laboratory chemicals-fujifilm wako chemicals …...hybridization at 68ù for 16-20 hr. hybridization...
TRANSCRIPT
�������� �����
� ���� �
���� ������ � �����
���� ��� ���������
������� ������� ������
���� ��� �� ��� ��� �� ����
� ����� �� ���� �� �
�� ����������������������������������
�
�� � ���� ���������������������������
�
�� �� �� � �� �� ���� ��� ��������� �� ���� ��� ��� ��
�
�� �� ��� ��� �� �� �� ���������������������
�� �����! ���������������������������
�� �������" #�� ��"� $ %�� �����������������
�� ���� ��� ��������� �� ���� ��� ��� ���������
&
�� �'������� ����'����������������������
&
�� (� ������� �� � �� � �� �����������������
)
*� (� ������� �� ��� � �� �����������������
+
,� -.���/��������������������������
0
� $ '���" �� �.��� �� ��� �. ���" 12�� � ��" �� ���
0
&� �'�"����� �� ������� � ���������������
�3
)� $ '���" �� � '���! �� ��� �. 41���" �� � ������3
+� 5� � �� ������� � ��� 6 �!� -�'�� ���� 7������
��
+2��4��"����� ���! �����" ! � �������������
��
+2��$ ��"�������������������������
��
�� $ � � � �������������������������
��
� 8 �� ��������������������������
��
� $ "�� � (����������������������������
��
��� ��1 6�"�� 5���� �� �� 41� �' ���7����������
�*
�� ���������������� �.���/���� ' ���� � � ��� ���" � ��%� ���� ���" �
�� � ���. �� ���' �� �� ! � � ���� �� �� ��"". 1�� �� � � ��
���� �� "" �.� �� �� � �� � ���! � �"����!� � � ��" ' ����� ��
� ���� � ���" ���9 ��������" ��� ��� � ��� � ��� � � ��" ��������
��� �� "����2�� ��� 9 �' 2����'�! ��� � ���"". � '����!�
4� � � �'' ��"". ���"��" ��������� �� � %�� � � � ��" ������ ��
�.���/���� ��� ��� � ����� , ��.�� 4�� �"". � ��� �� �� ��� � �� �
��� ��� � ���� ���' '$�� � �. �' � ��� �� �� ��"� � ��
�� � %� � � � �� � ���' �� � ����
���� ��� ��������� �� ���� � �� 1 "" �� ' ���� ��� � ��
::���" 12�� � �� � �! ����;; 6����79 ��� �� ��' � ��������"
��������� ' ������ �� �� � �� �� ���� ��� ��������� ' �����
� �� � �� � �� �!�� �� ����9 � �� � ��� ��� � ��� �� �� ��� �
���' ��� 8����. ���' �� ��� �.� � �� ���� � �� ""� � �! �'2
��� �� ��� � �.���/����9 �� �.��� �� ��� ���' � �� � ��� ��� �
���� �� �! �� � �. ���" 12�� � ��" �� � ���"".9 �� � '���!
�� ��� �� � '�� � �. 41���" �� ������� ��. ��.��" � ����2
���� ��� ' ���� �� ��". ���" � �� ��� �� ! � � ���� �� ��"".
1�� �� � � � �� � ���9 ��� � ��". ���2��. �����
� ���� �
�� ��������
� �������� � �� ��� ��� ���� ���� �� ��������
������ ��� ��� �� ��� � �������� � �� ��������� � �� �����
� ���� ���� �� ���������� ������
� �� � ���������� ��������� ��� ������� ��� � �� ������� ���
������� ��� ����������� ������ ��� ������ ���� ��� �� ������ ����
����� �� � ���� ��� ������� ������� � � ����
� ���� ����������� �� ������ ��� �����
���� ���� � �� �������� � � ��� ��� � ����� �������� ��� ��������
�� � !��� �"������ ���� �# $%&� ���� � ��� "����������
���� ��
� ���������� �� ���� !�������� �������� ��� " ���������
����������
���� '�� � �� � � ��(���� �������� �������� � � � ��� ���� �� ���
��� ������ �� ����
� ���� ������������
�� �� ������ ��� �� ���� ���� ��� � � &� ��� ���
� ��� ���� �����������
�� ������ #� $������� �� ��� � � �� ��������� %�� &�'�
���������
PrepPreparation aration of Tof Testerster ss ss cDNA cDNA PrepPreparation aration of Driver dof Driver ds cDNA cDNA
Step VII-2 ( ) Step VII-3( )
HybriHybridizization of Tation of Tester ss cDNAster ss cDNA an and Driver ds cDNAd Driver ds cDNA
Step VII-4( )
Digestion ofDigestion of hybrid ds cDNA hybrid ds cDNA
Step VII-5( )
AmAmplification of residual Tplification of residual Tester ss cDNA ster ss cDNA
Step VII-6( )
Digestion Digestion of of residuresidual ss cDNAal ss cDNA
Step VII-7( )
Subtracted cDNA Subtracted cDNA
Your cDNA library is
amplified with one-side 5'-
phosphorylated primer. The
tester ds cDNA is digested by
Lambda Exonuclease to obtain
ss cDNA for tester.
Your cDNA library is amplified
and digested by Rsa restriction
endonuclease to obtain Driver ds
cDNA.
Hybridize with Tester ss cDNA and excess amount of Driver ds cDNAs
Digest hybrid ds cDNA by duplex-specific nuclease
Amplify Tester ss cDNA with the same primer set which is used
in preparing for Tester ds cDNAs.
Digest remaining ss cDNAs by Exonuclease I
p7 p8
p9
p9
p9
p10
� ���� �
’’
’ ’
Lambda Exonuclease
’
’
’
’
’’
’ ’
’
’
’
’
’’
’ ’
’
’
’
’
Endonuclease Rsa I
’’
’ ’
’
’
’
’
’ ’
’ ’
’
’
’
’
’
’
’
’
Denature and hybridization
’ ’
’ ’
’ ’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
Duplex-specific nuclease
� ���� �
’
’ ’
’ ’
’ ’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
DNA amplification
’’
’ ’
’’
’ ’
’’
’ ’
’
’
’
’
’
’
’
’
Exonuclease I
’
’
’
’
’
’
’
’’
’ ’
’’
’ ’
’’
’ ’
Purification
’’
’ ’
’’
’ ’
’’
’ ’
Subtracted ds cDNA
Cloning
� ���� �
�� ��� ������� � ��� ���
�� ��������
� � ������ ��������� ��� � ����
��� �������� ��������� ������ ���� � ����
��� ������������� ������ ���� � ����
��� �� ���!� ������ ������� ��� � ����
��� ���� ���!� ������ ������� ������ ���� � ����
�"� ���������� ��� � ����
�#� ������������������ ���� � ����
�$� ��%��%����� ���� � ����
�&� '� '���� ���� � ����
� �� � ��(� '���� )������* � �+� ����� � ����
�� ������
,%�� -�� �� ����� �� ���� �� ����.���� ���!���+ )���� ��/*
����� -�� �%� �� ��� � �%� -�� ���� �%� ���0�/ ���������+
����
� � ������ ���������
��� �������� ��������� ������
��� ������������� ������
��� �� ���!� ������ �������
��� ���� ���!� ������ ������� ������
�"� ����������
�#� ������������������
� � ��
�$� ��%��%�����
�&� '� '����
� �� � ��(� '���� )������
�� ���������� �������� ��������������� �
� ��1) ��������� �� ������ �� ���.�� ��1)
�� 2������ �� ������ �� ���.�� ��1)
�� 2������ �� ���� /��� ��+/+ 3)2��*�!�����
�� ����� �� �1) �� ��������
�� �1,2 4������ � � ���(� �),2* �,,2* �5,2* �3,2 ���%�
"� ' � 5����� �� �0 4������� 6��/%� � &�! ��� �* 3��!��������
� � ����
#� 7�������� ��������� ���� �� �� $!���& �
$� 2%��(5%�����(8����� )��%� ���9��9 .�(.��
&� #�:* &&+�: ��%��
�� �1) ���� ������� ���-��
� )/����
�� ��%����� ������
�� �,)� ������
�� ����/ ������
�� '������ ��������� 0����
� ���� �
�������� �
��� ��� ��
��� � ������� ��� ��
��� � ���� ��
��� � �� � �
��� ����� � ��
��� ������ � ���
��� ! �� "�# � ������� ��� $��� � �%&'�� ���& ��&��� � ��
�(� )�* "�# ���� ���$��� �+� ��� � �& "* �� �����
�%� ,������������� $-.��� ���
�'� !�� ���/ $(�0����
��� � � �� ���������" " ��������"
�� � �� ��������� �� ����������� ������� ����������
� 1� �� �.23 � ��� ��� �"��& �"��# �.23" "����# ��+ ��
"�� �� ���� �� ��� �"� �� +����4
� ��� �� ��" ��� �� ������� �� �� �"�� ��# #� +� �.23" ��
#" ��# ���� ��, �� �� +���� �� �� ������� �� �#����� " �
�� �.23"4 1� "����# ��� �# ���� �� �� �� �� ��" ��� �"��
�.23 " ���"���� ���# �� �� '50��� ��� ��� ����� �� " ���0
"����## �.23 ���� #���0"����## ��� ���#���"4 6�� ��
�" �� #� +� �.23 ��# �"�� �.23 � ��� *� �� *� ����#
��� "�� +����& � "����# ��� �# ���� ��� �� ��" ��� ��0
�� � ��� �� �� #� +� �.23 *� #" ��# � �" # �� ��" ��
��� �� ��" ��� ���� � ��� �� �� �"�� �.234
� ��� � # �� ��" ������������� �� ������ ��� �+� ���
�" �" �� #����� �� ��� ��� ��� # �� ���������" " * ��
� + "�� "������ �"���"4
Primer 3
P-5TesterPrimer 15' 3' 3'
Primer 4
Primer 2
Driver 5' 3' 3' 5'
'
� ������� �� �� �� �� �� "� ��� ������� ��" " �"��� �� +���0
�� �� "������# �.23"4
� 1� �� �" � �����0"��� ��� ���"& * ������# �-�-0
�37 .23 ��� ���"& *� �� " � �� � #� � ��# �����0"���
�8 � * �� �� � ��0 � 99��� "����55 �����"4 �� �����* ��
����#��" �� ��� � 8# * �� �-�-�37 .23 ��� ���"4
� �� ������ �� �� ���� � # .23 ���#��� #��#" �� � ��� 0
���" ��# � ������ � ��� �"#4 3+� # �+� ���� � ��� �� ���0
� �� ��� � "������ ��4
� �"�� �� �� �#������"" �� ��� ����� �# � �� " / �4
� ��� ��" �� ,� � ����� �� :�0� ����� �� "� � ������ �� �0
;� �# ��� ���+�� �� �� ��" ��# "���� .23 �������" ��*
��� � � �� "������ �� ����""4
1� �� " ��������& * ����� �� ��� ���" ��� � ���� �� �" ��
"���� �� .23 ���� � ��� �� ����#"4
� ���� �
�� ��������� � ����� �� ����
� �� � ������ ���� �� �� ��� ������� ������
���� ������� ��� ������ ��� ��� ����
�� !��������� "���� ���� # �$� %�& '���
�� �$� ��()� '��
)�� �� � ����* ������������� ���% '��
)�� �� �'+*!���!����������� ���% '��
(,),(�- ��� )�� ����� ������ ��. �� �������� "����� /��
������� ����� �� �����
)�� �� � ��� )�� �� ��0���� ��!��� �� 1����� ��0����2 ��
��� 1����� ��� ����������� ��� ���� ������� ���� ��� !3& 1��*
���� �� ��� !3&$%�. 4������ ��� 5�1���� )�� ��2
� ���!���� ��� �� ��� �������� ������ ���� ���� �� ' )&5*���� 2
� � !��� ��� ����� ���� ��� ������������ ��������� ��� !��*
���6����� �� �� ��� �� !������� ����� ����2 (���� �� �� ���
������ ��� ��� ��������� ���� ��� �� ����*���� �2 �
����2
7'� ��2
7'� � ���2
'��#�� .� ���2 ��# �����
8 � ��2
8 � ' ��2
� &���� ���� �������� ����� �� � ������������� ���2 ��� ���
�� �� !���� � �������� ����� � ����� � '� /�� 1�$1�� ���
�� �� 1�����2
� &�������� �� �/���� �! ��9�9����� ��� . ����� �� ��� �� *
!������2
� (������� ��� �!�������� �� � ��� ��� ��� ��� ��� �� :�������*
���� ���� �� . �$� ;��� ������� ��� '��� �� 772'<
������2 %�� �� 1�����2
� &�������� �� �/���� �! ��9�9����� ��� ' ����� �� ��� �� *
!������2
5���� ��� !��� ���� �'��� �� 8�< ������ �� ��� �� !���*
���2 5� �1� ��� �!�������� ��� ��� ��� !��� �� ��� �� ���
���2 �����1� ��� !��� �� //�� �� ������� �����2
��� '�� �� ����� ��� :�������� "���� ��� ��� �� �� �*
�� :�������� ��� �� �����2 (������� �� ��� ��� )&5 ���
��� ������� ��� .� ����� �� .8�2
� ������� ��� �' ����� �� 9�� �� ������1��� ��� �� ��� :�*
�������2
� (������� �� ��� ��� ������������� ��� ��� ��=�� ��� ����
1� � �� ����� ���� '��� �� ������� �����2
���� �� ��� �� !� �� ;!�� &����� �� ��� ��*��������� �!��
�� � ��� �� �1� �� ��* �����*������ ���2
� &�������� �� 8���� ��� ' ����� �� ��� �� !������2
� %����� ��� ,� #� �� � ������ �� ��� ��� ���� ;!�����!���� *
���� �� ������ ��� ������������� �� ��� (����� �� ����2
��� ������������� ���$��� � ,� #� 1�� �.8��$ ��������
�,� #� � .8�� ����� ������ ���$ �
� ���� �
� ������� � ��� �� ����� �� ���� ���� ��������� ������
�
������ � �� ���
�� ��� ������������� �� ����� �� ���� �� ��� �� ������ ��
��������� ��� ������������� !" ������� ��������������
�� ��������� � ���� �� � ��
� �� � ������� ��!� ��# �� ��� ��������� �����$
���� �!���" ��� ��% ��� ���
&�������������� '����� ���� ( ���� )�*�& +%�
�% ���� �� �� +�
������ , �%�) +�
������ - �%�) +�
.�. �/ ��� ���"������ �������� �$, �� ���������� '������ -�
��������� ����� �� �%%�
������ , ��� ������ - ��0����� ������ �� 1����� ��0������ ��
"��� 1����� ��� ����������� ��� ���� �!���" ����� ��� �2*
1����� ��� ��� �2*)�, 3������ ��� 4�1���� ������� 5���
"�� ��� ��� ���1�� ���� ��� ������ ���� ��!���" ����� ����
������ ���� ���� 1����� �� ������ !� ������� ���� �*4 ������� ���
������������� �� ���1�� ���� ���� �������� �� ������ ������� ��
�*4 ������� ��� ������������� �� ������ �����
� �������� &%� �� ��� �������� �������� ���� ���� �� + �*4 ��!�� �
� ������" ��� ����� ����� ��� ������������ ��������� ��� ���"6
����7����� ����� ��� ������������ ������ !����� ���� ����� ���
�����!�� ��� &%� ��������� �����!��� �� ����6������ %�& �
��!���
8+� & ����
8+� &% ����
+%�(%� ,% ���� ��( �"����
9&� & ����
9&� + ����
� ��� �%%� �� ������$����������$�����"� ������� �&+$&-$�
1��1��� ��� ��# !" 1����#�
� *��������� �� �- %%% ��� ��: :%%��� ��� , ������� �� ���� ���6
���������
� ������� ��� ����������� �� � ��� ��!� ��� ��� �� �� ;���6
�������� �%� �� ,��� ������ ������� ��� &+%� �� 88�+<
�������� )�# !" 1����#�
*��������� �� �- %%% ��� ��: :%%��� ��� + ������� �� ���� ���6
���������
4���� ��� ������ ���� �+%� �� 9%< ������� �� ���� �������6
����� 4���1� ��� ����������� ��� ����� ��� ������ �� ��" �� ���
���� ������1� ��� ������ �� --� �� ��������� ������
� ��� �� ��� ������ �� ���� *������ �� ��� ���6���������� ����
������ ��� ����1�� �� ���6���������6������ ����
� *��������� �� 9%%�� ��� + ������� �� ���� ������������
��� +� �� �%�) '����� ��� �� �� ����� )�# �����" ��� ��6
��!��� ��� & ����� �� ,9��
� ������1��� ��� ��� ����������� ������������ ��� &% ������� �� :%��
� ���� �
� ������ ��� ��� ��� � � ����� ���� ��������� �����
� ��� ����� � ������������ ��� �� ���� ��������
����� �! "� ����!�
� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� ' ������ � � �� (
��������
� )������ ��� ��������� � ��� ��"� �� �� ��� � *������(
��% ���� � ' ��� +��� ������ �� ����� � ,,��-
������ .�! "� ����!�
� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� ' ������ � � �� (
��������
� /���� ��� ������ ���� ����� � 0�- ����� � � �� ���(
����� /� �� ��� ��������� �� ��� ��� ������ � ��� �� ���
��� 1������ ��� ������ �� ���� � ��������� �����
� .����� ��� 21�3� � ������� � ��� 14� ���� +�������� (
���� � ������� ��� ���������� � ��� 1����� �� �14��
14� ���������� ��$��� � 21�3� ��������$� �� �������
�21�3� � ���$ ��"�� ����� 14�� ��
� 5����� ��� �$��� � 1����� �� �14� ���� ��������� �����
�
+ ��� � �� �$
6� 14� ���������� � 1����� �� �14� �� �� �� ���% ��
��� ��� 14� ���������� "� ����� ������������
�� ����������
��� ��� � )����� �� �14� �� �$ % ��� � 1����� �� �14� ����
�$ �� ��� � ��7�"����8��� 9����� � 5#/ ��"� � .�!
$������
������ �� ��� ������ � ��� � � ���
6���"�� �� � ������ � ,&� �� ��"����8� �� �3(�� ���� �
3&��
�� ������ �� ������ �� ���� �� ��������������� ������
��� ��� � �������� ��1����!(�������� ������� 9����� � 3&
� � 7�"����8��� ������ �3&� �� +��� �� .�! $����� �� ��(
��"�� �� �� ������ � 3&��
��� ��� � 1����!(�������� ������� �� ����"�� �� '�
������ � 3&��
� ��� ���� � +�� +����� �� ����"�� �� � ������ � 3&��
������ ��� ��� ��� � � ����� ���� &��� � ��������� �����
� ��� ����� � ����� � ������ � �� �� ���� ��������
����� �� �! ���� ����!�
� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� ' ������ � � �� (
��������
� )������ � ��� ��������� � ����� ��"� �� �� ��� �
*������ ��% ���� � ' ��� +��� ������ �� ����� �
,,��- ������ .�! "� ����!�
� #�������$� � ��%��� �� ��&%&���$ �� � ������ � � �� (
��������
� /���� ��� ������ ���� ����� � 0�- ����� � � �� ���(
����� /� �� ��� ��������� �� ��� ��� ������ � ��� �� ���
��� 1������ ��� ������ �� '��� � ��������� �����
� ������
�� ���������� �� �������� ���
� �� � ������ ���� �� �� ��� ������� ������
��������� ����� ����� ���� !�"
#�� ���������� $���� ���� % �&" '�(# �)�"
!) �&" ��*+� ��"
+�� �� !� !)�' ��"
+�� �� #� !)�' ��"
*,+,*�- ��� +�. ����� ������ !� �� !������� ������ /�"
*��� 0� � !))�"
+�� �� ! ��� +�� �� # ��� ��� �� � ��� ��� ��������� ��� ���
*����� ���� �� ���� !1
� �������� #)�" �� ��� �������� ������ ���� ���� �� � +(2 ���� 1
� � ���. ��� ����� ���� ��� ������������ ��������� ��� ��.�
���3����� �� �� ��� �� �������� ����� ����1 *���� �� �� ���
������ ��� #)�" ��������� ���� ��� �� ��������� )1# "
����1
4�� # ��14�� #) ���1�)�%)� ) ���1 � � �.���5#� # ��15#� � ��1
� (���� ���� �������� ����� �� � ������������� ���1 ��� !))
�" �� �������������� ����� . ����� �#��#/�! 0�&0�� ���
�� ���� 0�����1
� (�������� �� !/�))) �� �!6�6))��� ��� ����� �� ��� �� �
�������1
� *������� �� ��� ���������� �� � ����� ��� ��� ��� !�" ��
7������� ���� !)�" �� �&" ���� ������� ��� #�)�" ��
441�8 ������1 '�� ���� 0�����1
(�������� �� !/�))) �� �!6�6))��� ��� � ����� �� ��� �� �
�������1
2���� ��� ���� ���� !�)�" �� 5)8 ������ �� ��� �� �����
���1 2� �0� ��� ���������� ��� ��� ��� ���� �� ��. �� ���
���1 �����0� ��� ���� �� //�" �� ������� �����1
�� ������ �� ���� � � �� ��� �� ��� ������
� ��� �� //�" �� ���� ������ �� ��" �� !) � 7���������
$���� ��� !�" �� 7���������1 '�� ����.1 *������� �� ���
��� +(2 ��� ��� ������� ��� ) ����� �� 5�1
� ������� ��� !� ����� �� 5)� �� ������0��� 7���������1
� "��� �� ��� �� �� �� ���� (����� �� ��� ������������ ����
�� � ��� �� �0� �� ��� ������������ ���1
� (�������� �� 5))�� ��� � ����� �� ��� �� �������1
� '����� ��� ,�#%) �� � ������ �� ��� ��� ���� ������������ �
���� �� ������ ��� �������������1
�
�� �� �! ���
��� ������������� ���&�"� � ,�#%) 0����)��& "�������
!,�#%) � �)�� ���� ������ ���& "1
� ������
�� ����� � �� ��� �� ����� ����� ����� ������
��� ������ �� �� �� ��� ����� � �� ���� ������� ���� ���
��� �������� ���� ���� ����� �� ����� ������ ����� ������ �������
������ �� �� ��������
����� ������ �����! !��� �� "�� ��!��� �������� !��� ��
����� ���� ���!��� �� ������� !�����
#��� � ������������� �������� ��� ��� ����$������ ��� %&���
��� '� &����� �( �� ��� ��$������ �� %&����� )( ��� ��� ����
�� ��� ��������! �� ���
���� ��� �� ��� !� � ��� �� ����
�� %' �!( &����� '�� �� ) �'�*
�������������� +����� ���� , ����-* .!/�� '0�*
'0 ����-* ��� '�*
&���� ������� '0�. '�*
�������� ������� '0�. '�*
�1�1�2 � ���������� % ����� '3) �� '��������� +�����( '�*
������� ����� �� �0�*
�/4 ��� �������� ���� ��� ��������! ����������� ��� �/4 ��� ����
���� �����5� $� '�06 �!����� !�� ����������������
� ������� ��� ��������! ����� ��� �� ������� ��
78� � ����
78� �0 ����
80�,0� )0 ���� ��� ������
9�� ' ����
9�� � ����
��"� #��� �
"�!��� ' ����� ���� �$����� $�� � ���� ���� ����� �� ������ ��
����$������ �� �� �� ��$������ ��� ��� ������ ��
���� ��� ��!���������� ������� ����� ��$�������� �������
���� �� "� ��� ��������� � ��� ������� ��!!��� ���� ��� ��$�
�������� ����� ��� �� ���� �� &�$�������� :�� ;� � ��
���� ����������
HepG2 cDNA
GAPDH GAPDH 100bp SL
1,500bp1,000bp
1%
GAPDH glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase
Subtracted cDNA
Agarose S
AFP : alpha-fetoproteinGAPDH : glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
931bp859bp
AFP AFP GAPDH AFP
Normal liver tissue cDNA
�� #��������<���� ��� �� �� +�! ������ #� �� &����!���� � &�� =�!���� *� *��
:����� ��� �� *�� :�5����� �� =� +�� .��5� .� =�� .����� ������� #��
.���5� *� *�� *� ������ &� � �� &��!��� �� ��� ����� ���� ���
��>)� %)( 3 �)9� %�00?(
�� $����������� �� �� ������$�� �� ���������� ��� �������������� ��������������
�������� ���� "�� ���������� ��� �� ���� ��� ������ ������� ;� � ����
/������� @� ������������� �� &�$�������� :�� ;� � �� ������ ��� ��!�
� ������
�� ������� �����
���� ������� � �� �������� ������� ����
��������� ������ �� ���!"��� � ��� #���
��������� ���� $������ %�� &�' (����#��� ����)� *� �#+�
,�����*�� ��� � ��� #���
��,�*�*�� -�� (�.�#��/ (����#��� 0�����! 1��-� �* "&
,�������� �)����2$)����%��"23 ��"!� ����)�� 4*�5*�5�6 *�� "&
������**� 7�)���� 4���6/ (����#��� 0�����! 1��-� ��� "&
��������� 1�!�����/ (����#��� 0�����! 1��-� ��� "&
,�*������ 7�)��)��"��� �* "&
*�8�8���� ���+� �� ���� &�--�� 4������+�6 ,���
,�*�����, ����� � � �����
,�,����,� ��� ��7 ��� "&
,�����*8� 8� &��-��� 0#%%�� ������ �!� � "&�,
,�������� 7�)�-�#" 0��"�-� ���#���� �� "&
,�8������ �� �����- �����/ ��������-/ ������� ��� "&
� ������
�������� ��� ���� �� ��� ������������
←←
(1) Preparation of Tester ss cDNA
Amplified cDNA Library (16 cycles : 10 ng) : 100 LPhenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 L
14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.
Sup.
Sample 1 (1 ng)
Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 L
←←←
14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.
ppt.
70% Ethanol 150 L←
14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.
ppt.Air-dryDistilled water 44 L10 Lambda Exonuclease Buffer 5 LLambda Exonuclease 1 LVortexIncubate at 37 30 min.Incubate at 80 15 min.Distilled water 50 L
←←←
Removal of low-molecular-weight DNA
700 g, 5 min. R.T.
filtrateMeasure at OD260 nm
Tester ss cDNA (1 ng/ L)
(2) Preparation of Driver ds cDNA
Amplified cDNA Library (16 cycles : 10 ng) : 100 L
Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex
←←←
14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.
Sup.
14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.
ppt.
70% Ethanol 150 L←
14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.
ppt.Air-dryDistilled water 44 L
Vortex
Vortex
← Phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 LVortex
� ������
(4) Digestion of the hybrid ds cDNA by Duplex-specific nuclease
Sample 2 (1 ng)Measure at OD260 nm
Driver ds cDNA (100 ng/ L)
(3) Hybridization
Tester ss cDNA (1 ng) 1 LDriver ds cDNA (200 ng) 2 L
Mix
4 Hybridization Buffer 1 L
Heat at 98 for 2 min.
Hybridization at 68 for 16-20 hr.
Hybridization solution at 68 4 L
2 Duplex-specific nuclease Buffer 5 L68 , 10 min.Duplex-specific nuclease 1 L68 , 30 min.Stop Solution 10 L68 , 5 min.Distilled water 80 LPhenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 L
14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.
Sup.Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.
ppt.
70% Ethanol 150 L
14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.
ppt.Air-dry
Distilled water 31 L
DNA amplification step
Vortex
Removal of low-molecular-weight DNA.
700 g, 5 min. R.T.10 M Buffer 5 LRsa 1 LIncubate at 37 2 hours.Incubate at 80 20 min.Distilled water 50 L.Phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.
Sup.Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.
ppt.
70% Ethanol 150 L
14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.
ppt.Air-dryDistilled water 10 L
� ������
(5) Amplification of Subtracted cDNA
Amplified Subtracted cDNAPhenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 100 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 3 min. R.T.
Sup.
Sample 3 (1 ng)
Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% Ethanol 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5 min. R.T.
ppt.
70% Ethanol 150 L
14,000 rpm (18,800 g), 2 min. R.T.
ppt.
Air-dry
Distilled water 44 L
700 g, 5 min. R.T.
filtrateMeasure at OD260 nm
(6) Removal of the residual ss cDNA by Exonuclease I
Amplified subtracted cDNA : 44 L10 Exonuclease I Buffer 5 LExonuclease 1 LVortexIncubate at 37 30 min.Incubate at 70 15 min.Distilled water 50 L
Removal of low-molecular-weight DNA
(7) Check of Subtracted cDNA (human cDNA)
Amplification of Sample 1, Sample2, Sample3
Agarose gel electrophoresis (1% agarose in TAE)
Subtracted ds cDNA
���� ���� ��� �� ����������� �������� �������� ������ �������� ��� ��������� ���
��������� � ��������� � ���
������ � ������������!��
�""��##$$$%$������%��%&�
���� ��� ��� ���� �� ����� '���$��( )�(
)�����(� *+ � � �
,%-%+%
��������� � ���������������
������ � �������������!�
�""��##$$$%$����%��
���� ��� ��� ���� �..�/�"/��� ��
������� 0����
1�/�2
��������� � ��!��� �� ����
������ � ��!��� �� �����
�""��##$$$%$����������%(�
�������� �����
� ������
���� �� �� ����
������
���� ���� ������ � �� ���
�� � ���
���� ����������������������������
�� ������������������������������
���� �� � �������� ��� ��������� �����������
����� ���������������������������
� � �����������������������������
����������� ���������������������
���� ����������������������������
�� ������� ���������������������
�� ������ �� ����� ������������������
�� ������ �� ����� ������������������
�� !�����"����� ���������������������#
#� � �$�%&����'� � $�����������������
�������������������������#
(� � ������� ������� ��������������#
�� )%�� $������������������ �������(
�� � ������� ������������� ��������(
�&�� ���� ������ ��������������(
�&�� ���� �����������������������
���� ����������������������������
�������� �����������������������
���� ����������������������������
������� �������������������������
������
��������������������������������
���������� ����������������������
�������� ����������������������
��������������������� ���������
� ������������������������������
�������������������������������
*�����!�������� ���������������+,��
������!�"������ ������#�$���%&�
���� -� �$�%&����'� ����� ��.������/ �� � �������� ��� ������
�� *�����!� ��������!�"������ ����� �����
����������'���������!�"������ ����� ���
������ ����������������%�������
���� !������ �$�%&����'� � $������( �������
����������(������ ���)%�� $�������( �
���������� ���������� �����������
���������'$��������������������
����������� ��������������� ����������
�� ������������ ��������������
��������������� �� � �������� ��� ��������
*�����!�������� ������������������)�
��������������
� ������
�� ��
� ������ ����������������������������
������ ���������� ������������������
��
� ��� ��� �����������
������ ��� ��������� ��� ��������������
���������������������� ���� �����������
������������������ �������������������
��� ��������������
� ��������������������������
������� �������������� � �� ������������������
��������������������������
� ����� ������!�� ����� ����������"�� ����������
������
��� �����"�� �������������������
���������������������������� ���� ����
��������
� ���� �����������
��������������!������������"#��
�����
� ������ $���������"����������� ���� ���
��������
����� ���� ������ � �� ��� ������
Tester ss cDNA(1 Driver ds cDNA(2 )cDNA
DNA
cDNAP23
cDNAPCR
(Rsa )
P24
Tester ss cDNA Driver ds cDNA
P25
cDNADNA
cDNAP25
P25
xonuclease I
P26
Tester ss cDNA Driver ds cDNA
Tester ss cDNATester cDNA
PCR
ss cDNA ss cDNA
Subtracted ds cDNA
Tester ss cDNA DNA
Lambda Exonuclease
� ������
’’
’ ’
Lambda Exonuclease
’
’
’
’
’’
’ ’
’
’
’
’
’’
’ ’
’
’
’
’
Rsa I
’’
’ ’
’
’
’
’
’ ’
’ ’
’
’
’
’
’
’
’
’
’ ’
’ ’
’ ’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
Duplex-specific nuclease
� ������
’
’ ’
’ ’
’ ’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
DNA
’’
’ ’
’’
’ ’
’’
’ ’
’
’
’
’
’
’
’
’
Exonuclease I
’
’
’
’
’
’
’
’’
’ ’
’’
’ ’
’’
’ ’
’’
’ ’
’’
’ ’
’’
’ ’
Subtracted ds cDNA
Cloning
� ������
�������
�����
��� ����� �� ������� ��� � ��
��� �������� �� ������� ������ ���� � ��
��� ������������� ������ ���� � ��
��� �� ���!� ������ ������� ��� � ��
��� ���� ���!� ������ ������� ������ ���� � ��
�"� �� �������� ��� � ��
�#� ����� �������������� ���� � ��
�$� �%��%� ���� ���� � ��
�&� '�� '������ ���� � ��
���� � ���(� '���� )������* � �+� ����� � ��
�� ��
�������������������������������
���� , ��� ����� �� ������� ��� �������� �� ������� ������
��� ������������� ������ ��� �� ���!� ������ �������
��� ���� ���!� ������ ������� ������ �"� �� ��������
�#� ����� ��������������
����� , �$� �%��%� ���� �&� '�� '������ ���� ����(� '���� )������
�������������
� ��
�� -����������.�� ��/)�����/) �������
�� -����������.�� ��/)���0�����
�� ������������0������1)0��*�!���� ��
�� �/)�����
�����������/)���������������
��2�����������������2������ '��������
-303-)4 �/) ����������������-303-)4 �/)
�����������15�������������������
�������������������������
�� /-0 6���������� ����(� )-0* --0* 5-0* 1-0�
"� ��� ���������&�!�������������/)�
�0�����������
���� � �����������������������
��
#� �������� ����$!���&�
$� ������ �������������������������
&� #�7�&&+�7����
��� �/) �������
��� �����
��� ����� �
��� ��-) ������
��� ���� 8 ������
��� �����
� ��
�"� 059 �!�"
�#� �� ����!�"
�$� �� ��#��
�&� �#����$
� ������
��� ���������
��� ������
��� ���������������� �� �����������
��� �������� ��������� ������
��� ����������� ����
��������������������������
��� �������� ���������
��� ��������
������
�� �����������������
� ������������� �������������������� ��
����� ����� ����������� ����
� ��� ��������� ���������!��"# $�����������
����� ���������������
� $������������������ ������������������
�� �������������� ��������$�����������%
���������$�������� ��������$������
���������"� &'#�(�)���������������� ��
����������� ���������������� �����
������ ��������$������������������� ��
��������$�������� ����������������
����*���*������ ���
Primer 3
P-5TesterPrimer 15' 3' 3'
Primer 4
Primer 2
Driver 5' 3' 3' 5'
'
� $�����+$�,���$�-&��������������
� ����.(�������" ������������ ����$������
�� ����-�$�+��/������!���������� ���
���������
� ������ ���������� �� ��������������������
������ $#)����������������" �#�
��" #��������������������" ����
�����������������������������
� ������ ���������� �� ������������������$
�����������
� ������������� ��%��
� �� ��������������� ���$���� ��������
���.(�������" �������� ����� ����������
�����������������
� ������������������ ��%��0�"�)��� .��/
�������$���1 ��� #)�������������������
����������$���1 ��� $#)����������� ����
����������������������&�'$,!��
��������� ��� �����
� ������
�� ������ �� �����
� ���� ��������������������������
���� ������� ��� ����
�������������� ������ ���� � ������ �� �� ! ��
� ������ "�#$% !��
$����� �������& � �� !��
$����� ��!'����& � �� !��
#($(#�) ��� $�����%���� �*+ �� ���������� ������� ,��
������� � ��
$����� ��� $����� ��������������������
����- ���������� ����������- ���+ .��/
��"�� 0�1��%� $��������������
� !�� $ 0���� �� �����������
� �����������������
2!� ���
2!� � ��
! �� � + �� ��� ����%
3�� ���
3�� !��
� ����������������������� ��������
� ������ ��� ������ � �� ��!*�,*��
�����������
� �,& �����4&4 ����+�������������
� ����������������5��������� ����+�����
6�"��� ������ � ���� �227!8���� �! �������
������
� �,& �����4&4 ����!�����������
�! ���3 8���� �����������,,�����
����������
!���� ����" 59������%� ��������������" 59�/
�����%���������� $ 0���� ������� ��
���+3��+ �������������
� 4 ���! ��������������" 59������%������
���
� ������������������! ����������
������ �������
�������������������� $�����������
���������
� �����3 ���!�������������
� ���������(��� ��������������
�
6���� � �� ���
�����������������������(��� ��+3������
����������
�� ��������������������
������������������ �����������
������
� ������
�� ������ � ������
� ���� ��������������������������������� ����� �� ��� ����
�������������� ������ ���� � ������ �� �� ! ��
� ������ "�#$% !��
$����� &' � �� !��
$����� (' � �� !��
#)$)#�* ��� $�����%���� �+& �� ���������� ������� (��
�������� � ��
$����� &�$����� (���������� ��������
���, ���������� �����������, ���& -����"
�.�/��%� $��������������������/�� �����
#�%��� ������������ ����������#�%���
��������$��������������� ���/�� �����
���$��������������
� !�� $ .���� � ���� ������
� ������������������
0!� ���
0!� � ��
! �� � & �� ��� ����%
1�� ���
1�� !��
� ��������� ����$ .���� ���������
������ ��� ������ � �� ��!+�(+��
�����������
� �(' ��� ��2'2 ����&��������������
� ������������ ���3��������� ����& �����
4�"��� ������ � ����005!6���� �! �������
������
� �(' ��� ��2'2 ����!��������������
�! ���1 6���� ����������((��������
������
�������������������$�����������
��������
� ������1 ���!��������������
� � �� �������!������ ���������������&1���
�������������
2 ��� �����������������������
� �����! ��������� �� ����
� � ������ ��� ������ � ��
�!+�(+������������
� �(' ��� ��2'2 ����&��������������
� ������������ ���3��������� ����& �����
4�"��� ������ � ���005!6���� �! ��������
�����
� �(' ��� ��2'2 ����!��������������
� 1 6���� ����������� �������� ���
���
� ���������)��� ���������������
�
4���� � �� ���
�������������������������)��� ��! ������
����������
� ������
� ��� ���������������������
����������������������������
�� �
�� ����������
� ������ ����� ����� �� ��� �� �������������� ����� ���� ������������������������� !""���������
����
����� �� ��� # ������ �� ��� � � # ���
� $%����������&%���&�������������
����������� ��� ���������������
�� ��������������� ����������������������������
���
� ��������������������������&%���������&%�����������!'(�)*�'���"�� �!�(���� !""���+�����
������ ���&%�����������������
����� ��� ������������������
���������������� �
� �����!'(�)*�'���"�� �!�(���������&%��,�������
�������
� �����-��' -�(!��������&%��+�������������
� %��������������������������
� ��������������������� ���!����+#��#�������������
� ��.��� �'/ ��%.%������,��������������
����������������0�1��1��/��� ����, /�(��-���!/ ������ ��������$$2+3������+��������
������
��.��� �'/ ��%.%������+��������������
� �+����4�3������������ ��,���������
�������
���������������������������
���� �
�� ��������� ����������
� -!�������� ������������
-!�������� ��������+*�� ,�����/'(�"������� !""�� 5��1 & //�(�� 6��(� +�����//�(�� �� � +����/�� �. ���6 +����/�� �. ���6 +�� 77 8 �� �(�/���������#, �� ����(!���� �!""��� ���
�� �����
��/�� ������/�� �������� ����� ���������
�� ��/�������� �����/�� ����'��/�� �� �
����/������!����"#����/����������
���������+9 $��������$�
� ������
� ��� ������� ��������������
� ��������������
��� ������ ��������� ��� �� ��� ����� ������ ���
� ���������������������������������
���������� ���������������������
��������
� ������ ��� �������������������������
� ����������������� !"�!#$�" � �����% &�'%(#)� ��� " � ����������*�+���������� ��
������
� ������ ��� ��������������������������
� ��������+ ������������������������
�������
�� ������������������ �����
���� ������� ���� ��� � �,%$)� �"��� -)..������ ��,%$)� �"���� �������� ������� �����
�����������������
� ������������������,%$)� �"����������
� ��������������� ��������#��������
�������
� ���������������������������
� ��������/��� $�������������
�
'"�� � �� $��
������������������$�&����/���������&���
���������
�� ��������� � ��������������
����')0 �"� �( ����������������������
����� �����!������1���2� �3"� #$������
�������
����������������
�"�#��4�� �� ������������4�� �� �� �����'"�� �
����"�#���#5�� ��������������#5�� (� ����
�'"�� � �������"�#��')0 �"� �( ���� �'"�� � ���
���� $������1���2��3"� #$����������
��4�� ���������������������������
��������� ��������
���� �� $�� '"�� � ���� ���
����� #.#�" #%$ -)..�� 6# ! ��% &� 7�� � ����
����% &� (�4�� ���
'�$�� ��#���� ���7 ���
�$ #��$�� ��#���� ���7 ���
4/�/4�8 ��� �% ����"������� #$ ���# ) #%$ -)..��� ���
�������� ����
�������������� �����!������
1���2��3"� #$!�"��'�$�� ��#�������$ #��$��
��#�����������
� ������
��� ���
��� ����
������ ���� ��� ����
��� ��
��� ���
� ����� ���� ���������� �����������
������������������������
��������
� ����������������� ��������
������������������������� ���� �!"�#�"$%& '$"
(#)%�� ��� ������� �������������
������*�������������������� ��+*��
��� �� �!"�#�", ��������� ����
���� �������"� �� �������������������$-� ,�
��������� �!"�#�", ���������� &���������
������������������������
HepG2 cDNA cDNA
GAPDH GAPDH 100bp SL
1,500bp
1,000bp
1%
GAPDH glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase
Subtracted cDNA
Agarose S
AFP : alpha-fetoprotein
GAPDH : glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
931bp859bp
AFP AFP GAPDH AFP
������������������*�������� ������
�������������������������� �!"�#�",
��������������������������������
�+*�������� ������������������ �!"�#�",
������ ������ ���������������������
����������������� ����� �!"�#�", ����
������������������!����� �������
���
������
./�$,%-0 *� ��0 �%�,#&%-#0 �� ��0 /�/�%-0 �� �0 1#�&�0 �� ��0
'/#��)%-0 �� ��0 '%2/��#)%0 1� ��0 3#"20 3� 1�0 3�/)-$"�/0 ��0 3%4
�%20 �� ��0 ��)�#&%-0 � �� #&, /#�$&0 �� ��0 ������� ���� ��0 �� 5 �� 6�7 8
��� 6���97
�����������
���������"�����#������������
����������� ���� �!"�#�"$%& '$"(#)%���������
� ������
����
���� ��� � � � �
���� � ������� ��� ���������� � �����
������ � �� ������� !�� "�# $���%���� &��'(� ) ��*��
+�� )�� ��� � � �����
+)�)�� ���� $�,���� -�� ����."/0 $���%���� 1����'� 2���� �) �"
+��� ��� �(����.�(����!���.3������ ��%�(�� -)�4)4�/ )� �"
� �))� 5�(���� -����/0 $���%���� 1����'� 2���� � �"
� �� 2��%����0 $���%���� 1����'� 2���� � �"
+�) ���� 5�(�%(������ �) �"
)�66�� � � * ��� ��� "����� - �����7* / + �'
+�) ���+ �'����� � � �'
+�+� +� � � ��5 � �"
+�� )6� 6� "�����' 1�!!�� ��� �� ��� � �"�+
+��� �� 5�(����� 1������ �������� � �"
+�6� � � ��������� &����0 ������8��0 ������� � �"
� ������
������������
cDNA Library (10 ng) DNA (16 cycles) : 100 L
(25:24:1) 100
44 L
50 L
OD260 nm
(1) Tester ss cDNA
14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex
Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 570% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2
10 Lambda Exonuclease Buffer 5 L
Lambda Exonuclease 1 L
37 3080 15
Vortex
DNA/Primer
700 g, 5
(1 ng/ L) Sample 1 (1ng)
(2) Driver ds cDNAcDNA Library (10 ng) DNA (16 cycles) : 100 L
(25:24:1) 100
14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex
44 L
Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5
70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2
� ������
OD260 nm
(100 ng/ L)
98 , 2
80 L
(25:24:1) 100 L
cDNAcDNA
Sample 2 (1ng)
(3) Hybridization
Tester ss cDNA (1 ng) 1 LDriver ds cDNA (200 ng) 2 L
4 Hybridization Buffer 1 L
68 16 20
(4) Duplex-specific nuclease
Hybridization (68 ) : 4 L
2 Duplex-specific nuclease Buffer 5 L
68 , 10
Duplex-specific nuclease 1 L
68 , 30
Stop Solution 10 L
68 , 5
14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex
31 L
Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5
70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2
DNA
DNA/Primer
700 g, 510 M Buffer 5 LRsa 1 L37 , 280 , 20
50 L
(25:24:1) 100 LVortex
14,000 rpm (18,800 g), 3
Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5
70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2
10 L
� ������
(5) Subtracted cDNA DNASubtracted cDNA DNA (35 cycles)
(25:24:1) 100 L
14,000 rpm (18,800 g), 3Vortex
44 L
Ethachinmate 1 L3 mol/L Sodium Acetate 10 L99.5% 250 LVortex14,000 rpm (18,800 g), 5
70% 150 L14,000 rpm (18,800 g), 2
(6) Exonuclease I cDNA
DNA Subtracted cDNA 44 L
50 L
10 Exonuclease I Buffer 5 L
Exonuclease I 1 L
37 3070 15
Vortex
DNA/Primer
OD260 nm
700 g, 5
(7) Subtracted ds cDNA ( )
Tester ss cDNA (Sample 1), Driver ds cDNA (Sample 2),Subtracted ds cDNA (Sample 3) 1 ng DNA (GAPDH, -actin )
Sample 3 (1ng)Subtracted ds cDNA
S T U V W X Y Z [ \
�������