1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ THÚY

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

LIPOSOME

LÀM CHẤT MANG THUỐC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ THÚY

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

LIPOSOME

LÀM CHẤT MANG THUỐC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2012.Y

Người hướng dẫn: PGS. TS. NGUYỄN THANH HẢI

ThS. NGUYỄN VĂN LÂM

Hà Nội – 2017

Lời cảm ơn

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô giáo trong

Khoa Y Dược đã dìu dắt, giúp đỡ em trong suốt 5 học trên ghế nhà trường và

đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp.

Đồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải

thầy là người trực tiếp giao đề tài và chỉ bảo, định hướng cho em thực hiện đề

tài này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Thị Minh

Huệ đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho em được làm thực nghiệm trên Bộ môn

Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội.

Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em cũng xin gửi lời

cảm ơn đến ThS. Nguyễn Văn Lâm. Thầy là người đã tận tình chỉ bảo hướng

dẫn, định hướng, giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và

hoàn thành khóa luận.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên của

Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện

thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng xin được cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè

đã luôn động viên, cổ vũ trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa

luận của mình.

Hà Nội, tháng 6 năm 2017.

Sinh viên

Nguyễn Thị Thúy

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TT Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ

1 CHOL Cholesterol

2 DC Dược chất

3 DĐVN Dược điển Việt Nam

4 DLS Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động

5 DOX Doxorubicin

6 EE Encapsulation Efficient - Hiệu suất liposome hóa

7 GUV Giant Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp khổng lồ

8 HBG

HEPES Buffer Glucose – HEPES pH 7,4 trong môi trường

glucose 5%

9 HBS

HEPES Buffer Saline – HEPES pH 7,4 trong môi trường NaCl

0,9%

10 HEPES N-2- hydroxy ethyl piperazin-N-2-ethansulfonic acid

11 HSPC

Soy Phosphatidylcholin - Phosphatidyl cholin dầu đậu nành đã

hydrogen hóa

12 KTTP Kích thước tiểu phân

13 LUV Large Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp lớn

14 LTP Latanoprost

15 MLV Multi Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp

16 MUV Medium Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp trung bình

17 MVVs

Multi Vesicular Vesicle – Liposome kép – liposome trong

liposome

18 OLV Oligo Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp nhỏ

19 PBS Đệm photphat pH 7,4 trong môi trường NaCl 0,9%

20 PDI Polydispersity Index – Chỉ số đa phân tán

21 PEG Polyethylen glycol

22 PL Phospholipid

23 PTX Paclitaxel

24 SPC Phosphatidylcholin dầu đậu nành

25 SUV Small Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp nhỏ

26 Tc Nhiệt độ chuyển dạng

27 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

28 TEM

Trasmission electron microscopy - Kính hiển vi điện tử truyền

qua

29 VOR Voriconazole

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Số hiệu Tên bảng biểu Trang

Bảng

1.1

Một số phân loại liposome theo cấu trúc lớp vỏ 4

Bảng

2.1

Các nguyên liệu sử dụng 18

Bảng

3.1

Kết quả đo KTTP, PDI và điện thế zeta của hệ môi trường hydrat

là nước

23

Bảng

3.2

Kết quả đo KTTP, PDI và điện thế zeta của hệ môi trường hydrat

là đệm acetat pH 4,0

24

Bảng

3.3

Kết quả đo KTTP, PDI và điện thế zeta của hệ môi trường hydrat

là đệm citrat pH 4,0

25

Bảng

3.4

Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat

amoni pH 5,5

25

Bảng

3.5

Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat:

dung dịch glucose 5%

26

Bảng

3.6

Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường

hydrat:dung dịch saccarose 10%

26

Bảng

3.7

Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat:

dung dịch NaCl 0,9%

27

Bảng

3.8

Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat:

đệm PO4/ NaCl

27

Bảng

3.9

Sự thay đổi KTTP, PDI của hệ môi trường hydrat là nước trước

và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

28

Bảng

3.10

Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian của hệ môi trường hydrat:

đệm acetat pH 4,0 trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

30

Bảng

3.11

Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian của hệ môi trường hydrat:

đệm citrat pH 4,0 trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

31

Bảng

3.12

Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian của hệ môi trường hydrat:

đệm amoni pH 5,5 trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

33

Bảng

3.13

Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian của hệ môi trường hydrat:

dung dịch glucose 5% trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

35

Bảng

3.14

Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian của hệ môi trường hydrat:

dung dịch NaCl 0,9% trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

36

Bảng

3.15

Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian của hệ môi trường hydrat:

đệm PO4/ NaCl pH 7,4

38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Số hiệu Tên hình vẽ Trang

Hình

1.1

Cấu trúc liposome 2

Hình

1.2

Các cách mang dược chất của liposome 3

Hình

1.3

Phân loại liposome dựa vào kích thước và cấu trúc số lớp 3

Hình

1.4

Các dạng liposome biến đổi 5

Hình

1.5

Sơ đồ bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa màng

film

8

Hình

1.6

Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha

đảo

9

Hình

1.7

Hệ thống phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn 10

Hình

1.8

Sự giải phóng thuốc khi có kích thích bên ngoài với cấu trúc

đa lớp và đơn lớp

11

Hình

1.9

Thiết bị đùn tay mini extruder và thiết bị nén đẩy áp suất cao 13

Hình

1.10

Khả năng tập trung tại mô đích của liposome dựa trên hiệu ứng

EPR

15

Hình

1.11

Sự khác biệt mạch máu ở các mô bình thường và mô ung thư 16

Hình

2.1

Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 21

Hình

3.1

Hình ảnh chụp TEM của các mẫu liposome 23

Hình

3.2

Sự thay đổi về điện thế zeta theo thời gian của các mẫu

liposome có môi trường hydrat là H2O

29

Hình

3.3

Sự thay đổi về điện thế zeta theo thời gian của các mẫu

liposome có môi trường hydrat là đệm acetat pH 4,0

30

Hình

3.4

Sự thay đổi về điện thế zeta theo thời gian của các mẫu

liposome có môi trường hydrat là đệm citrat pH 4,0

32

Hình Sự thay đổi về điện thế zeta theo thời gian của các mẫu 34

3.5 liposome có môi trường hydrat là amoni pH 5,5

Hình

3.6

Sự thay đổi về điện thế zeta theo thời gian của các mẫu

liposome có môi trường hydrat là dung dịch glucose 5%

35

Hình

3.7

Sự thay đổi về điện thế zeta theo thời gian của các mẫu

liposome có môi trường hydrat là dung dịch NaCl 0,9%

37

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1

Chương 1- TỔNG QUAN .......................................................................................... 2

1.1. Khái niệm liposome ............................................................................................ 2

1.2. Phân loại .............................................................................................................. 3

1.2.1. Phân loại theo kích thước và cấu trúc số lớp .............................................. 3

1.2.2. Phân loại theo thành phần cấu trúc lớp vỏ. ................................................ 3

1.3. Thành phần cấu tạo liposome ........................................................................... 6

1.3.1. Phospholipid ............................................................................................... 6

1.3.2. Cholesterol .................................................................................................. 7

1.4. Phương pháp bào chế ......................................................................................... 7

1.4.1. Phương pháp Bangham (hydrat hóa màng film). ....................................... 7

1.4.2. Phương pháp tiêm ....................................................................................... 8

1.4.3. Phương pháp bốc hơi pha đảo (Reverse – phase evaporation method) ..... 9

1.4.4. Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn (supercritical reverse phase

evaporation method). ............................................................................................ 9

1.5. Ảnh hưởng của đặc tính tiểu phân đến tới chất lượng liposome ................. 10

1.5.1. Ảnh hưởng của KTTP .............................................................................. 10

1.5.2. Ảnh hưởng điện thế zeta đến độ ổn định ................................................. 11

1.6. Phương pháp giảm kích thước tiểu phân. ...................................................... 12

1.6.1. Phương pháp siêu âm ............................................................................... 12

1.6.2. Phương pháp nén/ đẩy qua màng ............................................................. 12

1.6.3. Phương pháp đông lạnh - giải đông (freeze- thawed) .............................. 12

1.6.4. Phương pháp vi hóa lỏng (microfluidization) .......................................... 13

1.7. Ứng dụng của liposome .................................................................................... 13

1.7.1. Ứng dụng của liposome trong điều trị ung thư .................................... 13

1.7.2. Ứng dụng đưa thuốc tới mắt .................................................................. 15

1.7.3. Ứng dụng đưa thuốc tới phổi ................................................................. 16

1.8. Ưu điểm và nhược điểm của liposome ........................................................... 16

1.8.1. Ưu điểm .................................................................................................... 16

1.8.2. Nhược điểm .............................................................................................. 17

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 18

2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu nghiên cứu....................................... 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................ 18

2.1.2. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 18

2.3. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................... 19

2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 19

2.4.1. Bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa màng film ................... 19

2.4.2. Nghiên cứu quy trình làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân ........ 20

2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường bên trong và bên ngoài đến đặc tính

tiểu phân của liposome ....................................................................................... 20

2.5. Phương pháp đánh giá liposome tạo thành ................................................... 21

2.5.1. Đánh giá cảm quan ................................................................................... 21

2.5.2. Phương pháp đánh giá hình thái, cấu trúc liposome ................................ 21

2.5.3. Phương pháp đánh giá đặc điểm hóa lí của hệ có môi trường trong và

ngoài khác nhau .................................................................................................. 21

Chương 3 - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN .................................... 23

3.1. Hình thái, cấu trúc liposome ........................................................................... 23

3.2. Đánh giá quy trình giảm và đồng nhất KTTP............................................... 23

3.2.1. Hệ môi trường hydrat nước (H2O) ........................................................... 23

3.2.2. Hệ môi trường hydrat: đệm acetat pH 4.0 ................................................ 24

3.2.3. Hệ môi trường hydrat: đệm citrat pH 4.0 ................................................. 24

3.2.4. Hệ môi trường hydrat: đêm amoni pH 5.5 ............................................... 25

3.2.5. Hệ môi trường hydrat: dung dịch Glucose 5% ......................................... 26

3.2.6. Hệ môi trường hydrat: dung dịch saccarose 10% .................................... 26

3.2.7. Hệ môi trường hydrat: dung dịch NaCl 0.9% .......................................... 27

3.2.8. Hệ môi trường hydrat: đệm Phosphat trong NaCl pH 7.4 (PBS) ............. 27

3.3. Đánh giá độ ổn định của mỗi hệ liposome với các thành phần môi trường

trong và ngoài khác nhau. ...................................................................................... 28

3.3.1. Môi trường bên trong là nước .................................................................. 28

3.3.2. Môi trường bên trong là đệm acetat pH 4,0 (AB –acetat buffer) ............. 29

3.3.3. Môi trường hydrat: đệm citrat pH 4.0 (CB- citrate buffer) ...................... 31

3.3.4. Hệ môi trường hydrat: đệm amoni pH 4.0 (AmB – amoni buffer) .......... 33

3.3.5. Môi trường hydrat: dung dịch glucose 5% (Glu) ..................................... 34

3.3.6. Môi trường hydrat: dung dịch saccarose 10% (Sac) ................................ 36

3.3.7. Môi trường hydrat: dung dịch NaCl 0.9 % (NaCl) .................................. 36

3.3.8. Hệ môi trường hydrat: đệm Phosphat trong NaCl pH 7.4 (PBS) ............. 37

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................. 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Liposome là những hạt có cấu trúc hình cầu, bao gồm một nhân nước ở giữa,

bao bọc bởi vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp được mô tả lần đầu vào giữa

những năm 60 bởi Bangham [19,20]. Trải qua hơn 40 năm tiếp tục nghiên cứu, phát

triển và cải biến dạng ban đầu, liposome ngày càng được khẳng định là một hệ

mang thuốc, phân phối thuốc hàng đầu, đóng vai trò quan trọng trong việc hình

thành các dạng thuốc nhằm cải thiện hiệu quả điều trị [11,31,33].

Đầu tiên, thuốc có thể bao gói bên trong lớp lipid kép môi trường tối ưu cho

sự ổn định của dược chất nhưng lại được phân tán trong một môi trường có điều

kiện tương tự điều kiện sinh lý của cơ thể. Với cấu trúc đặc biệt của mình, liposome

phù hợp làm chất mang cho cả dược chất thân nước và thân dầu. Ngoài ra khi nạp

dược chất vào liposome, sự giải phóng thuốc có thể kéo dài và có kiểm soát hơn,

kích thước nano có thể đưa thuốc tới đích một cách hiệu quả. Hơn nữa, với cấu

thành từ phospholipid và cholesterol, đây là những thành phần không độc, tương

hợp sinh học, có ái lực tốt với tế bào, không gây ra kháng nguyên, các phản ứng dị

ứng và có khả năng phân hủy sinh học. Vì thế có thể coi liposome là một hệ mang

thuốc lý tưởng tăng khả năng ổn định của dược chất được bao gói, tăng thời gian

tuần hoàn, tăng hiệu quả điều trị,.. [4,5,20,31].

Quá trình bào chế liposome trải qua nhiều công đoạn, đòi hỏi đầu tư lớn về

trang thiết bị cũng như nhân lực kĩ thuật cao. Bên cạnh các liposome mang dược

chất sẵn thì một số nhà sản xuất đã bào chế sẵn liposome trắng (chưa mang dược

chất) để cung cấp cho các phòng thí nghiệm tiếp tục nghiên cứu gắn dược chất sau.

Điều này giúp tiết kiệm thời gian và để chuyên môn hóa hơn. Đối với một hệ nano,

KTTP và điện thế bề mặt là hai đặc tính quan trọng có ảnh hưởng lớn đến độ ổn

định cũng như tác dụng. Vì thế, việc bào chế liposome trắng với đặc tính tiểu phân

ổn định để làm trung gian cho các mục đích tiếp theo có ý nghĩa vô cùng quan

trọng.

Do vậy đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome làm chất mang thuốc” được tiến hành

nhằm mục đích:

1. Nghiên cứu quy trình giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân.

2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường xung quanh đến đặc tính tiểu phân

(KTTP và thế zeta) của liposome.

2

Chương 1- TỔNG QUAN

1.1. Khái niệm liposome

Liposome thuộc hệ điều trị cao hơn của dạng thuốc kiểm soát giải phóng - hệ

mang thuốc hướng đích (targeted drug delivery system) có cấu trúc hình cầu đơn

hay đa lớp kép cấu tạo gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ

phospholipid gồm một hay nhiều lớp, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng

ngàn nanomet [3,4]

Hình 1.1: Cấu trúc liposome

Thành phần chính của liposome là phospholipid và cholesterol. Đây là những

chất tương hợp sinh học với cơ thể, có thể phân giải được trong cơ thể nên có ưu

việt trong ứng dụng làm chất mang thuốc [3,4,54]

Trong lĩnh vực Dược, liposome được ứng dụng làm hệ mang thuốc và mô

hình tế bào nhân tạo. Khi sử dụng liposome làm chất mang thuốc, dược chất có thể

phân bố trong khoang nước của liposome, phân bố giữa lớp phospholipid kép,

tương tác và gắn với đầu không phân cực của phân tử phospholipid hoặc hấp phụ

trên bề mặt của lớp phospholidpid kép tùy thuộc vào đặc tính thân dầu nước của

dược chất và tương tác hóa lí giữa dược chất với lớp phospholipid kép (hình 1.2)

[5,30,43,54].

Hình 1.2: Các cách mang dược chất của liposome: 1- Dược chất trong khoang

nước. 2- Dược chất nằm giữa lớp lipid kép. 3- Dược chất gắn vào đầu phân cực của

phospholipid. 4- Dược chất liên kết với lớp lipid kép. 5- Dược chất liên kết với đầu

không phân cực của phân tử phospholipid. 6- Dược chất hấp phụ trên bề mặt lớp

lipid kép.

3

Một số dược chất chỉ ổn định trong một số điều kiện nhất định, tuy nhiên môi

trường ổn định nhất cho dược chất đôi khi lại không thích hợp với cơ thể do đó làm

giảm khả năng điều trị của dược chất. Liposome được dùng làm chất mang thuốc do

liposome có thể bao gói bên trong lớp lipid kép môi trường tối ưu cho sự ổn định

của dược chất nhưng lại được phân tán trong một môi trường có điều kiện tương tự

điều kiện sinh lý của cơ thể. Do đó liposome được coi là một trong những hệ mang

thuốc lý tưởng [24,26,30].

1.2. Phân loại

1.2.1. Phân loại theo kích thước và cấu trúc số lớp

+ Liposome đơn lớp (ULV: Unilamellar vesicle): Vỏ chỉ có một lớp phospholipid

Tùy theo kích thước mà có 4 loại: Loại nhỏ SUV (Small Unilamellar Vesicle) SUV

có đường kính từ khoảng 20-50 nm, loại to LUV (Large Unilamellar Vesicle) có

đường kính trên 50 nm, loại khổng lồ GLV (Giant Unilamellar Vesicle) có đường

kính trên 1000 nm[4,43].

+ Liposome đa lớp (MLV: multilamellar vesicle): Cấu tạo gồm nhiều lớp lipid và

nhiều ngăn nước đồng tâm, kích thước 400 - 3.500 nm. Gồm 3 loại: OLV (Oligo

Lamellar Vesicle) có ít hơn 5 lớp lipid kích thước 100-1000 nm, MLV có 5-25 lớp

lipid kích thước trên 500 nm, MVV (Multi Vesicular Vesicle) cấu trúc liposome kép

(liposome trong liposome) [4,43].

Hình 1.3: Phân loại liposome dựa trên kích thước và cấu trúc số lớp phospholipid.

1.2.2. Phân loại theo thành phần cấu trúc lớp vỏ.

Liposome quy ước: là loại liposome được tạo thành từ các phospholipid khác nhau,

cholesterol và có thể có các lipid khác nhưng không có sự thay đổi nào trên bề mặt

liposome.

Nhược điểm: thời gian tồn tại ngắn trong hệ tuần hoàn do dễ bị liên kết

protein và bị các tế bào trong hệ thống miễn dịch bắt giữ, khả năng hướng đích kém

do cơ chế thụ động, có nguy cơ giải phóng dược chất vào các tế bào bình thường

[8,25].

Liposome biến đổi: nhằm khắc phục nhược điểm của liposome qui ước, các nhà

khoa học đã nghiên cứu thay đổi cấu trúc của liposome để tăng cường hiệu quả

mang thuốc hơn. Một liposome mang thuốc hiệu quả phải đạt được các yêu cầu sau:

• Hiệu suất mang thuốc phải cao và ổn định.

4

• Tồn tại lâu trong hệ tuần hoàn.

• Có khả năng thoát khỏi lòng mạch máu tại vị trí bị bệnh để đi vào mô bệnh.

• Kiểm soát được khả năng giải phóng thuốc vào trong tế bào.

Để cải thiện sự lưu thông trong hệ tuần hoàn cũng như là đưa, phân phối thuốc

hướng đích, bề mặt liposome được thay đổi bằng việc đưa thêm polymer thân nước

PEG, các phối tử hướng đích (targeting ligand) như protein, chuỗi peptide, kháng

thể đơn dòng,.. để đạt mục tiêu hướng đích chủ động [35,54].

Bảng 1.1 : Một số phân loại liposome theo thành phần cấu trúc lớp vỏ

Loại liposome Thành phần

Liposome quy ước PL tự nhiên hoặc PL điện tích âm kết hợp với cholesterol.

Liposome nhạy

cảm với pH

PL được sử dụng như DOPE (dioleoylphosphatidyl

ethanolamin).

Liposome tích

điện dương

Lipid tích điện dương bề mặt với DOPE.

Liposome tuần

hoàn dài

Bề mặt được bao bởi polymer thân nước.

Liposome miễn

dịch

Bề mặt liposome gắn kháng thể hoặc các nhóm hướng

đích có khả năng nhận biết và liên kết với tế bào đích.

Có thể phân loại liposome biến đổi theo mục đích bào chế gồm các loại [8,54,55]:

+ Liposome tuần hoàn lâu trong máu (tuần hoàn dài) (Long-circualating

liposome): Liposome loại này có bề mặt bao phủ một lớp polyme thân nước, tương

hợp sinh học nhằm tạo ra một lớp áo bảo vệ cho liposome tránh khỏi sự nhận diện

của quá trình opsonin hóa và do đó làm giảm khả năng thải trừ liposome khỏi hệ

tuần hoàn. PEG là polyme hay được sử dụng để tạo ra liposome tuần hoàn dài trong

máu [7,12, 22, 28,59].

+ Liposome mi n dịch (Immuno liposome): Bề mặt liposome được gắn lên các

phân tử có khả năng nhận biết và liên kết với tế bào đích (các nhóm nhận đích -

target ligand). Các chất hướng đích đầu tiên được sử dụng là các kháng thể IgG nên

liposome này được gọi là liposome miễn dịch. Hiện nay đã phát triển thêm nhiều

nhóm nhận đích khác mà không phải là các kháng thể nên các liposome đều gọi tên

theo nhóm hướng đích được gắn tuy nhiên vẫn được xếp vào loại liposome miễn

dịch như: liposome hướng receptor folate, liposome hướng receptor tranferin [12,

28].

+ Liposome mi n dịch tuần hoàn dài (Long-circualating Immunoliposome): Đây là

loại liposome kết hợp các ưu điểm của liposome tuần hoàn dài và liposome miễn

dịch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome. Đặc điểm

cấu tạo của liposome này s có lớp áo polyme bảo vệ ở bên ngoài và các chất hướng

5

đích s được gắn vào đuôi các phân tử polyme bảo vệ hoặc gắn lên vỏ liposome [22,

28].

Hình 1.4: Các dạng liposome biến đổi

Ngoài ra còn một số dạng của liposome đó là:

+ Liposome cảm ứng (sensitive liposome): Là các liposome trong thành phần cấu

tạo có chứa một tỉ lệ các chất có khả năng thay đổi cấu trúc vật lý hoặc hóa học

dưới các điều kiện đặc biệt, có thể là các phospholipid đặc biệt hoặc các polyme có

khả năng bị phân giải cấu trúc về mặt vật lý hoặc hóa học khi nhận được tín hiệu

kích thích tại mô đích. Tác nhân gây kích thích có thể là thuộc tính đặc trưng tại mô

bị bệnh như pH, tác nhân oxy hóa khử, tác nhân phân giải cấu trúc tại môi trường

mô bệnh (tác nhân nội) hoặc có thể là do tác động từ bên ngoài như siêu âm, điện từ

trường, nhiệt độ (tác nhân ngoại) như:

a/ Liposome nhạy cảm nhiệt độ (temperature sensitive liposome): thành phần

phospholipid như phosphatidyl ethanolamine, dioleoyl phosphatidyl ethanolamine

liposome nhạy cảm với nhiệt độ nhanh chóng giải phóng dược chất khi nung nóng

đến 41,3oC và do đó có khả năng nhắm mục tiêu phân phối hóa trị liệu toàn thể cho

mô tế bào khi kết hợp với chứng tăng thân nhiệt [11,18,35,47].

b/ Liposome từ tính (magnetic liposome): bề mặt liposome được bao bởi một lớp vỏ

polymer có gắn các hạt nano từ tính như oxit sắt Fe3O4 hay sắt dạng oxi hóa như γ-

Fe2O3. Trong một từ trường thay đổi, thay đổi hướng ngẫu nhiên từ hướng song

song sang hướng đối cực, cho phép chuyển năng lượng từ thành dạng nhiệt, do đó

làm tăng nhiệt độ tại các mô khối u. Các mô tại khối u thường nhạy cảm với sự gia

tăng nhiệt độ hơn các mô lành, vì thế đây là một hướng điều trị ung thư mới [10,12].

c/ Liposome nhạy cảm pH (pH sensitive liposome) : là những liposome có thành

phần phospholipid như DOPE, có khả năng hoạt động trong môi trường pH thấp

như ở mô khối u khoảng 5,5 [6,8,35,47].

Ngoài ra còn một số dạng của liposome đó là:

6

+ Liposome tích điện dương (cationic liposome): có khả năng liên hợp với tế bào,

màng tế bào, thích hợp dùng làm hệ phân phối thụ động các đại phân tử tích điện

như DNA, RNA [35,47].

+ Lipoplexes: gồm phospholipid cationic liên kết với AND (lipofectin) để chuyển

gen, điều trị bệnh về gen, không bền và độc ở liều cao [35,47].

+ Virosome: dùng vỏ virus làm chất mang đóng vai trò như một vaccin tạo đáp

ứng miễn dịch cho cơ thể [6,8].

+ Proliposome: là liposome ở dạng bột đông khô, khi dùng thêm pha nước hydrat

hóa tạo hỗn dịch liposome [47].

+ Ethosome: ngoài thành phần phospholipid còn chứa tỷ lệ lớn alcol (ethanol,

isopropanol), bào chế với mục đích tăng thấm thuốc qua da [47].

+ Liposome linh động (flexible liposome): là liposome đơn lớp nhỏ, được bào chế

từ phosphatidylcholin với sự có mặt của chất diện hoạt (Tween 80, muối mật, natri

cholat,…) và ethanol, có tác dụng tăng thấm thuốc qua da, được ứng dụng nhiều

trong mỹ phẩm. Liposome linh động có khả năng thấm qua lớp sừng còn được gọi

là transferosome [47].

+ Niosome: sử dụng chất diện hoạt không ion hóa thay cho phospholipid như

Span 80, Span 60, Tween 80, .. Độ ổn định có thể cao hơn, hiệu suất gắn dược chất

cao hơn, rẻ tiền hơn so với liposome. Niosome gần đây được phát triển như một

chất mang thuốc tương tự liposome, cải thiện sinh khả dụng cho các dược chất ít

tan, thấm kém, tăng độ ổn định cho các dược chất kém bền [35].

+Arsonoliposome: là dạng liposome sử dụng arsonolipid thay cho phospholipid,

dùng trong điều trị ung thư và diệt ký sinh trùng vì khả năng tăng độc tính với tế

bào ung thư và đơn bào [35].

1.3. Thành phần cấu tạo liposome

1.3.1. Phospholipid

Phospholipid (PL) có nhiều trong cơ thể của động vật và thực vật, có nhiều

trong dầu thực vật (đậu nành, hạt bông, hạt hướng dương, hạt cải…) và các mô

động vật (lòng đỏ trứng, não bò…). PL là loại lipid chứa phospho, một đầu phân

cực, một đầu không phân cực nên nó có khả năng tự tạo thành lớp màng kép trong

môi trường nước. PL là nguyên liệu tách chiết từ tự nhiên hoặc tổng hợp, có cấu

trúc tương đồng sinh học với tế bào sống, do đó an toàn, tăng khả năng vận chuyển

thuốc, dễ xâm nhập vào các tổ chức đích. PL là thành phần chính của liposome.

Mục tiêu trong bào chế là sử dụng PL làm hệ mang thuốc có đặc tính tương hợp cao

với mô và tế bào, vì vậy sự hình thành các dạng chất mang từ PL có ý nghĩa quan

trọng để có thể mang thuốc và ổn định trong quá trình vận chuyển thuốc.Tính lưỡng

thân mang lại cho phospholipid sự tự hình thành, khả năng nhũ hoá và thấm ướt.

Khi tiếp xúc với dung dịch nước, phần thân nước được hydrat hoá, phần “đuôi” có

xu hướng thu nhỏ lại, tạo thành kết tụ kiểu micel (hình 1.1) [3,4,7,12].

7

1.3.2. Cholesterol

Ngoài phospholipid, thành phần không thể thiếu được trong liposome là các phân tử

sterol. Các sterol là thành phần rất quan trọng trong màng tế bào tự nhiên, vì vậy khi

đưa vào liposome mang lại sự thay đổi về đặc tính rất lớn cho chất mang.

Cholesterol (CHOL) có vai trò tăng độ cứng, giảm tính thấm của màng (giúp tránh

rò rỉ DC trong thời gian bảo quản) và tăng khả năng chịu áp lực thẩm thấu của màng

lipid kép. CHOL đã được chứng minh trước đây có tính chất chống oxy hóa

trong màng sinh học và liposome gián tiếp qua cơ chế dehydrat làm giảm độ ẩm

của lớp màng kép, do đó làm giảm hàm lượng nước trong màng khiến suy giảm

lượng ion H+

và OH-, dẫn đến làm giảm trực tiếp phản ứng thủy phân PL

[8,25,57].

Sara Zalba và các cộng sự (2012) đã nghiên cứu vai trò của CHOL trong cả 3

phương pháp bào chế liposome Oxaliplatin khác nhau là: tráng phim, đông khô và

bốc hơi pha đảo. Các sterol tăng sự ổn định của màng, hiệu suất gắn Oxaliplatin của

liposome có sử dụng CHOL cao hơn 10% so với không sử dụng CHOL trong thành

phần vỏ. Tuy nhiên, việc giải phóng thuốc trong môi trường tế bào diễn ra chậm

hơn khi có mặt CHOL. Ngoài ra, các liposome có CHOL cũng có giá trị PDI cao

hơn các liposome không có CHOL trong công thức thành phần [56].

Lượng CHOL dùng trong công thức liposome phụ thuộc chủ yếu vào mục đích áp

dụng. Với tỷ lệ CHOL cao (trên 40%), liposome không liên kết được với phân tử

DNA và khó tương hợp được với màng, do vậy không phù hợp với hệ phân phối

gen trị liệu. Khi thiết kế công thức liposome, thường căn cứ vào tỷ lệ mol giữa các

thành phần lipid phối hợp với nhau và giữa dược chất với tổng lipid. Liposome

thường áp dụng cho hệ mang thuốc với hàm lượng DC không quá cao do nồng độ

lipid trong hệ phân tán là có giới hạn, nên giới hạn khả năng mang thuốc [3,4,6,51].

1.4. Phương pháp bào chế

1.4.1. Phương pháp Bangham (hydrat hóa màng film).

Do Bangham [14] đưa ra từ năm 1964, với các bước tiến hành:

- Tạo film: Hoà tan hỗn hợp lipid trong dung môi thích hợp. Thường sử dụng tỷ lệ

10-20 mg lipid/1ml dung môi, bốc hơi dung môi bằng thiết bị phù hợp để tạo thành

màng mỏng lipid. Thường dùng thiết bị cất quay chân không để loại dung môi (có

thể thu hồi dung môi) hoặc đông khô lipid vào từng lọ nhỏ. Thời gian cất quay để

bốc hơi dung môi không chỉ nhằm mục đích làm khô lipid mà với DC thân dầu

(nằm ở lớp lipid kép của liposome) thì DC thường được phối hợp và hoà tan vào

dung môi hữu cơ cùng với các lipid. Như vậy quá trình bốc hơi dung môi cũng tạo

điều kiện cho DC liên kết với lipid.

- Hydrat hoá: hydrat hoá lipid với nước hoặc dung dịch đệm ở nhiệt độ và thời gian

thích hợp kết hợp quay tốc độ cao tăng hòa tan để tạo thành hỗn dịch liposome.

Quá trình hydrat hóa nên được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển pha

của lipid Tc khoảng 10oC nhằm đảm bảo tính linh động trong quá trình sắp xếp hệ

mang thuốc, thông thường từ 50 – 60oC. Thời gian hydrat hoá phụ thuộc vào loại

8

phospholipid. Thời gian đầu (khoảng 1 giờ) phải lắc hoặc quay với tốc độ cao, sau

đó lắc hoặc quay tốc độ thấp hơn trong thời gian từ vài giờ.

Môi trường hydrat hoá tuỳ theo loại PL và mục đích mang thuốc có thể là

nước, dung dịch natri clorid 0,9%, dung dịch đệm (citrat, phosphat, Hepes…), dung

dịch đường (glucose,dextrose, sucrose…). Áp suất thẩm thấu của dung dịch đệm

thường lựa chọn tương đồng với máu (290 mOsm/kg) để có thể ứng dụng vào in

vivo. Môi trường hydrat hoá có thể chứa muối, chất ổn định, dược chất,.. [14,20,43].

Liposome bào chế bằng phương pháp hydrat hoá màng mỏng thường có kích

thước lớn và đa lớp. Một số PL không có khả năng hydrat cao như phosphatidyl

ethanolamin, dễ bị kết tụ lại tạo thành các liposome đa lớp nên cần có biện pháp

khuấy trộn phù hợp. Với phương pháp hydrat hoá film cần công đoạn tiếp theo là

giảm và đồng nhất kích thước.

Hình 1.5: Sơ đồ quá trình bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa

màng film.

1.4.2. Phương pháp tiêm

1.4.2.1. Phương pháp tiêm etanol

Được Batzri và Korn mô tả năm 1973, còn được gọi là phương pháp pha

loãng ethanol hay tiêm ethanol. Quy trình bào chế gồm các bước: hòa tan

phospholipid và các thành phần tạo màng vào ethanol, bơm nhanh dung dịch này

vào môi trường nước cất hoặc hệ đệm TRIS - HCl, kết hợp khuấy trộn. Do thay đổi

dung môi s tạo thành các SUV có kích thước khoảng 25 nm. Sử dụng siêu lọc để

loại ethanol và tinh chế liposome. Liposome thu được có kích thước nhỏ (30-110

nm) khá đồng nhất mà không phải trải qua quá trình siêu âm. Ưu điểm của phương

pháp này dung môi không quá độc như etanol và dễ dàng mở rộng quy mô

[3,4,8,21,42].

1.4.2.2. Phương pháp tiêm ete

Hòa tan dược chất trong nước, đun cách thủy để duy trì nhiệt độ khoảng 55 –

65oC. Hòa tan các thành phần tạo màng liposome vào ete hoặc dietyl ete/ metanol.

Bơm từ từ dung dịch ete vào dung dịch nước từ phía đáy, khi tiếp xúc với pha nước,

ether s bốc hơi dưới áp suất giảm tạo thành liposome không đồng nhất có kích

thước 200 – 1000 nm. Phương pháp tiến hành nhanh nhưng hiệu suất tạo liposome

thấp, dược chất phải tiếp xúc với nhiệt độ và dung môi, có thể ảnh hưởng tới độ ổn

định của chế phẩm [41,42,43].

9

1.4.3. Phương pháp bốc hơi pha đảo (Reverse – phase evaporation method)

Phương pháp bốc hơi pha đảo sử dụng các dung môi hữu cơ như diethyl ete /

isopropyl ete hoặc hỗn hợp của diethyl ete: chloroform (1: 1 v/v) và hỗn hợp của

chloroform: methanol (2: 1 v/v) hòa tan phospholipid .Tiến hành bốc hơi dung môi

dưới áp suất giảm. Hòa tan trở lại hỗn hợp các thành phần bằng một dung môi

không trộn lẫn được với nước. Để tạo mixel đảo, thêm pha nước và siêu âm trong

khoảng thời gian thích hợp cho đến khi tạo thành hệ phân tán dạng nhũ tương nước

trong dầu. Các mixel đảo có cấu trúc gồm phospholipid đơn lớp bao quanh nhân

nước. Sau đó, bốc hơi từ từ dưới áp suất giảm để loại dung môi hữu cơ, khi đó các

mixel sát nhập vào nhau, hệ chuyển sang trạng thái gel. Tiếp tục quá trình bốc hơi

dung môi, khi đạt tới điểm giới hạn, trạng thái gel bị bẻ gẫy, các mixel bị phá vỡ

phospholipid tái sắp xếp tạo cấu trúc lipid kép và hình thành liposome.

Ưu điểm chính của phương pháp này là tỷ lệ đóng gói dược chất cao, phù

hợp để bào chế liposome mang các chất có cấu trúc phân tử cồng kềnh, kích thước

lớn như albumin. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là tạo ra các liposome có

kích thước lớn, không đồng nhất, trong quá trình bào chế sử dụng nhiều dung môi

hữu cơ, cần có biện pháp loại và kiểm soát dung môi tồn dư và những khó khăn để

mở rộng quy mô [42,60].

Hình 1.6: Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo.

1.4.4. Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn (supercritical reverse phase

evaporation method).

Chất lỏng siêu tới hạn là chất lỏng không ngưng tụ, rất dày đặc ở nhiệt độ và

áp suất nhất định bằng hoặc vượt quá điểm tới hạn. Khi đó sự khác biệt giữa pha

lỏng và pha khí không tồn tại, pha lỏng và pha khí nằm cân bằng tạo thành một pha

duy nhất- chất lỏng siêu tới hạn. Chất lỏng siêu tới hạn có nhiều đặc tính khác biệt

so với các chất lỏng truyền thống. Đáng chú ý là carbon dioxide siêu tới hạn

(scCO2) là một chất thay thế dung môi hữu cơ với những ưu điểm như chi phí thấp,

không độc và không dễ cháy, nhiệt độ và áp suất tương đối thấp (31°C và 73,8 bar)

với các tính chất hòa tan tương tự như các dung môi không phân cực.

Năm 2001, Otake và các cộng sự [16] lần đầu tiên đưa phương pháp bào chế

bằng phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn sử dụng scCO2 làm dung môi để

10

hòa tan lipid. Nhiệt độ tăng lên để đạt được cả nhiệt độ chuyển pha của

phospholipids và nhiệt độ siêu tới hạn của CO2. Áp suất cũng được giữ trên giá trị

siêu tới hạn. Sau vài giây để đạt được cân bằng, một dung dịch nước của dược chất

được đưa vào trong bình chịp áp suất lớn qua bơm cao áp ( bơm HPLC), cho đến

khi đạt được đủ dung dịch. Cuối cùng, áp suất giảm xuống để giải phóng CO2 và sự

phân tán liposome đồng nhất được hình thành [10,16,20,32,60].

Hình 1.7: Hệ thống phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn.

Ngoài ra còn có thể bào chế liposome theo một số phương pháp khác:

- Phương pháp đông khô (freeze –dryzing/ lyophylization method) [14,39,42,60].

- Phương pháp dùng chất diện hoạt không ion hóa (niosome) [39,42,43,60].

- Phương pháp màng tiếp hợp (membrane contactor method) [39,42,43,60].

- Phương pháp loại nước và bù nước (dehydration and rehydration) [41,43,60].

1.5. Ảnh hưởng của đặc tính tiểu phân đến tới chất lượng liposome

1.5.1. Ảnh hưởng của KTTP

1.5.1.1. Ảnh hưởng của KTTP đến tác dụng

Kích thước tiểu phân là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến

quá trình lưu thông trong tuần hoàn máu, sự tích tụ tập trung tại mô (hiệu ứng EPR),

ngoài ra còn ảnh hưởng đến quá trình phóng thích thuốc, động học invivo giải

phóng thuốc của liposome do đó ảnh hưởng tới tác dụng sinh học, hiệu quả đưa

thuốc tới đích cũng như hiệu quả lâm sàng. Seynhaeve A.L. và các cộng sự, đã

nghiên cứu hiệu quả điều trị khối u rắn đã nhận thấy liposome có kích thước gần

100 nm có khả năng tập trung vào khối u rắn hơn 5-6 lần khi sử dụng liposome kích

thước 400 nm. Ngoài ra liposome có kích thước nhỏ hơn 200 nm có khả năng lưu

hành máu lâu hơn liposome kích thước lớn [6,21,54,57,58].

1.5.1.2. Ảnh hưởng của KTTP đến độ ổn định

Độ ổn định của liposome giảm theo sự tăng kích thước, tối ưu với kích thước

từ 80 đến 200 nm[17,46] do kích thước tiểu phân nhỏ dẫn đến động năng nhỏ,

không đủ lớn để vượt qua hàng rào năng lượng (lực đẩy), ngăn cản các tiểu phân

11

không tiến lại gần nhau. Mặt khác theo phương trình Stock thì tốc độ sa lắng tỉ lệ

thuận với bình phương bán kính do đó tiểu phân kích thước lớn xu hướng tập hợp,

liên hợp lại tạo thành hệ không ổn định. Các liposome kích thước lớn hơn 400 nm

s nhanh chóng bị hệ thống thực bào đơn nhân và hệ thống RES nhận biết và loại

bỏ. Để đạt sự phóng thích thuốc vào khối u hiệu quả do hiệu ứng EPR [23,50,58] và

cũng lưu hành trong máu lâu hơn thì kích thước liposome nên nhỏ hơn 200 nm

[36,58]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng các hạt có đường kính khoảng 80 - 120 nm là

phù hợp nhất để thu được chế phẩm chống khối u hiệu quả, có độ ổn định tốt, duy

trì nồng độ thuốc đến đích, ngăn ngừa sự rò rỉ thuốc tới các mô lành xung quanh

[17,43,53,57,58].

Hình 1.8: Sự giải phóng thuốc khi có một kích thích bên ngoài với cấu trúc đa lớp

và đơn lớp.

Liposome với cấu trúc đa lớp MLV không được sử dụng nhiều do cấu trúc

nhiều ngăn cứng và không xác định vì thế sự giải phóng dược chất s kéo dài và có

thể một phần thuốc không được giải phóng ra khi cần thiết. Trong khi đó các

liposome đơn lớp ULV với cấu trúc đặc trưng là một lớp lipid kép, khi một tác nhân

kích thích, sự giải phóng thuốc s cùng một thời điểm. Do đó mà các liposome đơn

lớp, đồng nhất về cấu trúc s là mục tiêu của bào chế [22].

1.5.2. Ảnh hưởng điện thế zeta đến độ ổn định

Hầu hết các hạt phân tán trong môi trường nước s thu được một lượng điện

thế bề mặt do sự ion hóa của các nhóm bề mặt và sự kết tập điện tích. Điện thế zeta

được gọi là điện thế động, do độ lớn của điện thế này quyết định tốc độ di chuyển

của các hạt tiểu phân keo dưới tác động của điện trường. Độ lớn của điện thế cho

thấy mức độ đẩy lùi điện tử giữa các hạt tích điện lân cận, tương tự nhau trong môi

trường phân tán. Đối với các hạt kích thước đủ nhỏ và giá trị điện thế zeta cao s

cho hệ ổn định do sự hòa tan, phân tán chống lại sự kết tập. Đối với một hệ có giá

trị điện thế zeta nhỏ, lực hút điện tử vượt quá lực đẩy có thể đẫn đến sự kết tập và

keo tụ lại. Một hệ keo ổn định nên có trị tuyệt đối giá trị điện thế zeta lớn 30 mV

[22,41].

12

1.6. Phương pháp giảm kích thước tiểu phân.

1.6.1. Phương pháp siêu âm

Liposome đa lớp kích thước lớn có thể phân chia và tái tạo thành các

liposome đơn lớp kích thước nhỏ nhờ năng lượng siêu âm [4,5,9]. Có 2 loại thiết bị

siêu âm áp dụng giảm kích thước liposome dựa trên nguyên tắc trực tiếp và gián

tiếp. Thiết bị siêu âm trực tiếp là đưa đầu/que vào hỗn dịch, còn nguyên tắc dán tiếp

là cho hỗn dịch liposome vào ống hay cốc rồi đặt vào bể hoặc đổ hỗn dịch vào bể

siêu âm. Siêu âm trực tiếp cho hiệu quả cao nhưng chỉ tác dụng với thể tích nhỏ và

dễ làm nóng hoặc đưa tạp vào mẫu, còn bể siêu âm có thể áp dụng cho lượng lớn

mẫu nhưng hiệu quả giảm và đồng nhất kích thước không cao do khó kiểm soát

được thông số sóng siêu âm. Phương pháp siêu âm có rất nhiều các yếu tố ảnh

hưởng đến kích thước và độ ổn định của liposome như cường độ và biên độ sóng

siêu âm, nhiệt độ (trên Tc của PL), thể tích mẫu, bề dày hệ phân tán so với đầu phát

siêu âm…. [30,39].

1.6.2. Phương pháp nén/ đẩy qua màng

Nguyên tắc của phương pháp là nén/ đẩy liposome qua màng (polycarbonat)

có kích thước lỗ xốp phù hợp đó là liposome đa lớp lớn có thể biến dạng và trở

thành liposome đơn lớp hoặc nanoliposome tuỳ theo kích thước của màng. Thông

thường cần đẩy nhiều chu kỳ và sử dụng màng có kích thước từ lớn đến nhỏ dần. Ở

qui mô nhỏ, sử dụng thiết bị cầm tay (Hình1.9). Với quy mô lớn, sử dụng thiết bị

nén áp suất cao với khí trơ. Đồng nhất hoá áp suất cao dựa trên nguyên tắc sử dụng

áp suất làm nhiễu loạn dòng chảy của hệ phân tán, tăng tốc độ va chạm của các giọt

dẫn tới các tiểu phân được phân chia nhỏ hơn [39,42].

So sánh giữa phương pháp siêu âm và phương pháp đẩy qua màng với thể

tích nhỏ cho thấy phương pháp siêu âm có thể nhanh chóng cho kích thước nhỏ, còn

phương pháp đẩy qua màng cần lặp lại nhiều chu kỳ mới giảm được kích thước

nhưng độ đồng nhất cao hơn [6]. Tuy nhiên phương pháp siêu âm sử dụng đầu dò

kim loại có thể giải phóng các hạt titanium vào các mẫu.

Hình 1.9: Thiết bị đùn bằng tay mini extruder và thiếtbị nén/ đẩy dưới áp suất cao

1.6.3. Phương pháp đông lạnh - giải đông (freeze- thawed)

Liposome kích thước lớn được làm lạnh nhanh sau đó được rã đông từ từ, quá trình

này lặp đi lặp lại nhiều lần tạo thành các liposome kích thước nhỏ hơn.Nguyên lí

13

của phương pháp dựa trên sự phá vỡ cấu trúc màng của liposome khi bị đông lạnh

và tan chảy liên tục [39,42,60].

1.6.4. Phương pháp vi hóa lỏng (microfluidization)

Phương pháp vi hóa lỏng lần đầu tiên được đưa ra bởi Mayhew và cộng sự vào năm

1984 áp dụng quy mô sản xuất công nghiệp. Phương pháp này cho phép đồng nhất

hóa hệ phân tán liposome MLV bằng cách cho chảy qua phễu lọc kích thước lỗ

khoảng 5 micromet dưới áp suất cao (10000 psi) trong một buồng tương tác. Sau đó

các tiểu phân s di chuyển qua hai ống nhỏ ở tốc độ cao trên 500 m/s rồi đổ dồn về

cùng một buồng chứa. Sự va chạm tạo nên quá trình sản sinh, chuyển đổi năng

lượng cao, làm bẻ gãy các tiểu phân MLV thành SUV có kích thước đồng nhất. Sau

5-10 chu kì s thu được các SUV có kích thước khoảng 100 nm [39,42,60].

1.7. Ứng dụng của liposome

Liposome như một hệ vận chuyển thuốc tới đích mang tiềm năng lớn, với

những ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm, tiêu biểu đó là:

1. Bảo vệ các phân tử thuốc nhạy cảm (DNA, RNA, oligo-nucleotide).

2. Tăng cường sự hấp thu nội bào (chống ung thư, kháng khuẩn) [52].

3. Thay đổi dược động học và phân bố sinh học (giải phóng kéo dài với

những thuốc có thời gian bán thải ngắn như insulin [29].

4. Nâng cao sự hấp thu thuốc (Amphotericin B, Minoxidil, Paclitaxels [31],

Cyclosporins) [20].

Trong đó một số lĩnh vực đã thu được các kết quả đáng khả quan như:

Hóa trị liệu ung thư, bào chế liposome phun mù, kháng sinh trị liệu, enzyme trị

liệu, vận chuyển DNA trong liệu pháp gene, ứng dụng trong miễn dịch trị

liệu sản xuất vaccine và kháng nguyên, các thuốc dùng trong nhãn

khoa,..[2,4,11,40,45].

1.7.1. Ứng dụng của liposome trong điều trị ung thư

Ung thư đang trở thành mối nguy hại đe dọa đến sức khỏe con người.

Hiện nay trên thế giới có khoảng 23 triệu người đang sống chung cùng căn bệnh

này và Việt Nam đang nằm trong 50 nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư

(WHO). Các điều trị lâm sàng nhằm tiêu diệt cũng như ngăn ngừa sự phát triển,

lan rộng của khối u hiện nay phổ biến đó là phẫu thuật, xạ trị và hóa trị liệu.

Những biện pháp này có thể loại bỏ hoàn toàn tế bào ung thư nhưng cũng có

nguy cơ gây tổn thương các cơ quan và các mô lành xung quanh, gây ra các tác

dụng phụ không mong muốn.

Các thuốc sử dụng điều trị ung thư cũng là mối quan tâm lớn hiện nay.

Đáng kể đến là các hoạt chất như: doxorubicin, cerubidin, fucoidan,..Tuy nhiên,

một số rào cản sinh lý có thể ngăn các tác nhân tích lũy tại vị trí các khối u dẫn

đến hiệu quả phân phối thấp, hiệu quả điều trị không cao. Ngoài ra sự phân phối

không chọn lọc của các thuốc điều trị này đến các mô ung thư và các mô

thường.Vì vậy mà các phân tử thuốc tự do không thể đưa tập trung vào các mô

14

khối u, đạt nồng độ hiệu quả để có tác dụng. Ví dụ chỉ có dưới 0.1% phân tử

thuốc tiêm được tìm thấy trong 1 gam mô khối u càng cho thấy sự phân phối

không hiệu quả của chúng. Khi các phân tử này được đóng gói trong cấu trúc

liposome thì sự tích tụ tại khối u tăng gấp 2-3 lần. Các thuốc được đóng gói

trong liposome dễ dàng tăng khả năng tuần hoàn trong máu đồng thời tăng

cường lắng đọng tại các khối u, bảo vệ thuốc tránh các quá trình chuyển hóa

cũng như là phân phối thuốc đến các mô ung thư, hạn chế đến các mô lành, tăng

cường hấp thu trong các cơ quan giàu đơn bào, đại thực bào đơn nhân và hệ

thống lưới nội môi (gan, lá lách, tủy xương) và giảm hấp thu tại thận, cơ tim và

não [38,40]. Để đạt mục tiêu là các khối u, liposome phải tồn tại lâu trong vòng

tuần hoàn máu, tiếp cận khối u theo cơ chế thụ động bằng cách đi qua các khe

hở thành mạch của các mô ung thư và cuối cùng là tập trung tại các mô đích.

Khả năng tập trung tại mô đích của các liposome này được gọi là hiệu ứng tăng

tính thấm và tính lưu giữ (enhance permeability and retention effect – EPR)

[23,50].

Hình 1.10: Khả năng tập trung tại mô đích của liposome dựa trên hiệu ứng

EPR.

Hiệu ứng EPR dựa trên sự khác biệt giữa cấu trúc của các mô ung thư và

các mô thường. Các khối u thường chứa một lượng lớn các mao mạch giữa các

tế bào nội mô. Các mạch máu nuôi khối u thường có hình dạng bất thường và có

những khe hở. Các khe hở của lớp tế bào lót màng trong mạch máu thường có

đường kính vượt quá 400 nm. Các phân tử thuốc liposome có đường kính nhỏ

hơn 400nm s vượt qua được những khe hở này đi vào khối u và phóng thích

thuốc. Kích thước các khe hở ở những mạch máu của các mô bình thường có

đường kính nhỏ hơn 10 nm, không cho các phân tử thuốc liposome đi qua, vì

vậy ngăn chặn thuốc đến các mô lành và gây hại. Chính nhờ đặc tính này mà

các hạt kích thước nano có thể dễ dàng thoát mạch và tích tụ tại khối u. Ngược

lại các mô bình thường các tế bào nội mô kết hợp chặt ch dẫn đến ngăn ngừa

sự khuếch tán của các hạt nano bên ngoài các mạch máu [23,50,57].

15

Hình 1.11: Sự khác biệt giữa mạch máu ở mô bình thường và mô ung thư.

Một số ví dụ về các loại thuốc ung thư có hiệu quả và độc tính thấp hơn

so với các chế phẩm không liposome hóa của DC doxorubicin (tên thương mại:

Doxil®/ Caelyx®), daunorubicine liposome (tên thương mại là DaunoXome®)

và liposomal cytosine b-arabinoside (tên thương mại là DepoCyte®). Trong đó,

Doxil® là thuốc tiêm được biết đến nhiều nhất khi mà công nghệ nano ra đời

như một sự đổi mới cho mục tiêu khối u. Doxorubicin là thuốc chỉ định trong

điều trị ung thư như ung thư vú, u xương ác tính, ung thư đường tiết niệu và

sinh dục: ung thư tử cung, bàng quang, tinh hoàn. Đây là hoạt chất có độc tính

cao, có thể ảnh hưởng đến không chỉ khối u mà còn đến tim và thận. Việc bào

chế doxorubicin dưới dạng liposome nhằm cải thiện chỉ số điều trị bằng việc

đưa thuốc tới mô khối u, giảm tác dụng phụ. Doxil® là thuốc được Cục Quản lý

Dược và Thực phẩm Mỹ (FDA) và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMA) phê

duyệt năm 1995 [22].

1.7.2. Ứng dụng đưa thuốc tới mắt

Mắt là một tổ chức nhỏ có cấu trúc phức tạp. Khi các yếu tố như vi khuẩn,

virus, nấm tác động vào s gây ra một số bệnh về mắt ở vùng mi mắt, giác mạc,

võng mạc như nhiễm khuẩn, lẹo mắt,viêm giác mạc, viêm kết mạc,… Hiện nay

có nhiều dạng bào chế khác nhau, tuy nhiên các dạng thuốc này gặp phải một số

yếu tố cản trở hấp thu của thuốc như rào cản sinh lí của hệ thống nước mắt, bản

chất cấu tạo của các lớp mô vùng giác mạc và kết mạc. Nói chung sinh khả

dụng của các thuốc nhãn khoa quy ước rất thấp, chỉ khoảng 1-3% lượng dược

chất trong liều thuốc có thể thấm qua giác mạc và phân bố đến nơi tác dụng tại

các khoang mắt. Một trong những hướng nghiên cứu để cải thiện và nâng cao

sinh khả dụng của các chế phẩm đó là bào chế các tiểu phân mang thuốc, chúng

s khó bị rửa trôi bởi quá trình động học của nước mắt do đó dược chất s dễ

dàng hấp thu vào các mô giác mạc và kết mạc đem lại hiệu quả điều trị [24,43].

Fernando A. và các cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome mang DC

voriconazole (VOR), một thuốc kháng nấm nhóm azole được chỉ định trong các

trường hợp viêm giác mạc, có KTTP đạt 116.6 ± 5.9 nm, giá trị PDI hẹp 0.17 ±

0.06, thế zeta đạt -7 mV, EE 80%, có độ ổn dịnh 30 ngày trong dung dịch và 90

ngày sau đông khô với thành phần công thức VOR: PC tỉ lệ 7.2: 40 mM. Đánh

giá hiệu quả trên invivo nhận thấy sản phẩm không gây kích ứng trong thử

nghiệm HET-CAM’s và có khả năng phân phối khoảng 47,85 ± 5,72 g / cm2

VOR vào giác mạc lợn sau 30 phút thử nghiệm thẩm thấu, nồng độ này cao hơn

nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) các loài nấm được phân lập từ những ca lâm

16

sàng viêm giác mạc [24].

Yaganesh V. và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome chứa DC Latanoprost

(LOP) giúp giải phóng kéo dài nhằm tăng hiệu quả điều trị bệnh glocom (tăng

nhãn áp). Liposome có KTTP 109 ± 18 nm, PDI = 0.19 ± 0.04, EE đạt 94% ±

5%, có độ ổn định trên 6 tháng ở 4oC và 1 tháng ở 25

oC. Đánh giá hiệu quả

giảm áp lực trong mắt trên thỏ giữa dạng thuốc liposome và dạng thuốc chứa

LOP thông thường dạng tự do trong 90 ngày nhận thấy hiệu quả giảm áp lực lần

lượt là 4.8 ± 1.5 và 2.5 ± 0.9 mmHg [56].

1.7.3. Ứng dụng đưa thuốc tới phổi

Hơn 80% trường hợp ung thư phổi không đáp ứng với hóa trị liệu. Một

trong những hạn chế đó là sự đề kháng của cơ thể đối với các tác nhân lạ gây

độc tế bào hiện đang được sử dụng trong điều trị ung thư phổi, do đó nồng độ

thuốc tại vị trí khối u là rất thấp. Không những thế, các loại thuốc trị liệu với

liều lượng cao còn có thể gây độc cho các mô, cơ quan khỏe mạnh. Paclitaxel

(PTX) là một thuốc chỉ định trong ung thư phổi. Tuy nhiên hạn chế của thuốc

đó là kém tan trong nước, hơn nữa cấu trúc biểu mô ở phổi mỏng dẫn đến sự

tích lũy thuốc của các dạng thuốc hít là rất nhỏ. Phát triển các hệ thống phân

phối thuốc đến đích là các khối u như liposome là một cách tiếp cận đầy hứa

hẹn bằng việc đưa trực tiếp thuốc vào phổi trong trường hợp ung thư phổi do

hiệu ứng tăng tính thấm và tính dẫn lưu (EPR) của những hạt kích thước nhỏ

(100 nm). Koshkina và cộng sự đã so sánh hiệu quả điều trị giữa PTX liposome

đường tiêm tĩnh mạch và dạng phun mù với cùng liều lượng ở chuột. Kết quả

cho thấy PTX có độ thanh thải chậm hơn và nồng độ cao hơn trong phổi ở dạng

phun mù so với đường dùng tĩnh mạch [31].

1.8. Ưu điểm và nhược điểm của liposome

1.8.1. Ưu điểm

- Do đặc tính của phospholipid rất gần với cấu trúc màng tế bào, liposome là hệ

mang thuốc an toàn, tương đồng có khả năng thâm nhập tốt vào mô và tế bào đích.

- Liposome có thể mang đồng thời cả dược chất (DC) thân nước và thân dầu.

Dược chất có thể phân bố ở các vị trí khác nhau tùy thuộc đặc tính thân dầu thân

nước và tương tác lý hóa của dược chất với lớp phospholipid [49].

- Cấu tạo tương tự màng sinh học nên liposome dễ dàng thấm qua tế bào làm

tăng sinh khả dụng của DC, có thể mang DC tới nội bào để chữa bệnh nội bào.

Hoặc đưa DC tới đích nhờ gắn các ligand (ví dụ các mảnh kháng thể) trên màng

liposome [47].

- Làm thay đổi phân bố sinh học của một số DC có độc tính cao, dùng liều

thấp như: thuốc điều trị ung thư, thuốc kháng khuẩn, kháng nấm… Làm giảm phân

bố thuốc tại cơ quan lành, tăng phân bố tại đích so với DC tự do, làm giảm độc tính

và tác dụng không mong muốn, tăng hiệu quả điều trị, tiết kiệm DC….[47,49].

17

- Thể hiện ưu điểm của dạng siêu vi nang: bảo vệ dược chất tránh tác động bất

lợi của ngoại môi trong quá trình bảo quản hay trên đường vận chuyển tới vị trí tác

dụng trong cơ thể: pH, enzym, tác nhân oxy hóa… làm tăng độ tan của DC hoặc

kéo dài tác dụng của thuốc [43,55].

1.8.2. Nhược điểm

Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng hiện nay chưa có nhiều chế phẩm ứng dụng

hệ vận chuyển thuốc liposome trên thị trường do một số nhược điểm sau:

- Phospholipid không bền về mặt hóa học nên ảnh hưởng tới độ ổn định của

liposome. Liposome dễ bị thanh thải bởi hệ thực bào, thời gian tuần hoàn khó kéo

dài. Tỷ lệ liposome hóa của nhiều DC còn thấp đặc biệt với DC có phân tử lượng

lớn.

- Phospholipid chủ yếu được chiết tách từ nguồn nguyên liệu tự nhiên do đó

rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên liệu. Phospholipid có thể lẫn các

lysophospholipid hoặc các sản phẩm khác của quá trình oxy hóa phospholipid [37].

- Hầu hết các phương pháp bào chế liposome đều chỉ thích hợp với quy mô

phòng thí nghiệm, khó triển khai trên quy mô lớn.

- Một số phương pháp bào chế liposome sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan

lipid gây tác động bất lợi đến môi trường.

18

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Liposome

2.1.2. Nguyên vật liệu

Bảng 2.1: Các nguyên liệu sử dụng

TT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Phosphatidylcholin dầu đậu nành đã

hydrogen hóa (HSPC)

Lipoid TCCS

2 Cholesterol Sigma Aldrich TCCS

3

Cloroform Trung Quốc

TKHH 4 Natri acetat Trung Quốc TKHH

5 Acid citric Trung Quốc TKHH

6 Hepes (N-2-hydroxyethylpiperazine-

N’-2-ethanesulfonic acid)

Sigma Aldrich

TCCS 7 Kali dihydrophosphat Trung Quốc TKHH

8 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc TKHH

9 Acid acetic Trung Quốc TKHH

10 Túi thẩm tích Spectra/Por 4,

Molecular weight cut off :12-14 kD

Spectrum Lab -

Mỹ

TCCS 11 Natri hydroxid Trung Quốc TKHH

12 Natri clorid Trung Quốc TKHH

13 Nước cất pha tiêm Việt Nam DĐVN

14 Amoni sulfat Trung Quốc TKHH

15 Dung dịch tiêm truyền glucose 5% Việt Nam DĐVN

16 Saccarose Mỹ TCCS

17 Etanol tuyệt đối Trung Quốc TKHH

18 Dung dịch NaCl 0.9% Việt Nam DĐVN

19

2.3. Phương tiện nghiên cứu

- Máy cất quay ROTAVAPOR R-210 của Buchi – Đức.

- Máy đo kích thước tiểu phân và đo thế zeta ZETASIZER ZS 90 (Malvern –Anh)

- Bể điều nhiệt Buchi – Đức.

- Thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao EmulsiFlex (Avestin Canada).

- Tủ sấy hút chân không.

- Cân kĩ thuật, máy đo pH InoLab, tủ lạnh.

- Cân phân tích Satorius BP 121S.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa màng film

Tạo lớp film lipid: Hòa tan HSPC: Chol (250mg: 50mg) trong 50ml Cloroform.

Tiến hành bốc hơi dung môi trên thiết bị cất quay ở nhiệt độ 40oC trong điều kiện

chân không, tốc độ quay 50 vòng/phút. Thời gian cất quay khoảng 1 giờ sau đó đưa

vào tủ sấy chân không, sấy trong khoảng 12-18 giờ.

Hydrat hóa: Tăng tốc độ quay lên 80 vòng/phút, tăng nhiệt độ lên 60oC, sử dụng

các dung dịch khác nhau để hydrat hóa

1. Nước cất

2. Dung dịch NaCl 0.9%

3. Dung dịch glucose 5%

4. Dung dịch saccarose 10%

5. Đệm citrat pH 4.0

6. Đệm acetat pH 4.0

7. Đệm amoni sulfat pH 5.5

8. Đệm phosphat/ NaCl pH 7.4

Tiến hành hydrat hóa trong khoảng 2 giờ s thu được hỗn dịch liposome màu trắng

đục.

+ Công thức đệm citrat: hòa tan 3.15g acid citric và 0.7g NaOH hòa tan trong

100 ml nước cất pha tiêm điều chỉnh tới pH 4.0 bằng dung dịch NaOH 10%. Lọc

qua màng cellulose acetate 0.2 μm.

+ Công thức đệm amoni sulfat: hòa tan 1.68g (NH4)2SO4 vào 100 ml nước

cất pha tiêm điều chỉnh tới pH 5.5 bằng dung dịch NaOH 10%. Lọc qua màng

cellulose acetate 0.2 μm.

+ Công thức đệm acetat: hòa tan 2.36g natri acetat và 8 ml dung dịch

CH3COOH 0.2 M trong 100ml nước cất pha tiêm, điều chỉnh pH 4.0 bằng dung

dịch NaOH 10%. Lọc qua màng cellulose acetate 0.2 μm.

+ Công thức đệm PO4/NaCl: hòa tan 0.144g Na2HPO4 và 0.024g KH2PO4

trong 100 ml dung dịch NaCl 0.9%. Lọc qua màng cellulose acetate 0.2 μm.

20

2.4.2. Nghiên cứu quy trình làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân

Sử dụng thiết bị nén áp suất cao EmulsiFlex (Avestin - Canada) với khí nén

nitơ nối với tủ tách ẩm. Nén lặp lại nhiều chu kỳ ở điều kiện nhiệt độ là 60oC và áp

suất thích hợp đến khi đạt kích thước và phân bố kích thước mong muốn. Sau cùng

lọc hỗn dịch qua màng 0.2 µm để loại các tiểu phân kích thước lớn.

Khảo sát và thu lại mẫu khi nén lần lượt qua 10, 20, 30 chu kì tại hai áp suất lần

lượt là 500 bar và 1000 bar để tìm ra quy trình phù hợp cho mỗi mẫu.

2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường bên trong và bên ngoài đến đặc tính

tiểu phân của liposome

Tiến hành đổi môi trường bên ngoài liposome của các hệ môi trường đã bào

chế trên bằng việc sử dụng phương pháp lọc túi lọc thẩm tích. Hút 5 ml dung dịch

cho vào trong túi thẩm tích, đặt trong 500 ml các môi trường ngoài khác nhau cần

khảo sát, để khoảng 3giờ ở nhiệt độ 4-8oC, sau đó lại tiếp tục tiến hành đổi môi

trường bằng các dung dịch trước đó để loại hoàn toàn môi trường ban đầu. Quy

trình thẩm tích mất khoảng 1 ngày để đổi hoàn toàn môi trường bên ngoài liposome.

Đổi môi trường bên ngoài liposome thành các môi trường như sau:

Môi trường trong liposome Môi trường ngoài liposome

Dung dịch hydrat hóa

Đệm HEPES/ NaCl pH 7,4 (HBS)

Đệm HEPES/ Glucose pH 7,4 (HBG)

Nước cất

+ Công thức đệm HEPES/ NaCl pH 7.4 (HBS) : hòa tan 20mM Hepes vào trong

500ml dung dịch NaCl 0,9%.

+ Công thức đệm HEPES/ Glucose pH 7.4 (HBG): hòa tan 20mM Hepes vào trong

500ml dung dịch glucose 5%.

Hình 2.1: Phương pháp thẩm tích sử dụng túi Spectra/ Por 4

21

Tổng hợp ta có sơ đồ quy trình các bước tiến hành nghiên cứu sau:

Dung dịch hydrat hóa

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình các bước tiến hành nghiên cứu.

2.5. Phương pháp đánh giá liposome tạo thành

2.5.1. Đánh giá cảm quan

So sánh độ đục trong của các hỗn dịch liposome tạo thành và sự lắng cặn, kết

tập của hỗn dịch nếu có.

2.5.2. Phương pháp đánh giá hình thái, cấu trúc liposome

Sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua (transmission electron

microscopy – TEM) để xác định hình thái, cấu trúc liposome tạo thành.

2.5.3. Phương pháp đánh giá đặc điểm hóa lí của hệ có môi trường trong và

ngoài khác nhau

1. Xác định KTTP trung bình và phân bố KTTP

Đánh giá KTTP và phân bố KTTP dựa vào giá trị đo đường kính trung bình

(Z-average), chỉ số đa phân tán (PDI), đo lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình.

2. Xác định điện thế zeta (zeta potential).

Tráng film Sấy chân không

Hydrat hóa

Giảm và đồng nhất kích thước Đổi môi trường bên ngoài

40oC

(HSPC: CHOl=250:50

mg) + 50ml Cloroform

v= 50v/p

40oC trong 12-18h

1. Nước cất

2. Dd glucose 5%

3. Dd saccarose 10%

4. Dung dịch NaCl 0.9%

5. Đệm AB pH 4.0

6. Đệm CB pH 4.0

7. Đệm AmB pH 5.5

8. Đệm PBS pH 7.4

Nén lần lượt qua 10,

20, 30 chu kì tại P=

500 bar và 1000 bar,

t= 60oC

60oC

60oC, v = 80v/ p

22

Pha loãng mẫu liposome 100 lần (sao cho count rate đạt khoảng 200-400 kcps) bằng

nước cất rồi đo giá trị điện thế zeta bằng kĩ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS) trên

thiết bị Zetasizer ZS90. Tiến hành đo lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình.

3. Đánh giá sự ổn định của hệ.

Đánh giá sự ổn định của liposome bào chế thông qua việc so sánh KTTP, PDI và

thế zeta của các mẫu tạo thành qua thời gian lần lượt là 1 ngày, 3 ngày, 7 ngày, 14

ngày và 1 tháng tại điều kiện bảo quản là 4oC.

Đánh giá môi trường bên ngoài phù hợp nhất để bảo quản mẫu liposome với các hệ

môi trường hydrat hóa khác nhau.

23

Chương 3 - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

3.1. Hình thái, cấu trúc liposome

Hình 3.1: Hình ảnh chụp TEM của mẫu liposome lần lượt là H2O và Acetat.

Kết quả hình ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử truyền qua (hình 3.1) cho thấy các

mẫu liposome có kích thước khá đồng nhất, các hạt tiểu phân liposome có kích

thước cỡ từ 70- 110 nm. Các hạt tiểu phân có dạng hình cầu, đơn lớp, lớp vỏ khá

mỏng.

3.2. Đánh giá quy trình giảm và đồng nhất KTTP

Đánh giá quy trình giảm kích thước tiểu phân đối với mỗi hệ môi trường

hydrat khác nhau tại 2 áp suất lần lượt là 500 bar và 1000 bar. Tại mỗi áp suất, đánh

giá KTTP, PDI và zeta các mẫu sau lần lượt 10, 20 và 30 chu kì.

3.2.1. Hệ môi trường hydrat nước (H2O)

Bảng 3.1: Kết quả đo KTTP, PDI và điện thế zeta của hệ môi trường hydrat là

nước

Số chu kì

nén

Áp suất nén

500 bar 1000 bar

Z – average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

Z – average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

10 139.1 0.229 -9.19 72.01 0.217 -15.2

20 121.62 0.212 -10.1 70.80 0.145 -28.2

30 118.1 0.214 -9.54 68.48 0.169 -25.1

24

Với dung dịch hydrat hóa là nước cất, khi so sánh khả năng làm giảm và

đồng nhất kích thước liposome ở 2 áp suất tăng dần từ 500 đến 1000 bar nhận thấy:

- Tại áp suất cao hơn là 1000 bar, các mẫu liposome có kích thước, giá trị phân bố

kích thước PDI giảm nhanh hơn áp suất nén 500 bar chứng tỏ khi áp suất tăng,

KTTP giảm và có độ đồng nhất tốt hơn.

- Khi nén qua 20 chu kì liên tiếp tại áp suất 1000 bar, mẫu liposome có KTTP

trung bình đạt 70.8 nm, PDI nhỏ nhất trong các mẫu và giá trị tuyệt đối điện thế zeta

cao nhất. Do đó có thể nhận định rằng các mẫu nén qua 20 chu kì cho mẫu đồng

nhất và độ ổn định cao nhất.

Từ đó ta chọn ra quy trình nén ở áp suất là 1000 bar và nén qua 20 chu kì là

quy trình phù hợp để làm giảm và đồng nhất kích thước.

3.2.2. Hệ môi trường hydrat: đệm acetat pH 4.0

Bảng 3.2: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: đệm

acetat pH 4.0

Số chu kì

nén

Áp suất nén

500 bar 1000 bar

Z –average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

Z – average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

10 121.1 0.174 21.9 84.3 0.2 22.2

20 113.8 0.177 21.1 74.3 0.152 32.4

30 103.2 0.167 24.6 82.2 0.181 28.6

Với dung dịch hydrat hóa là đệm acetat, khi so sánh khả năng làm giảm và

đồng nhất kích thước liposome ở 2 áp suất là 500 bar và 1000 bar nhận thấy:

- Tại áp suất cao hơn là 1000 bar, các mẫu liposome có kích thước, PDI giảm nhanh

hơn chứng tỏ khi áp suất tăng, KTTP giảm nhanh hơn và có độ đồng nhất tốt hơn.

- Khi nén qua 20 chu kì cho mẫu liposome có KTTP, PDI nhỏ nhất (KTTP trung

bình đạt 74.3 nm, PDI đạt 0.152) và giá trị thế zeta là -32 mV. Vì thế có thể nhận

định rằng các mẫu nén qua 30 chu kì cho mẫu đồng nhất và độ ổn định cao nhất.

Do đó quy trình nén ở áp suất là 1000 bar và nén qua 30 chu kì là quy trình

phù hợp nhất để giảm và đồng nhất kích thước.

3.2.3. Hệ môi trường hydrat: đệm citrat pH 4,0

25

Bảng 3.3: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: đệm

citrate pH 4.0

Số chu kì

nén

Áp suất nén

500 bar 1000 bar

Z –average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

Z – average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

10 188.9 0.492 0.86 131.4 0.347 1.15

20 178.1 0.523 1.11 123.7 0.189 2.67

30 151.4 0.592 1.26 126.9 0.201 1.51

Với dung dịch hydrat hóa là dung dịch đệm citrate pH 4.0, ta nhận thấy:

- Các mẫu khi nén với áp suất 500 bar đều cho KTTP khá lớn, giá trị PDI cao, thế

zeta nhỏ gần 0. Điều này cho thấy đây là những hệ không ổn định.

- Khi nén áp suất cao hơn là 1000 bar, các mẫu cho KTTP nhỏ hơn, PDI cũng giảm

xuống, đặc biệt khi nén qua 20 chu kì cho KTTP đạt 123.7 nm và PDI đạt 0.189.

Chọn ra quy trình nén qua 20 chu kì ở áp suất 1000 bar là quy trình phù hợp

để giảm và đồng nhất kích thước.

3.2.4. Hệ môi trường hydrat: đêm amoni pH 5.5

Bảng 3.4: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: đệm

amoni pH 5.5

Số chu kì

nén

Áp suất nén

500 bar 1000 bar

Z –average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

Z – average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

10 112.6 0.409 -2.98 95.06 0.188 2.21

20 94.27 0.335 -3.31 93.15 0.167 4.9

30 99.77 0.371 2.92 89.54 0.160 12.8

Với dung dịch hydrat hóa là dung dịch đệm amoni, khi so sánh khả năng làm

giảm và đồng nhất kích thước liposome ở 2 áp suất là 500 bar và 1000 bar nhận

thấy:

- Khi nén ở áp suất 500 bar, các mẫu liposome đều có kích thước phù hợp yêu cầu,

nhưng giá trị PDI đều cao hơn 0.3 và giá trị thế zeta gần 0 cho thấy đây là các hệ

không đồng nhất và ổn định.

- Tại áp suất cao hơn là 1000 bar, các mẫu liposome có kích thước, PDI giảm dần và

đều nhỏ hơn 0.2 hơn chứng tỏ khi áp suất tăng, KTTP giảm và có độ đồng nhất tốt

26

hơn. Đặc biệt là khi nén qua 30 chu kì cho KTTP đạt 89.54 nm và PDI đạt 0.160,

thế zeta cao nhất trong tất cả các mẫu.

Do đó chọn ra quy trình nén qua 30 chu kì tại áp suất 1000 bar là quy trình

phù hợp để làm giảm và đồng nhất kích thước.

3.2.5. Hệ môi trường hydrat: dung dịch Glucose 5%

Bảng 3.5: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: dung

dịch Glucose 5%

Số chu kì

nén

Áp suất nén

500 bar 1000 bar

Z –average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

Z – average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

10 180.8 0.254 -9.79 160.6 0.246 -10.3

20 163.6 0.329 -5.70 142.5 0.212 -10.7

30 141.1 0.309 -5.49 119.5 0.192 -19.5

Với dung dịch hydrat hóa là dung dịch glucose 5%, đây là dung dịch có độ

nhớt khá cao so với các dung dịch khác nên KTTP của các mẫu khá lớn, do đó cần

một lực nén ở áp suất cao và số chu kì nén lớn.

- Tại áp suất nén là 500 bar, các mẫu liposome đều có KTTP, giá trị PDI cao.

- Khi áp suất nén cao hơn là 1000 bar, các mẫu liposome có sự giảm dần về KTTP

cũng như giá trị PDI. Đặc biệt khi nén qua 30 chu kì cho thế zeta cao nhất và đây là

hệ đồng nhất và ổn định nhất.

- Tại áp suất nén là 500 bar, các mẫu liposome đều có KTTP, giá trị PDI cao.

Chọn ra quy trình thích hợp để giảm và đồng nhất kích thước đó là nén ở áp

suất 1000 bar và nén qua 30 chu kì liên tiếp.

3.2.6. Hệ môi trường hydrat: dung dịch saccarose 10%

Bảng 3.6: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: dung

dịch saccarose 10%

Số chu kì

nén

Áp suất nén

500 bar 1000 bar

Z –average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

Z – average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

10 231.9 0.845 -0.017 168.4 0.783 -0.199

20 222.1 0.792 -0.119 169.9 0.757 -0.373

30 278.7 0.851 -0.210 189.6 0.810 -0.18

27

Với dung dịch Saccarose 10% sử dụng để hydrat hóa, khi tiến hành nén đẩy

qua thiết bị ta thấy KTTP cũng như giá trị PDI đo được của các mẫu cao. Khi tăng

số chu kì nén lên thì KTTP và PDI cũng tăng lên, một thế zeta gần 0 cho thấy sự

không ổn định của các hệ liposome này.

Trong quá trình lưu giữ mẫu trong điều kiện bảo quản là 4oC, chỉ qua 1 đêm

các mẫu đã xuất hiện kết tập, lắng cặn dưới đáy lọ là minh chứng cho sự không ổn

định của hệ.

3.2.7. Hệ môi trường hydrat: dung dịch NaCl 0.9%

Bảng 3.7: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: dung

dịch NaCl 0.9%

Số chu kì

nén

Áp suất nén

500 bar 1000 bar

Z –average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

Z – average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

10 199.7 0.572 -1.36 136.1 0.374 -1.98

20 156.2 0.411 -1.90 108.6 0.290 -2.98

30 161.6 0.337 -1.99 121.4 0.303 -2.1

Với dung dịch hydrat hóa là dung dịch NaCl 0.9% ta nhận thấy:

- Các mẫu nén ở áp suất 500 bar đều cho KTTP khá lớn, giá trị PDI cao (> 0.3) và

thế zeta gần 0 nên là các hệ không ổn định.

- Khi nén ở áp suất 1000 bar có sự giảm về KTTP cũng như giá trị PDI, đặc biệt nén

qua 20 chu kì liên tiếp cho KTTP trung bình là 108.6 nm và PDI là 0.290 và trị

tuyệt đối giá trị thế zeta là lớn nhất.

Do đó quy trình nén qua 20 chu kì tại áp suất 1000 bar là quy trình phù hợp

để giảm và đồng nhất kích thước.

3.2.8. Hệ môi trường hydrat: đệm Phosphat trong NaCl pH 7.4 (PBS)

Bảng 3.8: Kết quả đo KTTP, PDI và thế zeta của hệ môi trường hydrat: đệm

PO4/ NaCl pH 7.4 (PBS)

Số chu kì

nén

Áp suất nén

500 bar 1000 bar

Z –average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

Z – average

(d.nm) PDI

Zeta

(mV)

10 116.4 0.245 -11.2 96.7 0.226 -25.3

20 112.9 0.211 -17.8 85.0 0.172 -27.9

30 112.2 0.226 -15.2 80.9 0.159 -30.7

28

Với môi trường hydrat hóa là dung dịch đệm PBS ta nhận thấy:

- Tại áp suất cao hơn là 1000 bar, các mẫu liposome có kích thước, PDI giảm nhanh

hơn chứng tỏ khi áp suất tăng, KTTP giảm nhanh hơn và có độ đồng nhất tốt hơn.

- Tại áp suất 1000 bar và nén qua 30 chu kì liên tiếp cho mẫu liposome có KTTP

trung bình và giá trị PDI nhỏ nhất trong các mẫu ( KTTP đạt 80.9 nm, PDI= 0.159)

thế zeta cao nhất là -30.7 mV.

Do đó quy trình phù hợp để làm giảm và đồng nhất kích thước đó là quy

trình nén liên tiếp qua 30 chu kì ở áp suất 1000 bar.

3.3. Đánh giá độ ổn định của mỗi hệ liposome với các thành phần môi trường

trong và ngoài khác nhau.

3.3.1. Môi trường bên trong là nước

Đối với hệ có môi trường bên trong và bên ngoài là nước, tiến hành thẩm tích đổi

môi trường bên ngoài liposome thành các đệm HBG và HBS, ta có các hệ môi

trường khác nhau:

Các hệ Môi trường trong và ngoài liposome

H2O/ H2O Môi trường trong là nước và ngoài liposome là nước

H2O/ HBG Môi trường trong là nước và ngoài liposome là đệm HBG

H2O/ HBS Môi trường trong là nước và ngoài liposome là đệm HBS

Đánh giá ảnh hưởng của môi trường trong và ngoài liposome đến sự thay đổi

KTTP và giá trị PDI của các hệ ta có bảng sau:

Bảng 3.9: Sự thay đổi KTTP, PDI qua thời gian của hệ môi trường hydrat:

nước trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

Ngày

Môi trường

H2O/ H2O H2O/ HBS H2O/ HBG Z- average

(d.nm) PDI

Z- average

(d.nm) PDI

Z- average

(d.nm) PDI

1 70.80 0.145 _ _ _ _

3 70.70 0.143 71.20 0.164 70.25 0.160

7 71.68 0.153 71.11 0.168 71.90 0.167

14 72.40 0.155 87.85 0.217 111.2 0.291

30 73.36 0.158 120.1 0.239 144.8 0.538

Dựa vào bảng ta nhận thấy:

29

- Không có sự thay đổi nhiều về KTTP ngay sau khi tiến hành thẩm tích đổi môi

trường bên ngoài.

- Sự thay đổi KTTP của mẫu có môi trường trong và ngoài liposome là H2O không

nhiều sau thời gian bảo quản 1 tháng, dao động trong khoảng từ 70.8 nm đến 73.36

nm và PDI thay đổi từ 0.145- 0.158.

- Khi thay đổi môi trường bên ngoài liposome sang đệm HBS và HBG thì các mẫu

có sự bất ổn định thể hiện qua giá trị đo KTTP và PDI tăng dần trong thời gian bảo

quản. Điều này càng rõ hơn khi đánh giá sự thay đổi điện thế zeta giữa các mẫu ở

đồ thị 3.2.

Hình 3.2: Sự thay đổi về điện thế zeta theo thời gian của các mẫu liposome có môi

trường hydrat là H2O.

Dựa vào đồ thị ta nhận thấy:

- Mẫu có môi trường trong và ngoài liposome là nước cất không có sự thay đổi đáng

kể giá trị đo thế zeta trong thời gian bảo quản. Sau 30 ngày thế zeta đo được là 27.5

mV, cho thấy đây là hệ khá ổn định.

- Khi thay đổi môi trường bên ngoài liposome, thế zeta đo được của các mẫu H2O/

HBS và H2O/ HBG nằm trong khoảng không ổn định, giảm dần trong thời gian bảo

quản chỉ còn lần lượt -9.9 mV và -6.8 mV.

Do vậy với liposome có môi trường bên trong và ngoài là nước s ổn định nhất.

3.3.2. Môi trường bên trong là đệm acetat pH 4.0 (AB –acetat buffer)

Đối với hệ có môi trường bên trong và bên ngoài là đệm acetat pH 4.0, tiến hành

thẩm tích đổi môi trường bên ngoài liposome thành môi trường nước cất, đệm HBG

và HBS, ta có các hệ môi trường khác nhau đó là:

Các hệ Môi trường trong và ngoài liposome

AB/ AB Môi trường trong và ngoài liposome là đệm acetat

AB/ H2O Môi trường trong là đệm acetat và ngoài liposome là nước

AB/ HBG Môi trường trong là đệm acetat và ngoài liposome là đệm HBG

AB/ HBS Môi trường trong là đệm acetat và ngoài liposome là đệm HBS

30

Đánh giá ảnh hưởng của môi trường trong và ngoài liposome đến sự thay đổi KTTP

và PDI ta có bảng sau:

Bảng 3.10: Sự thay đổi KTTP, PDI qua thời gian của hệ môi trường hydrat:

đệm acetat pH 4,0 trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

Ngày

Môi trường

AB/ AB AB/ HBS AB/ HBG AB/ H2O

Z- average

(d.nm)

PDI Z- average

(d.nm)

PDI Z- average

(d.nm)

PDI Z- average

(d.nm)

PDI

1 74.30 0.152 _ _ _ _ _ _

3 83.02 0.177 82.21 0.160 75.90 0.140 81.02 0.177

7 82.20 0.170 83.22 0.163 76.02 0.144 87.20 0.178

14 86.60 0.162 88.70 0.182 82.43 0.155 87.12 0.191

30 102.3 0.141 116.3 0.116 88.16 0.170 88.70 0.196

Nhận xét:

- Mẫu có môi trường trong và ngoài liposome là đệm acetat có KTTP tăng dần theo

thời gian từ 74.3 nm lên 102.3 nm, giá trị PDI thay đổi bất thường có thể là do các

hạt tiểu phân kích thước lớn rơi xuống đáy lọ, lơ lửng trên là các hạt có kích thước

nhỏ hơn.

- Sau khi tiến hành đổi môi trường bên ngoài liposome ta nhận thấy: với hệ đệm bên

ngoài là HBS KTTP tăng dần theo thời gian. Hệ đệm HBG và nước cất không tăng

nhiều, KTTP dao động trong khoảng 88 nm, và giá trị PDI đều trong khoảng 0.2 sau

30 ngày bảo quản cho thấy đây là các hệ khá ổn định. Điều này càng thể hiện rõ qua

việc đánh giá sự ổn định của các hệ thông qua việc đo điện thế zeta.

Hình 3.3: Sự thay đổi điện thế zeta theo thời gian của các mẫu có hệ môi trường

hydrat là đệm Acetat (AB).

Dựa vào đồ thị ta nhận thấy:

- Mẫu có môi trường trong và ngoài là đệm acetat có thế zeta giảm dần từ +32.4 mV

xuống +27.5 mV cho thấy hệ không ổn định theo thời gian bảo quản. Điều này có

31

thể giải thích là do ở môi trường pH quá thấp s làm gia tăng sự thủy phân

phospholipid làm hệ kém ổn định.

- Khi thay đổi môi trường bên ngoài liposome từ đệm acetat sang các môi trường

khác nhận thấy có sự thay đổi về điện tích từ dương sang âm chứng tỏ bề mặt

liposome đã hấp phụ nhiều ion (-) làm thay đổi điện tích bề mặt của chúng.

- Với môi trường bên ngoài là đệm HBS, mẫu đo được có thế zeta giảm dần theo

thời gian.

- Với môi trường bên ngoài liposome là đệm HBG và nước thì sự thay đổi điện thế

là không đáng kể, các mẫu đều có giá trị trong khoảng -30 mV cho thấy đây là các

hệ khá ổn định.

Đánh giá ảnh hưởng môi trường bên ngoài đến đặc tính tiểu phân liposome ta

có thể khẳng định với môi trường bên trong là đệm acetat thì môi trường bên ngoài

là nước và đệm HBG s ổn định. Trong đó nước là môi trường thích hợp nhất.

3.3.3. Môi trường hydrat: đệm citrat pH 4.0 (CB- citrat buffer)

Đối với hệ có môi trường bên trong và bên ngoài là citrat, tiến hành thẩm tích đổi

môi trường bên ngoài liposome thành nước cất, đệm HBG và HBS, ta có các hệ môi

trường khác nhau như sau:

Các hệ Môi trường trong và ngoài liposome

CB/ CB Môi trường trong và ngoài liposome là đệm citrate

CB/ H2O Môi trường trong là đệm citrat và ngoài liposome là nước

CB/ HBG Môi trường trong là đệm citrat và ngoài liposome là đệm HBG

CB/ HBS Môi trường trong là đệm citrat và ngoài liposome là đệm HBS

Đánh giá ảnh hưởng của môi trường trong và ngoài liposome đến sự thay đổi KTTP

và PDI ta có bảng sau:

Bảng 3.11: Sự thay đổi KTTP, PDI qua thời gian của hệ môi trường hydrat:

đệm citrat pH 4.0 trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

Ngày

Môi trường

CB/ CB CB/ HBS CB/ HBG CB/ H2O

Z- average

(d.nm)

PDI Z- average

(d.nm)

PDI Z- average

(d.nm)

PDI Z- average

(d.nm)

PDI

1 124.1 0.187 _ _ _ _ _ _

3 126.2 0.19 125.2 0.184 125.3 0.187 127.3 0.185

7 136.2 0.196 127.4 0.188 126.3 0.191 128.1 0.190

14 150.1 0.261 144.7 0.210 128.3 0.193 134.6 0.214

30 211.6 0.332 156.9 0.243 130.8 0.197 147.5 0.245

Nhận xét:

- Đối với mẫu có môi trường trong và ngoài là đệm citrat có KTTP tăng từ 124.1

nm lên 211.6 nm và giá trị PDI tăng từ 0.187 lên 0.332 theo thời gian có thể do pH

32

thấp s làm gia tăng sự thủy phân của phospholipid. Do đó đây không phải là môi

trường tốt để bảo quản liposome.

- Khi tiến hành thẩm tích để đổi môi trường bên ngoài liposome sang các hệ môi

trường có pH cao hơn cho thấy các hệ có xu hướng ổn định hơn. Không có sự thay

đổi nhiều về KTTP cũng như là PDI ngay sau khi thẩm tích, khoảng KTTP nằm

trong khoảng 124.1- 127.3 nm, PDI đều dưới 0.2.

- Trong thời gian bảo quản, các mẫu có môi trường bên ngoài liposome là nước và

HBS có sự gia tăng về KTTP cũng như giá trị PDI đo được đều lớn hơn 0.24. Mẫu

có môi trường bên ngoài là đệm HBG không có sự tăng nhiều về KTTP và PDI (nhỏ

hơn 0.2) cho thấy đây là hệ ổn định. Đánh giá thêm sự ổn định của các mẫu qua việc

đo thế zeta ta có đồ thị sau:

Hình 3.4: Sự thay đổi điện thế zeta theo thời gian của các mẫu có hệ môi trường

hydrat là đệm Citrat pH 4.0 (CB).

Dựa vào đồ thị ta nhận thấy:

- Mẫu có môi trường trong và ngoài là đệm citrat có thế zeta gần 0 nên kém ổn định,

điều này cũng được chứng minh qua sự gia tăng KTTP và PDI trên. Do đó các mẫu

liposome không nên bảo quản ở môi trường pH thấp như đệm citrate.

- Khi thay đổi môi trường bên ngoài liposome các hệ có xu hướng ổn định hơn và

có sự thay đổi về điện tích từ (+) sang (-). Điều này là do ở pH thấp, nhóm PO4- ở

trạng thái không phân li chỉ có nhóm N bậc 4 tích điện dương làm bề mặt liposome

chuyển sang tích điện dương. Khi đổi môi trường bên ngoài liposome sang pH cao

hơn thì bề mặt liposome hấp phụ ion âm chuyển sang tích điện âm (do hấp phụ thừa

các ion âm trong môi trường).

- Trong các công thức đã khảo sát, hệ đệm là HBS có thế zeta cao hơn đệm HBG là

bởi vì trong hệ đệm HBS có các ion Cl –

làm giảm bề dày lớp khuyếch tán (hệ

liposome trong nước có bề mặt tích điện âm nên lớp khuếch tán là lớp ion (+)) do

đó làm thế zeta bớt âm (tức thế zeta cao hơn). Điều này cũng được chứng tỏ qua sự

tăng nhanh về KTTP cũng như PDI trong thời gian bảo quản.

Do vậy với liposome chứa môi trường bên trong là đệm citrat thì môi trường

bên ngoài là đệm HBG s ổn định nhất vì thế zeta gần -30 mV.

33

3.3.4. Hệ môi trường hydrat: đệm amoni pH 4.0 (AmB – amoni buffer)

Đối với hệ có môi trường bên trong và bên ngoài là nước, tiến hành thẩm tích đổi

môi trường bên ngoài liposome thành nước cất, đệm HBG và HBS, ta có bảng sau:

Quy trình đổi hệ môi trường bên ngoài liposome

Các hệ Môi trường trong và ngoài liposome

AmB/ AmB Môi trường trong và ngoài liposome là đệm amoni

AmB/ H2O Môi trường trong là đệm amoni và ngoài liposome là nước

AmB/ HBG Môi trường trong là đệm amoni và ngoài liposome là đệm HBG

AmB/ HBS Môi trường trong là đệm amoni và ngoài liposome là đệm HBS

Đánh giá ảnh hưởng của môi trường trong và ngoài liposome đến sự thay đổi KTTP

và PDI ta có bảng sau:

Bảng 3.12: Sự thay đổi KTTP, PDI qua thời gian của hệ môi trường hydrat:

đệm amoni pH 5.5 trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

Ngày

Môi trường

AmB/ AmB AmB/ HBS AmB/ HBG AmB/ H2O

Z- average

(d.nm)

PDI Z- average

(d.nm)

PDI Z- average

(d.nm)

PDI Z- average

(d.nm)

PDI

1 89.54 0.160 _ _ _ _ _ _

3 97.23 0.170 88.72 0.174 103.7 0.187 100.4 0.170

7 96.31 0.186 90.23 0.198 104.01 0.187 102.1 0.189

14 95.32 0.176 91.47 0.196 108.4 0.198 112 0.191

30 99.64 0.197 93.27 0.200 120.2 0.242 116.4 0.210

Nhận xét:

- Đối với mẫu có môi trường bên trong và ngoài liposome là đệm amoni có KTTP

và PDI tăng theo thời gian, KTTP tăng không nhiều trong 14 ngày bảo quản, tuy

nhiên đến ngày 30 thì KTTP tăng lên 99.64 nm và PDI tăng từ 0.160 ngày đầu tiên

lên 0.197.

- Sau khi đổi môi trường bên ngoài sang các hệ có pH cao hơn nhận thấy: trong các

hệ thì hệ đệm HBG có sự gia tăng về KTTP từ 103.7 nm lên 120.2 nm và PDI tăng

từ 0.187 lên 0.242 theo thời gian. Hệ đệm HBS có KTTP nhỏ nhất, PDI bằng 0.2.

Tiếp tục đánh giá sự ổn định các mẫu qua sự thay đổi giá trị thế zeta qua đồ thị sau:

34

Hình 3.5: Sự thay đổi điện thế zeta theo thời gian của các mẫu có hệ môi trường

hydrat là đệm Amoni pH 5.5 (AmB).

Dựa vào đồ thị ta nhận thấy:

- Đối với hệ môi trường trong và ngoài liposome là đệm amoni, giá trị đo thế zeta

không có sự giảm xuống theo thời gian, từ +12.8 mV xuống +10.3 mV. Cùng với sự

thay đổi KTTP và PDI theo thời gian, nhận thấy môi trường bên ngoài là đệm

amoni không phải là thích hợp để bảo quản liposome.

- Khi đổi môi trường bên ngoài liposome sang các hệ môi trường khác nhau, ta nhận

thấy có sự thay đổi điện tích từ (+) sang (-) do bề mặt liposome đã hấp phụ các ion

(-) trong môi trường.

- Trong các công thức khảo sát được thì hệ đệm ngoài là HBS cho thế zeta dao động

không nhiều theo thời gian và là âm nhất.

Dựa vào sự thay đổi các đặc tính tiểu phân của các mẫu, với môi trường bên trong

là đệm amoni pH 5.5 thì môi trường bên ngoài là đệm HBS s cho các mẫu ổn định

hơn.

3.3.5. Môi trường hydrat: dung dịch Glucose 5% (Glu)

Đối với hệ có môi trường bên trong và bên ngoài là nước, tiến hành thẩm tích đổi

môi trường bên ngoài liposome thành nước cất, HBS, ta có bảng sau:

Quy trình đổi hệ môi trường bên ngoài liposome

Các hệ Môi trường trong và ngoài liposome

Glu/ Glu Môi trường trong và ngoài liposome là dung dịch Glucose 5%

Glu/ H2O

Môi trường trong là dung dịch Glucose và ngoài liposome là

nước

H2O/ HBS

Môi trường trong là dung dịch Glucose và ngoài liposome là đệm

HBS

Đánh giá ảnh hưởng của môi trường trong và ngoài liposome đến sự thay đổi KTTP

và PDI ta có bảng sau:

35

Bảng 3.13: Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian của hệ môi trường hydrat:

Glucose 5% trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

Ngày

Môi trường

Glu / Glu Glu/ HBS Glu / H2O Z- average

(d.nm) PDI

Z- average

(d.nm) PDI

Z- average

(d.nm) PDI

1 119.5 0.192 _ _ _ _

3 125.3 0.217 118.9 0.176 117.5 0.178

7 123.7 0.239 120.1 0.199 118.7 0.174

14 130.4 0.423 120.9 0.231 120.4 0.218

30 147.5 0.476 121.5 0.247 124.3 0.229

Nhận xét:

- Đối với hệ môi trường trong và ngoài liposome là dung dịch Glucose 5% có sự

tăng nhanh về KTTP từ 119.5 nm lên 147.5 nm và giá trị PDI tăng từ 0.192 lên

0.476 trong thời gian bảo quản.

- Tiến hành đổi môi trường bên ngoài liposome nhận thấy trong quá trình bảo quản

thì các mẫu cũng có sự gia tăng KTTP khoảng 120 nm và giá trị PDI lớn hơn 0.2.

Tiếp tục đánh giá sự ổn định các mẫu qua sự thay đổi giá trị thế zeta qua đồ thị sau:

Hình 3.6: Sự thay đổi KTTP và giá trị PDI theo thời gian của các mẫu có hệ môi

trường hydrat là dung dịch Glucose 5% (Glu).

Dựa vào đồ thị ta nhận thấy:

- Với môi trường trong và ngoài liposome là dung dịch Glucose có sự tăng điện thế

zeta từ -12.9 mV lên -9.35 mV theo thời gian. Do đó môi trường bên ngoài là

Glucose không phải là thích hợp để bảo quản mẫu.

- Sau khi đổi hệ môi trường bên ngoài liposome sang các môi trường khác ta nhận

thấy với môi trường ngoài là nước cất có thế zeta âm nhất và sự thay đổi này là

không nhiều theo thời gian từ -27.7 mV đến -26 mV.

36

Do đó với mẫu liposome có môi trường trong là dung dịch Glucose thì môi trường

bên ngoài là nước cất s cho mẫu ổn định nhất.

3.3.6. Môi trường hydrat: dung dịch Saccarose 10% (Sac)

Do các mẫu có môi trường hydrat là dung dịch Saccarose 10% có KTTP lớn, PDI

cao, các hệ có xu hướng kết tập, không ổn định nên không tiếp tục tiến hành đổi hệ

đệm bên ngoài liposome.

3.3.7. Môi trường hydrat: dung dịch NaCl 0.9 % (NaCl)

Đối với hệ có môi trường bên trong và bên ngoài là dung dịch NaCl 0.9%, tiến

hành thẩm tích đổi môi trường bên ngoài liposome ta có các hệ môi trường sau:

Các hệ Môi trường trong và ngoài liposome

NaCl/ NaCl Môi trường trong và ngoài liposome là dung dịch NaCl 0,9 %

NaCl/ H2O Môi trường trong là dung dịch NaCl và ngoài liposome là nước

NaCl/ HBG Môi trường trong là dung dịch NaCl và ngoài liposome là đệm HBG

Đánh giá ảnh hưởng của môi trường trong và ngoài liposome đến sự thay đổi

KTTP và PDI ta có bảng sau:

Bảng 3.14: Sự thay đổi KTTP, PDI theo thời gian của các hệ môi trường

hydrat NaCl 0,9% trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

Ngày

Môi trường

NaCl/ NaCl NaCl/ H2O NaCl/ HBG

Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI Z- average (d.nm) PDI

1 108.6 0.29 _ _ _ _

3 105.7 0.233 119.5 0.298 110.3 0.45

7 121.3 0.34 112.5 0.31 # #

14 181.8 0.432 126.1 0.409 # #

30 # # 140.8 0.465 # #

Chú thích: ##: các mẫu có giá trị KTTP >1500 nm, PDI không xác định.

_: không có giá trị vì chưa có mẫu.

Nhận xét:

- Mẫu có môi trường trong và ngoài là dung dịch NaCl 0,9% có sự tăng nhanh về

KTTP cũng như giá trị PDI theo thời gian. Đặc biệt khi quan sát bằng mắt các mẫu

đã có hiện tượng lắng cặn, kết tập tiểu phân dưới đáy lọ sau nửa tháng. Do đó đây là

hệ không ổn định.

37

- Sau khi thay đổi môi trường bên ngoài liposome ta nhận thấy hệ đệm ngoài là đệm

HBG cho các giá trị KTTP và PDI quá cao và cũng xuất hiện kết tập tiểu phân dưới

đáy lọ theo thời gian. Với môi trường bên ngoài liposome là nước cất, KTTP và PDI

cũng tăng dần từ 119.5 nm lên 140.8 nm và PDI tăng từ 0.298 lên 0.265.

Tiếp tục đánh giá sự ổn định các mẫu qua sự thay đổi giá trị thế zeta qua đồ thị sau:

Hình 3.7: Sự thay đổi KTTP và giá trị PDI theo thời gian của các mẫu có hệ môi

trường hydrat là dung dịch NaCl 0.9% (NaCl).

Dựa vào đồ thị ta nhận thấy:

- Các mẫu có môi trường bên ngoài là dung dịch NaCl 0.9% và đệm HBG có giá trị

thế zeta tiệm cận 0 do đó đây là các mẫu không ổn định. Điều này cũng được minh

chứng qua việc đo KTTP vầ PDI của các mẫu.

- Với môi trường bên ngoài là nước, có sự tăng dần điện thế theo thời gian bảo quản

từ -20.4 mV lên -10.5 mV. Điều này cũng cho thấy đây là một hệ không ổn định

theo thời gian.

Vì vậy, với liposome có môi trường hydrat hóa là dung dịch NaCl 0,9% đều cho các

mẫu không ổn định ngay cả trước và sau khi tiến hành đổi hệ đệm.

3.3.8. Hệ môi trường hydrat: đệm Phosphat trong NaCl pH 7.4 (PBS)

Đối với môi trường hydrat là đệm Phosphat trong NaCl, không tiến hành đổi hệ

đệm bên ngoài ta s có môi trường trong và ngoài liposome s là đệm PBS/ PBS.

Đánh giá sự thay đổi KTTP, PDI và điện thế zeta theo thời gian ta có bảng sau:

38

Bảng 3.15: Sự thay đổi KTTP, PDI và điện thế zeta theo thời gian của các hệ

môi trường hydrat: đệm PO4/ NaCl pH 7.4

Ngày Môi trường hydrat : đệm PO4/ NaCl pH 7.4

Z- average (d.nm) PDI Zeta (mV)

1 80.9 0.159 -30.7

3 81.1 0.164 -30.8

7 84.0 0.167 -29.5

14 92.0 0.178 -27.9

30 93.6 0.181 -27.6

Nhận xét: đối với môi trường hydrat hóa là đệm phosphat trong NaCl, sau thời gian

bảo quản có sự tăng KTTP từ 80.9 nm lên 93.6 nm, giá trị PDI cũng tăng dần từ

0.159 lên 0.181. Điện thế zeta tăng từ -30.7 mV lên -27.6 mV. Tuy nhiên đây cũng

là một hệ khá ổn định.

39

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

KẾT LUẬN

Nghiên cứu đã đạt được các kết quả như sau:

1. Với mỗi dung dịch hydrat khác nhau s có quy trình giảm và đồng nhất kích

thước khác nhau.

2. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường trong và ngoài khác nhau đến đặc tính tiểu

phân, từ đó nhận thấy với mỗi môi trường bên trong khác nhau thì s có môi trường

bên ngoài phù hợp nhất để bảo quản các mẫu liposome cho độ ổn định tốt nhất

trong thời gian bảo quản 1 tháng đó là:

Môi trường trong Môi trường ngoài

KTTP

(nm) PDI

Zeta

(mV)

Nước Nước 73.6 0.158 -27.5

Đệm acetat pH 4.0 Nước 80.7 0.196 -30.8

Đệm citrat pH 4.0 Đệm HBG 130.8 0.197 -28.7

Đệm amoni pH 5.5 Đệm HBS 93.27 0.200 27.2

Dung dịch glucose 5% Nước 124.3 0.229 -26.0

Đệm PO4/ NaCl pH 7.4 Đệm PO4/ NaCl pH 7.4 93.6 0.181 -27.6

Trong các hệ môi trường trong và ngoài khác nhau, chọn ra hệ có môi trường trong

là đệm acetat pH 4.0 và bên ngoài là nước cất cho hệ ổn định nhất theo thời gian.

Các mẫu có môi trường hydrat là dung dịch NaCl 0,9%, dung dịch saccarose

10% đều cho các hệ không ổn định trước và sau khi đổi môi trường bên ngoài.

ĐỀ XUẤT

1. Tiếp tục nghiên cứu tương tác giữa các môi trường trong và ngoài khác nhau để

cải thiện độ ổn định cho chế phẩm liposome.

2. Từ liposome bào chế ra, tiếp tục quy trình nạp các loại dược chất khác nhau vào

liposome. Tiếp đó đánh giá hiệu suất liposome hóa, hiệu quả mang thuốc của các

chế phẩm liposome trên mô hình in vivo cũng như đánh giá độc tính của thuốc trên

các dòng tế bào khác nhau.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Nguyễn Chí Đức Anh (2012), “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin”,

Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 2 – 30.

2. Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2014), “Kỹ thuật bào chế và

sinh dược học các dạng thuốc” (tập 2), NXB Y học, tr. 218 -230.

3. Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2005), “Một số chuyên đề về

bào chế hiện đại”, NXB Y học, tr. 158 – 187.

4. Phạm Thị Minh Huệ, Võ Xuân Minh (2013), “Kỹ thuật nano và liposome ứng

dụng trong dược học và mỹ phẩm”, NXB Y học, tr. 50 – 93.

5. Nguyễn Văn Lâm (2012), “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin

và đánh giá tác dụng trên động vật”, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học, Trường

Đại học Dược Hà Nội, tr. 2 – 32.

6. Lê Phương Linh (2013), “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của

liposome doxorubicin”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học

Dược Hà Nội, tr. 2 – 41.

7. Nguyễn Thị Phương Thảo (2015), “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng

thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa trên khối u động vật thực nghiệm”,

Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 2 – 50.

8. Nguyễn Thu Trang (2014),” Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin 2mg/

10ml bằng phương pháp pha loãng etanol”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học,

Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 2 –25.

9. Đào Thanh Tùng (2012), “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin”, Luận văn

tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 2 – 42.

Tài liệu Tiếng Anh

10. Akbarzadeh A, Samiei M, Davaran S. (2012), “Magnetic Nanoparticles:

preparation, physical properties, and applications in biomedicine”, Nanoscale Res

Lett; pp. 7-144.

10. Allen M., Pieter R. (2013), “Liposomal drug delivery systems: From concept to

clinical applications”, Advanced Drug Delivery Reviews 65, pp. 36–48.

11. Al-Jamal W. T., Al-Ahmady Z. S., Kostarelos K. (2012), "Pharmacokinetics &

tissue distribution of temperature-sensitive liposomal doxorubicin in tumor- bearing

mice triggered with mild hyperthermia", Biomaterials, 33(18), pp. 4608-4617.

12. Andri H., Li Ying H. (2014),“Magnetic liposomes for colorectal cancer cells

therapy by high-frequency magnetic field treatment”, Nanoscale Research Letters,

pp. 9 - 497.

13. Arcadio C, Cullis PR (1995), “Recent advances in liposomal drug-delivery

systems”, Curr Opin Biotechnol, pp. 698–708.

14. Bangham AD, Hornre RW (1964) ‘Negative staining of phospholipid and their

structural modification by surface –active agents as observed in the electron

microscope’, J Mol Biol 8, pp. 660-668.

15. Barenholz Y. et al., (1993), "Stability of liposomal doxorubicin formulations:

problems and prospects", Medicinal research reviews, 13(4), pp. 449-491.

16. Barenholz Y (2013), “Relevancy of Drug Loading to Liposomal Formulation

Therapeutic and Efficacy”, J Liposome Res, pp. 1-8.

17. Betageri G., Parsons D. (1992), "Drug encapsulation and release from

multilamellar and unilamellar liposomes", International journal of pharmaceutics,

81(2-3), pp. 235-241.

18. Chiu G. N. et al., (2005), "Encapsulation of doxorubicin into thermosensitive

liposomes via complexation with the transition metal manganese", Journal of

controlled release, 104(2), pp. 271-288.

19. Deepika S., Vaseem A. (2016), “Development of liposomal cosmeceuticals”,

Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 8(2), pp 834-838.

20. Deepthi V and Kavitha AN (2014), “Liposomal Drug Delivery System-A

Review”, RGUHS J Pharm Sci | Vol 4 | Issue 2, pp 47- 56.

21. Domazou A. S., Luisi P. L. (2002), “Size distribution of spontaneously formed

liposomes by the alcohol injection method”, Journal of Liposomes Research, 22(1),

pp. 205 – 220.

22. Elisa Elizondo, Evelyn M. (2011), “Liposomes and other vesicular systems:

structural characteristics, methods of preparation and use in Nanomedicine”,

Progress in molecular Biology and translational Science Vol.104, pp. 2-43.

23. Fang J., Nakamura H., Maeda H. (2011), “The EPR effect: Unique features of

tumor blood vessels for drug delivery, factors involved, and limitations and

augmentation of the effect”, Adv Drug Deliv Rev 63, pp 136-151.

24. Fernando Augusto Pires de Sáa (2015), “Liposomal voriconazole (VOR)

formulation for improved oculardelivery”,Colloids and Surfaces Biointerfaces,133

, pp331–338.

25. Grit M., Crommelin D. J., (1993), "Chemical stability of liposomes:

implications for their physical stability", Chemistry and physics of lipids, 64(1), pp.

3-18.

26. Hemanthkumar M, Spandana V.(2011), “ Liposomal encapsulation technology a

novel drug delivery system designed for ayurvedic drug preparation”, IRJP. 2011

2(10), pp 4–7.

27. Himanshu A, Sitasharan P, Singhai AK, (2011), “Liposomes as drug carriers”,

IJPLS 2(7), pp 945–951.

28. Ishida Tatsuhiro, Harashima Hideyoshi, Kiwada Hiroshi (2002), "Liposome

clearance", Bioscience reports, 22, pp. 197-224.

29. Kisel M., Kulik L. (2001), “Liposomes with phosphatidylethanol as acarrierfor

oral delivery of insulin .Studies in the rat”, Inter.J.Pharm, pp 105- 206.

30. Klibanov A. L., Shevchenko T. I., Raju B. I., Seip R., Chin C. T. (2010),

"Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble– liposome

constructs: A tool for targeted drug delivery", Journal of Controlled Release,

148(1), pp. 13-17.

31. Koshkina NV, Waldrep JC, Roberts LE (2001), “Paclitaxel liposome aerosol

treatment induces inhibition of pulmonary metastases in murine renal carcinoma

model”, Clin Cancer Res 7, pp. 3258-3262.

32. L. Lesoin, O. Boutin, C. Crampon, et al. (2011), “CO2/water/surfactant ternary

systems and liposome formation using supercritical CO2: a review”, Colloids Surf

Physicochem Eng Asp, 377, pp. 1–14.

33. Ling S., Magosso E. (2016), “Enhanced oral bioavailability and intestinal

lymphatic transport of a hydrophilic drug using liposomes”, DrugDev.Ind.Pharm

32, pp 335–345.

34. Mayer ID, Madden TM, Bally MU, Cullis PR (1993), “pH gradient-mediated

drug entrapment in liposomes”, Liposome Technology; pp. 27–44.

35. Mehran Alavi, Naser Karimi, Mohsen Safaei (2017), “Application of Various

Types of Liposomes in Drug Delivery Systems”, Adv Pharm Bull, 7(1), pp 3-9.

36. Nagayasu A, Uchiyama K, Kiwada H. (1990), “The size of liposomes: a factor

which affects their targeting efficiency to tumors and therapeutic activity of

liposomal antitumor drugs”, Adv Drug Deliv Rev 40, pp 75–87.

37. Needham D., Park J. Y., Wright A., Tong J. (2012), "Materials

Characterization of the Low Temperature Sensitive Liposome (LTSL): Effects of

Lipid Composition (Lysolipid and DSPE-PEG2000) on the Thermal Transition

and Release of Doxorubicin", Faraday Discussions, pp 67- 72.

38. NikitaLomis, Susan W., et al (2016), “Human Serum Albumin Nanoparticles for

Use in Cancer Drug Delivery: Process Optimization and invitro cheracterization”,

Nanomaterials 2016, 6, pp 1-16.

39. Olga P., Jana S. , Zoran K. , Vesna R. (2013), “Methods for Preparation and

Characterization of Liposomes as Drug Delivery Systems”, Int. J. Pharm.

Phytopharmacol. Res 3 (3), pp 182-189.

40. Prathyusha, Muthukumaran M., Krishnamoorthy B. (2013), “Liposomes as

targetted drug delivery systems present and future prospectives: a review”, Journal

of Drug Delivery & Therapeutics, 3(4), pp. 195-201.

41. Ray A. (2012), "Liposome in Drug delivery system", Asian J Res Pharm Sci,

2(2), pp. 41-44.

42. Riaz M (1996), “Liposome preparation method”, Pak J Pharm Sci 9(1), pp.65–

77.

43. Samad A., Sultana Y., Aqil M. (2007), "Liposomal drug delivery systems: an

update review", Current drug delivery, 4(4), pp. 297-305.

44. Schroeder A., Kost J., Barenholz Y. (2009), "Ultrasound, liposomes, and drug

delivery: principles for using ultrasound to control the release of drugs from

liposomes", Chemistry and Physics of Lipids, 162(1-2), pp. 1-16.

45. Scholtz J., Potchefstroom (2010), “Preparation, Stability and in Vitro Evaluation

of Liposomes Containing Amodiaquine”, Boloka institutional repository, pp. 69-72.

46. Seynhaeve A. L., Hoving S., Schipper D., Vermeulen C. E., Aan De Wiel-

Ambagtsheer G , Van Tiel S T , et al (2007), "Tumor necrosis factor α mediates

homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a

better tumor response", Cancer research, 67(19), pp. 9455-9462.

47. Sheeshpal Sharma, Lishu Mishra (2010), “Liposomes: vesicular system an

overview”, J Pharm Pharm Sci, Vol 2, Issue 4, pp 11­17

48. Storm G., Crommelin D. J. A. (1998), “Liposome: quo vadis”, Pharmaceutical

Science & Technology today, 1(1), pp. 19 – 31.

49. Su, C.W., Chiang, C.S., Li, W.M., Hu, S.H., Chen, S.Y.(2014), “Multifunctional

nanocarriers for simultaneous encapsulation of hydrophobic and hydrophilic drugs

in cancer treatment”, Nano medicine (Lond) 9, pp1499-1511"

50. Torchilin V. (2011), "Tumor delivery of macromolecular drugs based on the

EPR effect", Advanced Drug Delivery Reviews, 63(3), pp.131-135.

51. Torchilin V. P. (2005), "Recent advances with liposomes as pharmaceutical

carriers", Nature Reviews Drug Discovery, 4(2), pp. 145-160.

52. Valizadeh A, Mikaeili H, Samiei M, Mussa Farkhani (2012), “Synthesis,

bioapplications, and toxicity”, Nanoscale Res Lett.7, pp 480- 487.

53. Vonarbourg Arnaud, Passirani Catherine, Saulnier Patrick, Benoit Jean-Pierre

(2006), "Parameters influencing the stealthiness of colloidal drug delivery systems",

Biomaterials, 27(24), pp. 4356-4373. RES

54. Xu X., Khan M. A., Burgess D. J. (2012), "Predicting hydrophilic drug

encapsulation inside unilamellar liposomes", International journal of

pharmaceutics, 423(2), pp. 410-418.

55. Xu X., Burgess D. J. (2012), "Liposomes as carriers for controlled drug

delivery, Long Acting Injections and Implants”, Springer, pp. 195-220.

56. Yaganesh V., Marcus A. (2012), “Nanomedicine for glaucoma: liposomes

provide sustained release of Latanoprost in the eye”, International Journal of

Nanomedicine, pp. 123 -131.

57. Yarenholz B, (2003), “Relevancy of drug loading to liposomal formulation

therapeutic efficacy”, J Liposome Res, 13, pp. 1–8.

58. Ying Li, Yanping L. (2015), “Cell and nanoparticle transport in tumour

microvasculature: the role of size, shape and surface functionality of

nanoparticles”, Interface forcus 6, pp.1-13.

59. Zalba S., Navarro I., Trocóniz I. F., Tros De Ilarduya C., Garrido M. J. (2012),

"Application of different methods to formulate PEG-liposomes of oxaliplatin:

Evaluation invivo", European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,

81(2), pp. 273-280.

60. Zhenjun HUANG, Xuan LI, Ting ZHANG. (2014), “Progress involving new

techniques for liposome preparation”, Asian Journal of Pharmaceutical Sciences,

pp 1-12.