].

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Introduccin

La forma timica o metastinica es poco frecuente en el perro pero ms habitual en gato; en su

extensin pueden afectarse los ganglios estemales y mediastnicos, la pleura adyacente y el pulmn.Presentan sntomas generales: abatimiento, anorexia y prdida de peso, as como respiratorios: tos,disnea o taquipnea. Muestran disminucin de la tolerancia al ejercicio, disfagia o regurgitacin ycompromiso cardio-circulatodo con cianosis, desplazamiento del sonido cardiaco dorso-caudal, liquidoserohemorrgico/hemorrgico, distintos grados de hidrotrax o quilotrax como resultado de lainfiltraciny ocupacin del espacio torcico porel crecimiento tumoral en la regin antero-superior delmediastino [ShimodaT, 1993].

En la forma curnea se diferencian dos grupos segn su localizacin topogrfica: dermorrpicos o

epidermotrpicos. Los primeros estn caracterizados por lesiones en piel a modo de placas queengloban la dermis papilar y en ocasiones la reticular, con inclusiones focales en la epidermis paraformar los abscesos de Pautrier caractersticos de la micosis fungoides (MF) descrita en patologahumana. Los linfomas con epidermotropismo causan un marcado adelgazamiento de la capaepidrmicacon infiltracin difusa de la capa crnea como en la enfermedad de Woringer Polopp en medicinahumana/Rivas C, 1980;BurgGetaL 1983;Lever WF 1990;NortonA etal, 1994]. El cuadro clnicovara dependiendo del estadio y del animal. Generalmente se presenta como eritrodennia generalizada,dennatitis exfoliativa, placas drmicas o ndulos, y lceras mucocutineas confluentes que pueden darseen cualquier fase de la enfermedad [BakeriLet aL 1989; Moore PFet al, 1994; Couto CG et al, 1995;DayMj 1995; French RA eral, 1996].

La forma epidural se presenta con parlisis del tercio posterior (sndrome de neurona motorasupenor,...etc) por infiltracin de mdula espinal o espacioepidural [TurnerJL et al, 1989; SpodniclcGieraL 1992].

La forma solitaha renal puede darse en ambas especies aunque con mayor incidencia en el gato.Presenta sntomas asociados a obstruccin urinaria renal y postrenal, insuficiencia renalaguda/crnica,.. .etc, ya que suele crecer de forma difusa sin respetar la fisiologa del parnquima[Moulton JI? etal, 1990].

La analtica sangunea que comprenda frmulas leucocitaria y eritrocitaria, perfil bioqumico, enzimashepticas y renales, as como un aspirado de mdula sea, puede presentar una gran gama de alteracioneshematolgicas. La leucocirosis es un signo de aparicin relativamente constante, a veces como neurrofihiahacia la izquierda por un incremento de neutrfilos circulantes, o como linfocitosis, debida a una leucemialinfocitica sin masa tumoral reconocible (representa menos del 10%de los linfomas en el peno); en estadiosavanzadospuede observaituna poblacin linfoide inmadura en sangre en peno, en gatos tambin se da dichaforma leucmica en un 12% de los casos. Tambin es posible encontrar una marcada linfopenia en un 50%de los linfomas felinos. La anemia es el signo ms comn dentro del sndrome paraneoplsico asociado a

19

Introduccin

procesos lmfoprohferabvos. Suele ser no regenerativa, normocrmica y normoctica en perro yiam&maeroctica en gato; en la fonna digestiva es fcil hallarlapor ulceracin de lamucosa digestiva, y aveces con neutrofilia; se acompaa de trombocitopenia en casos de reemplazo de la mdula sea porinfiltracin tumoral, e incluso pancitopenia. La anemia autoinmune se da en casos de infecciones porretrovirus en gatos o en neoplasias primarias de mdula sea en ambas especies. La patogenia de lahipercalcemia (20%; paco frecuente en gatos) es confusa porque no presenta hiperpasia de la paratiroides,ni hipervitaminosis D ni ruptura sea por metstasis seas; puede deberse a la produccin endgena de unapseudohormona paratiroidea (parathonnona ectpica) con accin hipercalcerniante; se asocia a las formasmediastnica y multicntrica, y con mayor frecuencia a linfomas de estirpe T. La nefropata por hipercalcemiacon posterior insuficiencia renal es un cuadro muy frecuente en los gatos con linfoma, que produce, entreotros, sintonias como polidipsia y poliuria. La hiperglobulinemia monoclonal ocurre en penos con leucemialinftica crnica y ocasionalmente en perros con linfoma. La policlonal tambin puede darse en linfomas[CornoCG, 1985; Teske E et al, 1990; Dobson iMel al, 1993; Furie WS, 1993; Teske E, 1993; Teske E,994; TesAr Ee aL 994; Cotila CG eta!, 1995].

Las pruebas diagnsticas de mtina bajo la sospecha de un linfoma son la radiografia, sobre todo latorcica latero-lateral, para evaluar posible compromiso mediastnico o pulmonar adems de posiblesdesplazamientos del esfago, trquea o corazn; la ecografia abdominal, para el estudio del tracto digestivo,ganglios mesentricos, periportales, etc.., cualquier rgano con ecogenicidad anormal en e] que pueda estarmetastatizando el linfoma. La citologia suele ser la forma ms fiable para un diagnstico definitivo delinfoma, caracterizndose en la mayora de los casos por un infiltrado monomorfo de clulas linfoidesinmaduras de tamao superior al linfocito maduro, con la cromatina ms laxa, y uno o varios nucleolosevidentes. La biopsia de ganglio se utiliza cuando la citologa ha sido poco conclusiva, y para realizar eldiagnstico histolgico exacto, base necesaria para aplicar un posible tratamiento quiniioterpico [I-JardyirWD et al, 1989; TesAr E, 1994; Couto CG elal, 1995].

E 6) TRATAMIENTO. QUIMIOTERPL4

La quimioterapia (QT) ha sido el principal mtodo de tratamiento del cncer en los ltimas cincuentaaos. Ms dc cincuenta agentes (incluidas las hormonas) tienen gran utilidad en medicina humana, pero elnmero utilizado en la prctica veterinaria es mucho menor [CrowSE, 1982; Hardy ir WC> et al, 1989;Espaza P, 1993; TesAre E, 1993; Rosenha) RC eta!, 1995].

La ciruga es el tratanilento de eleccinpara muchos tumores slidos y en alguna ocasin la radioterapiaes efectivapara neoplasias localizadas, pero en ningn caso pueden aplicarse en enfermedades generalizadaso con metstasis.

20

Introduccin

La finalidad de la QTes curar al paciente, pero la obtencin de una cura real en medicinaveterinaria esmuy dudosaEl Tumor Venreo Transmisible (TVT) parece ser la excepcin a esta afirmacinpor obtenerseuna curacin total con distintas drogas ant-cncer [Rosenthai RC, 1995]. En medicinaVeterinaria la QT seaplica para obtener otros beneficios como elcontrol de enfermedades generalizadas imposibles de operar oradiaraumentando el periodo librede enfermedad, prevencin de la progresin de una neoplasia tratando deevitar las metstasis tempranas, y produce una mejora sintomtica del paciente que presenta un sndromeparaneoplsicoaadido.

Los farmacos anti-cncer sesuelen utilizarcombinados, ya que cada uno produce la destruccin de unafraccin constante de las clulas tumorales que es independiente a la destruida por otro frmaco, as secombinan las drogas para que acten en las distintas fases del ciclo celular. Con ello tambin se intenta evitarla aparicin por mutacin, de cepas resistentes a los frmacos antitumorales (resistencia rumorao. Estefenmeno se desarrolla por vanas razones, entre otras se cree debido a la desactivacin de las clulastumorales, impermeabilidad de las mismas a los frmacos, as como aparicin de rutas alternativas demetabolismo y reparacin celular.

A la horade disear un protocolo de quimioterapia hay que aplicar los siguientes principios bsicos enla utilizacin de fnnacos: que sean efectivos en solitario, con distintos mecanismos de accin, con diferentetoxicidad y con protocolo de tratamiento intermitente.

Previamente a la aplicacin del tratamiento quimioterpico,hay que valorar una serie de factores como:

1. Historia clnica y exploracin fisica detallada.2. Diagnstico histolgico de malignidad.3. Seleccin de drogas efectivas frente al tumor y conocimiento de su mecanismo de accin (factorescomo concentracin necesaria, ruta de administracin, biotransformacin, interacciones, resistencias ytoxicidades, as como su eliminacin).4. Anlisis de efectos adversos; toxicidad; dosis en las especies canina y felina.5. Entendimiento y cooperacin del dueo.

Para obtener el xito teraputico hay que hacer entender al dueo que la curacin (RC) no es la finalidaddel tratamiento, sino inducir remisiones prolongadas, parciales (Rl) o totales, que conlleven la menortoxicidad posible, intentando conservar la calidad de vida del paciente oncolgico. Esta calidad de vida, msque la cantidad, se convierte en la consideracin primordial en la prctica veterinaria a la hora de aplicar laQT como mtodo realista de tratamiento contra el cncer [CoutoCG, 985; Hardyir WD eta!, 989; CoutoCG etal, 1995].

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Introduccin

Laestrategia quiniioterpicase divide en cuatro fasesprincipales:

1. Induccin a la remisin,2. Intensificacin,3. Mantenimiento,4. Reinduccin de la remisin o rescate.

En la induccin seutiliza una terapia intensiva porcombinacin de drogas encaminadas a conseguir unaremisin completa (RC) reducindo de froma significativa la masa tumoral. Es un tratamiento fuerte yfrecuente comparado con el impuesto en el peado de mantenimiento. Si no se produce la RC, el animal sesomete a la terapia de intensificacin. En medicina veterinaria se utilizan distintos protocolos para lainduccin en los linfomas, como las terapias COl> (ciclofosfamida PO, vincristina IV y prednisona PO),COAI> (ciclofosfamida PO, vincristina IV, citosina arabinsido IV/SQ y prednisana PO), CHO?(ciclofosfamida PO, adriamicina IV, vincristina IVy prednisona o basados en PEG-L-Asparaginasa/L-Asparaginasa en el perro, y COAP, CHOPo DOMAC (dexametasona PO, vincristina IV, mitoxantronaIV, citosina arabinsido PO y ciclofosfamida PO) en el gato [Cauto CG, 1985; I-Iardy ir WD etal, 1989;McEwen EG, 1990; Teske Eet al, 1990; TesAre E, 1994; TesAre Eetal, 1994; Cauto CG et al, 1995].

La intensificacin se aplica cuando no se obtiene una RC en el peado anterior; es un tratamientoagresivo continuado normalmente a base de L-asparaginasa SQ y Doxonubicina, siempre bajo control detoxicidades paralelas -frmacos no mielotxicos o que ataquen a una fase celulardistinta- [Hardyir WC> etal, 1989; Cauto CG et al, 1995].

La fase de mantenimiento se aplica cuando se ha alcanzado la RC y se basa en un protocolo deagresividad moderada, como el LMP (clorambucil, metotrexate y prednisona; oral y ms cmodo) o elCOAP, ambos para penos y gatos.

En el caso de que la enfennedad se reproduzca de forma progresiva (recidiva), se empieza la siguientefase de la QT,la reinduccin de la remisin o rescate, donde se aplican las mismas drogas utilizadas parala induccin si hubo RC (o combinaciones con doxormbicina o adriamicina) aunque es mucho ms fcilmentener la primera remisin que producir la segunda. Si la RC no se alcanza, debe seguir el mismotratamiento hasta que no haya una evidencia clara de la progresin tumoral. En el perro normalmente seutilizan los protocolos ADIC y O-MAC. ambos efectivos pero con mayor toxicidadque el COAP [HardyirWC> er aL 1989; Teskeket al, 1990; Teske E, 1994; TeskeEet al, 1994; Cauto CG et al, 1995; RosenthalRCetal, 1995].

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Introduccin

G) TCNICAS ESPECIALES DE ESTUDIO

Uno de los objetivos principales de esta tesis es el conocimiento de la cintica y del ciclo celular de loslinfomas caninas para comprender su comportamiento biolgico y, por tanto, clnico rresfr E et al, 1993;Teske E 1994]. La agresividad podr condicionar la terapia administrada as como orientar al pronstico dela enfermedad [Garca R et al, 1989; Marcos B etal, 1993; Garca R et al, 1994; Obeso Oet al, 1994;Marcos Bet aL 1997]. As pues se utiliza la proliferacintunioral y la citometria.

Laproliferacin de un tumor se expresa por el tanto por ciento de clulas que se considera que estndividindose o bien estn prximas a ello (Gb, G~, M); dicho porcentaje seobtiene gracias a los marcadoresproliferativos PC 10 y MIB 1, ciclinas nucleares que seexpresan en todas las fases del ciclo celular a excepcinde (JO (fase de reposo). La cuantificacin del rea nuclear positiva a estos marcadores se realiza con elprograma proliferation ndex del analizadorde imagen CAS-200 sobre la preparacin, con ello se pretendereducirel tiempo empleado y el posible error de medida a mano, ya que el nmero total de campos estudiados(10campos analizadaspor cada preparacin) hace la labor antlua y densa; adems ofrece la expresin de losresultados estadsticos de forma automtica.

El estudio citomtrico informa sobre el contenido de AUN de una muestra problema. Es sabido que lasclulas diploides en fase 0~G~ poseen una cantidad de AUN que va aumentando a medida que la clulaprogresa hacia la fase S, hasta que llega a la 02-vM. En esta ltima fase, la clula tiene el doble de cantidadde ADN que en la fase 01. Atendiendo a los distintos contenidos de AUN,el citmetro permite identificar laproporcin de clulas en cada fase del ciclo celular, as como la ploidia.

El uso prctico de la citometra se basa en tres principios bsicos: 1) que las clulas tienen distintascantidades de AUN en cada estadio del ciclo celular; 2) la disponibilidad de tcnicas en las que se utilizanreactivos que se unen estequiomtricamente con al ADN; 3) la gran mayora dc clulas normales son diploides[Lee Setal, 1994].

Actualmente, la citometria (de flujo y esttica) de tumores slidos puede efectuarse sobre clulasrecuperadas del material parafinado [Hedley0W et al, 1985] adems del tejido fresco convencional conprcticamente el mismo resultado, lo que supone una gran ventaja a la hora de utilizar material retrospectivo[VanenKA, eta!, 1989; C!audRDetat 1989; Bauer TWera 990;Alanen 4 eta!, 1993; Rowman RelaL 1993; Bray!an RC, 1993; BclngA eL aL 1995; BoudryR eL aL 1997j.

La citometria deflujo se basa en una suspensin celular donde los ncleos son teidos con loduro depropidio, fluorocromo que se une a los pares de bases del AUN. Al pasarlo al citmetro, un haz de luz lserexcita la fluorescenciade los ncleos teidos, donde la intensidad de la fluorescencia emitida es directamenteproporcional al contenido de ADN, que es recogida y medida por un ordenador. Los resultados seexpresan

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Intmduocin

ccxx curvas que equivalen al porcentajede clulas con contenidos de AUN diferentes [FriersonMF 1988 y1991].

En la citonuesria esttica se parte de extensiones celulares o improntas, cuyos ncleos se marean en latincin de Feulgen, donde el cido clorbidrico hidroliza las bandas nbosa-purina dando residuos azcar-aldehdo; El reactivo de Schiff (colorante azul) reacciona con dicho residuo, dando un precipitado de colorazul (Mure A) que es reconocido por el analizador de imagen CAS-200 (programa de ploidia QUNA -quantitative DNA analysis-). Los resultados son expresados con curvas semejantes a las de citometria deflujo, nubesde punto5~..ete Mascas el aL 19971

En ambas citometras los valores estn referidos a los de ganglio controlde perro y de gato procesadosal mismo tiempo, ya que ambos programas estn diseados peara linfocitos humanos, y se ha tratado demminuzar al maximo el posible error /Marcos B et al, 1993; Marcos B etal, 997; Sanz C et al, 1998].

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III.- MATERIAL Y MTODOS

Material y Mtodos

A..- CASUSTICA

El material utilizado procede del archivo del servicio de Anatoma Patolgica e Histologa deldepartamento de Patologa Animal IIde la Facultad de Veterinariade la Universidad Complutense de Madrid;asimismo tambin secuenta con biopsias llegadas al departamento de Anatoma Patolgica de la FundacinJimnez Dez de Madrid (Universidad Autnoma de Madrid).

Partimos de 30 linfomas caninos (Tabla IV), de los cuales 4 son slo biopsias, y 26 son necropsiasseriadas, del periodo 1995-1997. Los casos en que se ha podido realizar necropsia proceden de dos fuentesdistintas: 19 casos del servicio de Patologa Mdica (Patologa Animal II) de la facultad de Veterinaria deMadrid, y los 7 restantesde centros privados (los cuales cuentan con una historia clnica reducida). Todas lasnecropsias se realizan en el servicio de Anatoma Patolgica del dpto. de Patologa Animal 11 de la Facultadde Veterinaria de Madrid. En ellas se recoge tejido linfoide y tejido hamatopytico,y distintos rganos enfuncin de la afectacin porel linfoma. Posterionnente sefijan en formaldehido tamponado al 10% e incluyenen bloques de parafma.

Para el estudio proliferativo y comprobacin de su fiabilidad, serecogen adems 15 biopsias ya incluidasen parafma, pertenecientes al periodo 89-94.

Ue la historia clnica se recoge la informacin posible sobre distintos factores relativos al animal o a lapropia enfermedad, como edad, sexo, sintomatologa (asociada o no al linfoma), tumores secundarios, estadioclnico, analtica sangunea bsica,posibilidad de tratamiento, con tipo de respuestay supervivencia.

Como controles se utilizan 8 linfomas felinos para verificar analogas o diferencias con las contrapartidascaninas. Se utilizan 7 ganglios control de perro y 3 de gato para consideracin morfolgica, pticaemmunohistoqumica.

B.- MORFOLOGIA PTICA

EJ estudio morfolgico de rutina serealiz tras la inclusin del tejido en paraflna y en secciones de cuatromicras teidas con tcnicas de: Hematoxilina Eosina (HE) convencional y Qienisa modificado (Lennert K,1978).

TINCINDE GIEMSJ4 MODIFICADO (LENNER2)Reactivos:1. Solucin Giemsa: 80% agua destilada, 20% Oiemsa puro (Merk,Alemania, ref. 9204)2. 100 ml H20 destilada con 5 6 gotas de cido actico glacial.3. Alcohol Isoproplico.

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Material y Mtodos

Procedindento:1. Desparafinar los corteshistolgicos (pasndolos porxilol, alcohol al 100% - 96% - 70% sucesivamente)

e hidratarlos en agua destilada.2. SesumergmenlasolueindeGiansaduranteunahora(laduracintieneunrangovariableentre20min.

y 1 h. en modificaciones posteriores).3. Se sacan los cortes de la solucinde Giemsa para pasar al H20 destilada acetilada, agitando unos 2 3

segundos para su diferenciacin (se debe controlar muy bien este paso).4. Se pasan inmediatamente por alcohol de 960, dejndolos hastaobtener el color deseado (controlar con

microscopio ptico).5. El proceso de diferenciacin se para sumergindo 3 veces (2 mm. cada vez) los cortes en alcohol

isoproplico.6. Se pasan por xilol tres veces (2 mm. cada vez)7. Se montan en Eukitt.

C.- MICROSCOPIA ELECTRNICA

Todos cortes electrnicos estudiados han sido seleccionados sobre secciones pticas de control de unamicra dc grosor, teidas con Giemsa.

Material y Reactivos:1. Gelatine capsules. (size l/6.Smm dianxetro/0.5m1). Cod. C089. TAAB.2. Acetona.3. Vestopal-W resin. Cod. VOOS. TAAB.

Solucin de trabajo:Solucin madre de Vestopal:Vestopal-W 10 ceIniciador alceActivador 0.2 ceMezclar el Vestopal-W con el iniciador, agitar con una varilia de vidrio antes de aadir el activador.

4. Iniciador del V-W: Tert-butyl perbenzoate. Cod. 8035. TAAB.5. Activador del V-W: Cobalt napthenate (6% cobalt). Cod. C031. TAAB.6. Rejillas: (specinien grids-PKT/100). Ccxi. 4629A-4. LKB.7. Tetrxido de osmio. Cod. 24505. Merck.8. BuiferCacodilato:

Cacodilato sdico 85.6 grAgua destilada 400 ceSolucin de trabajo:Dela solucin anterior se toman 400 ce, en 1.600 cc de agua destilada. pH 7.3.

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Materialy Mtodos

9.

Material y Mtodos

Contraste:16. Tincin con acetato de urmnilo: depositar en los los discos Pefr, con ayuda de una pipeta Pasteur,

tantas gotas de la solucin de acetato de uranio como rejillas deseenconirastarse.17. Situar una rejilla sobrecada gota.18. Cubrir el disco Petri y esperar 20 minutos.19. Transcurrido este tiempo tomar las rejillas. Lavar 3 veces en agua destilada y secar en secar en papelde

filtro.20. Tincin con citrato de plomo: depositar sobre el disco de Petri tantas gotas de la solucin de citrato de

plomo como rejillas deseen contrastarse. (Es conveniente que el disco de Petri que se use contenga en suinterior algunas lentejas de NaOH y haya estado cerrado desde algunos minutos antes, para reducir elnivel de CO2, que puede interferir en el proceso de tincin formando precipitados de carbonato deplomo).

21. Colocar las rejillas por el lado que contienen las secciones sobre la gota del reactivo.22. Lavarlas tres veces con agua destilada. Secar en papel de filtro (en el interior de la placa de Petri).23. Observacin en M. Electrnico de transmisin Hitachi HU-12A.24. Se fotografian las zonas demostrativas.

Se han estudiado 15 casos de CBCC, 2 de CB y 12 de LMF.

D.- INMUNOHISTOQIJMICA

El estudio inmunobistoquimico Lerealizado en todos los casos en tejido incluido en paraflna utilizandolos mtodos de Avidina-Biotina (ABC) y Estreptavidina-Biotina (STABC) segn la metdica explicada acontinuacin. Los anticuerpos utilizados, comerciales o experimentales, secitan en la Tabla V.

D. 1.- PROCEDIMIENTO IHQ MANUAL:

1.- Secciones deparafinay preparado de los cortesa. Cortar secciones de 4-6 micras de grosor y extenderlas en portaobjetos tratados con poli-L-lisina

(SIGMA, Cod. P-1274). Mantener en estufa a 600C durante una noche.b. Desparafinar e hidratar.c. Incubar 5 miii. en agua oxigenada al 3%.d. Lavar en agua.e. Se realiza Tratamiento con calor como mtodo recuperador antignico segn el AcMo. pnmario donde

sea necesano.

2.-Tratamientopor calorUtilizacin de calor como recuperador antigemco en:

a. Casos de material antiguo o con parafinas no adecuadas

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Material y Mtodos

b. Conlos anticuerpos dbiles para incrementar su positividad: MIB1,p53,...[Cattoretfl Ga al, 1992;Norton AJet al, 1994; Butier De:al, 1997]?

flpos:* Olla a presin.* Microondas.

Buifer empleado (en ambos):* Buifer citrato sdico pH 6 (citrato de t-sodio diliidrato C6H5Na3O7.2H20; Merk Cod.A763243).

Olla a presinColocar los cortes en costillas metlicas dejando dos espacios entre ellas para dejar fluir cmodamente el

buifer citrato entre ellas; se dejan en H20 destilada hasta que la olla a presin est preparada.La olla (capacidad: unos 2 litros) secoloca en un hornillo elctrico sin cenar hasta que entra en ebullicin,

entonces se introducen las costillas en el interior totalmente sumergidas en el buifer y se cierra la olla.La olla dispone de un sistema de control manual para sealar la correcta presin con la subida de una

vlvula. Una vez alcanzada dicha presin se cronometran 2 minutos (tiempo aproximado en alcanzar lasegunda vlvula de presin). Transcurrido el tiempo se debe pasar la olla al agua fria para bajar sutemperatura y presin y posterior apertura (no antes).

Una vez abierta la olla se pasan las cestillas al agua destilada lo ms rpido posible impidiendo que se

sequen las preparaciones; stas se pasan a buifer TRIS (T.B.S. Tris Saline Buifer Wash Concentrate;Lipsliaw/immunan. Cod. 484850; 30 ml/botella a diluir en 1 litro de >120 destilada; pFh7.2-7.8) y ya estnlistas para la tcnica de inmunohistoqurnuca.

Los anticuerpos que requieren la olla a presin como mtodo recuperador antignico de los aqu utilizados

son el MIEL, CD3, CD79a, 5100 (aunque tambin responde sin tratamiento) y J Chain. La mayoria seutilizaban antes con microondas, pero se obtiene mejor patrn de tincin sometindolos al calor por presinde la olla.

MicroondasEn este caso, las cestillas (de cristal o plstico) donde secolocan las preparaciones alternas, tienen que ir en

un contenedor de plstico rellenado con buifer Citrato Sdico pH 6 (el mismo buifer que para la olla apresin) que debe cubrir en exceso las mismas. El contenedor debe ir tapado para evitar en lo posible la salidadel buifer, aunque no hennticamente para que pueda salir el vapor.

Se utiliza un microondas de uso domstico con la mxima potencia, y el nmero de pulsos depender del

AcMo utilizado.Para los AcKAPPA y LAMBDA setrata de tres pulsos de 10, 10 y 5 minutos respectivamente. Se controla

entre cada paso para evitar la evaporacin del buifer con el consiguientesecado de las preparaciones.

3.-Incubacin con el anticuerpo primarioa. Anticuerpo monoclonal: incubar directamente el anticuerpo primario, a la dilucin ptima del mismo

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Material y Mtodos

en T.B.S., durante 40-60 ma dependiendo del AcMo que se trate.b. Ac poiclonal: si el anticuerpo primario es policlonal, incubar en Normal Swine Serian (NSS) 1:10(DAKO, X901) durante 10 minutos, para evitar inespecificaciones y fondo. Decantarlo sin lavar enT.B.S. e incubar el anticuerpo a su dilucin especifica durante 40-60 mm.

4.- Incubacin con el anticuerpo secundarioTipo de anticuerposecundario:

a. Si el Ac primario es monoclonal:Biotinylated affinity isolated rabbit imnumoglobulins TO MOUSE IMMUNOGLOBULINS. 1 ML. Cod.E354. Do. Solucin de trabajo: 1:250.b. Si el Acprimario es policlonal:Biotinylated alflnity isolated swine ininitmog]obulins TO RA?BBIT IMMUNOGLOBULINS. 1 ML. Cod.E353. Dako. Solucin de trabajo: 1:250.

Duracin: se incubanlas preparaciones de 40-60 minutos con posterior lavado en TES.

5.-incubacin con el anticuerpo terciao:Reactivos:

a. Tcnica de Avidina-Biotina (ABC); ABComplex/HRP (Dako. Code No. K355) que contiene:l.Reactivo a: Avidin lml. en 0,01 M Phosphate buifer, 0,15 M NaC, 15 mM NaN3, pH 7.2.2.Reactivob: Biotinylatedhorseradishperoxidase imlen 0,01 M Phosphatebuffer, 0,15 MNaCIpH 7,2,15 mM NaN3.3. Una botella para realizar la mezcla (1 xnixing / storage bottle).Solucin de trabajo: una gota de a + otra de b + SmI buifer TES.

b. Tcnica de Streptavidina-Biotina (STABC StreptABComplex/HRP (Do. Code No. K377) quecontiene:

iReactivo a: Streptavidun lml. en 0,01 M Phosphatcbuffer, 0,15 MNaCl, 15 niMNaN3, pH 7.2.2.Rcactivob. Biotinylatedhorseradishperoxidase Imlen 0,01 M Phosphatebuffer, 0,15 MNaClpH 7,2,15 mMNaN3.3. Una botella para realizarla mezcla (1 mixing storage bottle).Solucin de trabajo: una gota des + otra de b + 5 ml buifer T.B.S.

Tcnica:Los pasos previos son iguales en ambas tcnicas; enteeflos se deben hacer intensos lavados en buifer T.B.S.

de al menos 5 miii. de duracion.Se incuban las preparaciones con el anticuerpo terciario de 40-60 minutos y posteriormente se lavan en

lBS.

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Material y Mtodos

6-Reveladocon Diamino-Bendina (hABcontrastefinalCromgeno:

D.A.B. (3,3a-Diamino-benzidin-tetrahydroclorid) (25 gr). Cod. 32750. Fluka.Solucin de trabajo:

Buifer TRIS para D.A.B. pH 7.6:TRIS 0,2 molar 12 ccAcido clorhdrico 0,1 N 19 ccAguadestilada l9cc

Solucin de D.A.B.:a. D.A.B. 5 mgr +10 cc buifer D.A.B.b. Agua destilada 2,9 ce + 0,1 >1202.Mezclar y filtrar.

DAB comercial DAS TABLETS. (SIGMA FAST,D-4293):1 tableta de DAS +1 tableta de UREAH202 +5 ml H20 destilada

Tcnica:Las preparaciones se incuban en DAB durante 2 a 10 mm. (control con microscopio) y posteriormente selavanen TBS y se pasan al agua corriente para ser contrastadas con Hematoxilina de Carazzi. Se deshidratany montan en medio no acuoso (Eukitt).

Hematoxilina de Carazz:

Hematoxilina 2 grYodato potsico 0,4 grAlumbre potsico 100 grGlicerina 400 grAgua destilada 1.600 cc

D. 2.- PROCEDIMIENTOAUTOMTICO.

INMUNOTEIDOR: DAKO TECH.Mate~4 500/1000.Reactivos: DAKO Cbem-Mate~ Detection Kit. Code No. K 5001.

El funcionamiento del inmunoteifidor est basado en reacciones de capilaridad que hace ascender elreactivo dispuesto en bandejas especiales en cada paso del proceso, automatizado por un programainformtico, por preparaciones enfrentadas verticalmente creando una cmara virtual entre ellas. Asi sehomogeneizan las condiciones de manejo durante todo el procesado, y por consiguiente se igualan losresultados.

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Material yMtodos

El TECHMATE consta de 89 pasos automticos. El

Material y Mtodos

requerimientos durante toda lametdica que son mdispensables para una posterior valoracin:

La fijacin del material deber ser correcta y rpida, as sepreservar la integridad de los antgenos(Ag), la morfologa celular y tisular, se impide ladifusin de Ag de un compartimentocelular a extracelularlo que puede interknir en la reaccin Ag-Ac. Un fijadorde eleccin fue el formol preferentemente tamponadoen buifer a Ph 7,2. El proceso de fijacin sepuede alterarpor distintos factores; pH del fijador, temperatura,concentracin y tiempo de fijacin.

* Deben ser considerados los Tratamientos previos a las tcnicas de IHQ: como desparaflnacinyrehidratacin del tejido. En ocasiones, si el fijadorutilizado es del tipo aldehdo, se pueden formar enlaces conel Ag que se quiere detectar; por este motivo es preciso efectuar una digestin proteoltica (tripsina) enaquellos antgenos que lo requieran Otroproceso a efectuar es el bloqueo de enzimas endgenos (peroxidasaendgena o fosfatasa), debindose enmascarar/eliminar o inhibir la actividad enzimtica endgena quepresenta el tejido normal (sto se realiza con H202).

* Control de la propia tcnica de IHQ; tiempos de incubacin, lavados, revelado, evitando que enningn momento del proceso la preparacin se quede seca, incubando siempre en cmara hmeda atemperatura ambiente.

* De los anticuerpos monoclonales utilizados se considerarn: caractersticas, calidad, requerimientos,especificidad, concentracin y, dilucin ptima. Se deben tener en cuenta dos hechos: la tincin especficayel fondono-especfico que se debe evitar.

* Los reveladores o cronigenos como el DAS (2, 2 diaminobenzidmatetrahidroclorada) que produceun precipitado de color marrn, ha sido utilizado como sustrato de las tcnicas de avidina-biotina yestreptavidina-biotina.

Los controles, tanto positivos como negativos ensayados en paralelo con las muestras son exigidosconel ini de comprobarposibles reacciones inespecificas.

Lo ms complejo de las tcnicas de ll-IQ es la valoracin final (tincin especfica, inespecfica, intensidadde tincin, artefactos ...), aunque las premisas tcnicas y la experiencia suministra una informacinindispensable para interpretar los hallazgos en los LNH.

D. 4.- ANTICUERPOS UTILIZADOS EN INMUNOHISTO QUMICA

El listado completo de todos los Acutilizados en esta tesis sedetallan en la tabla V.

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Material y Mtodos

PROLIFERAClON: Descripcin detallada en seccinpro4/&racin.

MARCADORES LINFOIHSTIOCITARJOS:

1.- CD3, Pan T (Dako Rabbit Anti-Human T Cdl, Code No.A 452). Policlonal. Dilucin 1/50.ESPECIFICiDAD: Reaccionacon la porcin intracitoplasmtica del antgeno CD3 expresado en las clulasT. La protena consiste en una cadena de cinco polipptidos designados como gamma, delta, epsilon, zeta yetadc 16 a 2810. E antgeno CD3 se detecta en principio en los tiniocites tempranos, lo que representa unade las primeras seales de la estirpe linfoide. En timocitos corticales el antgeno est presente sobre todo comocomponente intracitoplsmico. Aparece en la superficie celular en el estadio de timocito medular. Las clulasde Purkinge del cerebelo parecen expresar tambin el antgeno CD3. Es el marcador ms especfico paraclulas T en material fijado y parafinado.REACl!VIDAD: Clulas T timicas y de tejidos linfoides perifricos. Reacciona con la mayora de los linfomasT, a excepcinde parte de los anaplsicos de alto grado.

2.- CD79a (DAKO clon HM57; CodeNo.M 7051). Monoclonal. Dilucin 1/50CARACTERISTICAS: Es un heterodimero fonnado por los polipptidos mbl y B29, asociadode anua nocovalente con el receptor de membrana de las Ig de las clulas E; es por tanto un complejo antignico demenbrana de las clidas B. Cuando el antgeno se une a este complejo se produce una transduccininlracitoplsmica acompaadade una fosforilizacinde distintos componentes. As pues el dmero mb- 11B29es a leaclula B lo que el CD3 es a la clula T.ESPECIFICIDAD: Es un antgeno temprano de la estirpe E y que persiste desde el estadio pre-B al de clulaplasmtica en el que aparece a nivel citoplasmatico. Apareceen humanos y en distintas especies de mamiferos.Marca leucemias E de clulas precursoras, linfomas B y algunos niielomas. Este anticuerpo es vlido en cortesde parafma y extensiones citolgicas, pero no para cultivo de tejidos [MilnerRl et al, 1996].

3.- S-100 (DAKO Code No. Z 311). Policlonal. Dilucin 1/400.CARACTERISTICAS: Sl0osehaaisladodel cerebro de iaca (segn el mtodo de BW Moare) con distintosbuffers que contienen 2.5 mM de EDTA y 0.1 mM de 2-Mercaptohetanol. Se realiza posterior purificacinporcroniatografla de afinidad, utilizando anticuerpos para contaminar las protenascerebrales. El antisueroseha purificado por absorcin con fase slida con plasma humano y suerobovino.ESPECIFICIDAD: El antisuero reacciona con la Sl 00 A y B bovina, y tiene una fuerte reaccin cmzada conla SiQO AyE humana. Tambin seha demostrado estareaccin cruzada con la ratay el canguro. El antisueroseha testado en varios tejidos incluidos en parafina y mostraron ser especficos de forma estricta a la 5100;tambin son positivas las clulas de Schwann del sistema nervioso perifrico, en piel los melanocitos,tumores melanocticos y las clulas de Langerhans. En ganglio linftico, l