laboratory chemicals-fujifilm wako chemicals …...hybridization at 68ù for 16-20 hr. hybridization...

32
i90~P90¹ Sizej | 1/32 | For Research Use Only Code No. 294-62001 Wako for genetic research DsDD cDNA Subtraction Kit Wako ¡ Table of Contents Page Û. Introduction cccccccccccccccccccccccc1 Ü. Features cccccccccccccccccccccccccc2 Ý. Overview of the DsDD cDNA Subtraction Kit Wako procedure cc2 Þ. The contents of the kit Wako ccccccccccccccccc5 ß. Storageccccccccccccccccccccccccccc5 à. Additional Materials Required cccccccccccccccc5 á. DsDD cDNA Subtraction Kit Wako procedure ccccccccc6 1. Important information cccccccccccccccccc6 2. Preparation of Tester ss cDNA cccccccccccccc7 3. Preparation of Driver ds cDNA cccccccccccccc8 4. Hybridization cccccccccccccccccccccc9 5. Removal of hybrid ds cDNA by Duplex-specific nuclease ccc9 6. Amplification of Subtracted cDNA cccccccccccc10 7. Removal of remaining ss cDNA by ExonucleaseÛ ccccc10 8. Check of Subtracted cDNA (e.g. Human tissue) cccccc11 8-1.Evaluation using control gene ccccccccccccc11 8-2.Results ccccccccccccccccccccccc11 â. References cccccccccccccccccccccccc11 ã. License cccccccccccccccccccccccccc11 ä. Related Products cccccccccccccccccccccc12 Appendix (Flow Chart of the Experiments) cccccccccc13 Û. Introduction Subtractive hybridization method is a powerful technique that enables to identify the enrichment of genes that are specifically expressed in one tissue or cell type or at a specific stage. Although several methods are reported until now, traditional procedures often have several drawbacks such as labor-intensive, time-consuming and technically demanding. Even a commercially available subtraction kit requires several rounds of hybridization and takes about 4 days. Especially it has to prepare Tester and Driver cDNAs from mRNA every time because of the influence on the sequences derived from the vector. DsDD cDNA Subtraction Kit Wako is an excellent method based on `` Duplex- specific Direct Digestion'' (DsDD), which overcomes traditional subtraction methods. Overview of the DsDD cDNA Subtraction methods is presented on Figure 1. First, tester and driver cDNA are prepared from cDNA Library from the two types of tissues or cells being com- pared. After hybridization, the hybrid ds cDNA from tester and driver cDNAs are digested by duplex-specific nuclease. Finally, the remaining ss cDNA are removed by ExonucleaseÛwithout any physical separa- tion. This method efficiently enables to enrich the genes that specifically expressed in tester cDNA, takes only two-day work.

Upload: others

Post on 10-Aug-2020

3 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

�������� �����

� ���� �

���� ������ � �����

���� ��� ���������

������� ������� ������

���� ��� �� ��� ��� �� ����

� ����� �� ���� �� �

�� ����������������������������������

�� � ���� ���������������������������

�� �� �� � �� �� ���� ��� ��������� �� ���� ��� ��� ��

�� �� ��� ��� �� �� �� ���������������������

�� �����! ���������������������������

�� �������" #�� ��"� $ %�� �����������������

�� ���� ��� ��������� �� ���� ��� ��� ���������

&

�� �'������� ����'����������������������

&

�� (� ������� �� � �� � �� �����������������

)

*� (� ������� �� ��� � �� �����������������

+

,� -.���/��������������������������

0

� $ '���" �� �.��� �� ��� �. ���" 12�� � ��" �� ���

0

&� �'�"����� �� ������� � ���������������

�3

)� $ '���" �� � '���! �� ��� �. 41���" �� � ������3

+� 5� � �� ������� � ��� 6 �!� -�'�� ���� 7������

��

+2��4��"����� ���! �����" ! � �������������

��

+2��$ ��"�������������������������

��

�� $ � � � �������������������������

��

� 8 �� ��������������������������

��

� $ "�� � (����������������������������

��

��� ��1 6�"�� 5���� �� �� 41� �' ���7����������

�*

�� ���������������� �.���/���� ' ���� � � ��� ���" � ��%� ���� ���" �

�� � ���. �� ���' �� �� ! � � ���� �� �� ��"". 1�� �� � � ��

���� �� "" �.� �� �� � �� � ���! � �"����!� � � ��" ' ����� ��

� ���� � ���" ���9 ��������" ��� ��� � ��� � ��� � � ��" ��������

��� �� "����2�� ��� 9 �' 2����'�! ��� � ���"". � '����!�

4� � � �'' ��"". ���"��" ��������� �� � %�� � � � ��" ������ ��

�.���/���� ��� ��� � ����� , ��.�� 4�� �"". � ��� �� �� ��� � �� �

��� ��� � ���� ���' '$�� � �. �' � ��� �� �� ��"� � ��

�� � %� � � � �� � ���' �� � ����

���� ��� ��������� �� ���� � �� 1 "" �� ' ���� ��� � ��

::���" 12�� � �� � �! ����;; 6����79 ��� �� ��' � ��������"

��������� ' ������ �� �� � �� �� ���� ��� ��������� ' �����

� �� � �� � �� �!�� �� ����9 � �� � ��� ��� � ��� �� �� ��� �

���' ��� 8����. ���' �� ��� �.� � �� ���� � �� ""� � �! �'2

��� �� ��� � �.���/����9 �� �.��� �� ��� ���' � �� � ��� ��� �

���� �� �! �� � �. ���" 12�� � ��" �� � ���"".9 �� � '���!

�� ��� �� � '�� � �. 41���" �� ������� ��. ��.��" � ����2

���� ��� ' ���� �� ��". ���" � �� ��� �� ! � � ���� �� ��"".

1�� �� � � � �� � ���9 ��� � ��". ���2��. �����

Page 2: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ���� �

�� ��������

� �������� � �� ��� ��� ���� ���� �� ��������

������ ��� ��� �� ��� � �������� � �� ��������� � �� �����

� ���� ���� �� ���������� ������

� �� � ���������� ��������� ��� ������� ��� � �� ������� ���

������� ��� ����������� ������ ��� ������ ���� ��� �� ������ ����

����� �� � ���� ��� ������� ������� � � ����

� ���� ����������� �� ������ ��� �����

���� ���� � �� �������� � � ��� ��� � ����� �������� ��� ��������

�� � !��� �"������ ���� �# $%&� ���� � ��� "����������

���� ��

� ���������� �� ���� !�������� �������� ��� " ���������

����������

���� '�� � �� � � ��(���� �������� �������� � � � ��� ���� �� ���

��� ������ �� ����

� ���� ������������

�� �� ������ ��� �� ���� ���� ��� � � &� ��� ���

� ��� ���� �����������

�� ������ #� $������� �� ��� � � �� ��������� %�� &�'�

���������

PrepPreparation aration of Tof Testerster ss ss cDNA cDNA PrepPreparation aration of Driver dof Driver ds cDNA cDNA

Step VII-2 ( ) Step VII-3( )

HybriHybridizization of Tation of Tester ss cDNAster ss cDNA an and Driver ds cDNAd Driver ds cDNA

Step VII-4( )

Digestion ofDigestion of hybrid ds cDNA hybrid ds cDNA

Step VII-5( )

AmAmplification of residual Tplification of residual Tester ss cDNA ster ss cDNA

Step VII-6( )

Digestion Digestion of of residuresidual ss cDNAal ss cDNA

Step VII-7( )

Subtracted cDNA Subtracted cDNA

Your cDNA library is

amplified with one-side 5'-

phosphorylated primer. The

tester ds cDNA is digested by

Lambda Exonuclease to obtain

ss cDNA for tester.

Your cDNA library is amplified

and digested by Rsa restriction

endonuclease to obtain Driver ds

cDNA.

Hybridize with Tester ss cDNA and excess amount of Driver ds cDNAs

Digest hybrid ds cDNA by duplex-specific nuclease

Amplify Tester ss cDNA with the same primer set which is used

in preparing for Tester ds cDNAs.

Digest remaining ss cDNAs by Exonuclease I

p7 p8

p9

p9

p9

p10

Page 3: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ���� �

’’

’ ’

Lambda Exonuclease

’’

’ ’

’’

’ ’

Endonuclease Rsa I

’’

’ ’

’ ’

’ ’

Denature and hybridization

’ ’

’ ’

’ ’

Duplex-specific nuclease

Page 4: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ���� �

’ ’

’ ’

’ ’

DNA amplification

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

Exonuclease I

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

Purification

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

Subtracted ds cDNA

Cloning

Page 5: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ���� �

�� ��� ������� � ��� ���

�� ��������

� � ������ ��������� ��� � ����

��� �������� ��������� ������ ���� � ����

��� ������������� ������ ���� � ����

��� �� ���!� ������ ������� ��� � ����

��� ���� ���!� ������ ������� ������ ���� � ����

�"� ���������� ��� � ����

�#� ������������������ ���� � ����

�$� ��%��%����� ���� � ����

�&� '� '���� ���� � ����

� �� � ��(� '���� )������* � �+� ����� � ����

�� ������

,%�� -�� �� ����� �� ���� �� ����.���� ���!���+ )���� ��/*

����� -�� �%� �� ��� � �%� -�� ���� �%� ���0�/ ���������+

����

� � ������ ���������

��� �������� ��������� ������

��� ������������� ������

��� �� ���!� ������ �������

��� ���� ���!� ������ ������� ������

�"� ����������

�#� ������������������

� � ��

�$� ��%��%�����

�&� '� '����

� �� � ��(� '���� )������

�� ���������� �������� ��������������� �

� ��1) ��������� �� ������ �� ���.�� ��1)

�� 2������ �� ������ �� ���.�� ��1)

�� 2������ �� ���� /��� ��+/+ 3)2��*�!�����

�� ����� �� �1) �� ��������

�� �1,2 4������ � � ���(� �),2* �,,2* �5,2* �3,2 ���%�

"� ' � 5����� �� �0 4������� 6��/%� � &�! ��� �* 3��!��������

� � ����

#� 7�������� ��������� ���� �� �� $!���& �

$� 2%��(5%�����(8����� )��%� ���9��9 .�(.��

&� #�:* &&+�: ��%��

�� �1) ���� ������� ���-��

� )/����

�� ��%����� ������

�� �,)� ������

�� ����/ ������

�� '������ ��������� 0����

Page 6: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ���� �

�������� �

��� ��� ��

��� � ������� ��� ��

��� � ���� ��

��� � �� � �

��� ����� � ��

��� ������ � ���

��� ! �� "�# � ������� ��� $��� � �%&'�� ���& ��&��� � ��

�(� )�* "�# ���� ���$��� �+� ��� � �& "* �� �����

�%� ,������������� $-.��� ���

�'� !�� ���/ $(�0����

��� � � �� ���������" " ��������"

�� � �� ��������� �� ����������� ������� ����������

� 1� �� �.23 � ��� ��� �"��& �"��# �.23" "����# ��+ ��

"�� �� ���� �� ��� �"� �� +����4

� ��� �� ��" ��� �� ������� �� �� �"�� ��# #� +� �.23" ��

#" ��# ���� ��, �� �� +���� �� �� ������� �� �#����� " �

�� �.23"4 1� "����# ��� �# ���� �� �� �� �� ��" ��� �"��

�.23 " ���"���� ���# �� �� '50��� ��� ��� ����� �� " ���0

"����## �.23 ���� #���0"����## ��� ���#���"4 6�� ��

�" �� #� +� �.23 ��# �"�� �.23 � ��� *� �� *� ����#

��� "�� +����& � "����# ��� �# ���� ��� �� ��" ��� ��0

�� � ��� �� �� #� +� �.23 *� #" ��# � �" # �� ��" ��

��� �� ��" ��� ���� � ��� �� �� �"�� �.234

� ��� � # �� ��" ������������� �� ������ ��� �+� ���

�" �" �� #����� �� ��� ��� ��� # �� ���������" " * ��

� + "�� "������ �"���"4

Primer 3

P-5TesterPrimer 15' 3' 3'

Primer 4

Primer 2

Driver 5' 3' 3' 5'

'

� ������� �� �� �� �� �� "� ��� ������� ��" " �"��� �� +���0

�� �� "������# �.23"4

� 1� �� �" � �����0"��� ��� ���"& * ������# �-�-0

�37 .23 ��� ���"& *� �� " � �� � #� � ��# �����0"���

�8 � * �� �� � ��0 � 99��� "����55 �����"4 �� �����* ��

����#��" �� ��� � 8# * �� �-�-�37 .23 ��� ���"4

� �� ������ �� �� ���� � # .23 ���#��� #��#" �� � ��� 0

���" ��# � ������ � ��� �"#4 3+� # �+� ���� � ��� �� ���0

� �� ��� � "������ ��4

� �"�� �� �� �#������"" �� ��� ����� �# � �� " / �4

� ��� ��" �� ,� � ����� �� :�0� ����� �� "� � ������ �� �0

;� �# ��� ���+�� �� �� ��" ��# "���� .23 �������" ��*

��� � � �� "������ �� ����""4

1� �� " ��������& * ����� �� ��� ���" ��� � ���� �� �" ��

"���� �� .23 ���� � ��� �� ����#"4

Page 7: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ���� �

�� ��������� � ����� �� ����

� �� � ������ ���� �� �� ��� ������� ������

���� ������� ��� ������ ��� ��� ����

�� !��������� "���� ���� # �$� %�& '���

�� �$� ��()� '��

)�� �� � ����* ������������� ���% '��

)�� �� �'+*!���!����������� ���% '��

(,),(�- ��� )�� ����� ������ ��. �� �������� "����� /��

������� ����� �� �����

)�� �� � ��� )�� �� ��0���� ��!��� �� 1����� ��0����2 ��

��� 1����� ��� ����������� ��� ���� ������� ���� ��� !3& 1��*

���� �� ��� !3&$%�. 4������ ��� 5�1���� )�� ��2

� ���!���� ��� �� ��� �������� ������ ���� ���� �� ' )&5*���� 2

� � !��� ��� ����� ���� ��� ������������ ��������� ��� !��*

���6����� �� �� ��� �� !������� ����� ����2 (���� �� �� ���

������ ��� ��� ��������� ���� ��� �� ����*���� �2 �

����2

7'� ��2

7'� � ���2

'��#�� .� ���2 ��# �����

8 � ��2

8 � ' ��2

� &���� ���� �������� ����� �� � ������������� ���2 ��� ���

�� �� !���� � �������� ����� � ����� � '� /�� 1�$1�� ���

�� �� 1�����2

� &�������� �� �/���� �! ��9�9����� ��� . ����� �� ��� �� *

!������2

� (������� ��� �!�������� �� � ��� ��� ��� ��� ��� �� :�������*

���� ���� �� . �$� ;��� ������� ��� '��� �� 772'<

������2 %�� �� 1�����2

� &�������� �� �/���� �! ��9�9����� ��� ' ����� �� ��� �� *

!������2

5���� ��� !��� ���� �'��� �� 8�< ������ �� ��� �� !���*

���2 5� �1� ��� �!�������� ��� ��� ��� !��� �� ��� �� ���

���2 �����1� ��� !��� �� //�� �� ������� �����2

��� '�� �� ����� ��� :�������� "���� ��� ��� �� �� �*

�� :�������� ��� �� �����2 (������� �� ��� ��� )&5 ���

��� ������� ��� .� ����� �� .8�2

� ������� ��� �' ����� �� 9�� �� ������1��� ��� �� ��� :�*

�������2

� (������� �� ��� ��� ������������� ��� ��� ��=�� ��� ����

1� � �� ����� ���� '��� �� ������� �����2

���� �� ��� �� !� �� ;!�� &����� �� ��� ��*��������� �!��

�� � ��� �� �1� �� ��* �����*������ ���2

� &�������� �� 8���� ��� ' ����� �� ��� �� !������2

� %����� ��� ,� #� �� � ������ �� ��� ��� ���� ;!�����!���� *

���� �� ������ ��� ������������� �� ��� (����� �� ����2

��� ������������� ���$��� � ,� #� 1�� �.8��$ ��������

�,� #� � .8�� ����� ������ ���$ �

Page 8: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ���� �

� ������� � ��� �� ����� �� ���� ���� ��������� ������

������ � �� ���

�� ��� ������������� �� ����� �� ���� �� ��� �� ������ ��

��������� ��� ������������� !" ������� ��������������

�� ��������� � ���� �� � ��

� �� � ������� ��!� ��# �� ��� ��������� �����$

���� �!���" ��� ��% ��� ���

&�������������� '����� ���� ( ���� )�*�& +%�

�% ���� �� �� +�

������ , �%�) +�

������ - �%�) +�

.�. �/ ��� ���"������ �������� �$, �� ���������� '������ -�

��������� ����� �� �%%�

������ , ��� ������ - ��0����� ������ �� 1����� ��0������ ��

"��� 1����� ��� ����������� ��� ���� �!���" ����� ��� �2*

1����� ��� ��� �2*)�, 3������ ��� 4�1���� ������� 5���

"�� ��� ��� ���1�� ���� ��� ������ ���� ��!���" ����� ����

������ ���� ���� 1����� �� ������ !� ������� ���� �*4 ������� ���

������������� �� ���1�� ���� ���� �������� �� ������ ������� ��

�*4 ������� ��� ������������� �� ������ �����

� �������� &%� �� ��� �������� �������� ���� ���� �� + �*4 ��!�� �

� ������" ��� ����� ����� ��� ������������ ��������� ��� ���"6

����7����� ����� ��� ������������ ������ !����� ���� ����� ���

�����!�� ��� &%� ��������� �����!��� �� ����6������ %�& �

��!���

8+� & ����

8+� &% ����

+%�(%� ,% ���� ��( �"����

9&� & ����

9&� + ����

� ��� �%%� �� ������$����������$�����"� ������� �&+$&-$�

1��1��� ��� ��# !" 1����#�

� *��������� �� �- %%% ��� ��: :%%��� ��� , ������� �� ���� ���6

���������

� ������� ��� ����������� �� � ��� ��!� ��� ��� �� �� ;���6

�������� �%� �� ,��� ������ ������� ��� &+%� �� 88�+<

�������� )�# !" 1����#�

*��������� �� �- %%% ��� ��: :%%��� ��� + ������� �� ���� ���6

���������

4���� ��� ������ ���� �+%� �� 9%< ������� �� ���� �������6

����� 4���1� ��� ����������� ��� ����� ��� ������ �� ��" �� ���

���� ������1� ��� ������ �� --� �� ��������� ������

� ��� �� ��� ������ �� ���� *������ �� ��� ���6���������� ����

������ ��� ����1�� �� ���6���������6������ ����

� *��������� �� 9%%�� ��� + ������� �� ���� ������������

��� +� �� �%�) '����� ��� �� �� ����� )�# �����" ��� ��6

��!��� ��� & ����� �� ,9��

� ������1��� ��� ��� ����������� ������������ ��� &% ������� �� :%��

Page 9: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ���� �

� ������ ��� ��� ��� � � ����� ���� ��������� �����

� ��� ����� � ������������ ��� �� ���� ��������

����� �! "� ����!�

� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� ' ������ � � �� (

��������

� )������ ��� ��������� � ��� ��"� �� �� ��� � *������(

��% ���� � ' ��� +��� ������ �� ����� � ,,��-

������ .�! "� ����!�

� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� ' ������ � � �� (

��������

� /���� ��� ������ ���� ����� � 0�- ����� � � �� ���(

����� /� �� ��� ��������� �� ��� ��� ������ � ��� �� ���

��� 1������ ��� ������ �� ���� � ��������� �����

� .����� ��� 21�3� � ������� � ��� 14� ���� +�������� (

���� � ������� ��� ���������� � ��� 1����� �� �14��

14� ���������� ��$��� � 21�3� ��������$� �� �������

�21�3� � ���$ ��"�� ����� 14�� ��

� 5����� ��� �$��� � 1����� �� �14� ���� ��������� �����

+ ��� � �� �$

6� 14� ���������� � 1����� �� �14� �� �� �� ���% ��

��� ��� 14� ���������� "� ����� ������������

�� ����������

��� ��� � )����� �� �14� �� �$ % ��� � 1����� �� �14� ����

�$ �� ��� � ��7�"����8��� 9����� � 5#/ ��"� � .�!

$������

������ �� ��� ������ � ��� � � ���

6���"�� �� � ������ � ,&� �� ��"����8� �� �3(�� ���� �

3&��

�� ������ �� ������ �� ���� �� ��������������� ������

��� ��� � �������� ��1����!(�������� ������� 9����� � 3&

� � 7�"����8��� ������ �3&� �� +��� �� .�! $����� �� ��(

��"�� �� �� ������ � 3&��

��� ��� � 1����!(�������� ������� �� ����"�� �� '�

������ � 3&��

� ��� ���� � +�� +����� �� ����"�� �� � ������ � 3&��

������ ��� ��� ��� � � ����� ���� &��� � ��������� �����

� ��� ����� � ����� � ������ � �� �� ���� ��������

����� �� �! ���� ����!�

� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� ' ������ � � �� (

��������

� )������ � ��� ��������� � ����� ��"� �� �� ��� �

*������ ��% ���� � ' ��� +��� ������ �� ����� �

,,��- ������ .�! "� ����!�

� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� � ������ � � �� (

��������

� /���� ��� ������ ���� ����� � 0�- ����� � � �� ���(

����� /� �� ��� ��������� �� ��� ��� ������ � ��� �� ���

��� 1������ ��� ������ �� '��� � ��������� �����

Page 10: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

�� ���������� �� �������� ���

� �� � ������ ���� �� �� ��� ������� ������

��������� ����� ����� ���� !�"

#�� ���������� $���� ���� % �&" '�(# �)�"

!) �&" ��*+� ��"

+�� �� !� !)�' ��"

+�� �� #� !)�' ��"

*,+,*�- ��� +�. ����� ������ !� �� !������� ������ /�"

*��� 0� � !))�"

+�� �� ! ��� +�� �� # ��� ��� �� � ��� ��� ��������� ��� ���

*����� ���� �� ���� !1

� �������� #)�" �� ��� �������� ������ ���� ���� �� � +(2 ���� 1

� � ���. ��� ����� ���� ��� ������������ ��������� ��� ��.�

���3����� �� �� ��� �� �������� ����� ����1 *���� �� �� ���

������ ��� #)�" ��������� ���� ��� �� ��������� )1# "

����1

4�� # ��14�� #) ���1�)�%)� ) ���1 � � �.���5#� # ��15#� � ��1

� (���� ���� �������� ����� �� � ������������� ���1 ��� !))

�" �� �������������� ����� . ����� �#��#/�! 0�&0�� ���

�� ���� 0�����1

� (�������� �� !/�))) �� �!6�6))��� ��� ����� �� ��� �� �

�������1

� *������� �� ��� ���������� �� � ����� ��� ��� ��� !�" ��

7������� ���� !)�" �� �&" ���� ������� ��� #�)�" ��

441�8 ������1 '�� ���� 0�����1

(�������� �� !/�))) �� �!6�6))��� ��� � ����� �� ��� �� �

�������1

2���� ��� ���� ���� !�)�" �� 5)8 ������ �� ��� �� �����

���1 2� �0� ��� ���������� ��� ��� ��� ���� �� ��. �� ���

���1 �����0� ��� ���� �� //�" �� ������� �����1

�� ������ �� ���� � � �� ��� �� ��� ������

� ��� �� //�" �� ���� ������ �� ��" �� !) � 7���������

$���� ��� !�" �� 7���������1 '�� ����.1 *������� �� ���

��� +(2 ��� ��� ������� ��� ) ����� �� 5�1

� ������� ��� !� ����� �� 5)� �� ������0��� 7���������1

� "��� �� ��� �� �� �� ���� (����� �� ��� ������������ ����

�� � ��� �� �0� �� ��� ������������ ���1

� (�������� �� 5))�� ��� � ����� �� ��� �� �������1

� '����� ��� ,�#%) �� � ������ �� ��� ��� ���� ������������ �

���� �� ������ ��� �������������1

�� �� �! ���

��� ������������� ���&�"� � ,�#%) 0����)��& "�������

!,�#%) � �)�� ���� ������ ���& "1

Page 11: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

�� ����� � �� ��� �� ����� ����� ����� ������

��� ������ �� �� �� ��� ����� � �� ���� ������� ���� ���

��� �������� ���� ���� ����� �� ����� ������ ����� ������ �������

������ �� �� ��������

����� ������ �����! !��� �� "�� ��!��� �������� !��� ��

����� ���� ���!��� �� ������� !�����

#��� � ������������� �������� ��� ��� ����$������ ��� %&���

��� '� &����� �( �� ��� ��$������ �� %&����� )( ��� ��� ����

�� ��� ��������! �� ���

���� ��� �� ��� !� � ��� �� ����

�� %' �!( &����� '�� �� ) �'�*

�������������� +����� ���� , ����-* .!/�� '0�*

'0 ����-* ��� '�*

&���� ������� '0�. '�*

�������� ������� '0�. '�*

�1�1�2 � ���������� % ����� '3) �� '��������� +�����( '�*

������� ����� �� �0�*

�/4 ��� �������� ���� ��� ��������! ����������� ��� �/4 ��� ����

���� �����5� $� '�06 �!����� !�� ����������������

� ������� ��� ��������! ����� ��� �� ������� ��

78� � ����

78� �0 ����

80�,0� )0 ���� ��� ������

9�� ' ����

9�� � ����

��"� #��� �

"�!��� ' ����� ���� �$����� $�� � ���� ���� ����� �� ������ ��

����$������ �� �� �� ��$������ ��� ��� ������ ��

���� ��� ��!���������� ������� ����� ��$�������� �������

���� �� "� ��� ��������� � ��� ������� ��!!��� ���� ��� ��$�

�������� ����� ��� �� ���� �� &�$�������� :�� ;� � ��

���� ����������

HepG2 cDNA

GAPDH GAPDH 100bp SL

1,500bp1,000bp

1%

GAPDH glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase

Subtracted cDNA

Agarose S

AFP : alpha-fetoproteinGAPDH : glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

931bp859bp

AFP AFP GAPDH AFP

Normal liver tissue cDNA

�� #��������<���� ��� �� �� +�! ������ #� �� &����!���� � &�� =�!���� *� *��

:����� ��� �� *�� :�5����� �� =� +�� .��5� .� =�� .����� ������� #��

.���5� *� *�� *� ������ &� � �� &��!��� �� ��� ����� ���� ���

��>)� %)( 3 �)9� %�00?(

�� $����������� �� �� ������$�� �� ���������� ��� �������������� ��������������

�������� ���� "�� ���������� ��� �� ���� ��� ������ ������� ;� � ����

/������� @� ������������� �� &�$�������� :�� ;� � �� ������ ��� ��!�

Page 12: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

�� ������� �����

���� ������� � �� �������� ������� ����

��������� ������ �� ���!"��� � ��� #���

��������� ���� $������ %�� &�' (����#��� ����)� *� �#+�

,�����*�� ��� � ��� #���

��,�*�*�� -�� (�.�#��/ (����#��� 0�����! 1��-� �* "&

,�������� �)����2$)����%��"23 ��"!� ����)�� 4*�5*�5�6 *�� "&

������**� 7�)���� 4���6/ (����#��� 0�����! 1��-� ��� "&

��������� 1�!�����/ (����#��� 0�����! 1��-� ��� "&

,�*������ 7�)��)��"��� �* "&

*�8�8���� ���+� �� ���� &�--�� 4������+�6 ,���

,�*�����, ����� � � �����

,�,����,� ��� ��7 ��� "&

,�����*8� 8� &��-��� 0#%%�� ������ �!� � "&�,

,�������� 7�)�-�#" 0��"�-� ���#���� �� "&

,�8������ �� �����- �����/ ��������-/ ������� ��� "&

Page 13: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

�������� ��� ���� �� ��� ������������

←←

(1) Preparation of Tester ss cDNA

Amplified cDNA Library (16 cycles : 10 ng) : 100 LPhenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 L

14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.

Sup.

Sample 1 (1 ng)

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 L

←←←

14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.

ppt.

70% Ethanol 150 L←

14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.

ppt.Air-dryDistilled water 44 L10 Lambda Exonuclease Buffer 5 LLambda Exonuclease 1 LVortexIncubate at 37 30 min.Incubate at 80 15 min.Distilled water 50 L

←←←

Removal of low-molecular-weight DNA

700 g, 5 min. R.T.

filtrateMeasure at OD260 nm

Tester ss cDNA (1 ng/ L)

(2) Preparation of Driver ds cDNA

Amplified cDNA Library (16 cycles : 10 ng) : 100 L

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex

←←←

14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.

Sup.

14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.

ppt.

70% Ethanol 150 L←

14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.

ppt.Air-dryDistilled water 44 L

Vortex

Vortex

← Phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 LVortex

Page 14: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

(4) Digestion of the hybrid ds cDNA by Duplex-specific nuclease

Sample 2 (1 ng)Measure at OD260 nm

Driver ds cDNA (100 ng/ L)

(3) Hybridization

Tester ss cDNA (1 ng) 1 LDriver ds cDNA (200 ng) 2 L

Mix

4 Hybridization Buffer 1 L

Heat at 98 for 2 min.

Hybridization at 68 for 16-20 hr.

Hybridization solution at 68 4 L

2 Duplex-specific nuclease Buffer 5 L68 , 10 min.Duplex-specific nuclease 1 L68 , 30 min.Stop Solution 10 L68 , 5 min.Distilled water 80 LPhenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 L

14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.

Sup.Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.

ppt.

70% Ethanol 150 L

14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.

ppt.Air-dry

Distilled water 31 L

DNA amplification step

Vortex

Removal of low-molecular-weight DNA.

700 g, 5 min. R.T.10 M Buffer 5 LRsa 1 LIncubate at 37 2 hours.Incubate at 80 20 min.Distilled water 50 L.Phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.

Sup.Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.

ppt.

70% Ethanol 150 L

14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.

ppt.Air-dryDistilled water 10 L

Page 15: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

(5) Amplification of Subtracted cDNA

Amplified Subtracted cDNAPhenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.

Sup.

Sample 3 (1 ng)

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.

ppt.

70% Ethanol 150 L

14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.

ppt.

Air-dry

Distilled water 44 L

700 g, 5 min. R.T.

filtrateMeasure at OD260 nm

(6) Removal of the residual ss cDNA by Exonuclease I

Amplified subtracted cDNA : 44 L10 Exonuclease I Buffer 5 LExonuclease 1 LVortexIncubate at 37 30 min.Incubate at 70 15 min.Distilled water 50 L

Removal of low-molecular-weight DNA

(7) Check of Subtracted cDNA (human cDNA)

Amplification of Sample 1, Sample2, Sample3

Agarose gel electrophoresis (1% agarose in TAE)

Subtracted ds cDNA

���� ���� ��� �� ����������� �������� �������� ������ �������� ��� ��������� ���

��������� � ��������� � ���

������ � ������������!��

�""��##$$$%$������%��%&�

���� ��� ��� ���� �� ����� '���$��( )�(

)�����(� *+ � � �

,%-%+%

��������� � ���������������

������ � �������������!�

�""��##$$$%$����%��

���� ��� ��� ���� �..�/�"/��� ��

������� 0����

1�/�2

��������� � ��!��� �� ����

������ � ��!��� �� �����

�""��##$$$%$����������%(�

Page 16: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10
Page 17: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

�������� �����

� ������

���� �� �� ����

������

���� ���� ������ � �� ���

�� � ���

���� ����������������������������

�� ������������������������������

���� �� � �������� ��� ��������� �����������

����� ���������������������������

� � �����������������������������

����������� ���������������������

���� ����������������������������

�� ������� ���������������������

�� ������ �� ����� ������������������

�� ������ �� ����� ������������������

�� !�����"����� ���������������������#

#� � �$�%&����'� � $�����������������

�������������������������#

(� � ������� ������� ��������������#

�� )%�� $������������������ �������(

�� � ������� ������������� ��������(

�&�� ���� ������ ��������������(

�&�� ���� �����������������������

���� ����������������������������

�������� �����������������������

���� ����������������������������

������� �������������������������

������

��������������������������������

���������� ����������������������

�������� ����������������������

��������������������� ���������

� ������������������������������

�������������������������������

*�����!�������� ���������������+,��

������!�"������ ������#�$���%&�

���� -� �$�%&����'� ����� ��.������/ �� � �������� ��� ������

�� *�����!� ��������!�"������ ����� �����

����������'���������!�"������ ����� ���

������ ����������������%�������

���� !������ �$�%&����'� � $������( �������

����������(������ ���)%�� $�������( �

���������� ���������� �����������

���������'$��������������������

����������� ��������������� ����������

�� ������������ ��������������

��������������� �� � �������� ��� ��������

*�����!�������� ������������������)�

��������������

Page 18: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

�� ��

� ������ ����������������������������

������ ���������� ������������������

��

� ��� ��� �����������

������ ��� ��������� ��� ��������������

���������������������� ���� �����������

������������������ �������������������

��� ��������������

� ��������������������������

������� �������������� � �� ������������������

��������������������������

� ����� ������!�� ����� ����������"�� ����������

������

��� �����"�� �������������������

���������������������������� ���� ����

��������

� ���� �����������

��������������!������������"#��

�����

� ������ $���������"����������� ���� ���

��������

����� ���� ������ � �� ��� ������

Tester ss cDNA(1 Driver ds cDNA(2 )cDNA

DNA

cDNAP23

cDNAPCR

(Rsa )

P24

Tester ss cDNA Driver ds cDNA

P25

cDNADNA

cDNAP25

P25

xonuclease I

P26

Tester ss cDNA Driver ds cDNA

Tester ss cDNATester cDNA

PCR

ss cDNA ss cDNA

Subtracted ds cDNA

Tester ss cDNA DNA

Lambda Exonuclease

Page 19: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

’’

’ ’

Lambda Exonuclease

’’

’ ’

’’

’ ’

Rsa I

’’

’ ’

’ ’

’ ’

’ ’

’ ’

’ ’

Duplex-specific nuclease

Page 20: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

’ ’

’ ’

’ ’

DNA

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

Exonuclease I

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

’’

’ ’

Subtracted ds cDNA

Cloning

Page 21: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

�������

�����

��� ����� �� ������� ��� � ��

��� �������� �� ������� ������ ���� � ��

��� ������������� ������ ���� � ��

��� �� ���!� ������ ������� ��� � ��

��� ���� ���!� ������ ������� ������ ���� � ��

�"� �� �������� ��� � ��

�#� ����� �������������� ���� � ��

�$� �%��%� ���� ���� � ��

�&� '�� '������ ���� � ��

���� � ���(� '���� )������* � �+� ����� � ��

�� ��

�������������������������������

���� , ��� ����� �� ������� ��� �������� �� ������� ������

��� ������������� ������ ��� �� ���!� ������ �������

��� ���� ���!� ������ ������� ������ �"� �� ��������

�#� ����� ��������������

����� , �$� �%��%� ���� �&� '�� '������ ���� ����(� '���� )������

�������������

� ��

�� -����������.�� ��/)�����/) �������

�� -����������.�� ��/)���0�����

�� ������������0������1)0��*�!���� ��

�� �/)�����

�����������/)���������������

��2�����������������2������ '��������

-303-)4 �/) ����������������-303-)4 �/)

�����������15�������������������

�������������������������

�� /-0 6���������� ����(� )-0* --0* 5-0* 1-0�

"� ��� ���������&�!�������������/)�

�0�����������

���� � �����������������������

��

#� �������� ����$!���&�

$� ������ �������������������������

&� #�7�&&+�7����

��� �/) �������

��� �����

��� ����� �

��� ��-) ������

��� ���� 8 ������

��� �����

� ��

�"� 059 �!�"

�#� �� ����!�"

�$� �� ��#��

�&� �#����$

Page 22: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

��� ���������

��� ������

��� ���������������� �� �����������

��� �������� ��������� ������

��� ����������� ����

��������������������������

��� �������� ���������

��� ��������

������

�� �����������������

� ������������� �������������������� ��

����� ����� ����������� ����

� ��� ��������� ���������!��"# $�����������

����� ���������������

� $������������������ ������������������

�� �������������� ��������$�����������%

���������$�������� ��������$������

���������"� &'#�(�)���������������� ��

����������� ���������������� �����

������ ��������$������������������� ��

��������$�������� ����������������

����*���*������ ���

Primer 3

P-5TesterPrimer 15' 3' 3'

Primer 4

Primer 2

Driver 5' 3' 3' 5'

'

� $�����+$�,���$�-&��������������

� ����.(�������" ������������ ����$������

�� ����-�$�+��/������!���������� ���

���������

� ������ ���������� �� ��������������������

������ $#)����������������" �#�

��" #��������������������" ����

�����������������������������

� ������ ���������� �� ������������������$

�����������

� ������������� ��%��

� �� ��������������� ���$���� ��������

���.(�������" �������� ����� ����������

�����������������

� ������������������ ��%��0�"�)��� .��/

�������$���1 ��� #)�������������������

����������$���1 ��� $#)����������� ����

����������������������&�'$,!��

��������� ��� �����

Page 23: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

�� ������ �� �����

� ���� ��������������������������

���� ������� ��� ����

�������������� ������ ���� � ������ �� �� ! ��

� ������ "�#$% !��

$����� �������& � �� !��

$����� ��!'����& � �� !��

#($(#�) ��� $�����%���� �*+ �� ���������� ������� ,��

������� � ��

$����� ��� $����� ��������������������

����- ���������� ����������- ���+ .��/

��"�� 0�1��%� $��������������

� !�� $ 0���� �� �����������

� �����������������

2!� ���

2!� � ��

! �� � + �� ��� ����%

3�� ���

3�� !��

� ����������������������� ��������

� ������ ��� ������ � �� ��!*�,*��

�����������

� �,& �����4&4 ����+�������������

� ����������������5��������� ����+�����

6�"��� ������ � ���� �227!8���� �! �������

������

� �,& �����4&4 ����!�����������

�! ���3 8���� �����������,,�����

����������

!���� ����" 59������%� ��������������" 59�/

�����%���������� $ 0���� ������� ��

���+3��+ �������������

� 4 ���! ��������������" 59������%������

���

� ������������������! ����������

������ �������

�������������������� $�����������

���������

� �����3 ���!�������������

� ���������(��� ��������������

6���� � �� ���

�����������������������(��� ��+3������

����������

�� ��������������������

������������������ �����������

������

Page 24: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

�� ������ � ������

� ���� ��������������������������������� ����� �� ��� ����

�������������� ������ ���� � ������ �� �� ! ��

� ������ "�#$% !��

$����� &' � �� !��

$����� (' � �� !��

#)$)#�* ��� $�����%���� �+& �� ���������� ������� (��

�������� � ��

$����� &�$����� (���������� ��������

���, ���������� �����������, ���& -����"

�.�/��%� $��������������������/�� �����

#�%��� ������������ ����������#�%���

��������$��������������� ���/�� �����

���$��������������

� !�� $ .���� � ���� ������

� ������������������

0!� ���

0!� � ��

! �� � & �� ��� ����%

1�� ���

1�� !��

� ��������� ����$ .���� ���������

������ ��� ������ � �� ��!+�(+��

�����������

� �(' ��� ��2'2 ����&��������������

� ������������ ���3��������� ����& �����

4�"��� ������ � ����005!6���� �! �������

������

� �(' ��� ��2'2 ����!��������������

�! ���1 6���� ����������((��������

������

�������������������$�����������

��������

� ������1 ���!��������������

� � �� �������!������ ���������������&1���

�������������

2 ��� �����������������������

� �����! ��������� �� ����

� � ������ ��� ������ � ��

�!+�(+������������

� �(' ��� ��2'2 ����&��������������

� ������������ ���3��������� ����& �����

4�"��� ������ � ���005!6���� �! ��������

�����

� �(' ��� ��2'2 ����!��������������

� 1 6���� ����������� �������� ���

���

� ���������)��� ���������������

4���� � �� ���

�������������������������)��� ��! ������

����������

Page 25: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

� ��� ���������������������

����������������������������

�� �

�� ����������

� ������ ����� ����� �� ��� �� �������������� ����� ���� ������������������������� !""���������

����

����� �� ��� # ������ �� ��� � � # ���

� $%����������&%���&�������������

����������� ��� ���������������

�� ��������������� ����������������������������

���

� ��������������������������&%���������&%�����������!'(�)*�'���"�� �!�(���� !""���+�����

������ ���&%�����������������

����� ��� ������������������

���������������� �

� �����!'(�)*�'���"�� �!�(���������&%��,�������

�������

� �����-��' -�(!��������&%��+�������������

� %��������������������������

� ��������������������� ���!����+#��#�������������

� ��.��� �'/ ��%.%������,��������������

����������������0�1��1��/��� ����, /�(��-���!/ ������ ��������$$2+3������+��������

������

��.��� �'/ ��%.%������+��������������

� �+����4�3������������ ��,���������

�������

���������������������������

���� �

�� ��������� ����������

� -!�������� ������������

-!�������� ��������+*�� ,�����/'(�"������� !""�� 5��1 & //�(�� 6��(� +�����//�(�� �� � +����/�� �. ���6 +����/�� �. ���6 +�� 77 8 �� �(�/���������#, �� ����(!���� �!""��� ���

�� �����

��/�� ������/�� �������� ����� ���������

�� ��/�������� �����/�� ����'��/�� �� �

����/������!����"#����/����������

���������+9 $��������$�

Page 26: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

� ��� ������� ��������������

� ��������������

��� ������ ��������� ��� �� ��� ����� ������ ���

� ���������������������������������

���������� ���������������������

��������

� ������ ��� �������������������������

� ����������������� !"�!#$�" � �����% &�'%(#)� ��� " � ����������*�+���������� ��

������

� ������ ��� ��������������������������

� ��������+ ������������������������

�������

�� ������������������ �����

���� ������� ���� ��� � �,%$)� �"��� -)..������ ��,%$)� �"���� �������� ������� �����

�����������������

� ������������������,%$)� �"����������

� ��������������� ��������#��������

�������

� ���������������������������

� ��������/��� $�������������

'"�� � �� $��

������������������$�&����/���������&���

���������

�� ��������� � ��������������

����')0 �"� �( ����������������������

����� �����!������1���2� �3"� #$������

�������

����������������

�"�#��4�� �� ������������4�� �� �� �����'"�� �

����"�#���#5�� ��������������#5�� (� ����

�'"�� � �������"�#��')0 �"� �( ���� �'"�� � ���

���� $������1���2��3"� #$����������

��4�� ���������������������������

��������� ��������

���� �� $�� '"�� � ���� ���

����� #.#�" #%$ -)..�� 6# ! ��% &� 7�� � ����

����% &� (�4�� ���

'�$�� ��#���� ���7 ���

�$ #��$�� ��#���� ���7 ���

4/�/4�8 ��� �% ����"������� #$ ���# ) #%$ -)..��� ���

�������� ����

�������������� �����!������

1���2��3"� #$!�"��'�$�� ��#�������$ #��$��

��#�����������

Page 27: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

��� ���

��� ����

������ ���� ��� ����

��� ��

��� ���

� ����� ���� ���������� �����������

������������������������

��������

� ����������������� ��������

������������������������� ���� �!"�#�"$%& '$"

(#)%�� ��� ������� �������������

������*�������������������� ��+*��

��� �� �!"�#�", ��������� ����

���� �������"� �� �������������������$-� ,�

��������� �!"�#�", ���������� &���������

������������������������

HepG2 cDNA cDNA

GAPDH GAPDH 100bp SL

1,500bp

1,000bp

1%

GAPDH glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase

Subtracted cDNA

Agarose S

AFP : alpha-fetoprotein

GAPDH : glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

931bp859bp

AFP AFP GAPDH AFP

������������������*�������� ������

�������������������������� �!"�#�",

��������������������������������

�+*�������� ������������������ �!"�#�",

������ ������ ���������������������

����������������� ����� �!"�#�", ����

������������������!����� �������

���

������

./�$,%-0 *� ��0 �%�,#&%-#0 �� ��0 /�/�%-0 �� �0 1#�&�0 �� ��0

'/#��)%-0 �� ��0 '%2/��#)%0 1� ��0 3#"20 3� 1�0 3�/)-$"�/0 ��0 3%4

�%20 �� ��0 ��)�#&%-0 � �� #&, /#�$&0 �� ��0 ������� ���� ��0 �� 5 �� 6�7 8

��� 6���97

�����������

���������"�����#������������

����������� ���� �!"�#�"$%& '$"(#)%���������

Page 28: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

����

���� ��� � � � �

���� � ������� ��� ���������� � �����

������ � �� ������� !�� "�# $���%���� &��'(� ) ��*��

+�� )�� ��� � � �����

+)�)�� ���� $�,���� -�� ����."/0 $���%���� 1����'� 2���� �) �"

+��� ��� �(����.�(����!���.3������ ��%�(�� -)�4)4�/ )� �"

� �))� 5�(���� -����/0 $���%���� 1����'� 2���� � �"

� �� 2��%����0 $���%���� 1����'� 2���� � �"

+�) ���� 5�(�%(������ �) �"

)�66�� � � * ��� ��� "����� - �����7* / + �'

+�) ���+ �'����� � � �'

+�+� +� � � ��5 � �"

+�� )6� 6� "�����' 1�!!�� ��� �� ��� � �"�+

+��� �� 5�(����� 1������ �������� � �"

+�6� � � ��������� &����0 ������8��0 ������� � �"

Page 29: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

������������

cDNA Library (10 ng) DNA (16 cycles) : 100 L

(25:24:1) 100

44 L

50 L

OD260 nm

(1) Tester ss cDNA

14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 570% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2

10 Lambda Exonuclease Buffer 5 L

Lambda Exonuclease 1 L

37 3080 15

Vortex

DNA/Primer

700 g, 5

(1 ng/ L) Sample 1 (1ng)

(2) Driver ds cDNAcDNA Library (10 ng) DNA (16 cycles) : 100 L

(25:24:1) 100

14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex

44 L

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5

70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2

Page 30: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

OD260 nm

(100 ng/ L)

98 , 2

80 L

(25:24:1) 100 L

cDNAcDNA

Sample 2 (1ng)

(3) Hybridization

Tester ss cDNA (1 ng) 1 LDriver ds cDNA (200 ng) 2 L

4 Hybridization Buffer 1 L

68 16 20

(4) Duplex-specific nuclease

Hybridization (68 ) : 4 L

2 Duplex-specific nuclease Buffer 5 L

68 , 10

Duplex-specific nuclease 1 L

68 , 30

Stop Solution 10 L

68 , 5

14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex

31 L

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5

70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2

DNA

DNA/Primer

700 g, 510 M Buffer 5 LRsa 1 L37 , 280 , 20

50 L

(25:24:1) 100 LVortex

14,000 rpm (18,800 g), 3

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5

70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2

10 L

Page 31: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

� ������

(5) Subtracted cDNA DNASubtracted cDNA DNA (35 cycles)

(25:24:1) 100 L

14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex

44 L

Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5

70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2

(6) Exonuclease I cDNA

DNA Subtracted cDNA 44 L

50 L

10 Exonuclease I Buffer 5 L

Exonuclease I 1 L

37 3070 15

Vortex

DNA/Primer

OD260 nm

700 g, 5

(7) Subtracted ds cDNA ( )

Tester ss cDNA (Sample 1), Driver ds cDNA (Sample 2),Subtracted ds cDNA (Sample 3) 1 ng DNA (GAPDH, -actin )

Sample 3 (1ng)Subtracted ds cDNA

Page 32: Laboratory Chemicals-FUJIFILM Wako Chemicals …...Hybridization at 68ù for 16-20 hr. Hybridization solution at 68ù0Á0Û0Á4 ôL 2jDuplex-specific nuclease Buffer 5 ôL 68ù, 10

S T U V W X Y Z [ \

�������