I. PENDAHULUAN

Praktikum mikrobiologi pada blok CHEM II ini adalah pewarnaan. Praktikum pewarnaan tersebut terdiri dari dua praktikum pewarnaan yaitu pewarnaan gram dan pewarnaan endospora. Pada Blok CHEM II mahasiswa diharapkan mampu untuk menjelaskan mengenai teori simpul khususnya simpul dua dan simpul tiga. Agar mahasiswa dapat mempelajari hal tersebut, maka dibutuhkan pemahaman lebih lanjut mengenai perbedaan-perbedaan dari berbagai macam bakteri (agent) agar dapat mengidentifikasi simpul-simpul yang ada. Dengan adanya praktikum mikrobiologi kali ini diharapkan mahasiswa dapat lebih mengerti dan memahami akan perbedaan dan sifat sifat bakteri dan nantinya diharapkan dapat membantu mahasiswa dalam menganalisis penyakit dan dalam penegakkan diagnosis penyakit.

Praktikum mikrobiologi pada pewarnaan endospora bertujuan untuk membedakan antara sel vegetatif beserta sporanya. Serta agar mahasiswa dapat memiliki pengetahuan tentang letak dari inti sel dengan berbagai indikator seperti malachit green. Sedangkan pada praktikum pewarnaan gram, tujuan praktikum adalah untuk mengetahui perbedaan antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Praktikum mikrobiologi pewarnaan gram memiliki prinsip dasar yang sama yakni, secara morfologi bakteri gram positif (+) dan bakteri gram negatif (-) adalah sama, namun yang membedakan antara keduanya adalah komponen penyusun dinding selnya.

II. TINJAUAN PUSTAKAPewarnaan

Pewarnaan yaitu cara untuk memperjelas bentuk, susunan ataupun sifat

mikroba, khususnya untuk bakteri.Media pertumbuhan bakteriDasar makanan yang paling baik bagi bakteri ialah medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa makanan, atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia.

Bentuk, Susunan, dan Sifat Media

Bentuk media ditentukan oleh ada tidaknya penambahan zat pemadat seperti agar, gelatin dan sebagainya.

Dikenal tiga bentuk media

1. Media cair (kaldu cair) : tidak ditambahkan zat pemadat, dipergunakan untuk bakteri dan ragi.

2. Media padat : menggunakan agar, merupakan media umum yang dipergunakan untuk pertumbuhan bakteri heterotrof, ragi dan jamur.

3. Media semi padat atau semi cair : penambahan zat padat 50%, dipergunakan untuk pertumbuhan mikroba yang banyak memerlukan air, anaerobik atau fakultatif.

Susunan mediaMengandung air, protein, asam amino, energi dan vitamin.

Dapat berbentuk :

1. Media alami : disusun oleh bahan alami, kentang, daging, susu, telur dan lain-lain.

2. Media sintetik, disusun dari senyawa kimia.3. Media semi sintetis : media yang disusun berdasarkan campuran bahan alami dan bahan sintetis.

Kaldu nutrisi untuk pertumbuhan bakteri terdiri dari pepton, ekstrak daging, NaCl dan aquades. Agar toge untuk pertumbuhan jamur/ ragi dan agar wortel untuk pertumbuhan ragi dan beberapa jenis jamur.Sifat Media

Tujuan lain penggunaan media yaitu untuk isolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi biakan yang didapat, artinya penggunaan zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan. Setiap media mempunyai sifat (spesifikasi) tersendiri sesuai dengan maksudnya.

Pembagian media berdasarkan sifat :

1. Media umum, contoh nutrien agar, dan agar kentang dekstrosa.

2. Media pengayaka. Media selektif

b. Media differensial

c. Media penguji

d. Media perhitunganBakteri Bakteri, dari kata Latin bacterium (jamak, bacteria), adalah kelompok raksasa dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus/inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Struktur sel mereka dijelaskan lebih lanjut dalam artikel mengenai prokariota, karena bakteri merupakan prokariota, untuk membedakan mereka dengan organisme yang memiliki sel lebih kompleks, disebut eukariota. Istilah "bakteri" telah diterapkan untuk semua prokariota atau untuk kelompok besar mereka, tergantung pada gagasan mengenai hubungan mereka.

Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (berada di mana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5-5 m, meski ada jenis dapat menjangkau 0,3 mm dalam diameter (Thiomargarita). Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan dan jamur, tetapi dengan komposisi sangat berbeda (peptidoglikan).Struktur dasar bakteri :

1. Dinding sel tersusun dari peptidoglikan yaitu gabungan protein dan polisakarida (ketebalan peptidoglikan membagi bakteri menjadi bakteri gram positif bila peptidoglikannya tebal dan bakteri gram negatif bila peptidoglikannya tipis).

2. Membran plasma adalah membran yang menyelubungi sitoplasma tersusun atas lapisan fosfolipid dan protein.

3. Sitoplasma adalah cairan sel.

4. Ribosom adalah organel yang tersebar dalam sitoplasma, tersusun atas protein dan RNA.

5. Granula penyimpanan, karena bakteri menyimpan cadangan makanan yang dibutuhkan.Struktur tambahan bakteri :

1. Kapsul atau lapisan lendir adalah lapisan di luar dinding sel pada jenis bakteri tertentu, bila lapisannya tebal disebut kapsul dan bila lapisannya tipis disebut lapisan lendir. Kapsul dan lapisan lendir tersusun atas polisakarida dan air.

2. Flagelum atau bulu cambuk adalah struktur berbentuk batang atau spiral yang menonjol dari dinding sel.

3. Pilus dan fimbria adalah struktur berbentuk seperti rambut halus yang menonjol dari dinding sel,pilus mirip dengan flagelum tetapi lebih pendek, kaku dan berdiameter lebih kecil dan tersusundari protein dan hanya terdapat pada bakteri gram negatif. Fimbria adalah struktur sejenis pilus tetapi lebih pendek daripada pilus.

4. Klorosom adalah struktur yang berada tepat dibawah membran plasma dan mengandung pigmen klorofil dan pigmen lainnya untuk proses fotosintesis. Klorosom hanya terdapat pada bakteri yang melakukan fotosintesis.5. Vakuola gas terdapat pada bakteri yang hidup di air dan berfotosintesis.

6. Endospora adalah bentuk istirahat (laten) dari beberapa jenis bakteri gram positif dan terbentuk didalam sel bakteri jika kondisi tidak menguntungkan bagi kehidupan bakteri. Endospora mengandung sedikit sitoplasma, materi genetik, dan ribosom. Dinding endospora yang tebal tersusun atas protein dan menyebabkan endospora tahan terhadap kekeringan, radiasi cahaya, suhu tinggi dan zat kimia. Jika kondisi lingkungan menguntungkan endospora akan tumbuh menjadi sel bakteri baru.Kunci dari empat kategori utama pada bakteri dan kelompok bakteri terdiri atas kategori-kategori. Empat kategori utama didasarkan pada karakter dinding sel; bakteri gram-negatif yang memiliki dinding sel, bakteri gram-positif yang memili dinding sel, bakteri yang tidak memiliki dinding sel, dan archaebakteria. Namun, yang akan dibahas adalah bakteri gram-negatif dan bakteri gram-positif.Dinding selDinding sel adalah dinding tipis berlapis-lapis yang mengitari sel. Dinding sel menyebabkan sel tumbuhan tidak dapat bergerak bebas, layaknya manusia dan hewan. Namun, dinding-dinding sel dapat memberikan dukungan, perlindungan dan bekerja sebagai filter. Pada bakteri gram-positif, kandungan utama dinding sel adalah peptidoglycan dan techoid acid; pada bakteri gram-positif, dinding sel meliputi peptidoglikan dan membran luar.

Sel tumbuhan yang dipisahkan dinding sel yang transparan.

Tekanan osmose internal kebanyakan bakteri berkisar antara lima sampai dua puluh atmosfir sebagai hasil dari konsentrasi larutan akibat transpor aktif. Pada kebanyakan lingkungan tekanan ini cukup untuk memecah sel apabila tidak terdapat dindin sel yang kuat. Dinding sel bakteri terlihat kuat karena memiliki komposisi lapisan yang mengandung berbagai substansi misalnya murein, mucopeptidae, atau peptidoglikan. Bakteri dibagi gram positif dan gram negatif berdasar reaksinya terhadap prosedur pewarnaan gram. Prosedur ini dinamakan sesuai seorang histologis, Hans Christian Gram, yang mengembangkan metode pembedaan warna dalam usaha mewarnai bakteri pada jaringan yang terinfeksi. Sel pertama kali diwarnai dengan kristal violet dan yodium, kemudian dicuci dengan aseton atau alkohol. Langkah terakhir menghilangkan warna pada bakteri gram negatif, tetapi tidak pada bakteri gram positif.

Di samping memberi perlindungan osmose, dinding sel memberikan peran penting dalam pembelahan sel dan juga membantu memulai biosintesisnya sendiri. Pada lapisan dinding sel terdapat lapisan antigenik utama permukaan sel, dan salah satu komponennya lipopolisakarida dinding sel gram negatif yang berfungsi aktif sebagai endotoksin nonspesifik dari bakteri gram negatif. Dinding sel secara umum bersifat permeabel nonselektif; satu lapis dinding sel gram negatif namun membran luar mengahalangi masuknya molekul yan berukuran relatif besar.Lapisan Peptidoglikan

Peptidoglikan adalah polimer kompleks yang terdiri dari tiga bagian: backbone, yang terdiri dari N-acetylglicosamine dan N-acetylmuramic acid secara berselang-seling; sekelompok rantai tetrapeptida identik yang melekat pada N-acetylmuramic acid; dan sekelompok identical peptide-cross bridges. Backbone pada semua spesies bakteri adalah sama. Pada beberapa dinding sel bakteri gram negatif, cross bridge terdiri dari sambungan peptida langsung antara kelompok diamopilemic acid (DAP) amino pada satu sisi dengan kelompok karboksil pada jung D-alanin sisi rantai yang lain.

Rantai tetrappetida pada semua spesies, secara umum memiliki bagian yang penting. Kebanyakan memiliki L-alanin pada posisi satu; D-gutamat atau substitusi dari D-glutamat pada posisi dua; dan D-alanin pada posisi empat. Posisi tiga merupakan rantai yang paling bervariasi: kebanakan bakteri gram negatif memiliki diaminopilemic acid pada posisi ini, di mana ditautkan komponen dinding sel lipoprotein, bakteri gram positif mungkin memiliki diaminopilemic acid, L-lisin, atau beberapa L-amino lain pada posisi tiga.Diaminopilemic acid

Diaminopilemic acid merupakan komponen unik pada dinding sel prokariot dan merupakan perekursor intermediet lisisn bakteri pada biosintesis asam amino. Fakta bahwa semua rantai peptidoglikan bertautan silang menandakan bahwa setiap lapisan peptidoglikan merupakan molekul besar tunggal. Pada bakteri gram positif, terdapat empat puluh lembar peptidoglikan, merupakan 50% dari seluruh komposisi dinding sel; pada bakteri gram negatif, hanya terdapat satu atau dua lembar, merupakan 5-10% dari dinding sel. Bakteri memperlihatkan bentuk mereka, yang pada sebagian spesies memiliki struktur dinding sel yang khas.Endospora

Ada sebagian dari bakteri yang membentuk endospora, sebagai usaha untuk mempertahankan hidup bila keadaan sekeliling tidak cocok, bila cocok kembali menjadi bakteri kembali.

Ada tiga posisi endospora :

1. Central contoh : Bacillus anthraxis, Bacillus subtilis

2. Subterminal contoh : Clostridium chauvoi, Clostridium septicum

3. Terminal contoh : Clostridium tetani.

Bentuk spora : spherical, dan oval. Bakteri bentuk cocci tidak membentuk spora. Endospora terdiri dari 20% air sedangkan bentuk vegetatif 80-90% air.III. Alat dan Bahan 1. Alat

1.1 Alat Pewarnaan Gram

a. Cawan petri steril

b. Jarum ose

c. Bunsen

d. Object glass1.2 Alat Pewarnaan Endosporaa. Cawan petri steril

b. Jarum ose

c. Bunsen

d. Object glass

e. Kertas buram atau kertas merang

f. Penangas air2. Bahan

2.1 Bahan Pewarnaan Gram

a. Larutan kristal ungu

b. Larutan kalium iodida

c. Alkohol aseton

d. Larutan Safranin

e. Aquadest

2.2 Bahan Pewarnaan Endospora

a. Malachit green

b. Larutan Safranin

c. Aquadest

IV. Cara Kerja

1. Pewarnaan Grama. Alat dan bahan disiapkan.b. Meja tempat praktikum dan tangan dibersihkan dengan alkohol agar tidak ada bakteri lain.c. Tutup cawan petri tempat sampel bakteri dibuka di dekat api bunsen dan ambil sampel dengan jarum ose.d. Dibuat apusan atau digoreskan pada object glass, jika terlalu tebal ditambah aquadest atau air.e. Difiksasi di atas bunsen untuk membunuh bakteri tanpa merusak strukturnya serta agar sampel menempel pada object glass.f. Digenangi KU selama 30 detik sebagai zat pewarna primer, aliri dengan air bersih dan keringkan.g. Digenangi larutan KI selama 45 detik, aliri dengan air bersih dan keringkan.

h. Digenangi alkohol aseton selama 30 detik, aliri dengan air bersih dan keringkan.

i. Digenangi Safranin selama 45-60 detik sebagai zat pewarna sekunder, aliri dengan air bersih dan keringkan.

j. Diamati di bawah mikroskop.2. Pewarnaan Endospora

a. Tutup cawan petri sampel bakteri dibuka di dekat api bunsen dan ambil sampel dengan jarum ose.

b. Dibuat apusan pada object glass, jika terlalu tebal ditambah aquadest.

c. Difiksasi diatas bunsen untuk membunuh bakteri serta agar sampel menempel pada object glass.

d. Dipanaskan dengan penangas untuk membuka pori-pori sel agar zat pewarna dapat masuk selama lima menit.

e. Diberi kertas merang atau kertas buram di atas apusan.

f. Ditetesi dengan malachit green di atas kertas buram agar tidak kering selama lima menit.

g. Setelah lima menit diangkat tetapi tidak langsung dialiri air atau didinginkan terlebih dahulu.

h. Dialiri dengan air bersih dan dikeringkan.

i. Diwarnai dengan Safranin selama 45-60 detik.

j. Dialiri dengan air bersih dan keringkan.

k. Diamati di bawah mikroskop.

V. HASIL DAN PEMBAHASANPraktikum Pewarnaan GramPertama sekali alat dan bahan yang diperlukan disiapkan. Meja dan tangan praktikan dibersihkan dengan alkohol agar memberi suasana aseptik saat praktikum dilakukan. Isolat yang telah disiapkan diambil menggunakan jarum ose yang telah disterilkan dengan cara menyentuhkannya saja pada koloni. Sampel dibuat apusan yaitu diletakkan pada object glass dengan satu arah dan dilewatkan di atas bunsen. Tujuan dari melewatkan apusan adalah untuk memfiksasi apusan pada object glass, membunuh bakteri tanpa merusak strukturnya, dan membuka pori-pori bakteri. Jika apusan terlalu tebal dapat diambah aquadest. Apusan tersebut digenangi dengan KU sehingga apusan berwarna ungu selama tiga puluh detik. Setelah tiga puluh detik, aliri dengan air bersih dan keringkan. Kemudian apusan digenangi dengan larutan KI selama 45 detik yang berfungsi untuk mengikat warna dari KU yang telah digenangi sebelumnya. Setelah KI, alkohol aseton digenangi selama 30 detik, fungsinya adalah melarutkan lipid dan menutup pori-pori bakteri sehingga KU terjebak di dalam, dan terakhir digenangi oleh safranin sebagai pewarna sekunder selama 45-60 detik.Untuk bakteri gram positif akan berwarna ungu karena ketika digenangi oleh alkohol aseton lapisan lipid yang hanya sedikit pada dinding sel bakteri tersebut luntur yang tersisa hanya lapisan peptidoglikan yang mendominasi dan, seperti yang telah disebutkan sebelumnya, alkohol aseton akan menutup pori-pori dari bakteri kemudian KU terjebak di dalamnya sehingga safranin, yang berwarna merah, tidak dapat masuk.

Sedangkan untuk bakteri gram negatif akan berwarna merah karena lapisan lipid yang mendominasi dinding selnya akan luntur sehingga setelah diwarnai dengan KU, warna ungu tersebut juga akan luntur bersama dengan lapisan lipid ketika digenangi dengan alkohol aseton. Selanjutnya, apusan akan berubah warnanya menjadi merah sesuai dengan warna safranin karena warna ungu sebelumnya telah luntur. Dari hasil praktikum diketahui warna akhir dari apusan tersebut adalah merah yang menandakan bahwa isolat yang diuji adalah bakteri gram negatif, tepatnya E. coli.Praktikum Pewarnaan EndosporaLangkah-langkah awal yang dilakukan sama dengan praktikum pewarnaan gram. Apusan yang telah dibuat berdasarkan cara kerja yang sama dengan praktikum sebelumnya, dilewat-lewatkan di atas penangas air dengan tujuan yang sama, terutama membuka pori-pori bakteri. Apusan tersebut ditutup dengan kertas buram supaya bakteri yang dibuat sebagai apusan tidak kontak langsung dengan praktikan, terlebih jika apusan tersebut dibuat dari bakteri patogen, dan mencegah malachit green (yang akan digunakan nanti) meluber. Kemudian apusan yang tertutup kertas buram ditetesi dengan malachit green. Malachit green di sini diberi untuk memberikan suasana ekstrem pada bakteri sehingga selama lima menit terus diteteskan pada apusan dan jangan sampai kering. Selanjutnya, apusan didinginkan. Apusan kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan lalu digenangi dengan safranin. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Dan diamati di bawah mikroskop. Tujuan dari pewarnaan endospora adalah untuk membedakan sel vegetatif dan endosporanya.Warna hijau yang terbentuk adalah endosporanya sedangkan warna merah yang terbentuk adalah organel-organel sel lain pada bakteri yang diuji.

Dari hasil praktikum didapatkan endosporanya terletak di sentral, ini menandakan bakteri yang diuji ada Bacillus sp. Perbedaan bakteri gram (+) dan bakteri gram (-)

1. Bakteri gram positif (+)

Komponen penyusun dinding sel terdiri dari peptidoglikan yang tersusun oleh asam teikoat (tebal), sedangkan lapisan lipidnya sedikit atau tipis. Peptidoglikan mempunyai sifat redibiti atau kaku, sehingga bakteri gram positif (+) lebih tahan terhadap disinfektan gas etanol. Dalam praktikum pewarnaan gram ketika objek diberi alkohol, pori-pori bakteri tetap menutup sehingga tetap berwarna ungu. Contoh bakteri gram positif adalah :

a. Staphilococcus aureus dan Streptococcus pyogenesStafilokokus berasal dari kata staphyle yang berarti buah anggur, sedangkan kokus berati benih bulat. Kuman ini sering di temukan sebagai kuman flora normal pada kulit dan selaput lendir pada manusia.

Streptococcus pyogenes di temukan oleh Pasteur dan Koch yang menemukannya pada nanah yang terkena infeksi. Kuman ini dapat menyebabkan penyakit epidemik diantaranya adalah scarlet fever, erisipelas, dll.

b. Bacillaceae

2. Bakteri gram negatif (-)

Dinding sel dari bakter gram negatif tersusuan atas lemak. Lemak bersifat rentan terhadap alkohol. Pada praktikum pewarnaan gram ketika diberi alkohol pori-pori akan membuka sehingga berubah warna menjadi merah. 80% dari bakteri gram negatif yang diisolasi di laboratorium Mikrobiologi Klinik adalah kuman Enterobacteriaceae. Enterobacteriaceae adalah sekumpulan famili kuman yang terdiri dari sejumah besar spesies bakteri yang sangat erat hubungannya satu dengan yang lainnya.Perbedaan bakteri gram positif dan bakteri gram negatifPerbedaanBakteri gram positifBakteri gram negatif

1. Dinding sel

a. Lapisan peptidoglikan

b. Kadar lipid2. Resistensi terhadap alkali3. Kepekaan terhadap iodium

4. Toksin yang dibentuk

5. Resistensi terhadap tellurit

6. Sifat tahan asamlebih tebal

1-4 %

tidak larut

lebih peka

eksotoksin

lebih tahan

ada yang tahan asamlebih tipis

11-14 %

larut

kurang peka

endotoksin

lebih peka

tidak ada yang tahan asam

KESIMPULAN1. Bakteri dapat diklasifikasikan berdasarkan dinding selnya serta komponen pembentuknya menjadi bakteri gram positif, bakteri gram negatif, dan bakteri yang tidak memiliki dinding sel.

2. Bakteri gram positif dan bakteri gram negatif dapat dibedakan dari komponen pembentuk dinding sel, resistensi terhadap alkali, kepekaan terhadap iodium, toksin yang dibentuk, kepekaan terhadap tellurit, dan sifat tahan asam.3. Komponen penyusun dinding sel pada bakteri gram positif didominasi oleh lapisan peptidoglikan, sedangkan pada bakteri gram negatif didominasi oleh lipid.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. Dinding sel. Available at: http://id.wikipedia.org/wiki/Dinding_sel.______. Bakteri. Available at: http://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri.______. Bakteri. Available at: http://www.e-dukasi.net/mapok/mp_full.php?id=255&fname=materi02.html______. Pewarnaan Gram. Available at: http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram.______. Gram Positif. Available at: http://id.wikipedia.org/wiki/Gram-positif.______. Gram Negatif. Available at: http://id.wikipedia.org/wiki/Gram-negatif.

Brooks, G. F. et all. 2005. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Salemba Medika. 29-30, 53.

Rachmawan, Obin. 2001. Ruang Lingkup Mikroorganisme. Available at: http://202.152.31.169/pertanian/pengendalian_mutu/ruagn_lingkup_mikoorganisme.pdf.Susiana Assani. 1993. Buku Ajar Mikroiologi Kedokteran. Jakarta: Staf FKUI.