1

Panel Ekspertów „KLIMAT” 1

LASY I DREWNO A ZMIANY KLIMATYCZNE: ZAGROŻENIA I SZANSE

Termin: 18 czerwca 2013

SESJA 2

MOŻLIWOŚCI ZWIĘKSZANIA SEKWESTRACJI WĘGLA W EKOSYSTEMACH

LEŚNYCH: EFEKTYWNOŚĆ FOTOSYNTEZY A ZMIENNOŚĆ

GENO- I EKOTYPOWA GATUNKÓW DRZEWIASTYCH

ZA POMOCĄ INŻYNIERII GENETYCZNEJ

Dr hab. Justyna NOWAKOWSKA, prof. IBL, Zakład Hodowli Lasu i Genetyki Drzew

Leśnych, Instytut Badawczy Leśnictwa

1. Przegląd problematyki z zakresu zwiększania sekwestracji węgla w

ekosystemach leśnych

Lasy na świecie generują znaczne korzyści ekonomiczne i zajmują

niekwestionowane miejsce w dziedzictwie narodowym każdego państwa. Oprócz

dostarczania surowca drzewnego, lasy pełnią ważną funkcję w ochronie jakości

powietrza i wody, niwelują zmiany klimatu poprzez składowanie ogromnych ilości

węgla w biomasie, oraz tworzą warunki bytowania dla wielu gatunków roślin,

mikroorganizmów i zwierząt.

1 Aktualizacja programu będzie prowadzona na stronie http://npl.ibles.pl/klimat

2

Ze względu na produkcyjną wartość sortymentu drzewnego i długą żywotność

drzew, produkty leśne można traktować jako towar wytwarzany w ramach modelu

gospodarstwa rolnego, choć istnieje duża różnica między uprawami drzew leśnych a

uprawami rolnymi - szczególnie wyraźnie widoczna w kontekście zastosowania

rozwiązań nowoczesnej inżynierii genetycznej. Skuteczne wprowadzenie zmian

genetycznych w rolnictwie, choć dla ograniczonej liczby cech i gatunków, może

stanowić wyzwanie dla naukowców i zarządców związanych z sektorem leśnym w

kontekście możliwości zastosowania drzew GMO w produkcji surowca drzewnego.

Temat ten wzbudza jednak gorące dyskusje i gwałtowne reakcje, którym często

brakuje poparcia obiektywnymi informacjami, zwłaszcza gdy informacje płynące ze

świata nauki są ze sobą sprzeczne i podważające własną wiarygodność.

Choć termin biotechnologii w leśnictwie można rozpatrywać pod wieloma

aspektami (genomika, proteomika, metabolomika, klonowanie in vitro, selekcja

drzew oparta na molekularnych markerach), w niniejszym opracowaniu - po krótkim

opisie metodyki tworzenia drzew transgenicznych, przedstawione będą możliwości

inżynierii genetycznej gatunków drzewiastych w Polsce i na świecie, z

uwzględnieniem zwiększenia biomasy i w konsekwencji sekwestracji węgla.

a) Genetyczna transformacja roślin drzewiastych

Modyfikacja genomu roślin drzewiastych, czyli ich genetyczna transformacja,

polega na wprowadzeniu specyficznej sekwencji obcego DNA do genomu komórki w

celu otrzymania osobników o nowych cechach jakościowych. Informacja genetyczna

danego gatunku, zawarta w DNA, może być wzbogacona w dodatkowe sekwencje

genów, które są wprowadzone do komórki na drodze transformacji wektorowej (za

pomocą bakterii Agrobacterium tumefaciens), lub bezwektorowej (przy użyciu

strzelby genowej). Na ogół, produkcja drzew transgenicznych jest ukierunkowana na

wprowadzeniu do komórek drzewa genu, którego produkt (białko) nadaje korzyści

hodowlane.

Ważnym etapem, jaki poprzedza transformację komórek roślin drzewiastych,

jest wyizolowanie sekwencji odpowiedniego genu, np. genu kodującego syntazę

glutaminową lub genu toksyna Bt kodującego toksyczne białko dla owadów z rzędu

Lepidoptera (Gallardo et al. 1999). Poszukiwanie genów odpowiedzialnych za różne

procesy metaboliczne w roślinie jest możliwe dzięki wykorzystaniu techniki

mikromacierzy DNA (DNA microarrays). Technika ta umożliwia identyfikację i

3

wstępną charakterystykę funkcji genów na poziomie transkrypcji. W ten sposób

odkryto m.in. geny Leafy kontrolujące proces kwitnienia u Arabidopsis thaliana, geny

enzymów szlaku syntezy komponentów ściany komórkowej oraz wiele innych genów,

odpowiedzialnych za procesy wzrostu i rozwoju roślin pod wpływem działania

hormonów takich jak auksyny, gibereliny, etylen i kwas abscysynowy (Campbell et al.

2004).

W końcowym etapie, wyhodowane rośliny transgeniczne poddawane są

weryfikacji pod kątem obecności obcego genu w genomie komórek. W zależności od

zastosowanego konstruktu genowego, proces wstępnej weryfikacji może być

przeprowadzany za pomocą testów ekspresji genów kodujących białka markerowe,

np. GUS lub odporność na antybiotyki. Ostateczna weryfikacja uzyskanych linii

transgenicznych oraz ich potomstwa wymaga przeprowadzenia molekularnych analiz

(techniki Southern-, Northern- i Western-blottingu, PCR oraz testów enzymatycznych

i immunochemicznych), potwierdzających integrację transgenu z genomem rośliny

oraz jego ekspresję w roślinie.

b) badania prowadzone w Polsce

Uprawy i obrót GMO są możliwe w Polsce od 28.01.2013 r. dzięki ustawie o

nasiennictwie, oraz ustawie z dnia 22 czerwca 2001 r. o organizmach genetycznie

zmodyfikowanych (Dz. U. z 2001 r. Nr 76, poz. 811; oraz z 2002 r. Nr 25, poz. 253).

W zakresie badań drzew leśnych, prowadzone są m.in. badania nad

wyhodowaniem transgenicznych topoli pod kierownictwem prof. dr hab. Stanisława

Karpińskiego w Katedrze Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin SGGW.

Stworzona przez zespół S. Karpińskiego transgeniczna topola Populus trichocarpa

L. posiada zwiększoną zawartość flawonoidów, co ma wpływ na większą

odporność na infekcje patogenów i ochronę nienasyconych kwasów tłuszczowych

przed utlenieniem (Sprawozdanie z kontroli, 2011). W procesie transformacji zostały

wykorzystane: 1) biorca - topola kalifornijska (P. trichocarpa L.); 2) dawca – A.

tumefaciens – wektor insercyjny pH7GWIWG2(I), pCAMBIA; 3) insert – pCAMBIA,

skonstruowany w Instytucie CAMBIA w Australii, pH7GWIWG2(I) - wektor oparty na

systemie Gateway M.

Zamierzone uwolnienie topoli genetycznie zmodyfikowanej planowane jest do

dnia 30 września 2014 r. na polu doświadczalnym „Wolica”, należącym do Katedry

4

Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin SGGW. Po zakończonym projekcie,

poznamy wymierny zysk wyhodowanych transgenicznych topoli w naszym kraju.

Brak jest badań odnośnie zwiększenia biomasy innych gatunków lasotwórczych

w oparciu o inżynierię genetyczną.

c) badania prowadzone na świecie

Zastosowanie inżynierii genetycznej w leśnictwie dotyczy w pierwszym rzędzie

upraw roślin szybko rosnących (topola), o dużym znaczeniu gospodarczym i

stosunkowo łatwym sposobie rozmnażania. Dzięki transformacji roślin drzewiastych,

możemy o wiele szybciej uzyskać pożądany efekt jakościowy przez np. zwiększenie

odporności na herbicydy i szkodliwe owady w porównaniu do tradycyjnych metod

selekcji. Dzięki tym metodom, drzewa na plantacjach lepiej przyrastają i

magazynują dwutlenek węgla w tkankach, bez strat spowodowanych przez

chwasty i żery owadów.

I tak, w USA powstała m.in. hodowla transgenicznych siewek topoli (Populus

trichocarpa x P. deltoides), odpornych na środki ochrony roślin takie, jak herbicyd

Roundup, powszechnie stosowany do zwalczania chwastów szerokolistnych i

trawiastych (Strauss et al. 2001). Aktywny składnik tego preparatu – glifosat, blokuje

kluczowy enzym – syntazę kwasu 5-endo-pirogronoszikimo-3-fosforanowego

(EPSPS) w biosyntezie aminokwasów aromatycznych w komórkach roślin wyższych.

W celu uzyskania odporności siewek topoli na glifosat, wyizolowano z komórek

bakteryjnych (Salmonella typhimurium) gen aroA, który koduje zmutowane białko

EPSPS i wprowadzono go do genomu rośliny (Campbell et al. 2003). Nadekspresja

genu aroA pod kontrolą stałego promotora CaMV 35S u topoli prowadzi do

akumulacji zmutowanego białka EPSPS w komórkach, co jest przyczyną

zmniejszenia powinowactwa białek docelowych dla herbicydu, bez wpływu na

biosyntezę aminokwasów aromatycznych. Dzięki temu, stosowany w uprawach topoli

herbicyd, hamuje selektywnie wzrost chwastów jednoliściennych, nie wpływając na

rozwój siewek topoli. Podobnie, otrzymano odporność na glifosat u siewek

modrzewia (Larix decidua Mill.) oraz mieszańca topoli (Populus tremula x alba)

(Campbell et al. 2003).

Innym ważnym zastosowaniem inżynierii genetycznej w leśnictwie jest hodowla

transgenicznych siewek topoli (Populus trichocarpa x P. deltoides) odpornych na

5

owady z rodziny stonkowatych, takich jak Chrysomela scripta (ryc. 1). Aby temu

zapobiec, zwiększono odporność mieszańca topoli Populus trichocarpa x P. deltoides

przez wprowadzenie do embriogennych komórek roślinnych konstruktu genowego

zawierającego gen kodujący -endotoksyny cryIA(a), cryIA(b) lub cryIA(c) z Bacillus

thuringiensis (Gelernter et al. 1993). Zintegrowany z DNA roślinnym gen Bt koduje

toksyczne białko dla żerujących na blaszkach liściowych larw. W te sposób,

transformacja topoli genem Bt umożliwiła uprawę tego gatunku na plantacjach bez

zastosowania chemicznych środków ochrony roślin - insektycydów.

6

zależności między sygnałami kwantowymi generowanymi w obrębie

fotosystemów a statusem redoks-hormonalnym komórki w odpowiedzi na stresy

biotyczne i abiotyczne. Badania te mają na celu zwiększenie produkcji biomasy

(plonowania) w naturalnych warunkach suszy glebowej.

poziomie ekspresji genów kodujących białka PSII u mutanta mpk4 A. thaliana, którą obroniłem w marcu 2012. Aktualnie zajmuję się badaniem interakcji MAP kinazy MPK4, ze specyficznymi fosfatazami, w komórkach topoli (Populus trichocarpa).

Ryc. 1. Schemat transformacji rośliny drzewiastej ze zwiększoną ekspresją genów

odporności na owady. Źródło: J. Nowakowska (2004)

Ryc. 2. Transgeniczne siewki topoli o zmniejszonej zawartości lignin w strukturze

drewna (Uniwersytet w Purdue, USA).

Źródło: http://www.nytimes.com/2007/11/20/science/20tree.html?_r=1&oref=slogin

7

Jak dotąd, jedynie u roślin modelowych (zielnych i uprawnych), prowadzone

są badania nad wprowadzeniem genów odpowiedzialnych za wzrost aktywności

fotosyntetycznej. Jest to możliwe dzięki modyfikacji szlaku fotosyntezy typu C3 (95

% roślin lądowych, do których przynależą również drzewa leśne), oraz szlaku C4 i

CAM.

Wzrost biomasy może być osiągnięty poprzez zwiększenie wydajności

fotosyntetycznej w chloroplastach, lub zmniejszenie procesu fotooddychania.

Fotosynteza typu C3 jest ograniczona aktywnością kluczowego enzymu rybulozo-

1,5-bisfosforanu karboksylazy-oksygenazy (Rubisco), oraz utratą cząsteczek CO2

przez fotooddychanie. W obecnym składzie atmosfery (21% O2 i 0,035% CO2), tlen

O2 w 25% obniża wydajność procesu fotosyntezy. Dodatkowo, spadek wydajności

fotosyntezy pogłębia się wraz z deficytem wodnym (suszą) i wysoką temperaturą.

Teoretycznie, modyfikacja aktywności enzymu Rubisco na rzecz zwiększonej

aktywności karboksylowej kosztem oksydacyjnej, może prowadzić do zwiększenia

efektywności fotosyntezy poprzez większe przyswajanie CO2 z atmosfery. Pierwsze

takie próby podjęto przez zmianę struktury miejsca aktywnego enzymu via

mutagenezę sterowaną genu Rubisco, oraz przez wprowadzenie większej ilości kopii

tego genu do rośliny. Niestety, nie uzyskano pozytywnych wyników (Normile 1999;

Zelitch 1989), ponieważ mechanizmy działania Rubisco nie są jeszcze gruntownie

poznane u roślin wyższych.

U roślin typu C4, cząsteczki CO2 są magazynowane podczas dnia, kiedy

aktywność oksydacyjna Rubisco jest największa, a uwalniane nocą, kiedy przeważa

aktywność karbokslazy Rubisco. Prowadzi to do większej wydajności fotosyntezy.

Pierwsze próby zmiany systemu asymilacji CO2 u roślin typu C3 na typ C4,

wykonano zwiększając w tkankach ryżu ekspresję karboksylazy

fosfoenolopirogronianowej (PEPC), która w roślinach C4 bierze udział w

przyswajaniu dwutlenku węgla. Podobnie u ziemniaka, zwiększona ekspresja genu

PEPC i dehydrogenazy NADH jabłczanowej, zahamowała aktywność oksygenazy u

Rubisco i zmniejszyła popyt na elektrony fotosystemie PSII przy podwyższonej

temperaturze, przez co wydajność fotosyntezy się zwiększyła (Lipka et al. 1999).

Na podstawie badań aktywności fotosyntetycznej u glonów, stwierdzono

zwiększenie stężenia cząsteczek CO2 wokół przestrzeni komórkowej, co wpłynęło na

większą aktywność Rubisco i w konsekwencji spowodowało wzrost aktywności

fotosyntetycznej (Lieman-Hurwitz et al. 2003).

8

Inne możliwości zwiększenia aktywności fotosyntezy u drzew leśnych

prowadzone są przez blokowanie procesu fotooddychania i wprowadzanie genów

kodujących białka odpowiedzialne za większą przyswajalność cząsteczek wody

przez roślinę. Zmniejszenie procesu fotooddychania może mieć miejsce poprzez

zablokowanie genów biorących udział w biosyntezie fosfoglikolanu – pierwszego

produktu fotooddychania w komórkach chloroplastowych Arabidopsis thaliana

(Kebeish 2006). Natomiast Almeida et al. (2007), wprowadzając gen AtTPS1 z

rzodkiewnika pospolitego do tytoniu, uzyskali lepszą przyswajalność wody z podłoża i

wzrost aktywności fotosyntetycznej na poziomie fotosystemu PSII.

Istotnym problemem, wymagającym dodatkowego rozpoznania efektywności

procesu fotosyntezy, jest dokładne poznanie biosyntezy i regulacji ekspresji

kluczowego enzymu fotosyntezy u roślin C3, tj. Rubisco.

U gatunków drzewiastych, obecnie prowadzone są badania genetyczne nad

zmianami w strukturze wiązań fenylopropenowych w ścianach komórkowych, co

narusza chemiczną strukturę ligniny, usieciowanej wiązaniami eterowymi i

kowalencyjnymi typu węgiel-węgiel (C−C). Lignina jest polimerem, w skład którego

wchodzą monomery - związki organiczne, będące pochodnymi alkoholi fenolowych,

m.in. alkohol koniferylowy, alkohol synapinowy, alkohol kumarylowy.

W ostatnich dziesięcioleciach, wiele uwagi poświęcono badaniu genów

uszkadzających strukturę monomerów lignin (Tabela 1). W Belgii, Francji i USA

prowadzone są badania nad transgenicznymi gatunkami drzew leśnych o

zmniejszonej zawartości lignin w ścianach komórkowych dzięki zmienionym

genotypom enzymów kluczowych w łańcuchu biosyntezy lignin (ligaza C4L,

dehydrogenaza CAD, liaza PAL) (Hu et al. 1999, Peña et Séguin 2001). Zmiana w

ekspresji genu ligazy kumarynowej C4L, która jest kluczowym enzymem w

biosyntezie lignin, prowadzi np. do zwiększenia o 30% zawartości włókien celulozy w

komórkach produkowanego drewna (ryc. 2), co umożliwia zastosowanie mniej

szkodliwych dla środowiska procesów technologicznych w przemyśle papierniczym.

W mieszańcach topoli (np. P. tremula x alba), obniżenie zawartości lignin

uzyskano przez zablokowanie genu COMT, poddanemu regulacji konstytutywnego

promotora 35S z kalafiora (Jouanin et al. 2000).

9

Tabela 1: Spis podstawowych modyfikacji genetycznych u roślin, ukierunkowanych

na biosyntezę lignin

10

Zablokowanie biosyntezy koenzymu CCoAOMT umożliwiło wyhodowanie

transgenicznej topoli o 12% zmniejszonej zawartości lignin. Ekspresja genu białka

F5H (ferulate-5-hydroxylaza) z Arabidopsis pod kontrolą promotora C4H, umożliwiła

Franke et al. (2000), wyhodowanie P. tremula × P. alba o zwiększonej zawartości

monomerów, co daje łatwiejszą delignifikację w trakcie produkcji pulpy. Zawartość

lignin można obniżyć aż do 52% przez wprowadzenie genu hydrolazy CAld5H do

komórek P. tremuloides.

Modyfikacja zawartości składu polisacharydów w ścianie komórkowej

prowadzi do zwiększenia zawartości celulozy, a w związku z tym wiązania węgla w

materii organicznej (Tabela 2). W transgenicznej topoli P. tremula, do której

wprowadzono genami endoglukanazy z rzodkiewnika pospolitego, zmniejszenie

zawartości lignin spowodowało zwiększenie zawartości celulozy ksyloglukanów

nawet o 10% (Shani et al. 2004). W 2007 r., Coleman et al. wyhodowali

transgenicznego mieszańca P. alba × P. grandidentata z wprowadzonym genem

bakteryjnym fosforylazy UDP-glukozowej (UGPase), choć drzewa te rosły jednak

wolniej niż kontrolne.

Nadal trwają badania nad zmianami w strukturze ściany komórkowej u takich

gatunków drzewiastych, jak: Populus sp., Pinus radiata i Eucalyptus.

Również zastosowanie techniki blokowania microRNA w tworzeniu drewna

reakcyjnego u drzew, umożliwia zwiększenie biosyntezy celulozy w ścianie

komórkowej (Lu et al. 2005).

Zwiększenie wzrostu biomasy jest jednym z priorytetowych zadań gospodarki

leśnej. Inżynieria genetyczna dotyczy tu głównie modyfikacji genomów drzew przez

wprowadzenie genów (tabela 2), biorących udział w kodowaniu białek,

odpowiedzialnych za syntezę i transport hormonów wzrostu np. auksyn (gen ugt,

acb). Wprowadzanie tych genów do roślin modelowych powoduje wzrost długości

korzeni u topoli (Salyaev et al. 2006). Transgeniczna topola z genem ekspansyny

PttEXPA1 miała zwiększone długości międzywęźli oraz większą powierzchnię

blaszek liściowych. Są to jednak badania tylko w fazie eksperymentalnej i potrzeba

jeszcze dalszych prac, zanim zostaną wyprodukowane stabilne linie transgenicznych

drzew o tendencji zwiększonego przyrostu biomasy i dobrej jakości włókien drewna.

11

Zakończenie sekwencjonowania innych genomów drzew, oraz ukończony w

2006 roku projekt sekwencjonowania całego genomu topoli P. trichocarpa przez

grupę badaczy Tuskana et al. (2006), przyczyni się do lepszego poznania

genetycznego podłoża regulacji ekspresji informacji genetycznej ukierunkowanej na

większą aktywność fotosyntezy w komórkach, co spowoduje szybszy przyrost masy

drewna i jego dobrą jakość.

Tabela 2. Podsumowanie głównych modyfikacji genetycznych prowadzonych w celu

zwiększenia wzrostu drzew

Genetycznie modyfikowane drzewa, ukierunkowane na produkcję biomasy na

plantacjach drzew leśnych, przyczynią się do większego pochłaniania dwutlenku

węgla, poprzez proces sekwestracji węgla w większych ilościach w częściach

nadziemnych drzew i w glebie (Kellison 2007).

12

Ciekawym osiągnięciem było uzyskanie przez prof. Straussa w 2001 roku w

USA sadzonek transgenicznej topoli (Populus trichocarpa), o zwiększonej asymilacji

jonów amonowych NH4+ (ryc. 3).

Ryc. 3. Modyfikacje prowadzące do wzrostu biomasy. A: zablokowanie ekspresji

genu 4CL powoduje wzrost biomasy transgenicznej topoli w porównaniu do kontroli.

B: zwiększona powierzchnia blaszki liściowej (po prawej) transgenicznej topoli w

odniesieniu do kontroli (po lewej). Źródło: University of California, Davis, 2006

2. Koncepcje rozwiązania, doskonalenia w biotechnologii leśnej

Biotechnologia otwiera szerokie możliwości dla modyfikacji cech genetycznych

drzew leśnych. Wiele jednostek naukowych pracuje nad optymalizacją metod

transformacji różnych gatunków drzew leśnych, w celu zwiększenia odporności na

jeden lub kilka czynników biotycznych i abiotycznych. Poznanie procesów

biochemicznych, regulujących mechanizm wegetatywnego rozmnażania gatunków

drzew leśnych stanowi cel badań wielu ośrodków naukowych. Sam proces

transformacji genetycznej powoduje bowiem zwykle zmniejszenie efektywności

regeneracji zarodków somatycznych z komórek, np. sosny i brzozy in vitro (Aronen i

Häggman 1995). W przypadku Pinus taeda, zauważono, iż proces transformacji

komórek kalusa powoduje zmniejszenie efektywności regeneracji o 40% (Wenk et al.

1999). Rozmnażanie sosny (Pinus taeda L.) i świerka (Picea abies L. Karst.) in vitro

nie jest jeszcze w sposób zadawalający opracowane, a napotkane trudności mają

B

13

podłoże genetyczne (ekspresja genów) lub fizjologiczne (białka kontrolujące proces

embriogenezy, jak np. reduktaza glutationowa). W związku z tym, trwają intensywne

badania nad poznaniem mechanizmów indukujących powstawanie zarodków z

dojrzałych komórek sosny i świerka, tak aby można było rozmnażać wegetatywnie

drzewa elitarne ww. gatunków (Lelu et al. 1999). Rozmnażanie cennych linii

hodowlanych różnych gatunków drzew leśnych drogą somatycznej embriogenezy

pozwala uzyskać dużą ilość rozmnażanego materiału o wyselekcjonowanym

genotypie. Jak dotąd, poznano np. czynnik transkrypcyjny CHAP3a, który indukuje

ekspresję genów biorących udział w regeneracji komórek świerka in vitro (Rutledge

et al., dane nie publikowane) i można przypuszczać, że podobny mechanizm

występuje również u innych gatunków drzew leśnych. Dalsze prace będą

postępować w kierunku identyfikacji innych czynników transkrypcyjnych i lokalizacji

genów odpowiedzialnych za indukcję procesu somatycznej embriogenezy, oraz ich

aktywność w czasie formowania się zarodków drzew iglastych.

Na szczególną uwagę zasługuje również udoskonalenie metod weryfikacji

stabilności transgenów w liniach zmodyfikowanych genetycznie.

Obecnie, w wielu laboratoriach trwają prace nad transformacją ważnych

przemysłowo gatunków drzew leśnych, w celu nadania odporności na herbicydy oraz

czynniki chorobotwórcze takie jak grzyby, owady, wirusy (Tzfira et al. 1998). W

Stanach Zjednoczonych i w Hiszpanii hodowane są w warunkach szklarniowych

transgeniczne odmiany brzozy i sosny, odporne na owady z rzędów Lepidoptera,

Diptera i Coleoptera (Peña i Séguin 2001). W Finlandii uzyskano już pozytywną

transformację komórek brzozy Betula pendula Roth., do której wprowadzono gen

transferazy metylowej PtCOMT z Populus tremuloides. Otrzymane tą drogą

transgeniczne brzozy wykazują zwiększoną odporność na owady z rzędu Coleoptera

w warunkach szklarniowych. Transgeniczna brzoza brodawkowata, posiadająca gen

chitynazy IV, jest odporna na wiele szczepów bakteryjnych (m.in. Streptomyces) i

grzybowych (np. Phytophthora infestans) (Lohtander et al., dane nie publikowane). W

Szwecji, zmodyfikowano genetycznie osobniki mieszańca P. tremula x P. tremuloides

w celu poprawy jakości drewna, zwiększenia przemiany węglowodanów w roślinie,

zwiększonej syntezy giberelin oraz nadanie odporności na owady z rzędów

Coleoptera, Lepidoptera i Diptera poprzez ekspresję toksyny Bt.

14

W Stanach Zjednoczonych i w Izraelu opracowywana jest metoda uzyskania

odporności na niekorzystne warunki klimatyczne (mróz, susza) i środowiskowe

(zasolenie, wysokie stężenie jonów rtęci w podłożu) oraz o zwiększonej asymilacji

jonów amonowych (NH4+) u topoli i sosny (Tzfira et al. 1998).

W Belgii i Francji prowadzone są badania nad transgeniczną topolą o

zmienionym składzie wiązań fenylopropenowych lignin, co umożliwi zastosowanie

mniej szkodliwych dla środowiska procesów technologicznych w przemyśle

papierniczym (Hu et al. 1999). Założone w 2004 roku plantacje topoli transgenicznej

odpornej na Melampsora sp. w INRA pod Orleanem (Francja), zostały niestety

zniszczone przez okoliczną ludność, więc na wyniki tych badań trzeba jeszcze

poczekać (informacja własna).

Transformacje genetyczne nad wprowadzeniem zmian metabolizmu

komórkowego są prowadzone głównie u takich gatunków drzew leśnych jak Pinus

taeda, P. radiata, P. sylvestris, Picea abies, Betula pendula, Pseudotsuga menziesii,

Populus tremula x P. tremuloides i Populus nigra. Jakkolwiek w większości prace te

dotyczą transformacji i ekspresji genów markerowych (GUS), to rozpoczęto już próby

wprowadzenia do komórek drzew leśnych takich genów jak: geny odporności na

herbicydy (BASTA), geny kodujące enzymy szlaku biosyntezy terpenów, których

ekspresja w roślinach transgenicznych zwiększa odporność drzew na szkodniki i

patogeny grzybowe u świerka, np. Phytium dimorphum i Ceratocystis polonica

(Fossdal et al. 2001), geny cyklazy karboksylowej (ACC), które wprowadzone do

komórek sosny zwyczajnej i brzozy brodawkowatej, przyczyniają się do zwiększonej

produkcji etylenu i indukcji dojrzewania zarodków somatycznych in vitro (Lu et al.,

dane nie publikowane).

Ważnym osiągnięciem w hodowli zmodyfikowanych genetycznie drzew będzie

wyhodowanie osobników charakteryzujących się kontrolowanym procesem

kwitnienia. Proces ten można przyspieszać powodując nadekspresję genów LEAFY

lub APETALA u topoli, lub blokować rozwój pąków kwiatowych poprzez wyciszanie

genów (Tzfira et al. 1998). Zahamowanie procesu kwitnienia w roślinach

transgenicznych eliminuje ryzyko uwolnienia transgenu do środowiska.

Wiele przedsiębiorstw przemysłu drzewnego, takich jak SweTreeTechnology AB

(Szwecja), ArborGen llc. (USA), Rubicon Ltd. (USA), Trees and Technology (USA),

Genesis Research and Development Corp. (Nowa Zelandia) oraz międzynarodowa

15

spółka CellFor Inc., wspierają finansowo badania naukowe w poszukiwaniu genów

odpowiedzialnych za cenne przemysłowo cechy drewna oraz finansuje wdrożenie

uzyskanych gatunków transgenicznych drzew do produkcji. Dla przykładu, spółka

ArborGen llc. przeprowadza testy hodowlane transgenicznej topoli na 50 poletkach

doświadczalnych głównie w USA, Brazylii i Nowej Zelandii (dla gatunków Pinus i

Populus), gdzie produkcja transgenicznych sadzonek P. taeda wynosi ok. 150000

sztuk rocznie.

Główne przeszkody (finansowe) napotykane w hodowli i obrocie drzew

genetycznie zmodyfikowanych dotyczą następujących kwestii:

1) koszt wyprodukowania transgenicznych linii w laboratorium jest duży, gdyż

wymaga często prowadzenia badań podstawowych na temat struktury i funkcji

genu, który ma być przeniesiony z obcego organizmu (bakterii, innej rośliny) do

komórki np. topoli,

2) złożony wpływ transgenu na ekologię gatunku w warunkach polowych

wymaga długoterminowych, kosztownych badań. Wraz z niekontrolowanym

przepływem pyłku, może nastąpić krzyżowanie transgenu z formami dzikimi

gatunku, dlatego wymagane są badania prowadzone na szeroką skalę nad

zasięgiem, efektywnością zapylenia, żywotnością mieszańców (modelowanie

komputerowe)

3) koszt patentów, licencji, zgody na publikacje przy wykonywaniu badań z

transgenem niosącym korzyści handlowe (np. przyrostu biomasy), jeśli wymaga

tego prawo,

4) koszty przechowywania dokumentacji i zgodności z przepisami, które mogą

być bardzo wymagające i prawnie ryzykowne dla złożonych programów

obejmujących wiele lat i miejsc objętych uprawą,

5) brak gwarancji, że ustalenia prawne nie ulegną zmianie (np. w interpretacji) w

trakcie długiego testowania lub wprowadzania w obrót handlowy produktu GMO,

6) ryzyko nieumyślnego uwolnienia do środowiska transgenów, które może mieć

miejsce podczas przedwcześnie zakończonych doświadczeń polowych,

pozostawienia plantacji na długi czas po osiągnięciu przez gatunek fazy

kwitnienia, używanie genotypów niekomercyjnych, lub prowadzenia plantacji na

16

geograficznie odległych siedliskach, bez uprzedniego zbadania wpływu

transgenu na środowisko,

7) czynniki zniechęcające do podejmowania kosztownych i ryzykownych badań,

w przypadku ewentualnego odrzucenia popytu rynku na dany produkt GMO i

koszty rozwiązania umowy wynikające z własności genów i metod transferu

genów, będących zazwyczaj w rękach hodowców i producentów drzew, którzy

w większości pokrywają koszty badań w terenie.

Przeszkody te, napotykane również w hodowli roślin uprawnych, wymusiły na

przedsiębiorstwach i rządach państw zaostrzenie przepisów prawnych, które stawiają

szereg wymogów odnośnie zastosowania biotechnologii w środowisku rolnym. Na

przykład w USA, gdzie jest najmniej sprzeciwu społecznego wobec upraw GMO,

planowane jest wprowadzenie obostrzeń warunków upraw polowych w tzw. modelu

eko-genetycznym, czyli po kilkudziesięcioletnim badaniu wpływu transgenu na

lokalne genotypy gatunku w konkretnych warunkach środowiska.

Pierwszym krokiem, do 2030 roku w hodowli drzew transgenicznych powinno

być uzyskanie sterylnych linii, u których nie dochodzi do wytworzenia kwiatów, pyłku i

nasion. Obecnie, wciąż trwają prace nad wyhodowaniem sterylnych mutantów u

roślin modelowych, w tym również topoli (Brunner et al. 2007). Średni koszt

wyhodowania jednej stabilnej linii mutantów (kilka lat) to około 10 000 USD.

Następnym etapem badań, do 2080 roku, będzie doskonalenie produktu –

zmodyfikowanego drzewa, w celu uzyskania precyzyjnych cech hodowlanych i

eliminacja genu markerowego (kodującego odporność na antybiotyki). Jeżeli celem

będzie długoterminowa uprawa leśna, przekraczająca wiek wejścia drzew w fazę

kwitnienia, w USA planuje się zastosowanie transgenów kodujących białka o wąskim

spektrum odporności, np. na patogenny grzyb Cryphonectria parasitica, który jest

główną przyczyną zamierania kasztanowca od początku 1900 w USA, lub na

chrząszcza z rodziny kózkowatych Anoplophora glabripennis pochodzącego z Chin.

Wprowadzenie transgenów hamujących rozwój dużej liczby gatunków – patogenów i

szkodników, niesie ryzyko eliminacji również pożytecznych gatunków bytujących na

drzewach.

Inny ważny aspekt to stabilność wprowadzonego genu do rośliny, gdyż często

fragmenty obcego DNA są eliminowane z jądra komórkowego w mechanizmach

segregacji genów w trakcie mejozy. Następne pokolenie nie posiada już

17

wprowadzonej nowej cechy do genomu i kosztowną procedurę transformacji należy

rozpocząć od nowa. W badaniu transmisji obcych genów w transgenicznym tytoniu

Nicotiana tabacum L., uzyskuje się tylko około 10% linii stabilnych genetycznie, tzn.

takich, których nasiona zawierają wprowadzony gen (obserwacje własne). Ośmioletni

monitoring 384 drzew transgenicznej topoli z genem BAR (odporność na herbicydy)

na plantacji w USA wykazał, że tylko 32 klony zachowały obcy gen w swoich

komórkach. Zachowanie transgenu w topoli może być jak dotąd jedynie

zagwarantowane dzięki wegetatywnemu rozmnażaniu (Brunner et al. 2007).

3. Propozycje zmian w istniejących regulacjach i systemach zarządzania

Nie proponuje się żadnych zmian z zapisie dokumentów regulujących

gospodarkę leśną w Polsce, gdyż potrzeba jeszcze wiele lat badań

interdyscyplinarnych zespołów naukowych aby wytworzyć stabilną, sterylną linię

transgenicznych drzew m.in. o właściwościach odporności na szkodliwe czynniki

biotyczne, o zwiększonej aktywności oksydazy enzymu Rubisco i większej

zawartości polisacharydów w ścianie komórkowej.

Zaproponować można jedynie działania edukacyjne i promocyjne w ośrodkach

prowadzących badania z zakresu biotechnologii drzew leśnych w Polsce, w celu

przybliżenia tej tematyki szerokiemu gronu odbiorców.

4. Podsumowanie

Wraz z pojawieniem się biotechnologii w sektorze leśnym, możliwe jest

zastosowanie rozwiązań genetycznych, ukierunkowanych na produkcję drzew o

zwiększonej biomasie, oraz odpornych na szkodliwe czynniki biotyczne (patogeny i

owady) i abiotyczne (np. wynikające z nagromadzenia składników odżywczych w

glebie). Dzięki wyhodowaniu odmian drzew zmodyfikowanych genetycznie, możliwa

będzie produkcja surowca drzewnego na terenach poddanych antropopresji, przy

zachowaniu pozaprodukcyjnych funkcji lasu, w tym: bytowanie innych gatunków

roślin i drzew, ochrona przed wiatrami, walory rekreacyjne, oraz sekwestracja

dwutlenku węgla w biomasie.

18

Obecnie, 35 krajów prowadzi badania nad 19 gatunkami GMT, z czego 2/3 ma

miejsce w USA. W Chinach jest ponad 500 ha plantacji klonów Populus nigra z

wprowadzonym genem toksyny Bt. W Europie, w prowadzeniu badań i hodowli GMO

obowiązują przepisy prawne: Protokół Kartageński, Konwencja IPPC i Dyrektywa UE

2003/556/EC.

W Polsce, aspekty prawne regulujące zakres badań laboratoryjnych i polowych,

oraz obrót materiałem modyfikowanym genetycznie zawiera ustawa z dnia 22

czerwca 2001 r. o organizmach genetycznie zmodyfikowanych (Dz. U. z 2007 r. Nr

36, poz. 233 z późn. zm.), w szczególności ustawa ta ukierunkowana jest na

czynności kontrolne takie, jak:

sprawdzenie danych użytkownika przeprowadzającego zamierzone

uwolnienie;

sprawdzenie zgodności miejsca zamierzonego uwolnienia z miejscem

określonym w decyzji w sprawie zamierzonego uwolnienia oraz

oznaczenia tego miejsca;

sprawdzenie izolacji przestrzennej miejsca dokonywania zamierzonego

uwolnienia;

sprawdzenie dokumentów związanych z prowadzeniem zamierzonego

uwalniania roślin genetycznie zmodyfikowanych;

sprawdzenie sposobu realizacji przez wnioskodawców warunków

wynikających z posiadanych decyzji Ministra Środowiska.

Warunki przekazywania sprawozdań z przebiegu prowadzonych doświadczeń

polowych są podane na formularzach określonych w załączniku do decyzji Komisji

2003/701/WE z dnia 29 września 2003 r., ustanawiającej zgodnie z dyrektywą

2001/18/WE Parlamentu Europejskiego i Rady UE formularz w odniesieniu do

przedstawiania wyników zamierzonego uwalniania do środowiska zmodyfikowanych

genetycznie roślin wyższych do celów innych niż wprowadzanie do obrotu (Dz. Urz.

UE L 254).

Rekomendacją do Narodowego Programu Leśnego jest utworzenie platformy

badań w zakresie:

19

1) genomiki funkcjonalnej gatunków drzewiastych, ukierunkowanej na

doskonalenie warsztatu (stabilność transgenu, metoda transformacji,

sterylność drzew),

2) opracowania intelektualnego prawa własności transgenu (fragmentu DNA) i

drzewa GMO. Obecnie, każdy element DNA użytego do konstrukcji transgenu

(sekwencje promotora, genu, terminatora) są własnością intelektualną

podmiotów, które nie biorą udziału w komercjalizacji końcowego produktu,

3) prowadzenia "Zarządzania adaptacyjnego" i określenia kosztów licencji w

związku z wysokimi kosztami i długimi terminami prowadzenia upraw drzew

transgenicznych,

4) przejrzystości polityki w prowadzeniu upraw genetycznie zmodyfikowanych

drzew, informowaniu społeczeństwa o prowadzeniu takich upraw,

przeprowadzeniu bilansu zysków i strat (ekonomicznych, ekologicznych i

społecznych).

Literatura źródłowa:

Almeida A.M., Silva A.B., Arau S. S., Cardoso L.A., Santos D.M., Torne J.M., Silva J.M., Paul M.J.,

Fevereiro P.S. 2007. Responses to water withdrawal of tobacco plants genetically engineered with the AtTPS1 gene: a special reference to photosynthetic parameters. Euphytica 154: 113–126.

Aronen T., Häggman H. 1995. Eur J. For. Pathology 25: 197-213.

Brunner A.M., Li J., DiFazio S.P., Shevchenko O., Montgomery B.E., Mohamed R., Wei H., Ma C., Elias A.A., VanWormer K., Strauss S.H. 2007. Genetic containment of forest plantations. Tree Genetics & Genomes DOI 10.1007/s11295-006-0067-8.

Campbell M. M., Brunner A. M., Jones H. M., Strauss S. H. (2003), Plant Biotechnol. J. 1: 141-154.

Coleman H.D., Canam T., Kang K.Y., Ellis D.D., Mansfield S.D. 2007. Overexpression of UDP-glucose pyrophosphorylase in hybrid poplar affects carbon allocation. Journal of Experimental Botany 58: 4257-4268.

Forest and genetically modified trees. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), Rome, 2010.

Fossdal C. G., Sharma P., Lönnenborg A. (2001), Plant Mol. Biol. 47(3): 423-435.

Franke R., McMichael C.M., Meyer K., Shirley A.M., Cusumano J.C., Chapple C. 2000. Modified lignin in tobacco and poplar plants overexpressing the Arabidopsis gene encoding ferulate 5-hydroxylase. The Plant Journal 22: 223-234.

Gallardo F., Fu J., Cantón F. R., Garcia-Gutiérrez A., Cánovas F. M., Kirby E. G. 1999. Planta 210: 19-26.

Gelernter W., Schwab G. E. 1993. Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: theory and practice. Edited by P. F. Entwistle, J. S. Corry, M. J. Ailey and S. Higgs. 1993 John Wiley & Sons Ltd., pp. 90-104.

Hu W. J., Harding S. A., Lung J., Popko J. L., Ralph J., Stokke D. D., Tsai C. J., Chiang V. L. 1999. Nature Biotechnol. 17: 808-812.

20

Jouanin L., Goujon T., de Nadai V., Martin M.-T., Mila I., Vallet C., Pollet B., Yoshinaga A., Chabbert B., Petit-Conil M., Lapierre C. 2000. Lignification in transgenic poplars with extremely reduced caffeic acid O-methyltransferase activity. Plant Physiology 123: 1363-1374.

Kebeish R. M. A. 2006. Construction and molecular analysis of genetically modified C3 plants expressing a glycolate oxidizing pathway inside the chloroplast. Rozpr. Dokt. Institute for Biology I (Botany and Molecular Genetics), Aachen, Niemcy, 182 pp.

Kellison R. 2007. Value-added products from forest biotechnology. Euphytica 154: 279–288. Kellison R.C., Balocchi C.E., Valenzuela S., Rodriguez J. 2007. Forest biotechnology: an extension of

tree improvement. International Journal of Biotechnology 9: 448-459.

Lelu M. A., Bastien C., Drugeault A., Gouez A. L., Klimaszewska K. 1999. Physiol. Plantarum 105: 719-728.

Lieman-Hurwitz J., Rachmilevitch S., Mittler R., Marcus Y., Kaplan A. 2003. Enhanced photosynthesis and growth of transgenic plants that express ictB, a gene involved in HCO3 accumulation in cyanobacteria. Plant Biotechnology 1: 43-50.

Lipka V., Häusler R. E., Rademacher T., Li J., Hirsch H. J., Kreuzaler, F. 1999. Solanum tuberosum double transgenic expressing phosphoenolpyruvate carboxylase and NADP-malic enzyme display reduced electron requirement for CO2 fixation. Plant Sci. 144: 93-105.

Lu S., Sun Y.-H., Shi R., Clark C., Li L., Chiang V.L. 2005. Novel and mechanical stressresponsive microRNAs in Populus trichocarpa that are absent from Arabidopsis. Plant Cell 17: 2186-2203.

Normile D. 1999. Genetic engineers aim to soup up crop photosynthesis. Science 283: 314-316. Nowakowska J. 2004. Zastosowanie roślin transgenicznych w leśnictwie – perspektywy i zagrożenia.

Biotechnologia 3(66): 78-86. Nowakowska J. 2011. Drzewa GMO leśnictwie – iluzja czy przyszłość ? Oikos 12/2011: 16-17. Nowakowska J. A. 2008. Czy w naszych lasach będą rosły drzewa GMO ? Notatnik Naukowy IBL

1(80)/2008(XVI), 4 pp. Nowakowska J.A. 2006. Detekcja ekspresji genów drzew leśnych za pomocą mikromacierzy DNA.

Sylwan 4: 33-43. Peña L., Séguin A. 2001. Trends Biotechnol. 19(12): 500-506.

Salyaev R., Rekoslavskaya N., Chepinoga A., Mapelli S., Pacovsky R. 2006. Transgenic poplar with enhanced growth by introduction of the ugt and acb genes. New Forests 32: 211-229.

Shani Z., Dekel M., Tsabary G., Goren R., Shoseyov O. 2004. Growth enhancement of transgenic poplar plants by overexpression of Arabidopsis thaliana endo-1,4-b-glucanase (cel1). Molecular Breeding 14: 321-330.

Strauss S. H., Campbell M. M., Pryor S. N., Coventry P., Burley J. 2001. J. of Forestry 99(12): 4-7.

Tuskan G.A., DiFazio S., Jansson S. et al. 2006. The genome of black cottonwood, Populus trichocarpa (Torr & Gray). Science 313(5793): 1596-1604.

Tzfira T., Zuker A., Altman A. 1998. Trends Biotechnol. 16: 439-446.

Wenk A. R., Quinn M., Whetten R. W., Pullman G., Sederoff R. 1999. Plant Mol. Biol. 39: 407-416.

Zelitch I. 1989. Selection and characterization of tobacco plants with novel O2 resistant photosynthesis. Plant Physiology 90: 1457-1464.