las nanopartÍculas de Óxido de cerio como...
TRANSCRIPT
LAS NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE CERIO COMO
HERRAMIENTA TERAPÉUTICA PARA LA REGENERACIÓN
TISULAR EN LAS ENFERMEDADES HEPÁTICAS
Wladimiro Jiménez Povedano
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Víctor Franco Puntes
Institut Català de Nanotecnologia UAB
2
3
1. Resumen del proyecto
En este proyecto se evaluó si las propiedades antioxidantes y de regeneración tisular
de las nanopartículas (NP) de CeO2 podrían funcionar como herramienta terapéutica
para mejorar la fibrosis hepática y la regeneración del hígado en las enfermedades
hepáticas. El proyecto se dividió en 7 protocolos independientes dirigidos a:
Protocolo A: caracterizar y sintetizar CeO2NP.
Protocolo B: caracterizar la evolución físico-química de las CeO2NP en medios
biológicos.
Protocolo C: evaluar el efecto de las CeO2NP sobre la liberación de mediadores
inflamatorios in vitro.
Protocolo D: analizar la distribución tisular de CeO2NP y su presencia en los tejidos a lo
largo del estudio.
Protocolo E: determinar la biodistribución in vivo de CeO2NP.
Protocolo F: investigar el efecto de las CeO2NP sobre la expresión de factores
proinflamatorios (IL-1, IL-6, IL-10, TNF) o profibrogènicos (PDGFR, TGRβR1, Col1α2,
α-SMA, MMP-2 , MMP-9, genes TIMP-1 y TIMP-2), la hemodinámica sistémica, la
presión portal y el contenido de colágeno intrahepático en ratas con fibrosis hepática, y
Protocolo G: investigar los efectos de las CeO2NP en ratas con fibrosis hepática
sometidas a hepatectomía parcial.
2. Resultados
Protocolos A y B. Durante el presenta trabajo se han analizado en detalle los métodos
de síntesis existentes en la actualidad para producir CeO2NP de pequeño tamaño,
incluyendo los principales parámetros de las reacciones, los productos obtenidos y la
problemática relacionada con su facilidad de uso en biomedicina. Se han identificado
varias soluciones potenciales, como una optimización de la preparación de nanoceria,
recubrimientos biocompatibles, monodispersidad y pureza, todos ellas basadas en
datos experimentales. En particular, se han descrito los protocolos de obtención de
nanoceria con un tamaño óptimo. Las preparaciones de NP son de tamaño reducido,
altamente catalíticas, preparadas en fase acuosa, libres de endotoxina y libres de
agregados.
4
Para ofrecer un tamaño óptimo, no solo para aplicaciones in vitro, sino también in vivo
(evitando el aclarado renal), hemos descrito dos posibilidades de revestimiento
biocompatibles para las CeO2NP. Ello aumenta levemente el diámetro hidrodinámico de
las NP y limita su exclusión renal: uno de los revestimientos es la polivinilpirrolidona
(PVP) y el otro es la albúmina (BSA).
Protocolo C. Las propiedades antioxidantes
de las CeO2NP se evaluaron en HepG2.
Después de 24 horas en cultivo, las células
se incubaron con H2O2 y se trataron con
CeO2NP o vehículo. La expresión de genes
proinflamatorios se analizó por RT-PCR. La
incubación con H2O2 aumentó los niveles
celulares de ROS, pero en presencia de
CeO2NP, se observó una inhibición
significativa en la inducción de ROS
(792 ± 323 vs. 32,8 ± 2,7%, p <0,05). De
forma paralela, se redujo
significativamente la viabilidad celular al
incubar las células con H2O2 (69,2 ± 6,3%). Por el contrario, este parámetro se
mantuvo estable (95,9 ± 5%) en presencia de las CeO2NP (figura 1). Además, la
incubación con H2O2 aumentó la expresión de iNOS y otros genes implicados en el
metabolismo de ROS, mientras que el tratamiento con CeO2NP atenuó
significativamente la
sobreexpresión de estos genes.
Estos efectos de las CeO2NP en
hepatocitos humanos no se han
descrito previamente y establecen
nuevos conocimientos sobre los
mecanismos involucrados en los
efectos protectores in vivo de las
CeO2NP.
Protocolo D. Las CeO2NP se administraron a ratas con fibrosis experimental y se
recogieron muestras de orina. Al final del estudio, los animales se sacrificaron y se
evaluó la deposición de cerio en los diferentes órganos. Como se muestra en la figura
5
2, las CeO2NP se localizaron principalmente en hígado y bazo. Cantidades significativas
de cerio también se encontraron en riñones y pulmones. El cerio se detectó de manera
constante durante un máximo de 8 semanas en todos estos órganos.
Protocolo E. En este protocolo las ratas recibieron nanopartículas de óxido de hierro
(Fe3O4NP). Estas son NP magnéticas ampliamente utilizadas para rastrear la
biodistribución empleando técnicas de imagen por resonancia magnética (RMI). Los
animales se estudiaron a diferentes tiempos: a) 30 minutos antes de la administración,
en condiciones basales; b) 30 minutos después de la última dosis de Fe3O4NP; c) 90
minutos después de la última dosis de Fe3O4NPs; d) 4 semanas después de la
Figure 2: RMN images obtained 0, 30 and 90 minutes following FeNPs administration
última dosis de Fe3O4NP, y f) 7 semanas después de la última dosis de Fe3O4NP. La MRI
se realizó en un 7,0 T BioSpec 70/30 escáner (Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania)
equipado con un diámetro interior de 12 cm, blindado activamente y con un sistema de
gradiente (400 mT/m). Los resultados indican que las NP se localizan principalmente
en el hígado y el bazo y no llegan al cerebro. Además, las NP se mantienen de forma
duradera en los diferentes órganos, como mínimo hasta la séptima semana.
6
Protocol F. Los efectos de las CeO2NP
sobre la hemodinámica sistémica y la
expresión de diferentes genes se
evaluaron en ratas con fibrosis inducida
por CCl4 tratadas con CeO2NP (0,1
mg/kg.bw, n = 10) o vehículo (sales de
amonio TMAOH 0, 8 mM, n = 15). Tras la
administración de las NP, el protocolo de
inducción de fibrosis se mantuvo durante
8 semanas más. A continuación se
realizó un estudio hemodinámico. Las
muestras de tejido hepático se
conservaron a -80 ⁰C. Estas muestras
también se procesaron y tiñeron con
hematoxilina-eosina. El resultado más
importante del estudio fue que el
tratamiento con las NP dio lugar a una
disminución significativa en la esteatosis
hepática y a una reducción en el grado de
hipertensión portal. Además se obtuvieron
muestras hepáticas para evaluar la
expresión de α-SMA, o de genes relacionados con el fenotipo macrofágico o la actividad
inflamatoria o vasoactiva. Se observó una reducción significativa en la abundancia del
ARNm de citocinas proinflamatorias (TNFα, IL1β, COX-2, iNOS), ET-1 y mensajeros
relacionados con el estrés oxidativo (Epx, Ncf1, Ncf2) y del retículo endoplásmico (Atf3,
Hspa5). Esto se asoció a una
reducción en el infiltrado
macrofágico, disminución de
caspasa-3, α-SMA y citocinas
inflamatorias.
Protocol G. Un total de 45 ratas fueron divididas en dos grupos. En el primer grupo, las
ratas fueron tratadas con 0,1 mg/kg CeO2NP i.v. dos veces por semana durante dos
semanas antes de la hepatectomía parcial 2/3 (PHX). El segundo grupo recibió vehículo
CCl4-Rats
Control (n=10) Vehicle (n=15) CeO2NPs (n=10)
Inflammation
IL1β 1.02 ± 0.08 61.6 ± 10.52*** 33.71 ± 4.7*†
IL6 1.29 ± 0.32 1174 ± 246*** 647 ± 133*
IL10 1.09 ± 0.15 91.5 ± 21.1*** 54.4 ± 11.1**
TNFα 1.06 ± 0.12 60.4 ± 11.4*** 19.7 ± 5.1††
iNOS 1.04 ± 0.12 1139 ± 287** 141 ± 56††
COX-2 1.14 ± 0.17 121.2 ± 28.3*** 31.1 ± 5.1††
Macrophage phenotype
MRC2 1.06 ± 0.13 10.9 ± 2.17*** 6.49 ± 1.29*
CD163 1.01 ± 0.05 1.09 ± 0.1 0.85 ± 0.17
Arg1 1.03 ± 0.08 1.33 ± 0.16 1.78 ± 0.23*
Cell growth and differentiation
VEGF 1.02 ± 0.07 0.75 ± 0.07 0.87 ± 0.09
Apelin 1.15 ± 0.24 1.6 ± 0.26 1.13 ± 0.26
PPARγ 1.04 ± 0.11 0.63 ± 0.07* 1.19 ± 0.19††
Vasoactive activity
ET-1 1.05 ± 0.11 14.8 ± 2.85*** 6.91 ± 1.98†
eNOS 1.04 ± 0.09 1.56 ± 0.14 1.47 ± 0.24
COX-1 1.06 ± 0.15 2.77 ± 0.38** 2.72 ± 0.55*
Table 1: mRNA expression of inflammatory, macrophage phenotype, cell growth and vasoactive genes. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 compared with control group; †p<0.05, ††p<0.01 compared with vehicle group (one-way ANOVA with the Newman-Keuls post hoc test and the Kruskal-Wallis test with the Dunn post hoc test when appropriate).
7
como tratamiento control. La PHX
se realizó en dos grupos
experimentales que se
sacrificaron el sexto día después
de PHX. La relación “peso de
hígado remanente/peso corporal
total” se calculó para obtener el
índice de regeneración del
hígado. Los resultados más
relevantes fueron: 1) las ratas tratadas con CeO2NP mostraron un aumento de la
regeneración del hígado después de 2/3 de PHX. Las ratas tratadas con CeO2NP
mostraron un aumento significativo del 11%, en la regeneración del hígado, en
comparación con las ratas tratadas con vehículo (p <0,05; n = 12) (figura 3A).
Además, la disminución de los niveles
sanguíneos de las transaminasas y LDH
después de 3 horas post-PHX (n = 8),
sugieren citoprotección hepática (figura
3B); 2) las ratas tratadas con CeO2NP
mostraron un aumento de la
proliferación hepatocelular durante la
regeneración del hígado. Se observó un
aumento significativo en el número de
células Ki67 positivas en el hígado
remanente tras PHX, en
comparación con las ratas
tratadas con vehículo
(44,6 ± 4,5 vs.
38,59 ± 6,7% de células positivas, respectivamente;
p <0,05 n = 13); 3) el tratamiento con CeO2NP afecta el metabolismo lipídico durante
la regeneración. Se observó una disminución en la acumulación de lípidos en los
hígados de las ratas tratadas con CeO2NP, en comparación con las ratas tratadas con
vehículo (figura 4A); 4) las CeO2NP aumentan la progresión del ciclo celular in vitro. El
porcentaje de células HepG2 apoptóticas disminuyó significativamente en células
HepG2 tratadas con CeO2NP (1,62 ± 0,1 vs. 1,28 ± 0,1; porcentaje del total de células
p <0,01; n = 4). También disminuyó el porcentaje de células que estaban en G2/fase Figure 4
8
M (15,40 ± 0,5 vs. 13,69 ± 0,5; porcentaje del total de células p <0,05; n = 4) (figura
5A). Se midieron los niveles de expresión de caspasa-3 activa, como marcador de la
apoptosis y la ciclina D1 como marcador de la progresión del ciclo celular. La cantidad
de caspasa-3 activada se redujo significativamente en células HepG2 tratadas. Por el
contrario, la cantidad de ciclina D1 aumentó significativamente en las células tratadas
con CeO2NP (figura 5B). Estos hallazgos indican que el tratamiento con CeO2NP reduce
la apoptosis y aumenta la proliferación celular in Vitro; 5) las CeO2NP alteran la vía de
señalización de NFkB y reducen el estrés oxidativo in vitro (figura 6). En resumen, las
CeO2NP protegen contra la lesión hepática crónica mediante la reducción en la
esteatosis, la respuesta inflamatoria y la expresión de genes de estrés oxidativo en
ratas fibróticas y mejora la regeneración del hígado y disminuye el daño hepático en
ratas después de PHX. Además, las CeO2NP protegen contra la apoptosis inducida por
falta de nutrientes en células HepG2.
3. Relevancia y posibles implicaciones
Nuestros resultados indican que las CeO2NP presentan un potencial terapéutico muy
importante en las enfermedades asociadas con un desequilibrio en la producción de
radicales libres y en las que se produce un incremento en la abundancia de especies
reactivas de oxígeno. En este escenario, las CeO2NP emergen como particularmente
adecuadas para el tratamiento de enfermedades crónicas del hígado, ya que una vez
administradas presentan un emplazamiento preferentemente hepático y residen en
este órgano durante largos períodos de tiempo, favoreciendo la regeneración del tejido
y puede prevenir la progresión de la lesión hepática. Así pues, una vez hemos
demostrado la eficacia terapéutica de las CeO2NP in vitro y en modelos experimentales
in vivo, el desafío futuro es demostrar la seguridad y la utilidad terapéutica de las
CeO2NP en pacientes con enfermedad hepática crónica y, en particular, en la
enfermedad de hígado graso no alcohólico y el carcinoma hepatocelular.
9
4. Bibliografía científica generada
Artículos
Oró D, Yudina T, Fernández-Varo G, Casals E, Reichenbach V, Casals G, González de la
Presa B, Sandalinas S, Carvajal S, Puntes V, Jiménez W.
Cerium oxide nanoparticles reduce steatosis, portal hypertension and display
antiinflammatory properties in rats with liver fibrosis.
Journal of Hepatology , 2016;64 :691-8. doi: 10.1016/j.jhep.2015.10.020.
Cerium oxide nanoparticles reduce steatosis, portal hypertension and display
antiinflammatory properties in rats with liver fibrosis.
World Biomedical Frontiers. http://biomedfrontiers.org/newtech-2016-9/
E.Casals, J.Piella, G.Casals, W.Jimenez, V.Puntes.
Intrinsic and extrinsic Immunological Properties of Nanoparticles: The case of Cerium
Oxide.
Frontiers in Immunology (sometido a revisión).
J.Ribera, J. Rodríguez-Vita1, M.Pauta., D. Oró, T.Yudina, V.Puntes, W.Jiménez,
M.Morales-Ruiz.
Cerium oxide nanoparticles reverse the proinflammatory activation of the portal vein
endothelium in cirrhotic rats.
PlosOne (sometido a revisión).
Comunicaciones
D. Oró, G. Fernández-Varo, V. Reichenbach, T. Yudina, E. Casals, G. Casals, B.
Gonzalez de la Presa, V. Puntes, W. Jiménez.
Cerium Oxide Nanoparticles Reduce Portal Hypertension and Show Antiinflammatory
Properties in CCl4-Treated Rats.
NanoBio & Med 2014. Barcelona, Spain.
D. Oró, G. Fernández-Varo, V. Reichenbach, T. Yudina, E. Casals, G. Casals, B.
Gonzalez de la Presa, V. Puntes, W. Jiménez.
10
Cerium Oxide Nanoparticles Reduce Portal Hypertension and Show Antiinflammatory
Properties in CCl4-Treated Rat.
The Liver Meeting 2014. Boston, MA,USA.
D. Oró; G. Fernández-Varo; T. Yudina; G. Casals; B. González de la Presa; V. Puntes;
W. Jiménez.
Hepatoprotective Effect of CeO2 Nanoparticles in Rats Treated with CCl4.
49th International Liver Congress, European Association for the Study of the Liver
(2014). London, UK.
D. Oró; G. Fernández-Varo; E. Casals; G. Casals; B. González de la Presa; V. Puntes;
W. Jiménez.
Efecto hepatoprotector de las nanopartículas en ratas tratadas con CCl4.
XXXVIII Congreso de la Asociación Española para el Estudio del Hígado (AEEH).
Madrid (2013), Spain.
D. Oró, G. Fernández-Varo, T. Yudina, V. Reichenbach, E. Casals, G. Casals, B.
González de la Presa, S. Carvajal, S. Sandalinas, V. Puntes, W. Jiménez.
Las nanopartículas de oxido de cerio (CeO2NPs) reducen la hipertensión portal y
muestran capacidad anti inflamatoria en ratas con cirrosis.
40 Congreso de la Asociación Española para el Estudio del Hígado (AEEH).
(2015). Madrid (Spain)
A. Arce-Cerezo, J. Ribera, M. Pauta, D. Oró, G. Casals, G. Fernández-Varo, T. Yudina,
V. Puntes, M. Morales-Ruiz, W. Jiménez.
El tratamiento con nanopartículas de óxido de cerio (CeO2NPs) aumenta la
regeneración hepática tras hepatectomía parcial (PHx) en ratas.
41 Congreso de la Asociación Española para el Estudio del Hígado (AEEH).
(2016). Madrid (Spain).
M. Morales-Ruiz, A. Arce-Cerezo, M. Pauta, J.Ribera, D. Oró, G.Casals, G. Fernández-
Varo, T. Yudina, V. Puntes, W. Jiménez.
Cerium oxide nanoparticle treatment enhances liver regeneration after two-thirds
partial hepatectomy in rats.
The Liver Meeting 2015. San Francisco (USA)
11
D. Oró, T. Yudina, S. Carvajal, J.Ribera, S. Marfà, G.Fernández-Varo, V.Puntes, W.
Jiménez.
Las nanoparticulas de oxido de Cerio normalizan la viabilidad celular, reducen la
sobreexpresión de citoquinas proinflamatorias y protegen del stress oxidativo a las
células hepáticas humanas ‘in vitro’.
41 Congreso de la Asociación Española para el Estudio del Hígado (AEEH).
(2016). Madrid (Spain)