laporan tetap 5 protein secara biuret
TRANSCRIPT
I. Nomor Percobaan : V
II. Nama Percobaan : Penentuan Kadar Protein Secara Biuret
III. Tujuan Percobaan : Untuk menentukan kadar suatu protein dengan
menggunakan spektrometer
IV. Landasan Teori
Protein merupakan polimer asam amino. Ada puluh asam amino yang berbeda
merupakan penyusun protein alami. Protein dibedakan satu sama lain berdasarkan tipe,
jumlah dan susunan asam aminonya. Perbedaan ini menyebabkan perbedaan struktur
molekuler, kandungan nutrisi dan sifat fisikokimia. Protein merupakan konstituen penting
dalam makanan, dimana protein merupakn sumber energi sekaligus mengandung asam-
asam amino esensial seperti lysine, tryptophan, methionine, leucine, isoleucine dan valine
(esensial berarti penting bagi tubuh, namun tidak bisa disintesis dalam tubuh). Protein juga
merupakan komponen utama dalam berbagai makanan alami, yang menentukan tekstur
keseluruhan, misalnya keempukan produk daging atau ikan, dan sebagainya. Protein
terisolasi sering digunakan dalam makanan sebagai unsur kandungan (ingredient) karena
sifat atau fungsi uniknya, antara lain kemampuannya menghasilkan penampilanm tekstur
atau stabilitas yang diinginkan. Misalnya, protein digunakan sebagai agen pembentuk gel
(gelling agent), pengemulsi (emulsifier), pembentuk busa (foaming agent) dan pengental
(thickener). Beberapa protein makanan merupakan enzim yang mampi meningkatkan laju
reaksi biokimia tertentu, baik yang menguntungkan maupun yang merugikan merusak. Di
dalam analisis makanan, mengetahui kadar total, jenis, struktur molekul dan sifat
fungsional dari protein sangat penting.
Spektrofotometri adalah cara analisa kuantitatif berdasarkan transmitansi atau
absorban larutan terhadap cahaya pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan
instrumen spektrofotometer. Apabila suatu cahaya yang mengandung seluruh spektrum
dari panjang gelombang melewati suatu medium, misal kaca berwarna atau larutan yang
meneruskan cahaya dengan panjang gelombang tertentu dan menyerap cahaya yang
lainnya maka medium seakan-akan berwarna. Warna ini sesuai dengan panjang gelombang
yang diteruskan dan disebut sebagai warna komplementer.
Sejumlah metode telah ditemukan untuk pengukuran kadar protein berdasarkan
spektroskopi UV-visible. Metode ini berdasarkan kemampuan protein menyerap (atau
membaurkan) cahaya di daerah UV-visible. Atau secara kimiawi atau fisik memodifikasi
protein untuk membuatnya menyerap (atau membaurkan) cahaya di daerah UV-visible.
Prinsip dasar di balik masing-masing uji ini serupa. Pertama-tama, semua serapan kurva
kalibrasi (atau turbiditas) vs kadar protein disiapkan menggunakan satu seri larutan protein
yang sudah diketahui kadarnya. Serapan (atau turbiditas) larutan yang dianalisis kemudan
diukur pada panjang gelombang yang sama, dan kadar protein ditentukan dari kurva
kalibrasi. Perbedaan utama pengujian ini adalah gugus fungsi yang berperan untuk absorbsi
atau pembiasan radiasi elektromagnetik, misalnya ikatan peptida, rantai samping aromatis,
gugus inti dan agregat protein.
Sejumlah metode UV-visibe untuk penetapan kadar protein sebagai berikut :
a. Pengukuran langsung pada 280nm.
Tryptophan dan tyrosine mengabsorbsi kuat cahaya uv pada 280 nm. Kandungan
tryptophan dan tyrosine berbagai protein umumnya konstan sehingga serapan larutan
protein pada 280 nm dapat digunakan untuk menentukan kadarnya. Keuntungan metode ini
karena sederhana untuk dilakukan, non-destruktif, dan tidak dibutuhkan reagen khusus.
Kerugian utama : asam nukleat juga mengabsorbi kuat pada 280 nm dan sehingga
mengganggu pengukuran protein jika ada dalam kadar yang bermakna. Namun demikian,
metode ini telah berkembang untuk mengatasi masalah ini, antara lain dengan pengukuran
serapan pada dua panjang gelombang yang berbeda.
b. Metode Biuret
Warna violet akan terbentuk bila ion cupri (Cu2+) berinteraksi dengan ikatan
peptida dalam suasana basa. Reagen biuret, yang mengandung semua bahan kimia yang
diperlukan untuk analisis sudah tersedia di pasaran. Reagen ini dicampurkan dengan
larutan protein, didiamkan 15-30 menit, kemudian diukur serapannya pada 540 nm.
Keuntungan utama dari teknik ini adalah tidak adanya gangguan dari senyawa yang
menyerap pada panjang gelombang yang lebih rendah. Teknik ini kurang sensitif terhadap
jenis protein karena absorpsi yang terjadi melibatkan ikatan peptida yang ada di semua
protein, bukan pada gugus samping spesifik.
c. Metode Lowry
Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-
Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein.
Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 - 750 nm,
tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang
dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak
besar di sekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan
konsentrasi rendah. Metode ini lebih sensitif untuk protein dengan konsentrasi rendah
dibanding metode biuret.
d. Metode pengikatan pewarna
Pewarna dengan muatan negatif (anionik) ditambahkan dalam jumlah berlebih pada
larutan protein yang pH nya telah disesuaikan sehingga protein menjadi bermuatan positif
(misalnya dibuat di bawah titik isoelektrik). Protein membentuk kompleks tak larut dengan
pewarna karena interaksi elektrostatik antar molekul, tapi masih tersisa pewarna tak terikat
yang larut. Pewarna anionik berikatan dengan gugus kationik dari residu asam amino basa
(histidine, arganine dan lysine) dan pada gugus asam amino bebas di ujung. Jumlah
pewarna tak terikat yang tersisa setelah kompleks protein-pewarna dipisahkan (misalnya
dengan sentrifugasi) ditentukan dengan pengukuran serapan. Jumlah protein yang ada di
larutan awal berhubungan dengan jumlah pewarna yang terikat :
[Pewarnaterikat] = [Pewarnaawal] - [Pewarnabebas]
e. Metode Turbimetri
Molekul protein yang umumnya laruta dapat dibuat mengendap dengan
penambahan senyawa kimia tertentu, seperti asam trikloroasetat. Pengendapan protein
menyebabkan larutan menjadi keruh, sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan dengan
mengukur derajat kekeruhan (turbiditas).
Keuntungan dan kerugian menggunakan UV-visible
Keuntungan :
Teknik UV-visible merupakan teknik yang cepat dan sederhana, serta sensitif terhadap
protein dengan konsentrasi rendah.
Kerugian :
Sebagian besar teknik UV-visible memerlukan larutan yang encer dan jernih, serta
tidak mengandung senyawa kontaminan yang dapat mengabsorpsi atau memantulkan
cahaya pada panjang gelombang di mana protein akan dianalisis. Karena diperlukan
larutan jernih, maka makanan harus mengalami sejumlah tahap preparasi sampel sebelum
dianalisis, seperti homogenisasi, ekstraksi pelarut, sentrifugasi, filtrasi, dsb. yang dapat
menyita waktu dan tenaga. Selain itu, kadang-kadang sulit untuk secara kuantitatif
mengekstraksi protein dari jenis makanan tertentu, terutama bila makanan tersebut telah
mengalami proses dimana protein menjadi agregat atau terikat secara kovalen dengan
senyawa lain. Kelemahan lain adalah, serapan tergantung pada jenis protein (karena
protein yang berbeda mempunyai sekuens/urutan asam amino yang berbeda pula)
HUKUM LAMBERT-BEER
Lambert merumuskan hubungan antara absorbansi dan panjang gelombang yang
ditempuh sinar dalam larutan.
Log P 0P
= k1’ b ........................(1)
Dimana Log P 0P
= absorbansi
P = tenaga radiasi yang keluar medium
Po = tenaga radiasi yang masuk medium
b = tebal lapisan medium
Menurut Beer, absorbansi dipengaruhi oleh konsentrasi sehingga
Log P 0P
= k2’ c ........................(2)
Bila k1’ = f (c) dan k2’ = f (b) maka substitusi dari persamaan (1) dan (2) adalah :
Log P 0P
= f (c) b Log P 0P
= f (b) c
f (c) b = f (b) c
f (c)c
= f (b)
b = k
Maka Log P 0P
= f (c) b = f (b) c = k ∙ c ∙ b
Jika konsentrasi larutan dalam mol/liter maka k harus ditulis sebagai ε dimana ε =
absortivitas molar
Log P 0P
= ε b c
Jika konsentrasi larutan dalam gram/liter maka k harus ditulis sebagai a dimana a =
absortivitas
Log P 0P
= a b c
A = a b c
Jika absorbsi = Log P 0P
= transmitansi (T)
A = Log P 0P
= Log 1T
= - log T
% T = P 0P
x 100%
Metode least square
Metode Least Square dipilih untuk pendekatan spektrofotometer menurut Hukum
Beer yang merupakan dasar absorbsi.
A = a b c
Dimana :
a = absortivitas c = konsentrasi zat pengabsorbsi
b = tebal cuvet
Bila A dialirkan untuk c terhadap cuplikan yang tebalnya b cm akan menghasilkan
daerah dimana hukum Beer berlaku suatu garis lurus dengan lereng ab.
A
C
Tetapi secara instrumentasi didapat grafik yang kurang memenuhi hubungan linier
antara absorbsi dan konsentrasi pada penentuan absorbansi larutan sehingga untuk
memenuhi hukum Beer kurva A vs C dipakai metode Least Square.
y = mx + c
dimana :
y = absorbansi
m = bilangan tetap (konstanta)
x = kadar larutan seri
Sedangkan m=n ∑ xy−∑ x ∑ y
n ∑ x2−(∑ x )2
c = ∑ x2∑ y−∑ x ∑ xy
n ∑ x2−(∑ x )2
V. Alat dan Bahan
Alat :
- Rak tabung reaksi
- Beker gelas
- Pipet tetes
- Spektrometer
- Tabung reaksi
- Gelas ukur
- Batang pengaduk
Bahan :
- reagen-reagen
reagen biuret : Larutkan 1,5 gr CuSO4.5H2O dan 6,0 gr natrium kalium tartrat (NaK
C4O6.4H2O) kedalam kira-kira 500 ml air di labu takar 1 liter. Kemudian tambahkan
300 ml 10 % NaOH sambil d ikocok-kocok. Dan akhirnya tambahkan air sampai garis.
Larutan biru ini dapat disimpan lama sekali. Apabila pembuatannnya kurang baik
dapat terjadi endapan hitam atau merah. Reagen yang demikian tidak boleh dipakai.
Larutan protein : buatlah larutan serum albumin murni atau kasein dalam air yang
berkadar 10 mg per ml. untuk mudah larutannya tambahkan beberapa tetes 3 %
NaOH.
VI. Prosedur Percobaan
Pipet kedalam tabung reaksi 1 ml larutan protein yang mengandung 1 sampai 10
mg per ml. tambahkan 4 ml reagen biuret. Kocok dan diamkan selama 30 menit pada suhu
kamar. Baca serapannya pada 540 nm. Untuk blanko dipakai campuran 1 ml air dan 4 ml
reagen biuret yang juga didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Hukum lambert-beer
berlaku untuk larutan-larutan protein antara 1 dan 10 mg per ml.
VII. Hasil Pengamatan
Konsentrasi Kasein
(mg/ml)
Adsorbansi (A)
albumin
Adsorbansi (A)
blanko
1 0,199 0,148
2 0,249 0,137
3 0,299 0,154
4 0,341 0,153
5 0,465 0,141
6 0,561 0,142
7 0,592 0,146
8 0,598 0,141
9 0,623 0,142
10 0,676 0,141
Absorbansi Sampel : 0.536
VIII. Reaksi Kimia
IX. Analisa Data
X Y XY X2
1 0,199 0,199 12 0,249 0,498 43 0,299 0,897 94 0,341 1,364 165 0,465 2,325 256 0,561 3,366 367 0,592 4,144 498 0,598 4,784 649 0,623 5,607 8110 0,676 6,76 100
X= 55 Y= 4,603 XY = 29,944 X2 = 385
N . XY - X . Y Slope (A) =
N . X2 – (X)2
10(29,944) – 55 (4,603) =
10 (385) – (55)2
= 0,056091
Y . X2 - X . XY Intersep =
N . X2 – (X)2
4,603(385) – 55 (29,944) =
10 . 385 – (55)2
= 0,1518
Y = AX+ B
Y = 0,06 X + 0,15 Y = 0.06 X + 0.15 = 0,06 (1) + 0,15 = 0.06 (6) + 0.15 = 0,21 = 0.51Y = 0,06 X + 0,15 Y = 0.06 X + 0.15 = 0,06 (2) + 0,15 = 0.06 (7) + 0.15 = 0,27 = 0.57Y = 0,06 X + 0,15 Y = 0.06 X + 0.15 = 0,06 (3) + 0,15 = 0.06 (8) + 0.15 = 0,33 = 0.63Y = 0,06 X + 0,15 Y = 0.06 X + 0.15 = 0,06 (4) + 0,15 = 0.06 (9) + 0.15 = 0,39 =0.69Y = 0,06 X + 0,15 Y = 0.06 X + 0.15 = 0,06 (5) + 0,15 = 0.06 (10) + 0.15 = 0,45 = 0.75
X 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Y 0.15 0.21 0.27 0.33 0.39 0.45 0.51 0.57 0.63 0.69 0.75
Grafik Hubungan antara Konsentrasi Albumin dan Adsorbansi Albumin
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.150.21
0.270.33
0.390.45
0.510.57
0.630.69
0.75
Grafik Hubungan antara Konsentrasi Albumin dan Adsorbansi Albumin dalam
regresi linear
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
0.10.20.30.40.50.60.70.8
0.150.21
0.270.330000000
000001
0.390000000000001
0.450.51
0.570.630000000
000001
0.690000000000001
0.750000000000001
kadar albumin
abso
rban
si
Dengan menggunakan kurva standar konsentrasi vs absorban maka konsentrasi
sample X
yang memiliki Absorbansi= 0.536 dapat ditentukan dengan rumus berikut :
A6
C6=
Ax
C x
0.5616
=0.536
X
0.561 . x = 0.536 .6
x = 3.2160.561
x = 5.73
X. Pembahasan
Spektrofotometri adalah cara analisa kuantitatif berdasarkan transmitansi atau
absorban larutan terhadap cahaya pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan
instrumen spektrofotometer. Terdapat beberapa metode spektrofotometri untuk penetapan
kadar protein yaitu Pengukuran langsung pada 280nm, Metode Biuret, Metode Lowry,
Metode pengikatan pewarna dan Metode Turbimetri. Namun pada percobaan kali ini
penentuan kadar protein dengan menggunakan metode biuret. Dimana protein yang akan di
uji adalah larutan albumin.
Pada percobaan kali ini, larutan protein di buat dari 1 sampai 9 mg per ml yang di
encerkan dari larutan albumin 10%. Setelah larutan protein dibuat lalu dimasukkan dalam
tabung reaksi dan semua tabung tadi ditambahkan dengan 4 ml reagen biuret dan dikocok
lalu diamkan selama 30 menit. Pada saat sampel dikocok, jangan sampai menimbulkan
buih karena akan mempengaruhi pengukuran absorbansi. Dan setelah ditetesi pereaksi
biuret, sampel didiamkan selama 30 menit. 30 menit ini merupakan operating time yaitu
waktu yang dibutuhkan agar seluruh reaktan/protein bereaksi seluruhnya dengan reagen.
Setelah 30 menit, maka sampel diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer dengan
panjang gelombang 540 nm. Panjang gelombang 540 nm merupakan panjang gelombang
serapan maksimum untuk warna ungu. Selain itu digunakan juga larutan blanko, larutan
blanko merupakan larutan tidak berisi analit. Larutan blanko biasanya digunakan untuk
tujuan kalibrasi sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri. Larutan blanko
diberi perlakuan yang sama seperti larutan albumin.
Setelah itu akan terlihat warna biru ungu pada semua tabung reaksi tadi.
Pembentukan warna biru ungu, ini menunjukkan adanya pembentukan senyawa kompleks
dengan Cu+2. Pengukuran nilai absorbansi larutan menggunakan suatu alat ukur yaitu
spectrometer UV pada panjang gelombang 540 nm, dengan alat ukur ini kita dapat secara
sfesifik mengukur absorbansi atau % T dari senyawa yang mengandung unsure logam,
oleh sebab itulah larutan standar ditambahkan dengan reagen biuret yaitu reagen yang
mengandung ion logam dalam hal ini adalah Cu2+.
Dalam pereaksi biuret terkandung 3 macam reagen yaitu reagen yang pertama
adalah CuSO4 dalam aquadest dimana reagen ini berfungsi sebagai penyedia ion Cu2+ yang
nantinya akan membentuk kompleks dengan protein. Reagen yang kedua adalah K-Na-
Tartrat yang berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak
mengendap. Reagen yang ketiga adalah NaOH dimana fungsinya adalah membuat suasana
basa. Suasana basa akan membantu pembentukan Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi
Cu2+ dan 2OH-. Dari hasil pengukuran pada spektrofotometer, didapatlah harga absorbansi
pada masing-masing konsentrasi yaitu 0.249, 0.299, 0.341, 0.465, 0.561, 0.592, 0.598,
0.623, 0.676. Data tersebut menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi harga
absorbansi yang didapat semakin besar. Hal ini sesuai dengan hukum Lambert-Beer yang
menyatakan bahwa hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi yang berbanding lurus,
yaitu semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula absorbansinya.
XI. Kesimpulan
1. Pada percobaan penentuan kadar protein secara biuret, terjadi pembentukan warna
biru ungu, ini menunjukkan adanya pembentukan senyawa kompleks dengan Cu2+.
2. Penentuan kadar protein secara biuret didasarkan pada pengukuran serapan cahaya
oleh ikatan kompleks yang bewarna ungu.
3. Semakin tinggi konsentrasi larutan protein maka semakin banyak ikatan peptida
dalam larutan yang menyebabkan pembentukan kompleks semakin banyak, ini
dapat dilihat dari warna biru ungu yang semakin pekat.
4. Pengukuran nilai absorbansi larutan menggunakan suatu alat ukur yaitu
spektrometer UV pada panjang gelombang 540 nm.
5. Panjang gelombang 540 nm merupakan panjang gelombang serapan maksimum
untuk warna ungu
6. Semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula daya serapnya.
XII. Daftar Pustaka
Anonim. (2012,Juni 09). Penentapan Totap Protein Serum Dengan Metode Biuret. Dipetik Mei 08, 2013, dari Blogspot: http://smart-fresh.blogspot.com/2012/06/penetapan-total-protein-serum-dengan.html
Poedjiadi, Anna.1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI-Press.
Lehninger.1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga.
Lesmana, I. (2011,Maret 01). Fungsi Larutan Blanko. Dipetik Mei 08, 2013, dari Blogspot: http://indralesman.blogspot.com/2011_03_01_archive.html
Lampiran :
a. Gambar Alat
Pipet tetes Beaker Gelas Gelas Ukur
Erlenmeyer Spektometer
b. Jawaban Pertanyaan
1. Buatlah standar kurva dan tetapkan kadar protein larutan protein yang diberikan
1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
0.10.20.30.40.50.60.70.8
Konsentrasi Albumin
Adso
rban
Karena diketahui harga adsorbansi sampel sebesar 0,536 maka konsentrasi
sampelnya terletak antara 5-6 mg/ml
A6
C6=
Ax
C x
0.5616
=0.536
X
0.561 . x = 0.536 .6
x = 3.2160.561
x = 5.73
2. Berikan penjelasan tentang hukum Lambert-beer
Jawab : Hukum lambert-beer menyatakan hubungan antara konsentrasi dengan
adsorbansi yang semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula absorbansinya.
Hal ini ditunjukkan dengan bentuk kurva yang linear antara konsentrasi dan
adsorbannya.
3. Senyawa apakah yang dapat menganggu cara biuret seperti di atas ?
Jawab : Senyawa yang memberikan endapan warna hitam atau merah pada reagen
biuret yaitu garam amonia. Jika hal tersebut terbentuk maka reagen biuret tidak
terbentuk.
4. Mengapa reaksi tersebut juga disebut dengan reaksi biuret ?
Jawab : Karena menggunakan reagen biuret
5. Senyawa kompleks apa yang terjadi ?
Jawab : Senyawa kompleks bewarna ungu
6. Apakah peptida juga memberikan reaksi biuret, jika memberikan, berikan penjelasan
dan bagaimana cara menentukan kadar protein yang bercampur di dalam peptide ?
Jawab : Ya, karena pada uji tersebut berfungsi untuk menunjukkan adanya ikatan
peptida pada molekul protein dengan memberikan efek warna ungu. Cara
menentukannya yaitu dengan menambahkan reagen biuret pada larutan protein
dengan pengukuran adsorbansi.