RATIBA LAKHLEF

Mémoire présenté

à la faculté des études supérieures

de l'université Laval

pour l'obtention

du grade de maître ès science (M.Sc.)

Biologie cellulaire et moléculaire

FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL

O Ratiba Lakhlef, 1999

National Library i*I ofCanada Bibliothèque nationale du Canada

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La molécule d'adhésion intercellulaire- 1 ICAM- 1 dont les contre-récepteurs majeurs sont les p 2-intégrines LFA- 1 et MAC-1, joue un rôle important dans la réponse immune et probablement dans les phénomènes de formation des tumeurs. L'ICAM-1 est exprimée sur une grande variété de cellules à des niveaux constitutifs généralement faibles mais peut être stimulée par des cytokines proinflammatoires (IL- 1, TNFa, IFNy ) ou par l'acide rétinoïque (AR), un agent de différenciation cellulaire. Notre équipe a identifié, dans le promoteur du gène de 1'ICAM-1, un élément de réponse à l'AR (RARE) en position -266 qui est activé par les hétérodimères de récepteurs d'AR, R A R P/R A R a . La séquence RARE, révèle une organisation de deux répétitions directes du type DR+5 et d'un élément inversé du type TRE-PAL. Nous avons étudié la régulation de l'expression de I'ICAM-1 par l'interaction entre les récepteurs à l'acide rétinoïque et les récepteurs thyroïdiens. Dans des expériences en transfection transitoire dans un système de gène rapporteur, nos résultats ont montré que les récepteurs thyroïdiens (RT3) en présence de leur ligand (T3), ne présentent aucun effet sur l'activité transcriptionnelle de base du promoteur dlICAM- 1 mais qu'ils inhibent significativement les effets stimulateurs des RXR et des RAR. Nous avons également montré par l'utilisation de mutants de délétion du promoteur de I'ICAM-1 que ce phénomène implique les éléments cis actifs localisés entre les positions -393 et -176, comprenant entre autre l'élément RARE. De plus, nous avons confirmé à l'aide d'un mutant ponctuel, le plasmide pBH RARE- que la séquence RARE est bien impliquée dans ce phénomène. Finalement, nous avons corrélé nos résultats de transfection par des analyses de gel de rétention.

AVANT-PROPOS

J'aimerais tout d'abord remercier ma directrice d e

recherche le Docteur Marie Audette, qui m'a donné u n e

seconde chance en m'accueillant dans son laboratoire et e n

fournissant à la fois le support financier et technique. J'aimerais

également lui exprimer ma profonde et sincère reconnaissance

pour ses conseils judicieux à la préparation de ce mémoire. Je

tiens également à remercier Mme Lucie Larouche, l'assis tante

de recherche de l'équipe pour son aide technique et ses

conseils, sans oublier les membres de l'équipe du Docteur

Richard Poulin, pour les nombreuses discussions scientifiques.

Finalement, je remercierais mon mari pour sa grande

compréhension, ma famille pour leurs encouragements et j e

dédirais ce mémoire à ma très chère fille Yasmine.

TABLE DES MATIERES Page

AVANT-PROPOS.. ................................................................... i i

o . . TAB LE DES MATIERES.. ..................................................... 1 i 1

........... ........................ LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX .. v i

LISTES DES ABRÉVIATIONS ..................................................... v

CHAPITRE 1-INTRODUCTION

............................................. 1.1 L'adhésion intercellulaire.. 1

.......................... 1 . 1 . 1 Modèle d'adhésion cellulaire.. 1

............................................................... 1.1.2 ICAM-1 4

................................................. 1.1.2A Structure 4

........................................................... 1.1.2B Rôle 6

1.1.2Ba Rôle d'ICAM-1 dans

l'inflammation et la réponse . immunitaire ...........................

1 .1.2B b ICAM- 1 et cancer.. .................. 1.1.2Bc ICAM-1 et maladies

inflammatoires ....................... 1.1.2Bd ICAM-1 comme récepteur de

pathogènes.. ................................. 1.1.2Be ICAM-1 comme molécule de

signalisation.. ......................... 1 O

1.1.2C Promoteur d'ICAM- 1 ................................... 1 1

1.1.2Ca Stimulation de la transcription

........ par l'acide rétinoïque ... ...... 1 2

1.2 La superfamille des récepteurs nucléaires

d'hormone .............................................................. 1 9

1.2.1 Les récepteurs des hormones thyroïdiens P i r et des retinoides ................................................... 2 1

1.2.1A Structure .................................................. 2 1

1.2.1B Rôle .......................................................... 2 2 1 . 2 . K Modulation de l'activité . e ................................. transcriptionnelle 2 9

CHAPITRE II- HYPOTHESE ET STRATÉGIES DE T R A V A I L ~ o * a * o . o * o * o * o o * o o ~ o a . o * o . * o * e ~ . o o o o o 0 0 0 3 3

.................. CHAPITRE iII- MATÉRIEL ET MÉTHODES 3 5

3.1 Réactifs .................. ............................................................... 3 5

......................................... ......... 3.2 Culture cellulaire .... 3 5 . ........ 3 3 Plasmides rapporteurs et vecteurs d'expressions 3 6

3.4 Transfections transitoires ............................................... 3 6

....................................................... 3.4.1 Transfections 3 6

3 .4.2 Préparation des lysats cellulaires ........ .... ....... 3 7

.................................................... 3.4.3 Essai luciférase 3 7

3.4.4 Essai phosphatase alcaline ................................. 3 8

........................................................... 3.5 Gel de rétention 3 8

. . . . ~ . ~ ~ ~ ~ . ~ . ~ ~ . ~ ~ ~ ~ ~ . . ~ ~ . . ~ . ~ . . . ~ . ~ ~ . . ~ . ~ . . ~ . * 3 .5 1 Extraits nucléaires 3 8 3.5.2 Dosage des protéines par la méthode de

Bradford .................................................................. 3 9

..... 3.5.3 Gel et électrophorèse .. ... .... ........ 40

.. ............ ............*...*.**.* 3.6 Mutagenèse dirigée. ...... .. 40

CHAPITRE IV- RÉSULTATS ........................................ 4 2

4.1 Effets de l'interaction entre les récepteurs à l'acide

rétinoïque (RXRa, RARB) et les récepteurs thyroïdiens

(RT3 a) sur l'activité transcriptionnelle

................................................................... dtICAM-1 4 2

4.1.1 Essais en transfection transitoire avec le

plasmide rapporteur pBHLUC 1.3 et des

vecteurs d'expression des récepteurs RXRa et

RT3a ................................................................... 4 3

4.2 Identification de la région du promoteur dtICAM-1

impliquée dans la régulation transcriptionnelle par

les récepteurs RXRa et RT3a .........................o....-......... 44

4.2.1 Essais en transfection transitoire avec le

plasmide rapporteur pBH RARE et des

vecteurs d'expression des récepteurs RXRa

............................................................... et RT3a 4 5

4.2.2 Essais en transfection transitoire avec le

plasmide rapporteur pBH RARE et des

vecteurs d'expression de RARa et de ............ ....................... RT3a ......................*... 45

4.2.3 Essais en transfection transitoire avec le

plasmide rapporteur E et des vecteurs

d'expression de RXRB et de RT3a.. ..................... 4 6

4.2.4 Essais en transfection transitoire avec le

plasmide rapporteur pBH RARE- et des

.......... vecteurs d'expression de RXRa et de RT3a 47

4.3 Mise en évidence des interactions ADN-protéines

.................................................................... spécifiques

CHAPITRE V- DISCUSSSION.oe .. . . . . . . * . . . . * . . . . . . . . . . . . . . . . . .m .

CHAPITRE VI- CONCLUSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

.......... BIBLIOGRAPHIE (Liste des références citées) 6 4

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX

Figure 1:

Figure 2:

Figure 3:

Figure 4:

Figure 5:

Figure 6:

Figure 7:

Figure 8:

Figure 9:

Recrutement des leucocytes aux sites inflammatoires.. ..................................

Représentation schématique de la

PAGE

famille des ICAMs ................................. 7

Représentation schématique de l'organisation du gène de L'ICAM-1 humaine.. ...........................................

Métabolisme et mécanisme d'action de l'acide rétinoïque .................................

Représentation des récepteurs de l'acide rétinoïque-at (RAR) et des récepteurs de l'acide rétinoïque 9cis (RXR) ............................................

La superfamille des récepteurs nucléaires d'hormones .........................

Structure des récepteurs nucléaires des hormones. ........................................... 2 3

Spécificité de liaison des récepteurs nucléaires à leurs cibles ........................ 2 6

Représentation des éléments de réponse du récepteur des hormones thyroïdiennes.. ..................................... 2 7

Figure 10: Représentation schématique des interactions entre les hétérodimères RARIRXR et les facteurs qui modulent

............. leur activité transcriptionnelle.. 3 2

Figure 11: Effet de la cotransfection de RXRa et de RT3a sur l'activité transcriptionnelle du plasmide pBHLUC 1.3.. ............................ 49

Figure 12: Effet de la cotransfection de RXRa et de RT3a sur l'activité transcriptionnelle du plasmide mutant de délétion pBHRARE. .............................................. 5 0

Figure 13: Effet de la cotransfection de RARb et de RT3a sur I'activi té transcriptionnelle du plasmide mutant de délétion pBHRARE. .............................................. 5 1

Figure 14: Effet de la cotransfection de RXRa et de RT3a sur l'activité transcriptionnelle

......... du plasmide mutant de délétion E... 5 2

Figure 15: Effet de la cotransfection de RXRa et de RT3a sur l'activité transcriptionnelle du mutant de délétion plasmide pBHRARE- ..............................cc.............. 5 3

Figure 16: Analyse de rétention en gel avec la sonde RARE d'ICAM-1 et d'extraits nucléaires de cellules COS-1 traitées ou non au RA etlou T3.. ........................... 5 4

Figure 17: Analyse de rétention en gel avec la sonde RARE drADH3 et d'extraits nucléaires de cellules COS- 1 traitées ou non au RA et/ou T3 .................. ............ 5 5

ADH

AEV

AF

AR

AR-9c

ARat

APO A l

CaM

CMH

CRABP

CRBP

DMSO

DTT

EDTA

E-Sélectine

ICAM- 1

IL

IFN

L-Sélec tine

LFA- 1

LI'S

ME

MHC

N-COR

NF-B

Alcool déhydrogénase

Avian erythroblastosis virus

Fonction activatrice

Acide rétinoïque

Acide rétinoïque 9 cis

Acide rétinoïque al1 tram

Apolipoprotéine A 1

Calmoduline

Complexe majeur d'histocompatibilité

Protéine cellulaire liant l'acide rétinoïque

Protéine cellulaire liant le rétinol

Diméthyl sulfoxide

Dithiotreitol

Ethylène diamine tétraacétate

Sélectine endothéliale

Molécule d'adhésion intercellulaire- 1

Interleukine

Interféron

Sélectine du leucocyte

Leukocyte function associated antigen- 1

Lipopolysaccharide

Enzyme malique

Chaine lourde de myosine

Nuclear receptor Co-repressor

Facteur nucléaire kappa B

PNPP

PML

P-Sélectine

RAR

RARE

RBP

RIP 140

RT3

RXR

SMRT

STAT 1

TBP

TCR

TIF 1

TNF

TRE

VCAM

Para-nitrophénol-phosphate

Leucémie promyélocytaire

Sélectine des plaquettes

Récepteur d'acide rétinoïque

Elément de réponse à l'acide rétinoïque

Protéine liant le rétinol

Receptor interacting protein 140

Récepteur des hormones thyroïdiennes

Récepteur X des rétinoïdes

Silencing mediator for retinoid and thyroid

hormone receptors

Facteur transducteur de signal et activateur

de la tanscription

Protéine liant la boîte TATA

Récepteur des cellules T

Transcription intermediary factor 1

Facteur nécrosant des tumeurs

Élément de réponse thyroïdien

Molécule d'adhésion cellulaire vasculaire

CHAPITRE 1

Introduct ion

1-1 L'adhésion intercellulaire

1.1.1 Modèle d'adhésion cellulaire

La communication intercellulaire se fait principalement de deux façons, soit par l'intermédiaire de messagers chimiques ou par contact direct cellule-cellule. Ce contact entre les cellules s'effectue par l'intermédiaire de protéines que l'on nomme molécules d'adhésion. Ces molécules d'adhésion interviennent dans plusieurs phénomènes tels que la réponse immunitaire, la migration cellulaire et l'organisation des cellules en tissus différenciés, la métastasie tumorale ainsi que l'inflammation chronique (1, 2).

Dans le contexte de la réponse immunitaire, l'exemple de la migration des leucocytes aux sites inflammatoires est l'un des phénomènes d'adhésion le mieux caractérisé (3, 4, 6). À partir de ce modèle, nous introduirons les principaux types de molécules d'adhésion (fig 1). En fait il existe dans le système immunitaire trois familles de molécules d'adhésion: la superfamille des immunoglobulines, la famille des séléctines et la famille des intégrines. Lors d'une agression de l'organisme par un agent pathogène, le système immunitaire intervient, d'une part, en relarguant des facteurs solubles pro- inflammatoires et d 'autre part en orchestrant la reconnaissance d'antigènes étrangers. De ceci résulte l'adhésion et l'activation des cellules impliquées dans la réponse inflammatoire. La réaction inflammatoire fait intervenir des séries de réactions s'enchaînant en cascade,

entraînant l'activation de différents types de cellules (neutrophiles, macrophages et lymphocytes) par de nombreux médiateurs chimiotactiques et inflammatoires telles les cytokines (TNFa, IL-1, IFN-y) par lesquels l'expression des molécules d'adhésion est soigneusement contrôlée.

Le premier type cellulaire recruté au site inflammatoire dans les quelques minutes qui suivent l'invasion comprend les leucocytes, principalement les neutrophiles. Par la suite, les lymphocytes et les monocytes s'y rendent. Les médiateurs de l'inflammation dont la thrombine et l'histamine activent les cellules endothéliales, résultant en l'expression d'une première famille de molécules d'adhésion les sélectines. C'est la P-sélectine, stockée dans les corps de Weibel-Palade des cellules endothéliales et des plaquettes (5, 7, 8) qui est rapidement relarguée de la surface cellulaire. Elle permet le premier contact immédiat des leucocytes à l'endothélium vasculaire qui s'effectue par l'interaction de la P-sélectine avec son contre- récepteur le CD15 exprimé à la surface des leucocytes. Ce contact entre les leucocytes et les cellules endothéliales via les sélectines permet aux leucocytes de rouler le long de l'endothélium pour arriver au niveau du site inflammatoire. Doré et al (7) ont démontré que le blocage de la fonction de la P-sélectine par des anticorps monoclonaux anti- P-sélectine, désignés MD6, résulte en une inhibition du roulement initial des leucocytes sur l'endothélium vasculaire. De même, la L-sélectine, exprimée par la majorité des leucocytes, va interagir avec les glycoprotéines des cellules endothéliales (9). La L-sélectine participe ainsi dans le contact initial et le roulement des neutrophiles sur la paroi endothéliale.

Plus tardivement, suite à la stimulation des cellules endothéliales par les cytokines proinflammatoires (TNFa ,

1) Circulation 2) "Rolling" 3) Adhésion

4) Extravasation 5 ) Infiltration

Figure 1 : Recrutement des leucocytes aux sites inflamniatoires. Les mtdiateurs de l'inflaiii~nation activent les ce1 lules endoth~liales et les neutrophiles ce qui permet d'abord l'expression des sélectines et le phénomène du roulement. L'expression des intégrines et des molCcules de la famille des immunoglobulines permet un attachement plus ferme des neutrophiles et l'extravasation vers les tissus atteints.

IFN-y, IL-1) et le LPS, la E-sélectine est exprimée permettant une très forte adhésion des leucocytes à l'endothélium (10). D'autres molécules d'adhésion appartenant à la famille des immunoglobulines et des intégrines sont aussi impliquées dans cette étape. Il s'agit de ICAM-1 et VCAM-1 exprimés à la surface des cellules endothéliales et qui interagissent avec leurs récepteurs, membres de la famille des intégrines exprimés à la surface des leucocytes (5, 11, 12). Ces intégrines sont soit des P2 intégrines dont (LFA-1 et MAC-1) pour ICAM- 1 et des intégrines dont VLA-4 pour VCAM-1 (13, 14).

Cet attachement ferme des leucocytes sur l'endothélium prépare l'extravasation des cellules vers le tissu sous-jacent. La migration transendothéliale des leucocytes est dépendante des intégrines, de ICAM et de PECAM. La PECAM-1 membre de la famille des immunoglobulines, est exprimée constutivement sur les leucocytes et les cellules endothéliales (15, 16). Lorsque les cellules endothéliales sont induites par les cytokines proinflamrnatoires, la PECAM- 1 se localise surtout au niveau des jonctions entre les cellules endothéliales (17). Une fois dans les tissus, les leucocytes (neutrophiles) procèdent à l'élimination de l'agent pathogène par phagocytose.

Le présent travail porte s u r la régulation transcriptionnelle de la molécule d'adhésion intercellulaire (ICAM- 1) membre de la famille des immunoglobulines.

1.1.2A Structure

ICAM- 1 est une glycoprotéine transmembranaire, de 85-110 KDa composée d'une seule chaîne polypeptidique avec 8 sites de N- glycosylation. La partie extra-cellulaire de la

molécule présente 5 domaines de type immunoglobuline C2. Le type Ig C, regroupe les molécules dont les domaines Ig, appelés constants, dénotent une grande conservation dans leur séquence et conformation. Ensuite le groupe C est subdivisé en sous-groupes C l et C2. Le groupe C l réunit les protéines impliquées dans la reconnaissance de l'antigène et le groupe C2 celles impliquées dans l'adhésion cellulaire, permettant donc de classer la protéine ICAM-1 comme membre de la famille des immunoglobulines de type Ig C2 (18). La liaison de LFA-1 sur ICAM-1 se fait au niveau de la partie NH2- terminale du premier et du deuxième domaine Ig. Le domaine D l est le plus important dans ces interactions. La liaison de ICAM-1fLFA-1 est régulée par le domaine cytoplasmique de la chaîne p de LFA-1 (18, 19). Par contre, MAC-1 sr: lie au niveau du troisième domaine Ig lorsque I'ICAM-1 est peu ou pas glycosylée (19, 20).

ICAM-1 est aussi le récepteur cellulaire de deux pathogènes: le r h i n o v i r u s (47, 48) et le p l a s m o d i u m falciparum (49). La liaison du rhinovirus à 1'ICAM-1 se fait au niveau du domaine extracellulaire D l et la première partie du domaine D2. Staunton et al ont identifié par des mutations dans les domaines D l et D2, les résidus importants dans la liaison de LFA-1 sur 1'ICAM-1 et qui sont conservés dans les autres molécules ICAM. Cependant, les résidus critiques à la liaison du rhinovirus sur ltICAM-1 ne sont pas conservés. Finalement, ICAM-1 lierait aussi la protéine CD43 ou gp15 (la sialophorine) exprimée à la surface des lymphocytes T, monocytes, neutrophiles et plaquettes. Cette interaction aurait un rôle à jouer dans l'activation des lymphocytes T (50) (fig 2)

Quatre autres molécules d'adhésion intercellulaire similaires à ICAM-1 sont aussi connues. D'abord, la ICAM-2 de 28-48 kd, possède deux domaines immunoglobulines et six sites de N-glycosylation. Les deux domaines Ig sont

homologues aux deux premiers domaines d'ICAM-1 (34% d'homologie). ICAM-2 lierait seulement LFA-1 (21). La ICAM-3 est une molécule d'adhésion similaire à ICAM-1, de 116-140 kd. Elle possède 5 domaines extracellulaires de type Ig, dont seuls les deux premiers sont homologues à ICAM-1. Elle lierait aussi LFA-1 (22, 23). La ICAMd est une glycoprotéine de 42 kd, possédant deux domaines de type Ig avec 4 sites de N- glycos ylation. Le premier domaine Ig présente une forte homologie avec le premier domaine dlICAM- 1, dtICAM-2 et dlICAM-3. ICAM-4 lierait LFA- 1 et probablement MAC-1 (24). Finalement la ICAM-5 possède neufs domaines extracellulaires de type Ig avec quinze sites potentiels de N-glycosylation. Elle lierait LFA-1 (25).

1.1.2B Rôle

1.12Ba Rôle d91CAM- ldans l'inflammation et la réponse immunitaire

La molécule d'adhésion intercellulaire- 1 (ICAM-1 ou CD54), fait partie de la superfamille des immunoglobulines. Elle est présente non seulement à la surface des leucocytes, mais aussi sur une grande variété de cellules dont les fibroblastes et les cellules endothéliales. I n vivo, l'expression de ICAM- 1 est constutivement faible, mais peut être rapidement induite par différentes cytokines produites sur les lieux d'une inflammation. Deux contre- récepteurs sont particulièrement importants pour le CD54 soit LFA-1 et MAC4 (19, 20, 26), des glycoprotéines de surface présentes sur les leucocytes et les monocytes. Leur interaction avec ICAM-1 est cruciale lors de réactions inflammatoires et immunitaires. ICAM-1 joue un rôle important dans l'interaction entre les lymphocytes B et T. 11 a été démontré (27) que l'interaction entre LFA-1 (sur les lymphocytes B) et ICAM-L(sur les lymphocytes T) est nécessaire à l'induction de

P-W v31

la prolifération et de la différenciation des cellules B et à l'augmentation de la sécrétion de IL-2 par les cellules T. Les anticorps anti-LFA- 1 inhibent l'interaction entre les lymphocytes B et les lymphocytes T, bloquent la production d'anticorps spécifiques et la prolifération des lymphocytes B. D'autres travaux (30) ont démontré que la diminution du niveau d'expression d11CAM-1 diminue l'efficacité avec laquelle les lymphocytes B présentent l'antigène aux lymphocytes T d'environ cent fois. Par ailleurs, Rothlein et a l (26) ont démontré par l'utilisation d'anticorps anti-LFA-1 et de la lignée cellulaire lymphoblastoïde transformée par le virus EBV (Epstein Barr Virus) que ICAM-1 est impliquée dans l'aggrégation homotypique des lymphocytes B, des cellules myeloïdes et des lymphocytes T. Sur les cellules présentatrices d'antigènes (CPA), TC AM- 1 augmente l'avidité de liaison entre le TCR et l'antigène présenté dans le contexte du CMH de classe II (11, 31, 33). Cette reconnaissance est nécessaire pour l'activation et la prolifération des lymphocytes T qui sécrètent plusieurs cytokines indispensables pour l'activation des cellules effectrices du système immunitaire (28, 29). L'expression dtICAM-1, stimulée par différentes cytokines, facilite la reconnaissance et la lyse des cellules tumorales par les lymphocytes T cytotoxiques, les cellules NK, les neutrophiles et les macrophages (32).

1.1.2Bb ICAM-1 et cancer

La transformation maligne et la progression vers un état métastatique sont des phénomènes caractérisés par des aberrations dans les interactions cellules-cellules. En effet, les liens intercellulaires sont perturbés de telle sorte que les cellules tumorales se détachent et vont envahir un nouveau site. 11 est probable que les métastases soient influencées par des modifications dans l'expression des molécules d'adhésion à la surface des cellules transformées. La présence dlICAM-1 a été démontrée à la surface des

mélanomes humains. Son niveau d'expression est plus élevé dans la lésion métastatique que dans la lésion primaire. La ICAM-1 se trouve ainsi associée au développement tumoral et au potentiel métas tatique du mélanome. En effet, l'inhibition de l'expression de la ICAM-1 par des séquences anti-sens dans les mélanomes, réduit significativement la métastasie de ces cellules (34, 35). Le mécanisme par lequel ICAM-1 favorise les métastases dans le mélanome est encore incompris. Certaines tumeurs telles que les lymphomes B et T et le myélome multiple expriment aussi de haut niveau dlICAM-1. L'équipe de Timonen (36) a démontré qu'un anticorps anti-CD54 inhibait environ 80% de la liaison des grands lymphocytes granulaires aux cellules de leucémie et de lymphome en culture. D'autre part, l'expression de I'ICAM-1 sur les cellules de cancer du rein est en corrélation avec le niveau d'infiltration par les mononucléaires, surtout les lymphocytes T (37). L'expression donc constitutive et stimulée de I'ICAM- 1 pourraient contribuer à la réponse immunitaire anti- tumorale de l'hôte.

1.1.2Bc ICAM- 1 et maladies inflammatoires

Une augmentation anormale et persistante de l'expression dtICAM- 1 est retrouvée dans différentes maladies du système immunitaire, associée souvent à un état d'inflammation chronique comme l'as thme (38, 39, 40), le psoriasis (4 1 ), l'arthrite rhumatoïde et le rejet d'allogreffe (42). Dans l'arthrite rhumatoïde (43,44) l'interaction des leucocytes avec les cellules dans l'environnement synovial pourrait jouer un rôle important dans la pathogénèse de cette maladie en contribuant à l'accumulation des leucocytes dans le tissu et le liquide synovial. L'expression dtICAM-1 serait dès lors un facteur limitant de cette interaction. La présence de I'ICAM-1 a été mise en évidence sur les cellules synoviales de type A, les fibroblastes synoviaux, les macrophages tissulaires et les cellules endothéliales des vaisseaux synoviaux. Le

cellules endo théliales des vaisseaux synoviaux. Le traitement des sujets atteints d'arthrite rhumatoïde avec des anticorps anti-ICAM- 1 a permis d'en diminuer les symptômes démontrant le rôle prépondérant d'ICAM- 1 dans cette pathologie (45, 46).

1.1.2Bd ICAM-1 comme récepteur de pathogènes

L'interaction des micro-organismes (virus, bactéries et parasites) avec les cellules cibles est généralement médiée par des récepteurs à la surface cellulaire, comme la ICAM-1 pour le rhinovirus humain, le CD4 pour le virus de l'immunodéficience humaine (HIV) et le CR2 pour le virus Epstein-Barr (EBV). La ICAM-1 est le récepteur pour le sous- groupe des rhinovirus (47, 48), responsables dans 50% des cas de coryza (rhume). Cette interaction permet de lier le virus aux cellules épithéliales nasales de I'hôte et d'initier l'infection et la réplication du virus. Dans le cas du plasmodium f a l c iparum, l'agent de la malaria (49), ICAM-1 sert d'intermédiaire pour l'adhésion des cellules endothéliales aux érythrocytes infectés par le pathogène. Ces deux pathogènes tirent avantage du fait que leur récepteur soit régulé positivement lors de la réponse immunitaire provoquée par eux pour propager l'infection chez l'hôte.

1.1.2Be ICAM-1 comme molécule de signalisation

La transduction du signal par les récepteurs membranaires est régulée par des interactions entre protéines et des changements dans les activités kinases etlou phosphatases spécifiques. De récentes études ont démontré que la ICAM-1 joue un rôle dans la transduction de certains signaux chimiques extracellulaires aux machineries intracellulaires et transcriptionnelles (51,52, 53). Il a été

de lymphomes B, augmente la phosphorylation de tyrosines de plusieurs protéines cellulaires, notament la kinase de la famille Src ( P53tP56 ) ainsi que l'activation de RAFl et de la MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase). Cependant, les effets de RAFI, MAPK et Src activés par la ICAM-1 sont encore inconnus (51). Le groupe de Chirathawa et al (54) a démontré que le pontage de ICAM-1 sur les lymphocytes T induit la phosphorylation de la protéine kinase cdc2 et par conséquent l'inhibition de son activité kinasique. Il est connu que la kinase cdc2, impliquée dans le passage de la phase G2 à la phase M du cycle cellulaire est inactive lorsque elle est phosphorylée sur la tyrosine 15 et la thréonine 14, elle est active une fois déphosphorylée ( 5 5 ) , suggérant ainsi que la ICAM- 1 pourrait être impliquée dans la régulation du cycle cellulaire.

1.1.2C Promoteur d'ICAM- 1

Chez l'humain le gène d'ICAM-1 se situe sur le chromosome 19. Il s'agit d'un gène unique d'environ 12 kilobases constitué de 7 exons séparés par 6 introns. Le premier exon encode la séquence signal et les 5 exons suivants, chacun des domaines Ig. Le dernier exon encode le domaine transmembranaire et la région cytoplasmique (fig 3).

Voragerber et al (56) ont démontré que la région 5' régulatrice comporte deux sites d'initiation de la transcription aux positions -41 et -319 de I'ATG de départ de la traduction de la protéine. Ces sites sont utilisés différemment selon les types cellulaires. On retrouve également deux boîtes TATA et une boîte CAAT. Cette région contient plusieurs sites consensus pour la liaison de facteurs de transcription (57, 58), notamment un site NF-KB (-187) ( 6 5 ) , un élément de réponse à l'acide rétinoïque RARE localisé en -266, qui lie les récepteurs RARP et RXRa (59, 60), deux sites SPI (-99 et -246), deux site TREIAP-1 (-324 et -1294), un site AP-2 (- 88) et un site AP-3 (-414) (61, 62, 63, 64). Finalement, deux

88) et un site sites ETS on positions - 158

AP-3 (-414) (61, 62, 63, 64). Finalement, deux été identifiées sur le promoteur d'ICAM-1, aux et -138 de l'ATG, reconnus par la protéine ERM

(66) et un site IRE (-116) qui lie les molécules STATl et STAT3 (67).

L'expression dlICAM-1 est généralement faible en absence de stimuli, mais elle est grandement induite par les cytokines proinflammatoires (IFN-y, le TNF-a, l'IL- 1) (68), quelques agents pharmacologiques tels que les esters de phorbol ainsi que par des agents physiques tel que les rayons UV (69). Notre laboratoire a été le premier à démontrer que l'expression de la ICAM-1 pouvait être induite par l'acide rétinoïque, un agent de différenciation cellulaire (59, 60). Aussi notre équipe a démontré (70) que le Ca2+ et la calmoduIine (CAM) étaient impliqués dans la signalisation par l'acide retinoïque pour la stimulation dlICAM- 1 dans la lignée humaine de neuroblastome (SK-N-SH). Le complexe calcium/calmoduline entraîne l'activation de la protéine kinase multifonctionnelle (CaMKII). Celle-ci répond à de faibles changements du niveau de Ca'+ intracellulaire, car pour être active, elle doit lier la calmoduline, qui elle est activée par la liaison d'ions de Ca2+. En utilsant des inhibiteurs de la CAM (W7 et calmidazolium), ils ont trouvé que l'expression dlICAM-1 stimulée par l'acide rétinoïque était inhibée mais pas celle stimulée par 1'IFN-y. D'autre part, l'inhibition de la CaMKII par le KN-62, un inhibiteur qui agit en occupant le site de fixation de la CAM sur l'enzyme, résultait en une baisse de l'expression de ICAM-1 en réponse à l'AR. Cependant, les mécanisme responsables de l'implication de la CaMKII dans l'activité de l'AR sur l'expression de I'ICAM-1 sont encore inconnus.

1.1.2Ca Stimulation de la transcription par l'acide rétinoïque

Les rétinoïdes sont des dérivés de la vitamine A. In vivo, la vitamine A ou rétinol est métabolisée de façon réversible en aldéhyde (rétinal) qui peut être ensuite oxydé

TM Cyt

Figure 3. Représentation schématique de l'organisation du gène de I'ICAM-1 humaine.

La partie (A) montre la structure exonlintron. Les exons ( ) sont identifiés 1, (D 1-D5) et ii. Dl - D5 correspondent aux domaines Ig exuacellulaires. La partie (B) représente la cme des exons avec les régions codantes ( ) et non codante ( O ).Une séquence représentant le signal péptide (SP). suivie de la partie extracellulaire (Dl-DS), dune partie transmembranaire (TM) et de la partie cytosolique (cyt) sont aussi schématisées.

d'une manière irréversible en acide rétinoïque. Ces molécules ont une action principale sur plusieurs fonctions telles que la vision, le développement embryonnaire, la croissance et la différenciation cellulaire (71, 72, 73) ainsi que sur la prévention de la transformation cancéreuse. Il a été démontré que les acides rétinoïques induisent la différenciation de certaines cellules malignes, les modèles les plus étudiés de cet effet étant ceux des lignées cellulaires de tumeur du sein, du tératocarcinorne F9 murin et de lignées de cellules leucémiques humaines. La leucémie aiguë promyélocytaire est caractérisée par une translocation spécifique t (15: 17) qui engendre une fusion entre les gènes PML (promyelocytic leukemia) et RARa, localisés respectivement sur les chromosomes 15 et 17, ce qui entraîne la synthèse d'une protéine hybride (PML-RARE). Cette protéine, e m p ê c he l'action des rétinoïdes sur la différenciation de la lignée promyélocytaire qui reste bloquée à un stade précoce (74, 75, 76). L'hybride interfère avec plusieurs voies d'activation de la transcription, liée non seulement à RAR, mais aussi à RXR et aux récepteurs des hormones thyroïdiennes et de la vitamine D. D'autre part, l'activation de cette même voie par l'AR entraîne une induction de la différenciation vers la voie granulocytaire. Ainsi, il est probable que la chimère PML- R A R a puisse être responsable à la fois du blocage de la différenciation et de la sensibilité particulière à l'acide rétinoïque. Lorsque l'hybride PML-RARa est exprimé de façon stable dans les cellules U937, on observe un blocage de leur différenciation alors qu'en présence de fortes doses d'AR, le pourcentage de cellules qui rentrent dans le programme de différenciation devient supérieur à celui des cellules U937 témoins (77, 78). Cependant, les mécanismes précis de l'action thérapeutique de l'acide rétinoïque dans cette pathologie restent inconnus.

Plusieurs tissus et types de cellules telles que les hépatocytes, produisent l'AR à partir du rétinol (vitamine A). La vitamine A provenant de l'alimentation animale etlou végétale, subit des modifications dans l'intestin, puis

transportée jusqu'au foie où le rétinol est stocké sous forme de rétinyl-ester. Le rétinol sécrété par le foie dans le plasma, se lie à une protéine plasmatique liant le rétinol (RBP) (Retinol Binding Protein) (79, 81). Les cellules captent le rétinol par l'intermédiaire de récepteurs membranaires spécifiques pour le RBP (80,81). Le métabolisme du rétinol en différentes molécules actives dont l'acide rétinoïque all-tram et 9-cis, s'effectue via deux étapes d'oxydation. La première étape catalyse l'oxydation du rétinol en rétinal par l'enzyme alcool déhydrogénase (ADH) (82, 83, 84). Cette étape est réversible alors que la deuxième étape qui catalyse l'oxydation du rétinal en acide rétinoïque par l'aldéhyde déhydrogénase (ALDH) est irréversible tel qu'illustré à la figure (4). Dans la cellule, l'acide rétinoïque libre se lie à des protéines cellulaires spécifiques, CRABP (Cytoplasmic-Retinoic-Acid-Binding-Protein) de type 1 et de type II. Ces protéines sont impliquées dans la régulation de la concentration intracellulaire de l'AR, en le séquestrant dans le cytoplasme pour limiter sa distribution et ses effets biologiques (85, 86, 87). Il a été démontré que l'activation du gène CRBPI et de l'alcool déhydrogénase (ADH3) par l'AR peut aboutir à l'augmentation de la synthèse de l'AR-at, alors que l'activation de CRAPBII peut participer à la régulation négative (83, 136, 138)

L'acide rétinoïque libre peut diffuser au noyau où il se lie à des récepteurs nucléaires spécifiques appelés RAR et RXR pour moduler l'expression des gènes cibles. Les RAR dont les ligands sont indifféremment les AR all-trans ou 9 4 s . comprennent trois membres encodés par des gènes différents R A R a, RARP et RARy ( 88, 89, 90). Ces gènes sont très conservés au cours de l'évolution et chaque type est subdivisé en plusieurs isoformes. 11 existe deux isoformes pour le RARa, quatres isoformes pour le RARB et deux isoforrnes pour le RARy, q u i diffèrent au niveau de la région N-terminale de la protéine.

Les RXR, qui ne lient que l'acide rétinoïque 9-cis, possèdent aussi trois sous-types: RXRa, RXRB et RXR y (91, 92,

93). Seul le gène RXRy de la souris génère deux isoformes (RX Ry1 et RXRy2). Il est cependant encore difficile d'attribuer une fonction précise à chaque isoforme mais ce phénomène serait probablement impliqué dans la diversité des effets biologiques des rétinoïdes (fig 5).

Les RAR et RXR sont des facteurs de transcription qui lient des éléments de réponse présents dans le promoteur des gènes répondant à l'acide rétinoïque. Il s'agit d'un élément de réponse à l'AR (RARE) qui se présente habituellement sous forme de répétitions consensus "half-site" PuGGTCA directes séparées par deux (DR-2) ou cinq nucléotides (DR-5), ou de répétition en palindrome. Lorsqutil n'y a qu'un seul nucléotide entre les répétitions directes, l'élément fonctionne via les RXR (RXRE) (voir section 1.1.1 B).

B 1 140 205 230 467 RXRa

1 82 147171 41 O RXRP

1 139 204 202 463 RXRyl

1 16 81 202 RXRy2

Figure 5. Représentation des récepteurs de l'acide rétinoïque-a t (RAR) et des récepteurs de l'acide rétinoïque 9cis (RXR).

Les isoformes de RAR sont représentées dans la partie (A) et ceux de RXR sont représentées dans la partie (B). Les domaines de liaison du ligand et à l'ADN sont très conservés à l'intérieur de chaque famille. Le pourcentage d'identité en acide aminés par rapport au RARa dans la famille des M R , et de RXRa dans la famille des RXR, est indiqué dans les rectangles. Les chiffres au dessus de chaque rectangle représentent les numéros des acides aminés correspondant.

1-2 La superfamille des récepteurs nucléaires d ' h o r m o n e s

Il existe deux types de récepteurs hormonaux, les récepteurs de la membrane plasmique, de type peptidique tels que les récepteurs à l'insuline et certains facteurs de croissance (EGF, PDGF). Ces hormones ne peuvent pas traverser la membrane et interagissent avec leurs récepteurs présents à la surface de la cellule. Il y a alors génération d'un signal qui traverse la membrane pour exercer ses actions cellulaires. La tranduction du signal de la membrane au noyau s'effectue via des messagers secondaires. Cependant, l'autre type de récepteurs hormonaux ne se localise pas à la surface des cellules, mais dans le cytoplasme et le noyau. Ces récepteurs font partie de la superfamille des récepteurs nucléaires (hormone stéroïde, vitamine D3, hormone thyroïdienne, acide rétinoïque ...) (99, 100, 101, 102, 103, 104) qui sont des facteurs de transcription hormono- dépendants. Les récepteurs des hormones stéroïdes (les glucocorticoïdes, les minéralocoticoïdes, progestérone et oestrogènes) ont été les premiers caractérisés (95, 96, 97). Par la suite, d'autres ADNc ont été clonés correspondant à des récepteurs pour des hormones complètement différentes des hormones stéroïdes tels que les récepteurs de l'hormone thyroïdienne (94) et de l'acide rétinoïque(98). De même, ont été isolés des ADNc encodant des récepteurs orphelins dont le ligand n'est pas connu (104, 105). Les premiers membres connus de cette famille sont schématisés dans la figure 6.

Dans les conditions basales, la localisation de la plupart de ces récepteurs est nucléaire, l'étape de la translocation semble en fait exister pour quelques récepteurs comme ceux des glucocorticoïdes. En absence d'hormone, le récepteur des glucocorticoïdes est situé dans le cytoplasme où il est retenu par des protéines chaperon de choc thermique, "hsp

Récepteur nucléaire des estrogenes

5 -;; %. & Le DOMAINE A98 DOMAINE C OOMAlNE D DOMAINE E

Récepteur nucléaire des glucocorticoïdes

Récepteur nucléaire de la vitamine 0 m- Récepteurs orphelins

ni! Récepteurs nucléaires de l'acide rétinoïque

LIGANDS

INCONNUS

ACIDE

Récepteurs nucléaires des hormones thyroïdiennes

m + a ~ c 4 - 6 m i - H 1

HORMONES THYRO~DIENNES

Figure 6 : La super famille des récepteurs nucléaires d'hormones. Ce sont des récepteurs dont les ligands sont de structures très différentes (à droite). Tous construits sur Le même modèle (à gauche). De nombreux membres de cette famille sont des récepteurs orphelins.

90" (heat shock protéine) (109, 115). L'interaction avec la hsp 90 au niveau du site de liaison de l'ADN des récepteurs masque cette région et par conséquent, empêche le récepteur de fonctionner. La présence de l'hormone induit la phosphorylation du récepteur, lui permettant ainsi de se libérer de l'interaction avec la hsp 90 (106, 107). Le récepteur actif, pénètre dans le noyau et participe à la transcription de gènes cibles (109). Par ailleurs, les récepteurs de l'hormone thyroïdienne et de l'acide rétinoïque restent en permanence fixés sur leurs séquences cibles et inhibent la transcription. Lorsque l'hormone se fixe à son récepteur, celui-ci active la transcription du gène (108). Pour certains récepteurs, il a pu être démontré que la fixation de l'hormone induit une transconformation allostérique qui lève cette inhibition (103, 115). Les détails de ces mécanismes sont donnés dans la section 1.2.1C.

1.2 .1 Les récepteurs des hormones thyroïdiennes et des rétinoïdes.

1.2.1 A Structure

Les récepteurs nucléaires qui reconnaissent des molécules d'hormones différentes sont construits sur le même modèle. Ce sont des facteurs de transcription et chacun deux régule des gènes cibles qui contiennent des éléments de réponse spécifiques (HRE). Ces récepteurs nucléaires comportent cinq régions principales correspondant à des domaines fonctionnels distincts. Tout d'abord, la région arnino- terminale A-B, contient un domaine de transactivation dont le fonctionnement dépend du promoteur et de la cellule impliquée. Elle contient la fonction activatrice AF1 qui est constitutive (109, 1 10). Cette région qui n'est pas conservée, diffère d'un type de récepteur à un autre. Elle doit contribuer à la spécificité d'action des différents récepteurs. La région C ,

riche en résidus cystéine qui correspond au domaine de liaison à l'ADN est la mieux conservée entre tous les récepteurs nucléaires. Elle présente environ 50 à 80 % d'homologie et renferme deux motifs protéiques (doigts de zinc) dans lesquels un atome de zinc échangeant des liaisons de coordination avec 2His et 2Cys ou avec 4 Cys, stabilise une conformation en doigt qui correspond au domaine de liaison à l'ADN (1 11, 113, 114). La région E est complexe. Elle renferme le domaine de liaison du ligand et le domaine transactivateur majeur AF2 dont la fonction est inductible par le ligand. Cette région contient aussi une interface de dimérisation qui confère au récepteur l'aptitude à former des dimères en solution (1 12). Cette région est relativement bien conservée démontrant entre 15 et 50% d'homologie de séquence en acide aminés. Les domaines D et F sont très peu conservés, leurs fonctions étant encore obscures. Cependant, la présence d'un certain nombre d'acides aminés basiques au sein de la région D, correspond probablement à un signal de localisation nucléaire (fig 7). Les récepteurs nucléaires d'hormone possèdent une structure globale identique (voir section 1.2.1A).

1.2.1B Rôle

La vitamine A et ses dérivés, les acides rétinoïques et les hormones thyroïdiennes ont des effets importants sur le développement, la croissance, la morphogenèse et la différenciation cellulaire. La plupart des effets biologiques de ces hormones s'exercent via des récepteurs nucléaires. Deux familles de récepteurs de l'acide rétinoïque ont été décrites: les RAR et les RXR (voir section 1.1.2Ca). Pour les récepteurs thyroïdiens, il existe deux isoformes majeures: le RT3a et le R T 3 p codées par des gènes différents q u i se situent sur le chromosome 17 et 3, respectivement. Ces récepteurs ont une affinité pour la triiodothyronine T3 (3,5,3'-triodo-L- thyronine) et ses dérivés. Ils contrôlent l'expression de gènes spécifiques par régulation hormonale de la transcription

Domaine

Site de liaison Région Domaine Domaine hy pervariable de fixation de fixation

au DNA de l'hormone Homologie E 0% - = 50 - 70% 4 7 4 0 % -

NH2 A-B D E F

Figure 7 : Structure des récepteurs nucléaires des hormones. La molécule est subdivisée en 6 domaines A-F. La position des fonctions activatrices (AFl et AF2) de la transcription et des doniaines de liaison à l'ADN et à l'hormone sont tgalement reportées. Les fonctions des domaines D et F sont encore obscures.

COOH

(115). Certaines formes du récepteur T3 sont codées par le protooncogène c-erbA dont la version oncogénique v-erbA a été identifiée dans le génome d'un rétrovirus leucémogène aviaire. Dans ce virus, l'oncogène v - e r b A coopère avec l'oncogène v-erbB pour provoquer l'érythroblastose aviaire chez les animaux infectés par AEV (Aviasis Virus) (116, 117, 119). Cependant, la protéine codée par l'oncogène v-erbA est réarrangée par rapport à la protéine normale codée par c - e r b A . Elle n'a aucune affinité pour les hormones thyroïdiennes. On sait maintenant que cette protéine se comporte comme un inhibiteur compétitif de c - e r b A et des récepteurs de l'acide rétinoïque pour la régulation de la transcription de gènes cibles (1 18, 121). 11 a été démontré que l'activité en réponse à l'hormone thyroïdienne du TRE-MLV LTR (Moloney Murine Leukaemia Virus) qui lie le c-erbA est abolie par l'expression de v-erbA. D'autres part, il a été démontré que l'oncogène v-erbA active la prolifération des fibroblastes embryonnaires de poulet et contribue par là au développement de sarcomes. Sur les cellules érythroïdes, v- erbA bloque le programme de différenciation et maintient ces cellules dans un cycle d'auto-renouvellement. Par ailleurs, l'acide rétinoïque bloque la prolifération des fibroblastes de poulet mais l'expression de v-erbA lève cette inhibition (120). Ces résultats suggèrent que v-erbA interfère avec les mécanismes de contrôle des programmes de différenciation et de prolifération cellulaire en réponse à l'acide rétinoïque ou à la T3.

Une séquence consensus pour les différents éléments de réponse hormonaux a été établie. 11 s'agit d'un motif de type AGGTCA, directement répété (DR). L'espacement entre les répétitions est variable, allant de 1 à 5 nucléotides (DR1 à DRS). 11 a été proposé que l'espacement entre les deux motifs répétés correspondrait à un code pour la reconnaissance de la cible ainsi que pour la polarité de fixation dans le cas des hétérodimères (122, 123, 124). Un espacement de 5 (DRS), 4

(DR4), 3 (DR3) et 1 nucléotide (DR1) correspondrait à un élément de réponse à l'acide rétinoïque, à l'hormone thyroïdienne, à la vitamine D3 et aux proliférateurs de peroxysome (125, 126, 127). Cependant, ce code de reconnaissance est dégénéré en ce qui concerne les RAR car un certain nombre d'éléments de réponse de type DR1 et DR2 ont aussi été identifiés dans le promoteur de gènes contrôlés par l'AR (fig 8). De même, des travaux récents ont démontré que le ligand du récepteur RXR, l'acide rétinoïque 9 cis, est capable d'induire la formation d'homodimères RXRIRXR qui reconnaissent les motifs DR1. Certains TREpal peuvent également fonctionner comme des RXRE (fig 9).

En général, la liaison d'homodimère RAR ou RT3 au niveau de ces séquences est peu efficace. Le véritable complexe liant l'ADN avec une forte affinité et spécificité est un hétérodimère RAR/RXR et RT3lRXR (130, 131, 132, 133, 134). La liaison de ces hétérodimères à l'ADN a été examinée sur plusieurs éléments de réponse de type RARE, RXRE et TRE et l'activité transcriptionnelle des gènes correspondants a été comparée à celle induite par les homodimères RAR, RXR et RT3. Pfahl et al (135, 136, 142) ont démontré par des analyses de gel de rétention que l'hétérodimère RARIRXR se fixe DR2-RARE du gène CRBPI et aux séquences gène RARP avec une grande efficacité d'où une transcriptionnelle. Cependant les homodimères R A R y et RXRa démontrent une faible affinité ces éléments de réponse. Par ailleurs,

aux séquences DR5-RARE du grande activité RARP RARa,

de liaison pour l'hé térodimère

RARIRXR en présence de l'AR-at peut agir comme un répresseur de l'activité transcriptionnelle lorsqu'il se lie au DRl-RXRE présent sur le promoteur du gène CRBPII (138). Les homodimères RXRIRXR en présence d'AR-9cis activent la transcription des gènes CRBPII et d'apolipoprotéine A l (ApoAl) (137, 141). Cependant, les récepteurs RT3 non liés peuvent inhiber l'induction du promoteur RARB par l'AR-at en diminuant les quantités du RXR disponibles. Aussi, la

Thiazolidinedlones

Hétérodimères

Séquence consensus directement répétée AGGTCA

Homodimères

9-C-AR Vit D 9-C-AR T3 9-C-AR F A R

9-C-AR 9-C-AR Vit D Vit D

Figure 8 : Spécificité de liaison des récepteurs nucléaires à leurs cibles. Les rdcepteurs nucléaires, sous la forme d'hCi6rodimbre avec la moldcule RXR, lient un motif d'ADN prdsent dans la rdgion promouise des gènes cibles, composC d'une séquence consensus (AGGTCA) directement répétée et espacée par un nombre variable de nucléotides de (1 à 6 pb).

TRE Séquence nucléotidique

Palindrome (TRE-PAL)

Répétition directe (DR)

Palindrome inversé (IP)

TCCAGTNNNNTCCAGT

- TGACCTNNNNNNAGGTCA

h

Figure 9. Représentation des éléments de réponse du récepteur des hormones thyroïdiennes. La sdquence consensus AGGTCA est répétée directement avec un espacement de quatre nucl6otides (DR4) ou sous forme d'un palindrome (TRE-PAL)

formation de complexe non productif entre le RXR et le récepteur orphelin COUP-TF (COUP-TFIRXR) peut réprimer la transcription via le DR 1 -RXRE (1 39).

Il a été démontré que les RT3a et B lient efficacement le TRE du gène MHC (chaine lourde de myosine) et du gène ME (enzyme malique) uniquement en présence de RXR. L'hétérodimère RT3/RXR active fortement la transcription de ces gènes en présence de T3. En revanche la présence de RA- 9c réprime cette activité en diminuant la formation des hétérodimère RT3lRXR et en favorisant les homodimères RXRRXR ( 142).

D'autre part, il est connu que le RT3 en présence de son ligand interfère avec l'activité transcriptionnelle de AP1 et par conséquent inhibe la transactivation dépendante du facteur AP1 de gènes cibles (143, 144, 145). Récemment il a été démontré que l'hétérodimérisation de RT3 avec le RXR augmente l'interférence avec l'activité APl du promoteur du gène de la collagénase. Les auteurs suggèrent que cette interférence n'est pas médiée par la liaison directe de RT3 au site de liaison APl mais à la compétition des deux facteurs transcriptionnel RT3 et AP1 pour un coactivateur commun requis à l'efficacité de la transactivation. Aussi l'hétérodimère RT3lRXR augmente l'activité transcriptionnelle de RT3 indépendante du ligand. II a été démontré que le TRE-RSV, retrouvé au niveau des LTR (Long Terminal Repeat) du virus RSV (Rous Sarcoma Virus) est activé par le RT3 en absence de son ligand. La présence de T3 inhiberait l'activité du TRE-RSV (145, 146).

Le groupe de Fahri et al (147) ont effectué des mutations à l'intérieur de la région C-terminale de RT3. Ils ont sélectionné les résidus les plus exposés de la structure en cristal du domaine de liaison du ligand, qui probablement forme une surface d'interaction avec les coactivateurs. Les résultats

obtenus ont démontré que la région C-terminale est importante aux activités biologiques de RT3 et probablement constituée de deux surface d'interaction, l'une impliquée dans l'activation dépendante du ligand et l'autre dans la transrépression de l'activité AP1. Cependant, les mutations dans la région C-terminale de RT3 n'affectent pas l'activité du TRE-RSV. Ceci suggère que l'activité indépendante du ligand est médiée par le domaine activateur situé dans la région N- terminale.

La protéine RXR est aussi capable de former des hétérodimères avec les récepteurs de l'hormone de la vitamine D3 (VDR) et avec les prolifateurs de peroxysome (PPAR) (126, 127). Elle jouerait ainsi le rôle de partenaire au sein de voies d'activation hormono-dépendantes.

1.2.1 C Modulation de l'activité transcriptionnelle

Les récepteurs des hormones thyroïdiennes et de l'acide rétinoïque, une fois activés après la liaison du ligand, se lient à leurs éléments de réponse et contrôlent l'expression de gènes spécifiques grâce à deux fonctions activatrices de la transcription (AF). Tel que mentionné la fonction AF1 située dans la région amino-terminale est constitutive, alors que la fonction AF2, situé dans la région carboxy-terminale, n'est active qu'après la liaison du ligand (149). Cette fonction AF2 nécessite une courte région qui peut adopter une structure d'hélice a amphipathique conservée entre les différents récepteurs. La mutation des résidus conservés abolit complètement l'activité transcriptionnelle du récepteur (150). Cependant, on connaît peu de chose du mécanisme par lequel les domaines activateurs modulent le niveau de transcription des gènes cibles.

Différents travaux ont révélé une interaction directe de plusieurs récepteurs nucléaires avec des composants de la machinerie transcriptionnelle de base tel que TBP ou le facteur TFIIB (152, 153). D'autres études ont démontré l'existence de facteurs intermédiaires (appelés coactivateurs ou adaptateurs) nécessaires à la transmission de l'effet activateur des récepteurs nucléaires (151, 154, 155, 159, 160). Plusieurs ADNc ont récemment été isolés qui codent des protéines capables d'interagir directement avec les fonctions activatrices de ces récepteurs. Les groupes de Parker et de Brown (156,157) ont décrit indépendament deux protéines appelées RIP 140 et RIP 160, capables d'interagir de manière hormono-dépendante avec le domaine AF2 du récepteur à l'oestrogène. Ils ont démontré par transfection transitoire une augmentation de la transactivation par les récepteurs à I'oestrogène en présence de vecteurs d'expression pour le RIP140. Cette protéine peut interagir avec d'autres membres de la superfamille des récepteurs nucléaires. D'autre part le groupe de Chambon a isolé 1'ADNc d'une protéine appelée TIF1, qui interagit avec la fonction AF2 des récepteurs (RXRa, RARa, VDR et ER) dépendament du ligand et module leur activité transcriptionnelle (1 58).

Par ailleurs, les récepteurs TR et RAR, ont la capacité à réprimer activement la transcription en absence d'hormone (163, 164, 165). Des travaux récents suggèrent que cette répression est médiée par le recrutement de corépresseurs au niveau du domaine C-terminal du récepteur (166, 167, 170, 171, 172). La présence du ligand induit un changement de conformation du récepteur qui permet la dissociation des corépresseurs et le recrutement des coactivateurs. Les groupes de Glass et Evans (166, 167) ont publié le clonage de deux nouveaux facteurs, SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor) et N-COR (nuclear receptor corepressor). Ils ont le potentiel d'agir en tant que corépresseurs de TR et RAR en absence du ligand. Cependant,

aucune interaction spécifique n'a été observée avec le RXR ou d'autres membres de la superfamille des récepteurs nucléaires. Des expériences de mutagenèse dirigée à l'intérieur de la région charnière (ou hinge region) du récepteur thyroïdien, ont permis d'identifier le site de liaison de N-COR et SMRT, appelé (COR BOX) (173, 174, 175). La mutation de plusieurs résidus qui sont conservés entre TR et RAR à l'intérieur du COR BOX, abolit la liaison de N-COR sur TR et RAR et engendre un récepteur dépourvu d'activité inhibitrice.

D'autres groupes ont montré que le corepresseur N-COR est responsable des variations d'activité transcriptionnelle des hétérodimères RARIRXR observées en fonction de la polarité de la liaison à l'ADN (161, 162, 165). Un élément de réponse DR5 permet la fixation de RAR en 3' et de RXR en 5' du site. La présence des ligands de RAR favoriserait la dissociation de N- COR et le recrutement des coactivateurs potentiels que sont les protéines RIP14O et RIP160. Ces derniers permettent la stimulation de la transcription de gènes cibles. Cependant, lorsque le RAR se lie sur la partie 5' d'un élément de réponse de type DR1, I'hétérodimère est peu ou pas actif du point de vue transcriptionnel. Cette absence de transactivation s'expliquerait par le fait que sur un DRI, N-COR reste associé au récepteur même en présence du ligand. Le recrutement des coactivateurs est identique, que la séquence soit de type DR1 ou DR5 (168, 169) (fig 10).

Les recherches vont continuer dans cette voie, afin de ca rac té r i se r d 'autres médiateurs (coact iva teurs , corepresseurs) de l'activité transcriptionnelle des récepteurs nucléaires vu leur importance dans la compréhension des mécanismes moléculaires de l'expression génique.

Coactivateurs

DR1 : RAWRXR

Figure 10 : Repr6sentation schématique des interactions entre les hétérodimères RAR/RXR et les facteurs qui modulent leur activité transcriptionnelle. Les coactivateurs transcriptionnels que sont RIP 140 et RIP 160 sont recrutks en présence du ligand du RAR, indépendament de la nature de l'Clément de rdponse. Cependant la dissociation de N-COR (corépresseur) qui se fait en présence du ligand n'a lieu que lorsque les rdcepteurs se lient sur un dément de type DR5 (où le RAR est en position aval). Ceci expliquerait l'absence de la tramactivation lorsque l'hétdrodimére est fixd sur un Clément DR1 (où RAR est positionnC en amont).

ICA

CHAPITRE II

But et stratégies de travail

1 joue un rôle important dans la réponse immunitaire en permettant l'adhésion des leucocytes et monocytes aux cellules cibles. Elle fait partie de la superfamille des immunoglobulines et sert de ligand aux B2 intégrines. Plusieurs cytokines comme l'IL-1 et le TNF-a ainsi que l'acide rétinoïque stimulent l'expression dfICAM- 1. L'analyse et la caractérisation de la région promotrice du gène ICA M-1 a révélé la présence d'éléments de réponse cis-actifs impliqués dans la régulation de la transcription du gène par les cytokines proinflammatoires. Notre équipe a identifié et caractérisé un élément de réponse à l'acide rétinoïque (RARE) en position -260 qui lie les récepteurs nucléaires RARB et RXRa. Cet élément révèle une organisation de deux répétitions directes du type DR+5 et d'un élément inversé du type TRE-PAL. Notre premier objectif était de déterminer si l'organisation de ce RARE permettait la liaison des récepteurs thyroïdiens T3R résultant en une modulation de la transcription dlICAM-1. Notre second objectif était de déterminer l'effet de l'interaction entre les RAR ou les RXR et les RT3 sur l'expression d'ICAM -1, au niveau transcriptionnel. Des essais en transfections transitoires d'un gène rapporteur constitué du promoteur dlICAM-1 cloné en amont du gène de la luciférase et de certains mutants de délétion du promoteur dt1CAM-1 ont été effectués en cellules COS-1. Les cellules ont été transfectées avec les gènes rapporteurs et des vecteurs d'expression encodant le RT3a, le RARP ou le RXRa en présence de différents traitements. Finalement, pour démontrer une liaison spécifique du facteur de transcription impliquée avec la séquence cis -actif déterminée, nous avons réalisé des études de gel de rétention. Nous avons utilisé des extraits nucléaires

de cellules COS-1 stimulées ou non à l'acide rétinoïque et /ou à la T3 pendant 24h et des sondes oligonucléotides comprenant le RARE dtICAM-1 et d'ADH3.

CHAPITRE III

3.1 Réactifs

L'acide rétinoïque al1 (trans) a été obtenu de Sigma et l'acide rétinoïque (9-cis) provient du Dr. Marcus F. Boehm (compagnie Ligand Pharmaceuticals, San Diego). Ils sont préparés à une concentration de 1mM dans du DMSO (Diméthyl Sulfoxide), aliquotés et conservés à la noirceur à - 20' C. La T3 (3,3' ,5-Triiodo-~-THyRoNINE) (obtenu de Sigma) est conservée dans du DMSO à -20" C à une concentration de 10 mM.

3.2 Culture cellulaire

La lignée cellulaire COS-1 (ATCC CRL-1650) provient de 1'American Type culture Collection (Rockville, MD). Ces cellules sont maintenues dans du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) supplémenté de 5% (vlv) de sérum bovin foetal, 2mM de glutamine, 35 kglm1 de gentamycine et incubées à 37" C en présence de 5% de CO2 et d'humidité. Les cellules sont lavées à l'aide d'un tampon phosphate salin (PBS: 0.9% NaCL, 0.2% KCL dans lOmM tampon phosphate pH 7.25) avant chaque passage et changement de milieu. Elles sont passées deux fois par semaine à raison de 2 000 000 de cellules par flacon 75 cm2 jusqu'à confluence. Les cellules sont utilisées jusqutau passage 20 au maximum.

3.3 Plasmides rapporteurs et vecteurs d'expression

Le plasmide rapporteur pBHLUC 1.3 qui porte le promoteur complet du gène de ICAM-1 cloné en amont du gène de la luciférase et les mutants plasmides D et E ont été obtenus de l'équipe du Dr Christian Stratowa de la compagnie (Bender et Co, Vienne) et ont été décrits par Voraberger et al (56). Le vecteur d'expression de la phosphatase alcaline (pBC12/RSV/SEAP) a été obtenu de l'équipe du Dr Grace Ju (Hoffman Laroche, USA). Le plasmide pBHRARE a été décrit par Aoudjit et al (59, 60). L'ADNc codant le récepteur RARB a été obtenu du Dr. M. Pfahl (Jolla Cancer Research Foundation, San Diego, CA) et cloné dans le vecteur d'expression pCMV contenant le promoteur du cytomégalovirus qui a été obtenu du Dr. M.B. Matthews (Cold Spnng Harbor, NY). Le plasmide pRS h - R X R a et RSr-TRcx ont été obtenus du Dr. R.M Evans (Howard Hughes Medical Institute, San Diego, CA).

3.4 Transfections transitoires

3.4.1 Tansfections

Lors des transfections transitoires, 400 000 cellules sont ensemencées par puits de 4 cm de diamètre dans des plaques à six puits, 4 à 6 heures avant la transfection. Les cellules sont transfectées par la méthode de précipitation au chlorure de calcium (177) avec 5 pg de plasmide rapporteur pBHLUC 1.3 ou des mutants du promoteur d'[CAM-1, 3.5 pg du vecteur d'expression codant la phosphatase alcaline (pBC 12/RSV/SEAP), utilisé comme contrôle du taux de transfection et 2p g des vecteurs d'expression encodant les récepteurs RARP, RXRa et RT3a lorsque mentionné. La quantité d'ADN utilisée lors des transfections est normalisée à la plus haute valeur à l'aide du plasmide Bluescript qui provient de la compagnie Stratagene. La solution de CaC12 (0.25 mM) et du HBS 2x (Hepes-Borate-Sulfate: 52mM Hepes,

342mM NaCl, 12mM KC1, 2.5 mM NaH2P04) sont ajoutées aux tubes. Les précipités sont bien mélangés au vortex et incubés à la température de la pièce pendant 30 minutes avant d'être déposés sur les cellules à raison de 2 0 0 ~ 1 par puits. Les cellules sont incubées avec le précipité pendant 18 heures, puis lavées au PBS. Elles sont ensuite traitées à l'AR lpM et /ou T3 100 nM et incubées pendant 24 heures supplémentaires. Les cellules sont ensuite récoltées et l'activité luciférase est mesurée et normalisée par rapport à l'activité de la phosphatase alcaline. Le niveau de stimulation est défini comme étant le rapport de l'activité luciférase normalisée obtenue à partir des cellules traitées sur celle obtenue de cellules contrôles. Les résultats sont une représentation de la moyenne de trois expériences indépendantes.

3 A.2 Préparation des lysats cellulaires

Cette étape consis te à récolter les protéines produites lors de la transcription de l'ADN. Pour ce faire, les lysats cellulaires sont d'abord préparés selon la méthode modifiée de Brasier et al (178). Les cellules sont lavées au PBS puis récoltées dans 1.5 ml de PBS. Après centrifugation à 13 000 rpm pendant 30 secondes, le surnageant est retiré et le culot de cellules est lysé dans 100 pl de solution de lyse (l%Triton X-100, 25mM glycylglycine pH 7.8, 15 m M MgS04, 4mM EDTA, ImM DTT). Le lysat cellulaire est séparé des débris et des membranes cellulaires par centrifugation à 13 000 rpm à 4' C pendant 5 minutes. Les lysats sont conservés à -80' C.

3 -4.3 Essai luciférase

Pour cet essai, 25 pl de lysat cellulaire sont d'abord complétés à un volume de 50p1 avec la solution de lyse décrite en (3.4.2.). Deux cents pl de tampon de réaction (ATP 0.1 M, M g S 0 4 1 M, Glycylglycine 1M; pH 7.8) sont ensuite ajoutés aux tubes. Cent pl d'une solution de luciférine (d-luciférine 1 mM,

glycylglycine pH 7.8 1M) sont injectés automatiquement au mélange réactionnel, amorcant ainsi la réaction qui conduit à l'oxydation de la d-luciférine en oxyluciférine et à l'émission d'un photon donnant une lumière caractéristique dosable par le luminomètre (Berthold Lumat LBMO 1).

luciférase

Luciférine + ATP + 0 2 oxyluciférine + CO2 + AMP + ppi + hv.

3.4.4 Essai phosphatase alcaline

La phosphatase alcaline codée par le plasmide pBC12lRSVlSEAP est placée sous le contrôle du promoteur du gène RSV (Roux Sarcoma Virus) qui est constitutivement activé et qui n'est pas modulé par nos traitements. Le dosage de cette enzyme nous permet la normalisation des résultats de transfections. Avant la récolte des cellules, 500 p l de surnageant de culture sont prélevés et incubés pendant 5 minutes à 65°C pour inactiver la phosphatase alcaline endogène. Après une centrifugation de 3 minutes à 14 000 rpm, 100 ul de surnageant sont prélevés et incubés avec 200 pl de tampon SEAP (1M diéthanolamine, 0.5 m M MgCl; pH 9.8) en présence de 20 pl de substrat polynitrophénylphosphate (PNPP 120 mM) pendant 30 à 90 minutes à 37" C. La réaction colorirnétrique est lue au spectrophotomètre à une densité optique de 405 nm.

3.5 Gel de rétention

3 .S. 1 Extraits nucléaires

Les cellules COS-1 sont traitées ou non à l'AR 9-cis (1pM) etfou au T3 (100 nM) pendant 24 heures. Des extraits nucléaires sont préparés par la suite selon la méthode de

Andrews et Faller (179). Brièvement, les cellules sont lavées avec du PBS puis détachées à l'aide de la trypsine (100 mglml) . La suspension cellulaire est ensuite centrifugée 5 minutes à 14 000 rpm. L e surnageant est retiré et les cellules sont resuspendues dans la solution (A) qui est de basse molarité en sel (NaCl 0.14 M, Tris-HC1 10 mM; pH 7.5) puis centrifugées à 1500 rpm à 4" C pendant 5 minutes. La même opération est répétée avec la solution (B), hautement saline (KCI 25 mM, Acétate Magnésium 2 mM, DTT (Dithiotreitoi) 1 mM, Tris-HCl 10 mM; pH 7.5). Les cellules sont ensuite lysées dans 2 ml de la solution (B) à l'aide d'un potter. Les noyaux obtenus après centrifugation sont lysés dans 1 ml de la solution (C) qui est de la même composition que la solution B sauf la molarité de KCl qui est basse (KCl 0.35mM, Acétate Magnésium 2 mM, DTT 1 mM, Tris-HCL 10 MM; pH 7.5) additionné de 100 pl de KC1 4M. Après une centrifugation de 15 mn à 13 000 rpm, le surnageant, contenant ainsi les extraits nucléaires est transféré dans des tubes Eppendorfs et conservé à -80" C après dosage des protéines par la méthode Bradford.

3.5.2 Dosage des protéines par Bradford

Cette étape sert à quantifier les protéines obtenues dans chaque extrait. Le principe de la méthode est basé d'abord sur la quantification de liaison de différentes protéines inconnues au bleu coomassie. Par la suite, la concentration en protéines est déduite de la courbe standard faite apartir de différentes dilutions de BSA (Bovine Serum Albumin). Dix pl de lysat cellulaire sont ajoutés à 790 pl d'eau. L e mélange est alors additionné de 200 pl de réactif Bradford, mélangé au vortex et laissé à la température de la pièce pendant 10 minutes, à la suite de quoi, une lecture à 595 nm au spectophotomètre est faite. Aussi, une lecture à 595 nm est réalisée pour les échantillons de la courbe standard qui ainsi faite permettra la déduction des inconnues.

3.5.3 Gel et électrophorèse

L'analyse de gel en rétention, permet d'objectiver la présence et la spécificité d'une interaction entre les protéines et les séquences définies d'ADN. Dix à 15 pg d'extraits nucléaires sont mis en présence de 40 000 cpm (0.06-0.lng) de la sonde oligonucléotide radiomarquée au yATP 3 2 ~ e t incubés pendant 30 minutes à la température de la pièce. Le mélange de l'extrait et de la sonde est fait dans un volume final de 20 1 1 contenant 20mM de Tris-HC1 (pH %9), 100 mM KC1, 3rnM MgC12,O.S rnM EDTA, 1mM DTT, 12% (vlv) glycérol et 2kg de poly (dI-dC). Par la suite, l'échantillon est déposé sur gel polyacrylamide 5% pour une migration de 3 heures dans un tampon d'électrophorèse contenant du TBE (Tris-Borate 0.089M, EDTA 0.002M) (0.5 x). Les sondes oligonucléotides utilisées contiennent le RARE d'ICAM-1 ou d'ADH3 ( 5 ' - G A T C C C C G G G G T C A T C G C C C T G C C A C - 3 ' ) et (5'- GATC AAACTGAACTCTGAATGACCCCTGT-3') respectivement. Elles sont synthétisées grâce au synthétiseur Biosystem DNA 3 8 1 A .

3.6 Mutagenèse dirigée

Il existe plusieurs méthodes permettant l'introduction de mutations ponctuelles dans l'ADN. La méthode que nous avons utilisée permet l'introduction de mutations ponctuelles directement à partir d'un plasmide, selon le protocole de "Qui kc hangeTM site-directed mutagenesis kit" de la compagnie Stratagene. Le plasmide que nous avons mutagénisé est le plasmide pBH RARE. La mutation de deux bases (GG) dans la première répétition de l'élément RARE a été effectuée. Le plasmide pBH RARE est d'abord dénaturé à la chaleur puis hybridé à deux oligonucléotides portant les mutations désirées. La réaction s'effectue dans un volume total de 50 pl, contenant 5 pl de tampon de réaction (lox), 5-50 ng de DNA,

125 ng de chaque amorce, 1 @ d'un mélange des nucléotides (10 mM) et lpl de Ph DNA polymérase. Après la réaction PCR, 1 pi de DpnI est rajouté aux mélanges qui sont centrifugés durant 1 mn et laissés à 37 OC pendant 1 heure. la DpnI, permet la digestion des plasmides méthylés, ayant deux brins parentaux, sélectionnant ainsi les plasmides portant les mutations. Les plasmides issus de la première transformation sont isolés par mini-prep puis soumis à une deuxième sélection par des digestions enzymatiques.

CHAPITRE IV

Résultats

4.1. Effets de l'interaction entre les récepteurs à l'acide rétinoïque (RXRa, RARP) et les r é ce p t e u r s thyroïdiens (RT3a) sur l'activité transcriptionnelle d'ICAM-1.

Des travaux effectués dans notre laboratoire (59, 60) ont permis de démontrer que l'acide rétinoïque stimule I'ac tivité transcriptionnelle du promoteur dtICAM- 1. Grâce à des mutants de délétion notre équipe a localisé sur le promoteur dlICAM-1 l'élément de réponse à l'acide rétinoïque (RARE) à la position -266 (SrGGGTCATCGCCCECCA 3') relativement à I'ATG. Des résultats obtenus en cotransfection transitoire des vecteurs d'expression encodant différentes isoformes de RXR et de RAR montrent que la régulation d'ICAM-1 par l'acide rétinoïque se fait par la formation d'un complexe hétérodimère (RARPfRXRa) provoquant un effet s y nergique sur l'activité transcriptionnelle dlICAM- 1. Le RARE dtICAM- 1 présente une organisation de deux répétitions directes d u type DR+5 et d'un élément inversé du type TRE-PAL. Notre objectif était de déterminer si l'organisation de ce RARE permettait la liaison des récepteurs thyroïdiens RT3 résultant en une modulation de l'activité transcriptionnelle dlICAM- 1. Dans ce contexte, nous avons exploré l'interaction entre les récepteurs RXRor/RARB et les RT3a qui sont connus p o u r former des hétérodimères capable de moduler l'activité transcriptionnelle de gènes cibles.

4 .1 .1 Essais en transfection transitoire avec 1 e plasmide rapporteur pBHLUC 1.3 et d e s vecteurs d'expression des récepteurs RXRa et RT3a.

Des essais en transfection transitoire dans des cellules COS-1 ont été effectués. Le plasmide rapporteur pBHLUC 1.3, constitué de la région 5' régulatrice du gène ICAM-I placée e n amont du gène rapporteur de la luciférase, a été cotransfecté avec les vecteurs d'expression des récepteurs RXRa et RT3a. Les cellules ont été traitées ou non à l'AR 9 -ci$ (1pM) e thu a u T3 (100 nM) et l'indice de stimulation a été déterminé. Les résultats représentent la moyenne de trois expériences indépendantes. Lors du traitement à l'acide rétinoïque 9 - c i s (lpM), on constate que l'activité transcriptionnelle d u plasmide pBHLUC 1.3 augmente de 4 fois par rapport à son niveau basal (fig 11). On constate aussi une stimulation de 3 fois de l'activité transcriptionnelle du promoteur d'ICAM- 1 excercée lors de la cotransfection du plasmide encodant le RXRa en absence du ligand. Par ailleurs, la cotransfection des récepteurs RXRa et RT3a en absence d'hormone démontre une stimulation de l'activité transcriptionnelle dtICAM- 1 de 6 fois. On obtient des niveaux de stimulation de 10 fois et de 2 O fois en cotransfectant les vecteurs d'expression du RXRaet d u RXRa/RT3a respectivement en présence de l'acide re t i noïque 9cis. Cependant, le traitement à la T3 produit une inhibition significative sur les effets stimulateurs de RXRa en présence de l'AR 9-cis de l'ordre d'environ 70%. La présence d u vecteur d'expression de RT3a, stimule légèrement de 2.5 fois le niveau basal d'expression du pBHLUC 1.3. Ce niveau basal ne semble pas être affecté par la présence de son ligand (fig 11). La T3 démontre donc un effet inhibiteur sur l'activité transcriptionnelle du pBHLUC 1.3 stimulée par l'AR 9cis e n présence des récepteurs RXRaIRT3a, effet qui provient

possiblement de l'antagonisme entre le RT3a et le RXRa pour l'élément de réponse RARE.

4.2. Identification de la région du promoteur d' ICAM- 1 impliquée dans la régulation transcriptionnelle par les récepteurs RXRaIRT3 a.

4 . 2 . 1 Essais en transfection transitoire avec 1 e plasmide rapporteur pBHLUC RARE et d es vecteurs d'expression des récepteurs RXRa et RT3a.

Pour déterminer si la séquence RARE est la région impliquée dans la modulation transcriptionnelle d'ICAM-1 p a r lthétérodimère RXRa/RT3a, nous avons effectué des transfections transitoires avec différents mutants de délétion dans la partie 5'- régulatrice du promoteur dlICAM-1. En comparant les résultats de transfection effectuées sur les différents plasmides rapporteurs, il est possible de dé termi ner où se situe la région impliquée. En fait, dans le plasmide pBHLUC RARE le site AP- 1 disparait lors de la délétion, ce q u i nous permet d'éliminer une eventuelle interaction des récepteurs à l'acide rétinoïque et thyroïdiens au niveau de ce site. La figure 12 nous révèle que l'activité transcriptionnelle du plasmide pBHLUC RARE, comprenant la région RARE, es t comparable à celle obtenue avec le plasmide pBHLUC 1.3 q u i comprend le promoteur d'ICAM-1 au complet. Les récepteurs nucléaires (RXRa,RT3 a) en absence de leurs ligands respectifs, stimulent d'environ 3 fois l'activité constitutive du pr O moteur dtICAM-1. Pour ce qui est de l'activité transcriptionnelle d u pBHLUC RARE stimulée par l'AR 9-cis, la combinaison d e RXRdRT3a exerce comme démontré précédemment s a stimulation d'environ 20 fois, qui se voit inhibée par la T3 de l'ordre de 60%.

4.2.2. Essais en transfection transitoire avec 1 e plasmide rapporteur pBHLUC RARE et d es vecteurs d'expression de RARB et de RT3a.

Des cotransfections transitoires avec le plasmide pBHLUC RARE et des vecteurs d'expression encodant les récepteurs RARB et RT3a ont aussi été réalisées afin d'évaluer l'effet d e l'interaction entre les RARB et RT3a sur l'expression d'ICAM- 1. Les données de la figure 13 nous montrent que la stimulation de la transcription du plasmide pBHLUC RARE p a r l'acide rétinoïque al1 trans (1pM) est de 3.5 fois par rapport à son activité basale. On constate aussi qu'en présence de l'acide rétinoïque al1 trans une stimulation de l'activité transcriptionnelle du promoteur d'[CAM-1 de 10 fois lors d e la cotransfection du plasmide encodant le RARB. Par ailleurs, la présence de l'acide rétinoïque al1 trans lors la cotransfection des vecteurs d'expression du RARB et du RT3a, produit également une stimulation de l'activité transcriptionnelle d u promoteur d'ICAM-1 d'environ 11 fois, ce qui diffère des résultats des expériences précédentes où en présence d e l'acide rétinoïque 9cis, la cotransfection des vecteurs d'expression du RXRa et du RT3a provoquait une stimulation de 20 fois (1 1,12). Donc le pouvoir stimulateur de l'AR 9-cis en présence des récepteurs RXRa et RT3a sur l'activité transcriptionnelle du promoteur d'[CAM- 1 semble supér ieur à celui de l'AR ail-trans en présence des récepteurs RARP e t RT3 a. On remarque cependant, une inhibition significative des effets stimulateurs du RARP en présence du ligand lors d u traitement à la T3 de l'ordre de 50%.

4 . 2 . 3 Essais en transfection transitoire avec l e plasmide rapporteur E et les vec teurs d'expression de RXRa et de RT3a.

Le plasmide E, est un mutant de délétion dans la région 5 ' régulatrice du promoteur d'[CAM-1. La délétion des éléments

de réponse situés entre les position -393 et -176 pb, résulte en la disparition des sites RARE et NF-KB. L'action de l'AR s u r le plasmide E a bien été démontré dans notre laboratoire (59). L'activité transcriptionnelle du plasmide E stimulée par l'acide rétinoïque diminue fortement par rapport à celle des au t re s plasmides comprenant le site RARE. On constate (fig 14) q u e les différentes cotransfections des vecteurs d'expression encodant le RXRa et le RT3a ainsi que les traitements à l'AR 9cis et à la T3 n'apportent aucune modification au n iveau d'expression de base du plasmide E En effet, les stimulation sont d'environ 0.4 fois. Ceci suggère donc que la modulation d e l'activité tarnscrip tionnelle du promoteur d'ICAM- 1 e n présence de l'hétérodimère RXRdRT3a est un phénomène requérant la présence des éléments cis actifs localisés entre les positions -393 et - 176, comprenant entre autre l'élément RARE.

4 . 2 . 4 Essais en transfection transitoire avec 1 e plasmide rapporteur pBH RARE- et d e s vecteurs d'expression de RXRa et de RT3a.

Notre équipe a démontré que la première répétition d u DR5 ou du palindrome de l'élément RARE, était importante dans la réponse à l'acide retinoïque. Ceci a été démontré p a r des analyses de gel en rétention, utilisant des extraits nucléaires de cellules COS-1 traitées à l'AR et de la sonde oligonucléotide RARE d'ICAM- 1 portant différentes mutations (60). Nous avons effectué des mutations dans cette répétition afin de déterminer si elle est aussi cruciale dans l'activité transcriptionnelle du pBHRARE lors de la combinaison de RXRcuRT3a. Ceci va nous permettre aussi de confirmer si la séquence RARE est bel et bien impliquée dans la modulation transcriptionnelle dlICAM- 1 par l'hétérodimère RXRIRT3. La mutation de deux bases (GG) dans la première répétition d e l'élément RARE (S'GGGTCATCGCCCTGCCA3') a été effectuée par mutagenèse dirigée. Le plasmide pBHRARE- ainsi ob tenu

est cotransfecté transitoirement avec des vecteurs d'expression de RXRa et de RT3a. On remarque à la figure 1 5 que les stimulations de l'activité transcriptionnelle d u promoteur d11CAM- 1 induites par l'acide rétinoïque 9cis e n présence des plasmides encodant le RXRa et le RXRaIRT3a sont réduites de façon significative de l'ordre de 80% et 85 % respectivement par rapport à l'activité transcriptionnelle d u pBHLUC RARE non muté. Ce qui confirme que l'élément RARE est bien impliqué dans la régulation transcriptionnelle d u promoteur dtICAM- 1 par l'interaction entre les récepteurs à l'acide rétinoïque et thyroïdiens. Cependant, lors de la cotransfection du vecteur d'expression du RT3a, l'activité transcriptionnelle du promoteur d ï C AM- 1 ne semble pas ê t r e affecté par la mutation dans le site RARE. La stimulation transcriptionnelle du plasmide pBHRARE- est de 3.5 fois p a r rapport à son activité basale. Le RT3a se lierait peut être à d'autres éléments de réponse sur le promoteur dlICAM-1.

4.3. Mise en évidence des interactions ADN-protéines spécifiques.

Des analyses de rétention en gel ont été effectuées, à l'aide de sondes oligonucléotides radiomarquées et d'extraits d e protéines nucléaires de cellules COS-1 traitées ou non à l'acide rétinoïque 9cis et/ ou au T3. Lors des expériences e n rétention en gel avec la sonde oligonucléotide RARE drICAM- 1 (fig 16), un simple complexe est obtenu avec des extraits d e cellules non traitées alors qu'un deuxième complexe faible s e forme avec des extraits de cellules traitées à l'acide ré tinoïque 9 4 s . Ce deuxième complexe spécifique implique possi blernent une interaction entres les récepteurs RXR et la sonde RARE d11CAM- 1. D'autre part, cette liaison spécifique di mi nue considérablement avec des extraits de cellules traitées à l'acide rétinoïque et au T3. Comme contrôle positif, nous avons répété la même expérience avec la sonde oligonucléotide RARE d'ADH3. II a été démontré que le gène de l1ADH3 est régulé

positivement par l'acide rétinoïque (83). Il possède un élément RARE bien caractérisé qui lie avec une grande affinité les récepteurs RAR et RXR. Les résultats de la figure 17 obtenus avec la sonde RARE d'ADH3 sont similaires à ceux obtenus avec la sonde RARE d'ICAM-1 (fig 16). Lors de la rétention en gel avec la sonde RARE d'ADH3 et des extraits de cellules traitées à l'acide rétinoïque 9 - c i s , on constate l'apparition d'un faible complexe spécifique qui n'est pas présent lors de l'utilisation des extraits de cellules non traitées. Afin de confirmer la spécificité du complexe obtenu, des essais de compétitions avec les mêmes sondes mais non marquées, ont également été effectués. Les figures 16 et 17 démontrent la disparition du complexe spécifique lors des compétitions de 10 fois et de 50 fois avec la sonde RARE dlICAM-1 et d'ADH3 non marquée.

- RXR RXWRT3 RT3

RA + + - + + - - + + - - + + -

Figure 11- Effet de la cotransfection de RXRa et de RT3a sur I'activité transcriptionnelle du plasmide pBHLUC 1.3

Les ceilules COS-1 ont été transfectées transitoirement avec 5 pg du plasmide pBHLUC-1.3, composé du promoteur dICAM-1 lié au gène de la luciférase, 2 pg de vecteur d'expression du récepteur RXRa et/ou RT3a et 3.5 pg du vecteur d'expression de la phosphatase alcaline. La quantité d'ADN a été normalisée a 15 pg ii l'aide du plasmide Biuescnpte. Dix-huit heures plus tard, elles ont été traitées au RA (1p.M) et/ou au T3 (100 nM) pour 24 heures. Par la suite I'activit6 lucifénse a été mesurée au luminomètre et les valeurs ont été standardisées par rapport la I'activité phosphatase alcaline.

Vecteur pBH

1 Luciferase -1 393

a0 a0 a pBHLUC1.3 P t k m m - - ? '777

-393 9 Plasmide 0

1 Plasmide E -266 n

u I 1 RARE

- RXR RXWRT3 RT3 RA + + - - + + - - + + - + + -

Figure 12- Effet de la cotransfection de RXRa et de RT3a sur l'activité transcriptionnelle du plasmide mutant de délétion pBHRARE

Les cellules COS4 ont été transfectées transitoirement avec 5pg du plasmide pBHRARE. composé du promoteur d'ICAM- 1 tronqué h la position -266 et lié au gène de la lucifénse. 2 pg de vecteur d'expression du récepteur RXRa et/ou RT3a et 3.5 pg du vecteur d'expression de la phosphatase alcaline. La quantité d'ADN a été normalisée à 15 pg ltaide du plasmide Bluescripte. Dix-huit heures plus tard. elles ont été traitees au RA (1pM) edou au T3 (100 nM) pour 24 heures. Par la suite l'activité luciférase a été mesurée au luminomètre et les valeurs ont été standardisées par rapport à la l'activité phosphatase alcaline.

Vecteur pBH W

Luciférase 1 pBHLUC1.3

-393 Plasmide D

-1 76 6 Plasmide E -266 n

u 1 RARE

- RARb R A R ~ / R T ~ R T ~ RA + + - - + + - - + + - - + + - T3 - - + + - - + + - - f i - - - + +

Figure 13- Effet de la cotransfection de RARP et de RT3a sur l'activité transcriptionnelle du plasmide mutant de délétion pBHRARE

Les cellules COS4 ont été transfectées transitoirement avec 5 pg du plasmide pBHRARE, composé du promoteur d'ICAM- 1 tronqué à la position -266 et lié au gène de la luciférase, 2 pg de vecteur d'expression du récepteur RARP etiou RT3a et 3.5 pg du vecteur d'expression de la phosphatase alcaline. La quantité d'ADN a été normalisée à 15 pg à I'aide du plasmide Bluescripte. Dix-huit heures plus tard. elles ont été traitées au RA (1p.M) etiou au T3 (LOO nM) pour 24 heures. Par la suite l'activité luciférase a été mesurée au luminomètre et les valeurs ont été standardisées par rapport B la l'activité phosphatase alcaline.

Vecteur pBH

Plasmide O

Plasmide E

RARE

Figure 14- Effet de la cotransfection de RXRa et de RT3a sur l'activité transcriptionnelle du plasmide mutant de délétion E.

Les cellules COS-I ont été transkctées transitoirement avec 5 pg du plasmide E, compost5 du promoteur dtICAM-1 tronqué à la position -176 lié au gène de la luciférase, 2 pg de vecteur d'expression du récepteur RXRa etlou RT3a et 3.5 pg du vecteur d'expression de la phosphatase alcaline. La quantité d'ADN a et6 norrnaiisée à 15 pg 1 Itaide du plasmide Bluescripte. Dix-huit heures plus tard, elles ont été traitées au RA (IW) etfou T3 (100 nM) pour 24 heures. Par la suite I'activité luciférase a Çté mesurée au luminomètre et les valeurs ont kt6 standardisées par rapport P la I'activité phosphatase alcaline.

Vecteur pBH

-266 1 RARE

-II-- - RXR RXRIRT3 RT3 RA + + - - + + - - + + - - + + - T3 + + - -

Figure 15- Effet de la cotransfection de RXRa et de RT3a sur I'activité transcriptionnelle du mutant de délétion plasmide pBHRARE-

Les cellules COS4 ont été tnnsfectées transitoirement avec 5pg du plasmide pBHRARE-, composé du promoteur d'ICAM-I tronqué à la position -266 et portant une mutation dans la première répétition de l'6lément RARE lié au gène de la luciférase, 2 pg de vecteur d'expression du récepteur RXRa etlou RT3a et 3.5 pg du vecteur d'expression de la phosphatase alcaline. La quantité d'ADN a été normalisée à 15 2 I'aide du plasmide Bluescripte. Dix-huit heures plus tard. elles ont été traitees su RA ( l m etlou au T3 (100 nM) pour 24 heures. Par la suite l'activité luciféme a été mesurée au luminomètre et les valeurs ont été standardisées par rappon à la l'activité phosphatase alcaline.

Vecteur pBH

Luciférase 1 pBHLUC1.3

3 1 Plasmide

-266 n U

COMP.

+

Figure 16- Analyse de rétention en gel avec l a sonde RARE dtICAM-1 et d'extraits

nucléaires de cellules COS4 traitées ou non au RA etlou au T3.

Dix mg d'extraits nucléaires de cellules COS4 traitees ou non au RA (IV) et ou/au T3 (100 nM) ont

été incubées avec la sonde oligonucléotide RARE dICAM-1 marquée au P32 (comme décrit dans

matériel et méthodes). La migration a été effectuée sur gel polyacrylamide 6% pendant 3 heures dans

du tampon TBE (0.5~). Des compétition de Lûx et de Sûx ont été rialisées avec la même sonde mais

non marquée.

Figure 17- Analyse de rétention en gel avec la sonde RARE d'ADH3 et d'extraits

nucléaires de cellules COS4 traitées ou non au RA euou au T3

Dix pg d'extraits nucléaires de cellules COS-1 traitées ou non au RA (1pM) et/ou au T3 (100

nM) ont été incubées avec la sonde oligonucléotide RARE d'ADH3 marquée au P32 (comme

décrit dans matériel et mkthodes). La migration a été effectuée sur gel polyacrylamide 6%

pendant 3 heures dans du tampon TBE (0.5~). Des compétition de 10x et de 50x ont été

réalisées avec la même sonde mais non marquée.

CHAPITRE V

Discussion

Dans notre laboratoire, il a été démontré que l'expression dfICAM- 1 est induite par l'acide rétinoïque principalement a u niveau transcriptionnel. L'analyse des mutants de délétion a révélé que la région en position -266 du promoteur dtICAM-1 comprend la séquence consensus RARE (S'GGGTCATCGCCCTGCCA3') qui lie les récepteurs RARP e t RXRa. Cet élément RARE révèle une organisation de deux répétitions directes du type DR5 et d'un élément inversé d u type TRE palindrome. La deuxième répétition du DR5 et d u palindrome présente des mésappariements, ce qui n'empêche toutefois pas la fixation de facteurs de transcription cibles (59, 60). Par ailleurs, des analyses en gel de rétention avec des sondes RARE dlICAM- 1 portant différentes mutations, O n t démontré que la première répétition est critique à la liaison d e l'hétérodimère RARBIRXRa alors que les mutations dans la deuxième répétition du palindrome ou du DR5 n'affectent pas cette liaison.

Le but de notre travail était de déterminer l'effet d e l'interaction entre les RARP ou RXRa et les RT3a sur l'activité transcriptionnelle d11CAM- 1. Dans un premier temps, no u s avons voulu déterminer si l'organisation du RARE permettait la liaison du récepteur thyroïdien. Des essais en trans fec t ion transitoire d'un gène rapporteur constitué du pro mo t eu r d'ICAM-1 cloné en amont du gène de la luciférase et d e certains mutants de délétion du promoteur d'ICAM-1 ont é t é effectués en cellules COS-1. Les résultats que nous avons obtenus (fig 11, 12 et 13), démontrent que le récepteur thyroïdien (RT3a), en présence de son ligand (T3), n'a pas d'effet sur l'activité transcriptionnelle d'ICAM-1. Cependant, en absence de son ligand, le RT3 stimule de 2.5 fois l'activité

constitutive du promoteur d'ICAM-1 ainsi que l'activité transcriptionnelle induite par le m a en absence de son ligand. Dans ce dernier cas, il est probable que les RXRa et les RT3a forment de complexes hétérodimères, liant avec u n e grande affinité l'élément de réponse RARE d'où la stimulation de la transcription d'envion 35% par rapport au RXR cotransfecté seul. Il est possible aussi que la présence des récepteurs RT3 viennent diminuer la quantité de corépresseurs disponible dans la cellule. Les RXR ainsi libérés de la liaison avec le corépresseur, stimulent alors la transcription d'envion 35% par rapport au RXR cotransfecté seul. Tel que mentionné, le RT3 en présence du ligand n e semble pas avoir d'effet sur l'activité transcriptionnelle d'[CAM-1. Probablement que la T3 favorise la formation d'homodimères RT3, réduisant ainsi le nombre de monomères disponible pour former des complexes avec les RAR et les RXR endogènes. Il est connu que les RXR et les RAI2 peuvent lier l'acide rétinoïque et stimuler la transcription d'un gène e n homo ou en hétérodimères. Les résultats obtenus indiquent que la cotransfection du RARB ou du RXRa, induit des stimulations de 10 fois lorsque stimulé à l'acide rétinoïque al1 trans ou 9-cis (fig 11, 12 et 13). Cependant, en absence d e ligand des niveaux de stimulations de 4 fois ont été obtenues. Ces niveaux de stimulations en absence de ligand pourraient être expliqués par la présence de la fonction activatrice AF1 située dans la région amino-terminale des récepteurs RARB e t RXRa. La fonction AF1 indépendante du ligand est responsable de l'activité constitutive des récepteurs à l'acide rétinoïque e t d'autres récepteurs stéroïdiens (149, 150). Cependant, il e s t aussi connu que les récepteurs à l'acide rétinoïque e t thyroïdiens ont la capacité de réprimer activement la transcription en absence d'hormone (1 21, 163). Cette activité inhibitrice attribuée au recrutement de corépresseurs cellulaires (164, 166, 167), peut être conciliée dans ce cas. En fait, la transfection transitoire permet la surexpression de récepteurs par rapport à la quantité du corépresseur présent

dans la cellule. Il est aussi connu qu'il y a présence de RAR e t de RXR endogènes dans les cellules COS-1 qui peuvent former des hétérodimères et induire la transcription.

Les résultats en cotransfection transitoire avec le RXRa ou le RARB et le RT3a en présence de leur ligand respectif (fig 1 1, 12 et 13), nous montrent clairement une inhibition significative de l'ordre de 70% des effets stimulateurs du RXRa et du RARB par la T3. Ceci suggère que la T3 favorise la formation de complexes homodimères RT3/RT3 qui compétitionnent avec les hétérodimères (RXEURT3 e t RARlRT3) pour l'élément de réponse RARE. Pfahl et al ( 1 4 2) ont effectué une série de gel de rétention afin de déterminer par quel mécanisme l'acide rétinoïque 9-cis diminue l'interaction de l'hétérodimère (RT3lRXR) avec le TRE-MHC. L'AR 9cis, induit la formation d'homodimères en solution réduisant ainsi le nombre de monomères RXR disponible p O u r former des hétérodimères (RT3lRXR). Des récepteurs RT3 e t RXR ont été incubés simultanément avec le TRE-MHC et le RARE-DR1 CRBPII, un élément de réponse spécifique aux RXR. En absence de I'AR 9cis, des liaisons de récepteurs ont été observées seulement avec le TRE-MHC. En revanche, la présence de l'AR 9cis induit la formation d'hornodimères RXR qui lient fortement le RARE-DRl. Une diminution des complexes formés entre le TRE-MHC et les hétérodimères RT3RXR a été également observée. il est aussi possible que le complexe formé en présence de la T3 ne soit pas transcriptionnellement actif. En absence de la T3, la possibilité d'hétérodimérisation de RXRlRT3 semble très probable. Ceci pourrait expliquer les fortes stimulations de 20 fois O b te n ue s en cotransfection de RXRlRT3 par rapport au RXR cotransfecté seul, en présence de l'AR 9-cis. En effet, ce résultat n'est pas observé lors de la cotransfection d e RARB/RT3a, traité à I'AR all-tram. L'explication la plus probable est que les récepteurs RT3 ne forment pas d'hétérodimères avec les RAR capables de lier efficacement u n

élément de réponse de type TRE ou RARE (148). Il a été démontré que des analyses de gel de rétention ne révèlent pas de complexe spécifique entre le RT3/RAR et le TRE-MHC ou le R A R E - R A R B . Une autre option possible serait celle de l'interaction des médiateurs (coactivateurs, corepresseurs) avec les domaines activateurs des récepteurs hormonaux. Glass et al (166, 168), ont démontré que les variations de l'activité transcriptionnelle de l'hétérodimère RARIRXR est en rapport avec le facteur corepreseur N-COR. La dissociation de N-COR sous l'effet du ligand se fait sur un DR5 permettant ainsi le recrutement des coactivateurs alors que, sur un DRl, N-COR reste associé au récepteur engendrant un complexe hétérodimère dépourvu d'activité transcriptionnelle. Le rôle dominant de ce corepresseur sur l'activité du récepteur a été confirmé par le fait qu'un mutant RAR, incapable de lier N- COR, puisse stimuler la transcription même après fixation sur un DR1. Il est aussi possible que les RAR, les RXR et les RT3 compétitionnent pour un coactivateur commun nécessaire à leur transactivation. Comme il a été suggéré pour l'interférence de RT3 avec l'activité AP-1 (143, 145) où la presence de la T3, réprime l'activation de la transcription par le facteur AP-1 de gènes cibles. Les auteurs suggèrent que l'interférence de RT3 dépendante du ligand avec l'activité AP- 1 n'est pas médiée par une liaison directe de RT3 au site de liaison AP-1 mais à une compétition pour un coactivateur commun nécessaire à leur transactivation. Il a été démontré que la substitution de certains résidus acides aminés localisés au niveau de la région C-terminale de c - e r b A , abolit sa capacité d'interférer avec l'activité AP- 1, suggérant ainsi que la région conservée au niveau C-terminal de c - e r b A représente le site d'interaction du coactivateur qui est requis lors de l'activité AP-1 (144, 147).

Les transfections avec les différents mutants de délétion du promoteur d'ICAM-1 (Fig 12, 13, 14 et 15) confirment que la région RARE est impliquée dans la régulation

transcriptionnelle dlICAM- 1 par l'interaction entre les récepteurs à l'acide rétinoïque et thyroïdiens. Les résultats obtenus avec le plasmide pBHRARE semblent montrer une très bonne cohérence avec ceux du pBHLUC 1.3, qui s'expliquerait par la présence de l'élément RARE sur les deux plasmides. En revanche, la transactivation du promoteur d'ICAM-1 est affectée dans le plasmide E et le pBHRARE- dont le site RARE est soit délété OU muté respectivement. Cependant, le site NF-KB aussi délété dans le plasmide E pourrait être également impliqué indirectement dans la régulation d'ICAM-1 par l'hétérodimère RXRlRT3. On a constaté aussi que le TR3a provoquait une stimulation de 3.5 fois sur l'activité basal du pBHRARE-. Le phénomène d'effet indirect pourrait être mentionné dans ce cas. Les récepteurs RT3 pourraient activer d'autres gènes présents dans les cellules COS-1 qui activeraient à leur tour le promoteur dtICAM- 1 .

Les résultats obtenus par rétention sur gel en présence d'extraits nucléaires de cellules COS-1 traitées à l'AR 9cis, révèlent l'apparition d'un faible complexe retardé impliquant possiblement les RXR, liant la sonde RARE d'ICAM-1 et la sonde contrôle RARE d'ADH3. Cependant cette liaison spécifique diminue dans les cellules traitées à l'AR 9cis et à la T3. Ce qui corrèle avec nos résultats de transfections. L'absence de la T3 favorise probablement la formation d'hétérodimères RXRlRT3 qui lient l'élément RARE avec une plus forte affinité alors que la présence de la T3 favorise la formation dthomodimères RT3. 11 serait maintenant intéressant d'étudier les rétentions sur gel avec des extraits nucléaires de cellules traitées à l'AR etlou la T3 en présence d'anticorps spécifiques contre les RXR, les RAR et les RT3. Ceci va nous permettre d'identifier l'homo ou l'hétérodimère qui se lie à l'élément RARE suite aux différents traitements et amener ainsi à une compréhension plus précise des modes de

régulation dlICAM-1 par l'interaction entre les récepteurs à l'acide rétinoïque et thyroïdien.

Les interactions entre les récepteurs à l'acide rétinoïque et d'autres récepteurs nucléaires notamment, les récepteurs aux oestrogènes, androgènes et la vitamine D pourraient également être étudiées dans cette perspective. Cependant, les élément de réponse de ces récepteurs nucléaire d'hormone diffèrent de celui des RAR et des RXR.

II reste du travail à accomplir afin de caractériser complètement tous les mécanismes de régulation de I'ICAM-1 par l'acide rétinoïque. Des résultats préliminaires que nous avons obtenus en transfection transitoire avec le plasmide PGL KB- portant le promoteur d'ICAM-1 muté au niveau du site N F K B , révèlent l'inhibition de l'effet stimulateur de l'acide rétinoïque sur l'expression dlICAM-1. Lors du traitement des cellules à l'acide rétinoïque al1 trans (lpM), on a constaté que la stimulation de l'expression du plasmide pGL 1.3 augmente de 3.5 fois par rapport à son niveau basal. D'autre part la cotransfection du plasmide pGL KB - démontre une stimulation de 1.03 fois lors du traitement des cellules à l'acide rétinoïque al1 trans (1pM) par rapport à son niveau basal. Ceci suggère que le l'acide rétinoïque al1 trans induit l'activation du facteur NFKB en plus des récepteurs RAR et RXR, qui probablement, coopèrent ensemble à l'activation dfICAM- 1. Ce phénomène a d'ailleurs été démontré pour le gène de CMH classe 1 (176). Dans ce dernier, l'acide rétinoïque induit l'activation des sous unités NFKB (P50-P65) et des récepteurs (RXRP-RARB) qui se lient à leurs éléments de réponse respectifs et induisent l'activation de la transcription. La mutation dans le site RARE a démontré une diminution de 50% de l'activité du promoteur du gène de CMH classe 1 induite par l'acide rétinoïque alors que, la mutation dans le site NFKB révèle une diminution supérieure à 50% de cette activité. Ceci porte donc a croire que la régulation par l'acide rétinoïque de 1'ICAM-1 est

dépendante d'autres voies et d'autres facteurs dont le mécanisme est encore à définir.

CONCLUSION

Cette étude montre que les récepteurs thyroïdiens (RT3) en présence de leur ligand (T3) n'ont pas d'effet sur l'activité de base du promoteur de 1'ICAM-1 mais qu'ils inhibent de façon significative les effets stimulateurs de RXR et de RAR. Ce phénomène implique positions -393 e t RARE. L'utilisation permis de confirmer

les éléments cis actifs localisés entre les - 176, comprenant entre autre l'élément

du mutant ponctuel, le pBH RARE- nous a que la séquence RARE est bien impliquée

dans ce phénomène.

Ces résultats suggèrent soit que la T3 favorise la formation d'homodimères RT3, réduisant ainsi le nombre de monomères disponible pour former des complexes hétérodimères avec les récepteurs RXR, soit que le complexe hétérodimère formé en présence de la T3 est transcriptionnellement inactif. Enfin, l'interaction des médiateurs (coactivateurs, corepresseurs) avec les domaines activateurs des récepteurs RXR, RAR et RT3 peut être un facteur régulateur de l'activité transcriptionnelle de I'ICAM-1.

Les rétentions en gel, en présence des anticorps spécifiques contre les RXR, les RAR et les RT3 méritent d'être explorées afin de mieux comprendre le mode de régulation de l'expression de l'[CAM- 1 par l'interaction entre les récepteur à l'acide rétinoïque et les récepteurs thyroïdiens.

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