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LCカラム選択ポイント② ‐ 分離モード-

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分離モード

•逆相分配クロマトグラフィー

•順相分配クロマトグラフィー

•イオン交換クロマトグラフィー

•イオン排除クロマトグラフィー

•サイズ排除クロマトグラフィー

•親水性相互作用クロマトグラフィー

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分離モードと測定対象物質

分離モード 主な測定対象物質

逆相分配 一般的に広く使われる

（疎水性相互作用による）

イオン交換 イオン性物質

イオン排除 有機酸

順相分配 親水性物質、脂溶性成分など

親水性相互作用（HILIC) 親水性物質

サイズ排除（SEC:GFC,GPC) 高分子化合物など

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逆相分配モード（Reverse Phase Partition Mode）

• 充塡剤の表層部分に官能基を導入し、分析対象成分が

この充塡剤と移動相との間での疎水性相互作用による

分配平衡により分配されその分配比の違いにより分離される。

• 固定相支持体

- シリカゲル、ポリマー樹脂 等

• 結合相 (化学結合相）

- 固定相支持体に化学的に結合させた官能基 C4,C8,C18等 • アルキル鎖が長いほど、カーボン量が大きいほど保持が強くなる

• 一般的な 移動相:

水< メタノール< アセトニトリル

(溶媒の溶出力強度 : 保持時間が短くなる)

2-10μm

細孔径（ポアサイズ）

8-30nm

全多孔性充塡剤

コアシェル型充填剤 *1

5

酢酸の解離曲線

カラム – pH の影響

酢酸のpKa4.8

50%解離

100%解離

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逆相分配モードを用いた未知物質のメソッド開発

① 中性化合物：

逆相分配クロマトグラフィーにより有機溶媒の濃度比を検討

② 酸性化合物：

分析対象成分のpKaを確認。 そのpHから酸性側に2以上シフトさせた緩

衝液と有機溶媒の混合液を用いて、逆相分配クロマトグラフィーにより溶出

③ 塩基性化合物：

分析対象成分のpKaを確認。 そのpHから塩基性側に2以上シフトさせた緩

衝液と有機溶媒比を調節

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順相分配モード（Normal Phase Partition Mode）

O

O

Si

O

Si

Si

Si

R

R

R

R

•シリカゲル、カーボン、アルミナ、チタニアなどを固定相とする 充塡剤を用いたもので、固定相の極性が高く、移動相の極性が低い分離モードを順相分配モードと呼ぶ。 • 一般的な固定相 R= OH シリカ R=(CH2)3NH2 アミノ基 R=(CH2)3CN シアノ基 R=(CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH ジオール基 • 一般的な 移動相 ヘプタン < ヘキサン < トルエン < クロロフォルム< エチルアセテート< イソプロパノール < アセトニトリル < メタノール

• 問題点: 水の存在や他の極性化合物が保持特性に大きく影響

8 8

• ポリマーベースのスチレンジビニリルベンゼン共重合体等にイオン交 換基を導入した充塡剤を用い、移動相中のイオンと測定対象成分との 充塡剤への保持力の競合状態や、疎水性相互作用による保持として 有機溶媒組成比の調整などを行う。 • 一般的な官能基

強陽イオン交換基（スルホン酸基）

弱陽イオン交換基（カルボキシル基）

強陰イオン交換基（四級アミン）

弱陰イオン交換基（三級アミン）

• 一般的な移動相：

緩衝液、塩濃度、有機溶媒組成比等を調整し分離を改善

移動相中のイオンと測定対象成分との充塡剤への保持力の競合状態

や疎水性相互作用による保持として有機溶媒組成比の調整

イオン交換モード（Ion Exchange Mode）

9

移動相

N+R3

N+R3 OH-

OH-

OH- OH-

OH-

OH- OH-

OH-

OH-

OH-

OH-

OH-

N+R3 N+R3

R3+N

R3+N

R3+N

N+R3

N+R3

N+R3

R3+N

OH-

R3+N

N+R3

OH-

OH-

官能基

OH-

OH-

固定相

B

- -

A

-

イオン交換分離（陰イオン分離例）

10 10

• •陽イオン交換樹脂のH型を使用。移動相：酸 •

H 2 O

H 2 O

H ＋ Cl －

H ＋ CH 3 COO － CH

3 COOH

COO － H ＋

SO 3 －

H +

SO 3 － H ＋

SO 3 － H ＋

SO 3 － H ＋

COO － H ＋

COO － H ＋

SO 3 － H ＋

H ＋ CH 3 （ CH

2 ） 2 COO － CH

3 (CH

2 ) 2 COOH

充填剤基材

溶離液

オクタンスルホン酸

CH 3 （ CH 2 ) 4 CH 2 SO 3 － H +

ヘプタフルオロ酪酸

CF 3 CF 2 CF 2 COO － H +

H 2 O

H 2 O

H ＋ Cl －

H ＋ CH 3 COO － CH

3 COOH

COO － H ＋

SO 3 －

H +

SO 3 － H ＋

SO 3 － H ＋

SO 3 － H ＋

COO － H ＋

COO － H ＋

SO 3 － H ＋

H ＋ CH 3 （ CH

2 ） 2 COO － CH

3 (CH

2 ) 2 COOH

充填剤基材

溶離液

オクタンスルホン酸

CH 3 （ CH 2 ) 4 CH 2 SO 3 － H +

ヘプタフルオロ酪酸

CF 3 CF 2 CF 2 COO － H +

Cl - 酢酸

Retention time C

on

du

ctivity

酪酸

強酸はウォーター

ディップ付近に溶出

Cl - 酢酸

Retention time C

on

du

ctivity

酪酸 Cl - 酢酸

Retention time C

on

du

ctivity

酪酸

強酸はウォーター

ディップ付近に溶出

• ポリマーベースの基材に陽イオン交換基を導入したもので、移動相には酸を流す。 強酸は、充塡剤官能基の負の電荷により排除(Donnan排除)され細孔(ポア)内部に 入れず、直ぐに溶出する。弱酸である 有機酸はポア内部に入り込み、 さらに疎水性相互作用もあって保持される。 •一般的な官能基

強陽イオン交換基（スルホン酸基）

• 一般的な移動相： 硫酸, オクタンスルホン酸等, 有機溶媒組成比を調整

イオン排除モード（Ion Exclusion Mode）

11 11

1

23

4

5

1. ギ酸

2. 酢酸

3. プロピオン酸

4. 酪酸

5. 吉草酸

2020101000

Retention time (min)

ICE-AS1

1

23

4

51

23

4

5

1. ギ酸

2. 酢酸

3. プロピオン酸

4. 酪酸

5. 吉草酸

2020101000

Retention time (min)

ICE-AS1

ギ酸（pKa:3.75）＜酢酸（pKa:4.76）＜プロピオン酸（pKa:4.87）＜酪酸（pKa:4.82）＜吉草酸(pKa:4.84)

ICE-AS1カラムによる有機酸の分析

イオン排除クロマトグラフィー：有機酸分析例

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• コントロールされたポアサイズの充塡剤を用いる。

• 分子の立体的な大きさごとに溶出

• ポアに入れない大きな分子から小さい分子へと順番に溶出

• ポリマーの分子量分布測定等に用いられる。

•充塡剤：有機溶媒系でには、ポリスチレンゲル

水系としては、メタクリレート系ゲル

•移動相：有機溶媒系としてTHFやトルエン、DMF、クロロホルム等

•校正曲線：分子量のわかっている標準のポリスチレンスタンダードを利用

サイズ排除クロマトグラフィーのモデル

試料の注入

サイズ排除モード(Size Exclusion Mode)

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HILICは、水と有機系の混合溶媒の使用可能な順相クロマトグラフィー

（normal-phase chromatography ）の一種

HILICは、逆逆相や水系順相（ “reverse reversed-phase” , “aqueous normal

phase” ）クロマトグラフィーとよんでいる。

HILIC は、非常に極性のある化合物の保持に使用

固定相は、シリカ、シアノ基、アミノ基、ジオール基などの極性基

移動相は、水のような極性溶媒を少量と有機溶媒 (>80 %)

Silica N

H2

Silica

OH

OH

Silica

CN

Silica

O

HO

HO

Silica

N

SO

3

Me

Me

+

-

親水性相互作用モード（HILIC: Hydrophilic InteractionMode)

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HILICモードの利点

• 逆相クロマトグラフィーで保持できない親水性の高い化合物を保持することができます。

• 逆相カラムで得られない選択性が得られます。

• マススペクトロメトリーで検出時、より高い感度が得られます。

• 有機溶媒系の移動相比率が高いので (> 80%)、ESI-MS 感度が改善されます。

• サンプル前処理にかかる時間を短縮できます。

• SPE, 除タンパク, or 液-液抽出の処理では、最終のステップで抽出されたサンプルの有機溶媒比率が高いです。 (e.g., acetonitrile, isopropanol, etc.)

• 逆相分析をする場合、有機溶媒を窒素雰囲気下で濃縮乾固し、水系移動相の比率が高い溶媒で再溶解します。

• HILICで分析する場合、試料は有機溶媒比率が高い方が感度良く分析できるので、前処理を行った場合はこのまま注入することが可能です。

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Mixed-Mode クロマトグラフィー

• 定義

• 疎水性相互作用 + イオン交換相互作用

• メリット

• 選択性の調整

• シンプルな移動相 (イオンペア試薬が不要）

• 異なるタイプの分析対象物質の同時分析

• 種類

• アニオン交換 / 逆相分配 (AEX/RP)

• カチオン交換 / 逆相分配 (CEX/RP)

• アニオン交換 / カチオン交換 / 逆相分配 (AEX/CEX/RP)