laporan isolasi dna kromosom dan plasmid
TRANSCRIPT
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
1/24
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
2/24
BAB I/ PENDA0,L,AN
1/1 LATAR BELAKAN
Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit mononukleotida, jika
unit - unit pembangunnya dioksinukleotida maka asam nukleat itu disebut dioksiribonukleat
(DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida disebut asam ribonukleat (RNA). DNA
dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit
mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3
suatu mononukleotida dan posisi ! pada mononukleotida lainnya ("arpet, #$%&).
Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat
(RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam
nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai
urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein
tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer
yang disebut nukleotida (Dage, #$$').
Dua tipe utama asam nukleat adalah asam dioksiribonukleat (DNA) dan asam
ribonukleat (RNA). DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban
kode genetik dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-
sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel
mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA (mRNA),
meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme
itu sesuai dengan kode DNA-nya(fessenden, #$$&).
eskipun banyak memiliki persamaan dengan DNA, RNA memiliki perbedaan
dengan DNA, antara lain yaitu(oedjiati, #$$*)+a. agian pentosa RNA adalah ribosa, sedangkan bagian pentosa DNA adalah
dioksiribosa.
b. entuk molekul DNA adalah heliks ganda, bentuk molekul RNA berupa rantai tunggal
yang terlipat, sehingga menyerupai rantai ganda.
. RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin seperti DNA tetapi tidak
mengandung timin, sebagai gantinya RNA mengandung urasil.
d. umlah guanin dalam molekul RNA tidak perlu sama dengan sitosin, demikian pula
jumlah adenin, tidak perlu sama dengan urasil.
/elain itu perbedaan RNA dengan DNA yang lain adalah dalam hal (/uryo, #$$') +
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
3/24
#. 0kuran dan bentuk
ada umumnya molekul RNA lebih pendek dari molekul DNA. DNA berbentuk double heli1,
sedangkan RNA berbentuk pita tunggal. eskipun demikian pada beberapa 2irus tanaman,
RNA merupakan pita double namun tidak terpilih sebagai spiral.
'. /usunan kimia
olekul RNA juga merupakan polimer nukleotida, perbedaannya dengan DNA yaitu+
a. ula yang menyusunnya bukan dioksiribosa, melainkan ribosa.
b. asa pirimidin yang menyusunnya bukan timin seperti DNA, tetapi urasil.
3. 4okasi
DNA pada umumnya terdapat di kromosom, sedangkan RNA tergantung dari maamnya,
yaitu+
• RNAd (RNA duta), terdapat dalam nukleus, RNA d dietak oleh salah satu pita DNA
yang berlangsung didalam nukleus.
• RNAp (RNA pemindah) atau RNA t(RNA transfer), terdapat di sitoplasma.
• RNAr (RNA ribosom), terdapat didalam ribosom.
*. 5ungsinya
DNA berfungsi memberikan informasi atau keterangan genetik, sedangkan fungsi RNA
tergantung dari maamnya, yaitu+
• RNAd, menerima informasi genetik dari DNA, prosesnya dinamakan transkripsi,
berlangsung didalam inti sel.
• RNAt, mengikat asam amino yang ada di sitoplasma.
• RNAt, mensintesa protein dengan menggunakan bahan asam amino, proses ini
berlangsung di ribosom dan hasil akhir berupa polipeptida.
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, he6an dan tumbuhan terdapat di
dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast.
enyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA
genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal
dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. ada organisme tingkat
rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri)
atau dibungkus oleh protein tertentu (pada 2irus). 7romosom eukariot berbentuk linear
sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. /elain itu prokariot juga mengandung satu
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
4/24
atau lebih plasmid. lasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih
keil dibanding kromosom.
• Isolasi DNA k&omosom/
rinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-
komponen sel lain. /umber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia.
embran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian
pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan
RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA.
/elanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu $&89 untuk menginaktifasi en:im yang
mendegradasi DNA (DNase). 4arutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa
dilarutkan lagi dengan air.
• Isolasi DNA plasmi2
DNA plasmid merupakan 6adah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA
plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh
lebih keil daripada DNA kromosom. 0ntuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan
perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. ertama, membran sel dilisis dengan
penambahan detergen. roses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA,
protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan
potasium. DNA ; protein ; potasium yang mengendap dipisahkan dengan ara sentrifugasi.
/upernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan.
7emudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya
DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.
• Isolasi RNA
RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein.
umlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA eukariot dapat
dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida d
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
5/24
DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini munul berbagai
teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. rinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses
untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. "asil ekstraksi tersebut
merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. =leh sebab itu dalam pelaksanaannya
harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi.
/eara kimia6i penghanuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senya6a kimia
seperti >DDn:im proteinase 7 dapat digunakan untuk menghanurkan protein. 7otoran akibat lisis
sel dipisahkan dengan ara sentrifugasi. 7emudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang
telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol.
Dalam proses ini sebagian keil RNA juga dapat dibersihkan. /edangkan holoform
digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. >n:im
RNAase digunakan untuk menghanurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi seara utuh.
emurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan menampur larutan DNA tersebut
dengan Na9l yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan
mengendapkan DNA se6aktu diampur dengan ethanol. roses sentrifugasi dengan keepatan
tinggi akan mengendapkan tepung ber6arna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung
ependorf.
ada manusia, hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. Agar
lebih efisien, isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. =leh sebab itu sampel
darah total (whole blood ) yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum, sel darah
merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat ) dengan teknik sentrifugasi. /etelahdisentrifugasi, sampel darah total akan terbagi menjadi tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas
merupakan serum, lapisan tengah ber6arna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat ) dan
lapisan ba6ah adalah sel darah merah. 4apisan kedua yang merupakan sel darah putih diambil
dengan klinipette.
olekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai maam
keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. ?solasi DNA dilakukan
dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan
karbohidrat. risnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghanuran (lisis), ektraksi
atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
6/24
Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus
menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA@ metodenya harus
efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah
struktur dan fungsi molekul DNA@ dan metodenya harus sederhana dan epat.
?solasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. /alah satu prinsip isolasi DNA
yaitu dengan sentrifugasi. /entrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan ampuran
berdasarkan berat molekul komponennya. molekul yang mempunyai beratmolekul besar akan
berada di bagian ba6ah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung
(ader, #$$3)
/etiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut
sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Disamping DNA kromosom, beberapa bakteri
juga mengandung DNA ekstrakromosom yang disebut DNA plasmid. erbeda dengan DNA
kromosom, DNA plasmid berbentuk sirkular dengan ukuran yang jauh lebih keil dibanding
DNA kromosom. DNA plasmid hanya berukuran #.&&&-'&&.&&& pasang basa. DNA plasmid
terdapat bebas di dalam sitoplasma, dan dapat melakukan replikasi seara autonom.
ada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki ber2ariasi bahkan sampai ribuan ataupun
tidak memiliki plasmid. lasmid bisa saja tidak terdapat pada bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi ketahanan hidup bakteri tersebut. lasmid hanya memberikan
sifat istime6a yang dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik.
eberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antaralain+ dapat ditransfer ke
bakteri lain dan memiliki =R? (Origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa
pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik =R? hingga semua plasmid
tereplikasi. lasmid memba6a informasi genetik dan mengalami replikasi untuk
menghasilkan plasmid yang identik dan diturunkan selama pembelahan sel (affar, '&&).
lasmid sering digunakan sebagai 2ektor untuk memba6a gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang. =leh karena itu, perlu diperoleh plasmid yang tidak
terkontaminasi dengan kromosom agar diperoleh produk yang diinginkan.
erdasarkan fungsinya plasmid dapat dikelompokkan menjadi+
• 5ertility- 5 plasmids
erupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel bakteri lain untuk proses
konjugasi. lasmid ini juga mempunyai kemampuan untuk mentransfer DNA atau gen baik
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
7/24
yang terdapat dalam plasmid ataupun dalam kromosom. lasmid ditemukan antara lain
pada Escherichia coli, Pseudomonas sp, dan Streptomyces.
• Resistane- R plasmids
engandung gen yang resisten terhadap antibiotik atau raun dan inhibitor pertumbuhanlainnya. lasmid R dapat ditemukan pada Staphylococcus.
• lasmid penyandi baterioins
aterioins adalah senya6a yang diproduksi oleh bakteri untuk menghambat
pertumbuhan atau bakteri lain yang spesises atau galurnya berbeda. lasmid ini
mengandung gen struktural baterioins ataupun gen yang mengkode protein yang
berperan dalam pemrosesan dan transport baterioins. enamaan plasmid ini tergantung
pada organisme yang memproduksinya.isalnya plasmid 9ol pada bakteri Escherichia
coli yang mengkode oliins.• Degradati2e plasmids
erupakan plasmid yang mampu menerna subsansi yang tidak biasa, ontoh toluen dan
asam salisilat.
• Birulene plasmids
erupakan plasmid yang menjadikan bakteri tersebut patogen.
erbagai maam bentuk plasmid akan mempengaruhi keepatan migrasi plasmid dalam
elektroforesis. >lektroforesis adalah proses migrasi dari fragmen DNA di dalam gel yang
direndam dalam larutan buffer. 0rutan migrasi bentuk-bentuk plasmid tersebut dari yang
paling epat adalah superoiled, superoiled denaturated, rela1ed irular, dan niked open
irular. entuk plasmid yang semakin keil atau ramping akan lebih mudah bergerak melalui
pori gel agarose sehingga akan menapai bagian ba6ah terlebih dahulu. erjalanan molekul
DNA di dalam gel mengikuti arus listrik, dari kutub negati2e menuju kutub positif. /emakin
besar tegangan arus listrik, perjalanan molekul DNA akan makin epat, demikian pula
sebaliknya. Ada bermaam- maam :at kimia yang digunakan sebagai gel di dalam proses
elektrofoesis. enggunaan jenis gel disesuaikan denga tujuan yang akan diapai. Ada dua araelektroforesis, yaitu elektroforesis gel agarose dengan 2isualisasi menggunakan ethidium
bromide dan elektroforesis gel polyarilamide dengan 2isualisasi menggunakan sil2er
staining.
Ada berbagai maam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid
digunakan sebagai 2ektor untuk kloning DNA. /elain itu plasmid juga banyak digunakan
untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Alasan
utama pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki opy number yang
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
8/24
besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu. 7arena plasmid memiliki fungsi
yang bisa dimanfaatkan keuntungannya, maka ada banyak ara yang digunakan untuk
mengisolasi plasmid tersebut. lasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. roses ini dikenal
sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar #-'&Cg. /edangkan untuk
jumlah yang lebih besar (#&&-'&&Cg) digunakan midi preparation dan maxi preparation untuk
jumlah yang lebih besar dari '&& Cg.
Dalam isolasi DNA plasmid biasanya diperoleh plasmid dalam 3 topologi, yaitu+
o2alently losed irulair (), open irulair (o), dan linier (l). ?solasi plasmid bertujuan
untuk mengisolasi atau memisahkan plasmid dari molekul-molekul lain yang terdapat di
dalam sel (/uryani, dkk. '#).
7eberhasilan tahapan isolasi bergantung pada sumber bahan, konsentrasi bahan,
stabilitas, dan kadar kemurnian produk akhir. ?solasi plasmid terdiri dari tiga tahapan
kegiatan, yaitu tahap kulti2asi dan pemanenan atau har2esting, tahap lisis dan tahap
pemurnian DNA plasmid. 7ulti2asi yaitu proses reproduksi bakteri sehingga pada saat
pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. erusakan (lisis) dinding sel
bakteri dapat dilakukan dengan ara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh
maupun dengan ara kimia6i menggunakan larutan lisis. lasmid yang diperoleh dimurnikan
dari berbagai kontaminan dengan penambahan fenol (ro6n '&&3).
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
9/24
plasma dan membran inti baik dengan ara mekanik maupun seara kimia6i. enambahan
detergen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena detergen dapat menyebabkan rusaknya
membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik detregen dengan protein
dan lemak pada membran membentuk senya6a lipid protein kompleks ( ahfud, '&& ).
aam-maam detergen yang digunakan juga berpengaruh pada hasil dari isolasi
DNA dengan kualitas baik karena kandungan pada masing masing detergen berbeda. ada
proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodeyl sulphate (/D/)
sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan
membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi akti2itas en:im nuklease yang
merupakan en:im pendegradasi DNA. /elain digunakan /D/, detergen yang lain seperti etyl
trimethylammonium bromide (9
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
10/24
/etelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan penuian dengan etanol, maka
etanol kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk
menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. enghilangan residu etanol dilakukan dengan
ara e2aporasi karena etanol mudah menguap. ada tahap penuian biasanya etanol
diampur dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu memisahkan kontaminan
yang tidak diinginkan seperti dN< ads dari Escherichia coliG
1/3 T,.,AN
• ahasis6a mampu melakukan isolasi DNA kromosom bakteri
• ahasis6a mengetahui dan mampu mengisolasi plasmid rekombinan p>< ads dari
bakteri Escherichia coli
1/( MAN+AAT
Dapat melakukan isolasi DNA kromosom (interselular) maupun plasmid
(ekstraselular) pada suatu bakteri
BAB II/ METODE PRAKTIK,M
/1 ALAT DAN BA0AN
• ISOLASI DNA KROMOSOM
Alat
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
11/24
- /entrifuse
- Borte1
- /haker ?nubator
- emanas air
-5ree:er
-
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
12/24
- /olution ??? (& m4 ! potasium asetat, ##.! m4 asam asetat glasial, '%.! m4
aEuadest)
- 9? (henolI9hloroformI?soamilalkohol)
- ufer
- >tanol pa
- Na asetat
/ CARA KER.A
• ISOLASI DNA KROMOSOM
• ISOLASI DNA PLASMID
embiakan dan emanenan akteri
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
13/24
?solasi plasmid
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
14/24
BAB III/ 0ASIL PENAMATAN DAN PEMBA0ASAN
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
15/24
• ISOLASI DNA KROMOSOM
ada praktikum kali ini kami melakukan perobaan isolasi DNA kromosom bakteri,
untuk mengisolasi DNA kromosom bakteri ini perlu dilakukan beberapa langkah yaitu
menumbuhkan bakteri dan pemanenan bakteri untuk mendapatkan sel yang ukup kemudian
pemeahan dinding sel bakteri dan yang terakhir pemurnian atau pemisahan kromosom dari
komponen-komponen sel lainnya.
enanaman untuk menumbuhkan sel bakteri dapat dilakukan dengan membiakkan
bakteri E!coli rekombinan yang diambil dari 4 padat dan ditumbuhkan di 4 air kemudiandishaker inkubasi selama #% jam pada suhu 3J9 dengan keepatan #!& rpm. Alasan
digunakannya shaker inkubator yaitu untuk meningkatkan aerasi sehingga mempermudah
dalam meratakan bakteri didalam media dan akhirnya pertumbuhan bakteri akan lebih
banyak.
/etelah penanaman yaitu dilakukan pemanenan, pemanenan dilakukan dengan ara
mengambil # ml biakan bakteri masukkan eppendorf #,! ml kemudian disentrifugasi selama !
menit keepatan #'.&&& rpm dengan keepatan ini maka akan mengendapkan sel-sel dari
bakteri sehingga yang diambil adalah natannya sedangkan supernatan dibuang. 7emudian
natan yang diperoleh diui dengan #ml / dan disentrifugasi lagi selama ! menit dengan
keepatan #'.&&& rpm penuian ini bertujuan untuk menghilangkan sisa-sisa media
supernatan. /etelah selesai penuian maka natan tadi disimpan pada suhu -'&J9.
emeahan dinding sel bakteri pada perobaan ini menggunakan metode "eat-/hok
yang dilakukan dengan ara mendidihkan pelet yang beku akibat disimpan disuhu -'&J9 tadi
selama * menit kemudian dilarutkan dengan !&Cl aEuabidest steril kemudian diresuspensi.
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
16/24
0ntuk mengisolasi DNA plasmid perlu dilakukan beberapa langkah yaitu penanaman
bakteri pada suatu media 4 air, pemanenan dan lisis sel bakteri serta pemurnian plasmid
DNA yang dilakukan dengan ekstraksi dengan pelarut organik atau metode kromatografi.
enumbuhan bakteri ini dilakukan dengan tujuan memperbanyak bakteri sehingga didapat sel
yang ukup untuk dilakukan dengan tujuan memperbanyak bakteri sehingga didapat sel yang
ukup untuk dilakukan proses selanjutnya. /ehari setelah penumbuhan bakteri dilakukan
pemanenan bakteri yang diambil sebanyak #,! ml dan dimasukkan ke tabuang eppendorf,
dilakukan pemeahanIlisis sel dengan sentrifugasi bakteri yang ada dalam tabung eppendorf
setelah ! menit. /upernatan (airan) sel dibuang, artinya DNA kromosom berada pada bagian
yang tidak larut yaitu pelet sel. roses sentrifuse di lakuakan sebanyak 3 kali berturut-turut
dengan tujuan mendapatkan pelet sel yang lebih banyak. "asilnya diresuspensi dengan
solution ? sebanyak #&&Cl dan di2orte1, lalu ditambah solution ?? sebanyak '&& Cl dengan
ara memipet #&& Cl /D/ #H dari #&H dan Na=" &,' N dari #& N sebanyak '& Cl serta
aEuadest steril %%& Cl dan dibolak-balik -% kali. 4alu, diinkubasi selama ! menit sampai
bening di es maka akan terjadi lisis dan diambil supernatannya. Ditambahkan #!& Cl solution
??? dan bolak-balik -% kali dan disimpan dalam es selama ! menit, lalu disentrifugasi dan
dipindahkan pada eppendorf baru. 0kur 2olume supernatan yaitu *!& Cl dan tambahkan 9?
dengan 2olume yang sama, di2orte1 dan sentrifus kembali (jangan lupa untuk memakai
sarung tangan saat bekerja dengan 9?). Diambil lapisan atas, ditambahkan etanol p.a ',!
kalinya dari *&& Cl dan Na asetat 3 sebanyak &,# kalinya dari 2olume supernatan saja yaitu
*&& Cl. Dilakukan presipitasi dengan suhu -'&89 didalam lemari es selama # jam, lalu
eppendorf ini disentrifugasi lagi dan diambil peletnya (residu) dan diui dengan etanol
dingin &H dengan ara resuspensi, lalu disentrifus lagi. /elanjutnya, pelet dikerngkan dalam
'& Cl buffer D
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
17/24
(/1 KESIMP,LAN
• ?solasi DNA adalah proses pemisahan DNA yang diinginkan dari molekul yang tidak
diinginkan.• lasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dapat replikasi otonom dan sebagai
2ektor transfer DNA.
• 4angkah isolasi adalah menumbuhkan bakteri, memanen bakteri, melisiskan dinding
sel bakteri dan pemisahan serta pemurnian plasmid DNA dari komponen lainnya.
(/ SARAN
?solasi DNA kromosom dan isolasi DNA plasmid harusnya dilakukan seara hati-hati
supaya tidak terkontaminasi pada tubuh.
BAB -/ DA+TAR P,STAKA
Dage ,Kohanis #$$'. "iokimia Dasar .andung+ enerbit Rekayasa /ains.
5esseden, Ronald A. '&&*. #in$auan %linis &asil Pemeriksaan 'aboratorium. akarta+
enerbit uku 7edokteran >9
/udjadi. '&&%. "ioteknologi %esehatan. Kogyakarta+ 7anisius
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
18/24
LAMPIRAN +OTO
Alat sentrifus
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
19/24
.9oli
emasukkan bakteri dalam tabung mikrosentrifus #.! ml
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
20/24
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
21/24
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
22/24
/upernatan dibuang untuk diambil peletnya dan dijadikan dalam tabung untuk
disentrifus
/upernatan dibuang untuk diambil peletnya dan dijadikan dalam tabung untuk
disentrifus
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
23/24
elet yang telah dipisahkan dengan supernatan di sentrifus selama ! menit
Dna kromosom diekstraksi dengan
mendidihkan pelet beku
-
8/16/2019 Laporan Isolasi Dna Kromosom Dan Plasmid
24/24
elet disimpan pada suhu -'09