laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky olomouc
DESCRIPTION
http://www.ueb.cas.cz/olomouc1. Analýza a třídění chromozomů. Pavlína Kovářová. Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc. Průtokový cytometr. Analýza : Mikrospóry Protoplasty Buněčná jádra Chromozómy Chloroplasty. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/1.jpg)
Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrieLaboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrieÚstav experimentální botanikyÚstav experimentální botaniky
OlomoucOlomouc
http://www.ueb.cas.cz/olomouc1
Pavlína KovářováPavlína Kovářová
Analýza a třídění Analýza a třídění chromozomůchromozomů
![Page 2: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/2.jpg)
Průtokový cytometr
BD FACSVantage (2 lasery, 8 parametrů)
Analýza: Mikrospóry
Protoplasty
Buněčná jádra
Chromozómy
Chloroplasty
![Page 3: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/3.jpg)
Schéma průtokového cytometru
Laser.......
.
.Unášecí tekutina
Regulátortlaku
Průtoková komora
+-
Sběrná zkumavka
Vzorek
Vychylovacídestička
Elektrickýpulz
Vychylovacídestička
![Page 4: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/4.jpg)
DetektorLaser
Vychylovacídestička
Vychylovacídestička
Odpad
Do leva tříděné kapky Do prava
tříděné kapky
Princip třídění
Analýza optických parametrů: fluorescence a rozptyl Společná analýza osmi parametrů Rychlost třídění (102 – 104 chr./ sec)
![Page 5: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/5.jpg)
Materiál používaný k přípravě suspenze chromozomů: Buněčné kultury Protoplasty listového mezofylu Meristemy kořených špičky
Příprava suspenze chromozomů
Extrakce chromozomů
Cytometrická analýza
PřípravaBuněčná synchronizace
Akumulace v metafázi
Barvení chromozomů
Třídění chromozomů
![Page 6: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/6.jpg)
Flow karyotyp
Idiogram
Relativní obsah DNA
Frek
venc
e
Idiogram Flow karyotyp vyjadřuje závislost relativního obsahu DNA na počtu daného typu chromozomů
Detekce strukturálních a početních změn chromozomů v karyotypu
Teoretický flow karyotyp
![Page 7: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/7.jpg)
Flow karyotyp
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivvn
í fre
kven
ce ChineseSpring I
II
III
I: 1D, 4D, 6D; II: 1A, 3A, 6A, 2D, 3D, 5D, 7D; III: 2A, 4A, 5A, 7A, 1B, 2B, 4B, 5B, 6B, 7B
3B
3B
Vrana et al. (2001)
Hexaploidní pšenice (1C = 17 000 Mbp)
Identifikace a určení čistoty tříděné frakce :FISHPRINS PCR
![Page 8: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/8.jpg)
Použití chromozomových linií :Použití chromozomových linií : Translokační linieTranslokační linie Deleční linieDeleční linie Adiční linieAdiční linie
Specifické chromozomové barveníSpecifické chromozomové barvení AT a GC nukletidových bazíAT a GC nukletidových bazí
Diskriminace jednotlivých chromozomů
![Page 9: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/9.jpg)
Kromě chromozomu 3B je v histogramu oddělený pík pro translokační chromozomy 5BL·7BL a 4AL·4AS-5BL, které můžeme snadno třídit. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem.
Třídění translokačních linií u pšenice
„Cappelle Desprez“
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e
3B
I
II
III
„Jubilar“
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e I
II
III
3B
4AL·4AS-5BL
4AL·4AS-5BL
5BL·7BL
5BL·7BL
Kubalakova et al. (2002)
![Page 10: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/10.jpg)
Jednotlivá ramena chromozomů můžeme třídit z ditelosomockych linií nebo z linií nesoucích izochromozomy. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem
„Chinese Spring“ iso5BL
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e
3B
II
III
Třídění chromozomových ramen u pšenice
I
iso5BL
iso5BL
„Chinese Spring“ Dt1BS
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e
3B
I
IIIII1BS
1BS
Kubalakova et al. (2002)
![Page 11: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/11.jpg)
Adiční linie pšenice a žita
Jednotlivé chromozomy žita mohou být tříděny z adiční linie pšenice–žito. Tříděné žitné chromozomy jsou identifikovány FISH s pSc119.2 repeticí a GAA mikrosatelitem.
T. aestivum (21'' + 1'' 6R)
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e
6R3B
6R
II
IIII
Secale cereale „Selgo“
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e 5BL·7BL1R - 6R
Kubalakova et al. (2003)
![Page 12: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/12.jpg)
Kubalakova et al. (2003)
Secale cereale „Adams“
Relativní intenzita fluorescence
Rela
tivní
frek
venc
e
2R - 7R
1R
B
119 Afa
Translokace BS·BL-1RS
5S45S
Afa45S
DAPI
Tato translokace byla detekována u 0.5% tříděných B chromozomů
B
Detekce vzácných strukturálních změn genomu
Průtoková cytometrie umožňuje analýzu velkého množství chromozomů (<103) a tím detekci vzácných strukturálních změn.
![Page 13: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/13.jpg)
“High-resolution” FISH na natažených chromozomech
Valarik et al. (v tisku)
Tříděné chromozomy mohou být nataženy až na 100 x větší délku, než byla ta původní, čímž se výrazně zlepší prostorové rozlišení až o dva řády.
PI
BAC9
17 μm (1x)
1352 µm (79.5x)
42 µm Chromosome 3B(T. aestivum)
![Page 14: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/14.jpg)
Gelová elektroforeza
PCR
1 2 3 4 5 6
TříděníI II III IV
Standartní karyotyp
1 2 3 4
I II
Translokace
5 6
Třídění 102 chromozomů trvá jen několik minut, proto je PCR velmi výhodným nástrojem k fyzickému mapování.
Fyzické mapování pomocí PCR se specifických primerů
![Page 15: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/15.jpg)
Konstrukce chromozomově specifických BAC knihoven
Ligace do defosforylovaného
BAC vektoru
E. coli transformace
Izolace vysokomolekulárni
DNA
Cytometrická analýzaa třídění
I
IIIII
3B
ChineseSpring
2 3 S1kbp
- 2200
- 825
- 225- 50
Kolonie
Uspořádání na 384-jamkové destičky
3 BAC DNA knihovny byly konstruovány z tříděných chromozomů pšenice:
• 3B chromosomově-specifická BAC knihovna
• 1D, 4D, 6D subgenomicka BAC knihovna
• BAC knihovna specifická pro chromozomové rameno 1BS
Šafář et al. (přijato do tisku); Janda et al. (v přípravě)
![Page 16: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/16.jpg)
V BAC knihovně hledáme specifické klony, které mapujeme na mitotických chromozomech pomocí in situ hybridizace.
Filtr po hybridizaci s genomickou DNA
Málo repetitivní BAC
Vysoce repetitivní BAC
BACDAPI
Tříděné 3B chromozomy
Fyzické mapování BAC klonů na tříděné chromozomy
63C11 63B13 63N2 81B7
![Page 17: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/17.jpg)
Závěr
Průtoková cytometrie může být použita ke třídění mitotických chromozomů zemědělsky významných obilovin a leguminóz.
Flow karyotyping je vhodný ke kvantitavní detekci numerických a strukturálních změn chromozomů
Tříděné chromozómy jsou vhodné pro fyzické mapování použitím FISH, PRINS and PCR
Tříděné chromozomy lze využít ke konstrukci chromozomově specifických BAC knihoven
![Page 18: Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022051221/56813b2b550346895da3efda/html5/thumbnails/18.jpg)
Naše laboratořNaše laboratoř
http://www.ueb.cas.cz/olomouc1