laporan protein dg metode biuret
DESCRIPTION
Laporan Biokimia 2TRANSCRIPT
A. Judul Percobaan : Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret
B. Mulai Percobaan : Senin, 28 Oktober 2013
C. Selesai Percobaan : Senin, 28 Oktober 2013
D. Tujuan :
Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan metode
Biuret.
E. Dasar Teori :
Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa selain polisakarida,
lipid dan polinukleotida yang merupakan penyusun utama makhluk hidup.
Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang
merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan
satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein itu sendiri
mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitroge dan kadang kala sulfur serta
fosfor. Protein dirumuskan oleh Jons Jakob Berzelius pada tahun 1938.
Struktur protein ada 4 tingkatan yaitu :
1. Struktur primer menunjukkan jumlah, jenis, dan urutan asam amino
dalam molekul protein (rentetan asam amino dalam suatu molekul
protein)
2. Struktur sekunder menunjukkan banyak sifat suatu protein, ditentukan
oleh orientasi molekul sebagai suatu keseluruhan, bentuk suatu molekul
protein (misalnya spiral) dan penataan ruang kerangkanya (ikatan
hidrogen antara gugus N-H, salah satu residu asam amino dengan gugus
karbonil C=O residu asam yang lain)
3. Struktur tersier menunjukkan keadaan kecenderungan polipeptida
membentuk lipatan tali gabungan (interaksi lebih lanjut seperti
terlipatnya kerangka untuk membentuk suatu bulatan)
4. Struktur kuartener menunjukkan derajat persekutuan unit-unit protein.
Ditinjau dari strukturnya, protein dapat dibagi dalam 2 golongan yaitu:
1. Protein sederhana yang merupakan protein yang hanya terdiri atas
molekul-molekul asam amino
2. Protein gabungan yang merupakan protein yang terdiri atas protein dan
gugus bukan protein. Gugus ini disebut gugus prostetik dan terdiri atas
karbohidrat, lipid atau asam nukleat.
Protein sederhana menurut bentuk molekulnya dibagi menjadi 2 kelompok,
yaitu:
1. Protein fiber. Molekul protein ini terdiri atas beberapa rantai polipeptida
yang memanjang dan dihubungkan satu sama lain oleh beberapa ikatan
silang hingga merupakan bentuk serat atau serabut yang stabil. Protein
fiber tidak larut dalam pelarut-pelarut encer, baik larutan garam, asam,
basa ataupun alkohol. Berat molekulnya yang besar belum dapat
ditentukan dengan pati dan sukar dimurnikan. Kegunaan protein ini
hanya untuk membentuk struktur jaringan dan bahan, contohnya adalah
keratin pada rambut.
2. Protein globular. rotein globular pada umumnya berbentuk bulat atau
elips dan terdiri atas rantai polipeptida yang terlibat. Protein
globular/speroprotein berbentuk bola, protein ini larut dalam larutan
garam dan asam encer, juga lebih mudah berubah di bawah pengaruh
suhu, konsentrasi asam dan asam encer. Protein ini mudah terdenaturasi.
Banyak terdapat pada susu, telur dan daging.
Reaksi-reaksi kahas pada protein (uji kualitatif)
1. Reaksi Ninhidrin. Ninhidrin beraksi dengan asam amino bebas da
protein menghasilkan warna biru. Reaksi ini termasuk yang paling umum
dilakukan untuk analisis kualitatif protein dan produk hasil hidrolisisnya.
Reaksi ninhidrin dapat pula dilakukan terhadap urin untuk mengetahui
adanya asam amino atau untuk mengetahui adanya pelepasan protein
oleh cairan tubuh.
2. Reaksi Biuret. Bila larutan protein dalam suasana basa kuat direaksikan
dengan larutan CuSO4 pekat, akan dihasilkan warna ungu. Warna yang
dihasilkan dari reaksi tersebut disebabkan oleh ikatan koordinasi antara
ion Cu2+ dengan pasangan elektron bebas dari N yang berasal dari
protein dan pasangan elektron bebas dari O molekul air. Reaksi ini tidak
berlaku untuk peptida.
3. Reaksi Uji Millon untuk Tirosin. Reagen Millon adalah larutan asam
nitrat yang mangandung raksa (I) nitrat dan raksa (II) nitrat. Bila reagn
millon dicampurkan dengan larutan yang mengandung protein akan
terbentuk endapan putih yang akan berubah merah bila dipanaskan.
4. Uji Penetralan Titik Isoelektrik. Titik isoelektrik adalah daereah pH
tertentu dimana protein mempunyai selisih muatan, sehingga tidak
bergerak dalam muatan listrik
Biuret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida yang terbentuk pada pemanasan
dua mulekul urea. Ion Cu2+ dari preaksi Biuret dalam suasana basa akan berekasi
dengan polipeptida atau ikatan-ikatn peptida yang menyusun protein membentuk
senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua
buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau
dipeptida.
Isi dari pereaksi biuret adalah Kalium hidroksida (KOH), Tembaga (II) sulfat
(CuSO4), Kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6). Pembuatan reagen biuret:
Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat
(KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian
tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya
tambahkan aquades sampai garis tanda.
F. Alat Dan Bahan:
Tabung reaksi
Larutan standar protein
Larutan sampel protein
Spektrofotometer UV-VIS
Reagen biuret
G. Alur Percobaan
1. Pembuatan standar
2. Penetapan Absorbansi Larutan Blanko
1 ml larutan standar protein
Dimasukkan dalam tabung reaksi I,II,III,IV,V dengan kadar protein
1 mg/ml
2 mg/ml
3 mg/ml
4 mg/ml
5 mg/ml
-+ 4 ml reagen biuret pada masing masing tabung reaksi
-Dikocok-Diinkubasikan 30 menit pada suhu
ruangan -Diukur absorbansinya pada λ optimum
dengan alat spektronik
hasil
1 ml aquades
- Dimasukkan ke dalam tabung reaksi- + 4 ml reagen biuret - Dikocok- Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu
kamar- Diukur absorbansinya pada λ optimum
hasil
3. Penetapan absorbansi larutan sampel
1 ml sampel
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
+ 4 ml reagen biuret
Dikocok
Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu kamar
Diukur absorbansinya pada λ optimum
hasil
H. Hasil Pengamatan
No. Prosedur kerja Hasil pengamatan Dugaan reaksi KesimpulanSebelum Sesudah
1. Pembuatan standar Larutan standar protein :Cair, jernih, tidak berwarna
Reagen biuret : Cair,jernih , biru (+++)
Larutan standar protein 1 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu(+)
Larutan standar protein 2 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (++)
Larutan standar protein 3 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (+++)
Larutan standar protein 4 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (++++)
Larutan standar protein 5 mg/ml + reagen biuret : jernih ungu (+++++)
Larutan basa Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein sehingga menghasilkan warna ungu dengan absorbansi dari panjang gelombang 520 nm.
Konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi panjang gelombang maksimum. Semakin tinggi konsentrasi maka semakin ungu warna larutannya.
Persamaan linear yang didapat dari kurva standar protein :Y = 0,0503x – 0,0281
Konsentrasi rata-rata sampel: 0,8171 mg/mL
1 ml larutan standar protein
Dimasukkan dalam tabung reaksi I,II,III,IV,V dengan kadar protein
1 mg/ml
2 mg/ml
3 mg/ml
4 mg/ml
5 mg/ml
-+ 4 ml reagen biuret pada masing masing tabung reaksi
-Dikocok-Diinkubasikan 30 menit pada suhu
ruangan -Diukur absorbansinya pada λ
optimum dengan alat spektronik
hasil
2.Penetapan Absorbansi Larutan Blanko
Aquades : jernih tak berwarnaReagen biuret : jernih biru (+++)
Blanko = biruMelalui excel, didapatkan persamaan Y = 0,0503x – 0,0281R2 = 0,936
Persamaan berdasarkan kurvaY = 0,0503x – 0,0281
Konsentrasi sampel1 = 1,03582 = 0,73763 = 0,6779Konsentrasi rata-rata sampel = 0,8171 mg/mL
1 ml aquades
hasil
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
+ 4 ml reagen biuret
Dikocok
Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu kamar
Diukur absorbansinya pada λ optimum
3. Penetapan absorbansi larutan sampel Sampel : jernih tak berwarna Reagen biuret : jernih biru
1 ml sampel
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
+ 4 ml reagen biuret
Dikocok
Diinkubasi selama 30 menit dalam suhu kamar
Diukur absorbansinya pada λ optimum
hasil
I. Analisis Data
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein yang ada pada
sampel dengan menggunakan metode biuret. Dengan adanya ikatan peptida, ion
tembaga (II) pada reagen biuret membentuk senyawa kompleks berwarna ungu
dalam larutan alkali. Penentuan protein secara biuret didasarkan atas pengukuran
serapan cahaya (absorbansi) oleh oleh senyawa kompleks yang berwarna ungu
menggunakan prinsip spektrofotometri UV-VIS. Reaksi biuret dapat digunakan
untuk menentukan konsentrasi protein karena ikatan peptida muncul dengan
frekuensi yang sama per asam amino dalam peptida. Sesuai dengan hukum
Lambert-beer, konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada
panjang gelombang maksimum.
1. Pembuatan Standar
Pembuatan serta penetapan absorbansi larutan standard bertujuan untuk
membuat kurva standar dimana diperlukan larutan standar protein dengan
konsentrasi 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml dan 5 mg/ml.. Larutan standar
dibuat dari pengenceran larutan awal 10 mg/ml yang berupa larutan jernih tidak
berwarna. Pengenceran didasarkan pada persamaan:
M1 x V1 = M2 x V2
Labu ukur yang digunakan untuk pengenceran adalah labu ukur 20 ml.
Konsentrasi
awal (M1)
Volume yang
diencerkan (V1)
Konsentrasi hasil
pengenceran (M2)
Volume hasil
pengenceran (V2)
10 mg/ml 10 ml 5 mg/ml 20 ml
5 mg/ml 16 ml 4 mg/ml 20 ml
4 mg/ml 15 ml 3 mg/ml 20 ml
3 mg/ml 13,3 ml 2 mg/ml 20 ml
2 mg/ml 10 ml 1 mg/ml 20 ml
Hasil pengenceran berupa larutan tidak berwarna.
Sebanyak 5 tabung reaksi diisi masing-masing 1 mL larutan standar
protein dengan kadar 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, dan 5 mg/ml. Setelah
itu ditambahkan 4 ml reagen biuret ke dalam masing-masing tabung. Reagen
biuret ini berfungsi untuk mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein.
Reagen ini mengandung NaOH dan CuSO4. Secara teori pada penambahan reagen
biuret akan menghasilkan warna ungu dimana warna ungu dihasilkan dari reaksi
antara reagen biuret dengan protein yang menghasilkan suatu senyawa kompleks.
Warna dari larutan protein berbeda-beda dari berbagai konsentrasi. Semakin besar
konsentrasi yang digunakan maka semakin pekat warna yang terbentuk, dan
begitu juga sebaliknya. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:
Hasil penambahan tabung dengan reagen biuret:
Tabung 1 (1 mg/ml): ungu
Tabung 2 (2 mg/ml): ungu (+)
Tabung 3 (3 mg/ml): ungu (++)
Tabung 4 (4 mg/ml): ungu (+++)
Tabung 5 (5 mg/ml): ungu (++++)
Setelah penambahan biuret, larutan dikocok dan diinkubasikan pada suhu 37oC
selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil atau sempurna.
Inkubasi menggunakan penangas air, suhunya diukur sampai 37oC, kemudian
diambil lalu dimasukkan tabung reaksi ke dalam gelas kimia yang berisi air.
Inkubasi/pemanasan yang dilakukan untuk mempertajam warna dari hasil reaksi
larutan protein dengan reagen biuret. Kemudian diukur absorbansi masing-masing
larutan pada masing-masing larutan pada panjang gelombang 520 nm dengan alat
spektrofotometri UV-VIS.
Tabel hasil absorbansi masing-masing larutan standart:
konsentrasi (mg/ml) absorbansi0,000 0,0001,000 0,0092,000 0,0343,000 0,1244,000 0,1975,000 0,221
Kurva standar
Kurva ini menunjukkan bahwa hasil percobaan sesuai dengan teori bahwa
konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada panjang gelombang
maksimum. Semakin tinggi konsentrasi larutan maka semakin ungu warna
larutan, hal ini mengakibatkan cahaya yang diserap lebih tinggi yang
menyebabkan nilai absorbansinya lebih tinggi. Dan didapatkan persamaan y =
0,0503x – 0,0281, dengan nilai regresi kelinearan = 0,936. Seharusnya didapatkan
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.0000.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
f(x) = 0.0502571428571429 x − 0.0281428571428572R² = 0.935959537598483
KURVA STANDART BIURET
absorbansi
kons
entr
asi (
mg/
ml)
hasil regresi 0,99 untuk mendapatkan hasil absorbansi yang maksimal. Hal ini
akan dibahas dalam diskusi.
2. Penetapan absorbansi larutan blanko
Penetapan absorbansi larutan blanko berfungsi sebagai faktor pengurang
dari absorbansi standar dan sampel karena standar dan sampel tidak murni namun
hasil dari pengenceran yang ditambah aquades. Tabung reaksi diisi 1 ml aquades,
kemudian ditambahkan 4 ml reagen biuret ke dalam tabung. Reagen biuret ini
berfungsi untuk mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein. Aquades
tidak mengandung protein jadi warna larutan menjadi seperti reagen biuret, yaitu
biru muda. Lalu diinkubasikan pada suhu 37oC selama 10 menit sampai terbentuk
warna ungu yang stabil atau sempurna. Inkubasi menggunakan penangas air,
suhunya diukur sampai 37oC, kemudian diambil lalu dimasukkan tabung reaksi ke
dalam gelas kimia yang berisi air. Inkubasi/pemanasan yang dilakukan untuk
mempertajam warna dari hasil reaksi larutan dengan reagen biuret. Kemudian
diukur absorbansi aquades pada panjang gelombang 520 nm dengan alat
spektrofotometri UV-VIS. Hasil absorbansi ini sebagai faktor pengurang dari
absorbansi standar dan sampel karena standar dan sampel tidak murni namun hasil
dari pengenceran yang ditambah aquades.
3. Penetapan absorbansi larutan sampel
Penetapan hasil absorbansi ini digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel.
Tabung reaksi diisi 1 ml sampel, kemudian ditambahkan 4 ml reagen biuret ke
dalam tabung. Warnanya menjadi biru. Reagen biuret ini berfungsi untuk
mengidentifikasi adanya ikatan peptida pada protein. Lalu diinkubasikan pada
suhu 37oC selama 10 menit sampai terbentuk warna ungu yang stabil atau
sempurna. Inkubasi menggunakan penangas air, suhunya diukur sampai 37oC,
kemudian diambil lalu dimasukkan tabung reaksi ke dalam gelas kimia yang
berisi air. Inkubasi/pemanasan yang dilakukan untuk mempertajam warna dari
hasil reaksi larutan dengan reagen biuret. Kemudian diukur absorbansi aquades
pada panjang gelombang 520 nm dengan alat spektrofotometri UV-VIS.
Perlakuan ini diulangi tiga kali. Hasil absorbansi yang didapat: 0,024, 0,009, dan
0,006. Dengan menggunakan persamaan linear yang didapat dari kurva standar
protein y = 0,0503x – 0,0281. Didapatkan konsentrasi sampel berturut-turut
1,0358; 0,7376; dan 0,6779. Konsntrasi rata-rata pada sampel = 0,8171 mg/ml.
J. Diskusi
Nilai regresi kelinearan yang didapat dari hasil percobaan = 0,936.
Seharusnya didapatkan hasil regresi 0,99 untuk mendapatkan hasil absorbansi
yang maksimal. Hasil ini dikarenakan kekurangtelitian kami dalam melakukan
pengenceran larutan standar, kurang teliti dalam mengambil volume larutan yang
tidak tepat. Selain itu juga dapat dikarenakan proses inkubasi yang dilakukan
belum maksimal dan warna belum mengembang.
K. Kesimpulan
Dari hasil percobaan dapat kami simpulkan sebagai berikut :
Konsentrasi protein berbanding lurus dengan absorbansi pada panjang
gelombang maksimum. Semakin tinggi konsentrasi larutan maka semakin
ungu warna larutan, hal ini mengakibatkan cahaya yang diserap lebih tinggi
yang menyebabkan nilai absorbansinya lebih tinggi.
Hasil absorbansi larutan blanko digunakan sebagai faktor pengurang dari
absorbansi standar dan sampel.
Persamaan linear yang didapat dari kurva standar protein y = 0,0503x –
0,0281.
Konsentrasi rata-rata sampel = 0,8171 mg/ml.
L. Daftar Pustaka
Fesenden, J Ralp, dan Joan S. Fessenden. 2006. Kimia Organik Jilid 2.
Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka. Jakarta: Erlangga.
Lehninger, Albert L. 1992. Dasar-dasar Biokimia. Terjemahan Maggy
Thenawidjaja. Jakarta: Erlangga.
Tim. 2013. Penuntun Praktikum Biokimia. Surabaya : Universitas Negeri
Surabaya.
M. Jawaban Pertanyaan
1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva
standar tersebut tentukan kadar protein sampel!
Tabel
konsentrasi (mg/ml) absorbansi0,000 0,0001,000 0,0092,000 0,0343,000 0,1244,000 0,1975,000 0,221
Kurva standar
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.0000.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
f(x) = 0.0502571428571429 x − 0.0281428571428572R² = 0.935959537598483
KURVA STANDART BIURET
absorbansi
kons
entr
asi (
mg/
ml)
2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi Biuret?
Jika benar demikian, bagaimana menentukan kadar protein yang tercampur
dengan peptida?
Peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret, hal ini
dibuktikan dengan terbentuknya larutan berwarna ungu jika peptida
direaksikan dengan reagen biuret. Cara penentuan kadarnya juga seperti cara
penentuan kadar protein seperti yang dilakukan pada analisis diatas yaitu
dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-VIS. Karena ikatan peptida
dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu yang dapat dibaca oleh
alat tersebut.
LAMPIRAN PERHITUNGAN
Untuk 5 mg/ml
M 1V 1=M2 V 2
10 ×V 1=5× 20
10 V 1=100
V 1=10 ml
Untuk 4 mg/ml
M 1V 1=M2 V 2
5 ×V 1=4 × 20
5 V 1=80
V 1=16 ml
Untuk 3 mg/ml
M 1V 1=M2 V 2
4 ×V 1=3 × 20
4 V 1=60
V 1=15 ml
Untuk 2 mg/ml
M 1V 1=M2 V 2
3 ×V 1=2× 20
3 V 1=40
V 1=13,3 ml
Untuk 1 mg/ml
M 1V 1=M2 V 2
2 ×V 1=1×20
2 V 1=20
V 1=10 ml
Lampiran tabel konsentrasi terhadap absorbansi
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.0000.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
f(x) = 0.0502571428571429 x − 0.0281428571428572R² = 0.935959537598483
KURVA STANDART BIURET
absorbansi
kons
entr
asi (
mg/
ml)
konsentrasi (mg/ml) absorbansi0,000 0,0001,000 0,0092,000 0,0343,000 0,1244,000 0,1975,000 0,221
Konsentrasi pada sampel:
Sampel 1
y = 0,0503x – 0,0281
0,024 = 0,0503x – 0,0281
0,0521 = 0,0503x
X = 1,0358
Sampel 2
y = 0,0503x – 0,0281
0,009 = 0,0503x – 0,0281
0,0371 = 0,0503x
X = 0,7376
Sampel 3
y = 0,0503x – 0,0281
0,006 = 0,0503x – 0,0281
0,0341 = 0,0503x
X = 0,6779
Jadi konsentrasi sampel rata-rata,
konsentrasi rata−rata=1,0358+0,7376+0,67793
=0,8171mg /ml
LAMPIRAN FOTO
Alat yang digunakan
Proses pengenceran
1 – 5 ppmLarutan yang digunakan
Penambahan BiuretProses Inkubasi