limmunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica roberto caporale pistoia, 29 ottobre 2011
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L’immunofenotipo leucocitario: L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnosticautilità diagnostica
Roberto CaporaleRoberto Caporale
Pistoia, 29 ottobre 2011Pistoia, 29 ottobre 2011
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Bernard Shoor & Leonard Herzenberg at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers
1974 - Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow (FACS-1)
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Sistema FACSCanto IISistema FACSCanto II
BD Biosciences
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Microscopia CitometriaMicroscopia Citometria in fluorescenza in fluorescenza
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Citometria a Flusso (CFM)Citometria a Flusso (CFM)
La CFM consente l’analisi automatica di sospensioni
cellulari monodisperse, misurandone le caratteristiche
fisiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare
che interseca una sorgente di eccitazione
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FOCALIZZAZIONEFOCALIZZAZIONE IDRODINAMICAIDRODINAMICA
campionecampione
sheath fluidsheath fluid
LASERLASER
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Diffrazione:proporzionale alle dimensioni della cellula rilevata lungo l’asse della luce incidente 0°
Rifrazione & Riflessione:proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità rilevate a 90° rispetto la luce incidente.
Generazione dei segnali di “scatter”Generazione dei segnali di “scatter”
SSCSSC
FS
CF
SC
GRANULOCITIGRANULOCITI
MONOCITIMONOCITI
LINFOCITILINFOCITI
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La combinazione dei due tipi di segnali permette di ottenere un particolare diagramma
di dispersione denominato
CITOGRAMMA
nel quale si possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base
alle sole caratteristiche fisiche
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Sottopopolazioni leucocitarie in sangue perifericoSottopopolazioni leucocitarie in sangue periferico -Citogramma --Citogramma -
LINFOCITILINFOCITI
MONOCITI
LINFOCITI
MONOCITI
NEUTROFILI
LINFOCITI
MONOCITI
NEUTROFILI
EOSINOFILI
LINFOCITI
MONOCITI
NEUTROFILI
EOSINOFILI
BASOFILI
VOLUME VOLUME
CO
MP
LES
SIT
A’
CO
MP
LES
SIT
A’
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ImmunofenotipizzazioneImmunofenotipizzazione cellularecellulare- definizione -- definizione -
Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi monoclonali).
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PubblicazioniPubblicazioni
Crescita delle applicazioni diagnostiche in citometria a flusso
1st
123328 references (2010)
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• Esperienza dell’operatore
• Valutazione delle prestazioni e della stabilità della
strumentazione
• Controlli di qualità (IQC, VEQ, EQAS)
Requisiti per una buona Requisiti per una buona analisi citometricaanalisi citometrica
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Riproducibilità dei parametri di fluorescenzaRiproducibilità dei parametri di fluorescenza
Linfoma Follicolare - diagnosiLinfoma Follicolare - diagnosi
Linfoma Follicolare - MMRLinfoma Follicolare - MMR
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LiquidiLiquidi::
•Sangue periferico
•Aspirati Midollari
•Leucaferesi
•Liquor
•Liquidi cavitari
SolidiSolidi::
•Linfonodi
•Biopsie
•Agoaspirati
Materiali idonei per indagini in CFMMateriali idonei per indagini in CFM
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Regole per una corretta analisi citometrica Regole per una corretta analisi citometrica in onco-ematologiain onco-ematologia
• Quesito diagnostico (dialogo con i clinici)• Caratteristiche del campione da analizzare• Scelta di adeguate combinazioni di anticorpi monoclonali• Regolazione dello strumento e “compensazione” delle
fluorescenze• Strategie di “gating” per il riconoscimento delle popolazioni
cellulari da analizzare• Integrazione con i laboratori di morfologia, citogenetica e
biologia molecolare• Formulazione di una risposta adeguata e conclusiva
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Metodo di studio in citometria Metodo di studio in citometria
• Valutazione delle normali componenti cellulari del sangue midollare
• Valutazione dello stadio maturativo di tali componenti
• Dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali
• Eventuale dimostrazione della loro clonalità
• Evidenziazione di fenotipi peculiari allo scopo di identificare una determinata entità nosografica e/o utili per lasciare una traccia in corso di follow-up (MMR)
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Espressione del CD45 nei leucocitiEspressione del CD45 nei leucociti
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Sangue Periferico vs Sangue MidollareSangue Periferico vs Sangue Midollare
Sangueperiferico
Sanguemidollare
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Maturazione Mieloide: SIDE SCATTERMaturazione Mieloide: SIDE SCATTER
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MATURAZIONE MIELOIDE:MATURAZIONE MIELOIDE: granulocitopoiesigranulocitopoiesistem cell Blasto
mieloidepromieloc
itaMielo cita granulo
cita
CD66c
CD13
CD11b
CD11a
CD66b
CD11c
CD16
CD64
Meta mielocita
CD34
CD33
CD15
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stem cell Blasto mieloide
promonocita
Mono cita
CD13
CD33
CD14
CD11b
CD36
CD64
MATURAZIONE MIELOIDEMATURAZIONE MIELOIDEmonocitopoiesimonocitopoiesi
CD34
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0
100
PROMIELO MIELO METAMIELO GRAN
CD11bCD11b
CD1CD100
CD1CD166
CD64CD64
CD1CD133
MATURAZIONE MIELOIDE:MATURAZIONE MIELOIDE: variabili di espressione variabili di espressione
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Interpretazione suInterpretazione su CD66bCD66b//CD11bCD11b
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BM normale Sindrome mielodisplastica
+ mature
immatureimmature
blocco maturativoblocco maturativoblastiblasti
Maturazione MieloideMaturazione MieloideInterpretazione su Interpretazione su CD66bCD66b//CD11bCD11b
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CD16 CD16
CD15CD64
CD
10
CD
13
CD
11b
CD
11b
Maturazione mieloide in BM normaleMaturazione mieloide in BM normale
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R4
CD16 CD16
CD15CD64
CD
10
CD
13
CD
11
bC
D11
b
Maturazione mieloide in BM con MDSMaturazione mieloide in BM con MDS
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Maturazione mieloide in BM con MDSMaturazione mieloide in BM con MDS
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Maturazione monocitaria in BM con Maturazione monocitaria in BM con LMMCLMMC
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Mean values of bone marrow leucocyte Mean values of bone marrow leucocyte populationspopulations
A. Santagostino
Cell count 34.5 x 106 cell/ml (SD 28.0)Erythroid 10.8% (SD 5.7)Lymphocytes 12.4% (SD 5.9)
CD3 61.4% (SD 15.1) CD4 29.3% (SD 11.3)CD8 30.8% (SD 13.1) NK 11.2% (SD 9.2)CD19 18.9% (SD 14.0)CD19+10+ 43.10% (SD28.6) CD19+20+ 45% (SD28.9)
Monocytes (CD14) 3.2% (SD 1.5)CD34+ cells 0.9% (SD 0.7)Whole myeloid serie 72.2% (SD 8.7)
Immature/blast 3.6% (SD 2.1)Promyelocytes 12.3% (SD 6.3)Myelo and metamyelo 28.4% (SD 11.4)band and mature 48.9% (SD 15.5)Eosinophils 1.9% (SD 1.5)
Plasmacells 0.4% (SD 0.3)
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CD16 FITCCD16 FITC//CD13 PECD13 PE//CD34 PerCP-Cy5.5CD34 PerCP-Cy5.5//CD11b PE-Cy7CD11b PE-Cy7//CD117 APCCD117 APC//CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7
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NORMALENORMALE
MDSMDS
Maturazione Mieloide: SIDE SCATTERMaturazione Mieloide: SIDE SCATTER
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Stetler-Stevenson, Blood 2001
• Hypogranulation of PMN 84%
• CD11b/CD16 abnormal 70%
• CD13/CD16 abnormal 78%
• CD64+ granulocytes 66%
• CD10- granulocytes 11%
• CD45-dim blasts 53%
• CD56+ granulocytes 21%
• CD56+ monocytes 33%
• My-cells expressing non-My Ags 38%
MDS ABNORMALITIES BY FCMMDS ABNORMALITIES BY FCM
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CD16 FITCCD16 FITC//CD13 PECD13 PE//CD34 PerCP-Cy5.5CD34 PerCP-Cy5.5//CD11b PE-Cy7CD11b PE-Cy7//CD56 APCCD56 APC//CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7
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CD19
nuclearenucleareTdT
CD22citoplasmaticocµ
CD10
CD20
CD34
stem cell Cellula pre-pre B
Cellula pre B
Cellula B
citoplasmaticoCD79a
SmIg
PROFILO ANTIGENCOPROFILO ANTIGENCO Maturazione linfoide BMaturazione linfoide B
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Maturazione linfoide BMaturazione linfoide BCD20 FITCCD20 FITC//CD10 PECD10 PE//CD34 PerCP-Cy5.5CD34 PerCP-Cy5.5//CD38 PE-Cy7CD38 PE-Cy7//CD19 APCCD19 APC//CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7
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Intensità di espressione nelle M. Intensità di espressione nelle M. LinfoproliferativeLinfoproliferative
MCLMCL
CLLCLL
CD22 FITCCD22 FITC//CD200 PECD200 PE/ / CD19 PerCP-Cy5.5CD19 PerCP-Cy5.5 / / CD5 PE-Cy7CD5 PE-Cy7/ / CD23 APCCD23 APC / /CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7
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MCLMCL
CLLCLL
Intensità di espressione nelle M. Intensità di espressione nelle M. LinfoproliferativeLinfoproliferative
Kappa FITCKappa FITC//Lambda PELambda PE/ / CD20 PerCP-CD20 PerCP-Cy5.5Cy5.5 / / CD38 PE-Cy7CD38 PE-Cy7/ / CD19 APCCD19 APC / /CD45 CD45
APC-Cy7APC-Cy7
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Presenza o assenza di marcatori nelle Presenza o assenza di marcatori nelle M. LinfoproliferativeM. Linfoproliferative
MCLMCL CLLCLL
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Espressione di ZAP-70 nelle CLLEspressione di ZAP-70 nelle CLL
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VALUTAZIONE HCLVALUTAZIONE HCLCD103 FITCCD103 FITC//CD11c PECD11c PE/ / CD20 PerCP-CD20 PerCP-
Cy5.5Cy5.5 / / CD25 PE-Cy7CD25 PE-Cy7/ / CD19 APCCD19 APC / /CD45 CD45 APC-Cy7APC-Cy7
![Page 42: Limmunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica Roberto Caporale Pistoia, 29 ottobre 2011](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062404/5542eb4c497959361e8b9afe/html5/thumbnails/42.jpg)
VALUTAZIONE T-LDGLVALUTAZIONE T-LDGLCD57 FITCCD57 FITC//CD5 PECD5 PE/ / CD3 PerCP-Cy5.5CD3 PerCP-Cy5.5 / /
HLA-DR PE-Cy7HLA-DR PE-Cy7/ / CD8 APCCD8 APC / /CD45 APC-Cy7CD45 APC-Cy7
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ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NKCD158a E CD158b SULLE CELLULE NK
pattern atteso in una popolazione pattern atteso in una popolazione policlonalepoliclonale
CD158a
CD158b
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ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+
pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità
CD158a
CD158a CD158a
CD158a
CD158b
CD158b
CD158b
CD158b
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pattern compatibili con l’ipotesi di clonalitàpattern compatibili con l’ipotesi di clonalità
ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK
pattern atteso in una popolazione policlonalepattern atteso in una popolazione policlonale
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VALUTAZIONE PLASMACELLULEVALUTAZIONE PLASMACELLULE
CD19 CD138 CD38 CD56 FSC / SSC
debole presente Brillante assente ↑↑ assente presente Ridotta presente ↑↑↑
PARAMETRI INDAGATI
plasmacellule normali
plasmacellule trasformate
IPOTESI DIAGNOSTICA
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Immunofenotipo plasmacellule normali Immunofenotipo plasmacellule normali
Combinazione MoAb FITCFITC PEPE PerCP-Cy5.5PerCP-Cy5.5 PE-Cy7PE-Cy7 APCAPC APC-H7APC-H7 HV-450HV-450
1 CD138 CD117 CD20 CD38 CD56 CD45 CD19
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Combinazione MoAb FITCFITC PEPE PerCP-Cy5.5PerCP-Cy5.5 PE-Cy7PE-Cy7 APCAPC APC-H7APC-H7 HV-450HV-450
1 CD138 CD117 CD20 CD38 CD56 CD45 CD19
Immunofenotipo plasmacellule trasformate
Immunofenotipo plasmacellule trasformate
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• CD19-CD56-
• CD19-CD56+
Immunofenotipo plasmacellule trasformate
Immunofenotipo plasmacellule trasformate
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Plasma cells: normal vs clonal
Ocqueteau et al, AJP 152,1655,1998
Normal & reactive
CD45+
CD38 +++CD138 ++
CD56-
CD19+
CD117-
k & l(polyclonal)
CD20-
MGUS
CD45+/-
CD38 +++/++CD138 ++
CD56-/+
CD19-/+
CD117-
CD20-
k &/or l(monoclonal in a
proportion of PCs)
Clonal
CD56++
CD45-
CD38 ++CD138 ++
CD19-
CD117-/+
CD20-
k or l(monoclonal)
CD45+
CD38 +++CD138 ++
CD56-
CD19+
CD117-
CD20-
k & l(polyclonal)
Myeloma
CD56++
CD45-
CD38 ++CD138 ++
CD19-
CD117-/+
CD20-
k or l(monoclonal)
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MM: dimostrazione di monoclonalitàMM: dimostrazione di monoclonalità
![Page 53: Limmunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica Roberto Caporale Pistoia, 29 ottobre 2011](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062404/5542eb4c497959361e8b9afe/html5/thumbnails/53.jpg)
IF1 IF2 IF3 IF4
CD19 + + - -
CD56 - - + -
% PC <0.4 >0.4 NS NS
Immunofenotipi plasmacellulariImmunofenotipi plasmacellulari
IF2% PC=15% PC=15%
% PC=15% PC=15%
% PC=19%% PC=19%% PC=19%% PC=19%
% PC=5%% PC=5%% PC=5%% PC=5%
IF3
IF4
IF1
21%
5%
62%
12%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
IF1 IF2 IF3 IF4
![Page 54: Limmunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica Roberto Caporale Pistoia, 29 ottobre 2011](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062404/5542eb4c497959361e8b9afe/html5/thumbnails/54.jpg)
CD45
CD117 CD56
CD38
fattori prognostici in CFMfattori prognostici in CFMfattori prognostici in CFMfattori prognostici in CFM
CD20
CD20+ CD38dim CD45- CD56- CD117+
IF1 / / / 18 /
IF2 3 3 1
IF3 9 13 5 31
IF4 2 2 2 12 10
TOT IF 11 15 10 33 42
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Nuovi targets per la terapia contro il Nuovi targets per la terapia contro il MMMM
![Page 56: Limmunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica Roberto Caporale Pistoia, 29 ottobre 2011](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062404/5542eb4c497959361e8b9afe/html5/thumbnails/56.jpg)
SANGUE MIDOLLARE MM
SANGUE PERIFERICO MM
Presenza di PC-MM su Sangue periferico: Presenza di PC-MM su Sangue periferico:
SANGUE PERIFERICO NORMALE
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Malattia Minima ResiduaMalattia Minima ResiduaMalattia Minima ResiduaMalattia Minima Residua
A
B
DIAGNOSI
MMR
Sensibilità strumentale = 1/10000Sensibilità strumentale = 1/10000
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Utilità della citofluorimetria nel paziente affetto da MM:
• distingue tra plasmacellule normali, reattive e patologiche
• determina eventuali fattori prognostici
• identificare nuovi targets per la terapia contro il mieloma
• un’elevata sensibilità nel valutare la MMR
• possibilità di evidenziare PC-MM anche su sangue periferico
Conclusioni (I)Conclusioni (I)
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• L’analisi multiparametrica multicolore consente una L’analisi multiparametrica multicolore consente una maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni maggiore opportunità di discriminare sottopopolazioni cellulari.cellulari.
• E’ necessario applicare buone procedure di validazione E’ necessario applicare buone procedure di validazione strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei strumentale e ottimizzare la scelta delle combinazioni dei reagenti.reagenti.
• L’elettronica digitale ha decisamente aiutato nella L’elettronica digitale ha decisamente aiutato nella esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa esecuzione di analisi complesse fino a poco tempo fa impensabili.impensabili.
Conclusioni (II)Conclusioni (II)