Flow cytometrie bij lage cytoses in lumbaal vocht

Veerle CompernolleSupervisor: Nancy Boeckx

Principe van Flow Cytometrie

Fluorescencedetectors

Side scatter

Forward scatterLaser

Stream of fluid containing antibody-labeled cells

Onderwerp van critical appraised topic

=

Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op cerebrospinaal vocht

Onderwerp van critical appraised topic

=

Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op vochten

Beperking:De verstrekkingen 555730-555741 en 555752-555763 mogen enkel worden aangerekend aan de ZIV voor het typeren van hematologische maligniteiten, of in geval van congenitale of levensbedreigende verworven immunodeficiënties, of in geval van sarcoïdose.

Identificatie van een receptor of een membraan- of cytoplasma- ofnucleair antigeen van hematopoïetische cellen, exclusief de antigenen van het HLA systeem

Onderwerp van critical appraised topic

=

Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op vochten

Voornamelijk: Opsporen metastasen van hematologische maligniteiten

in cerebrospinaal vocht

39

21

8 84

9

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45Ly

mfo

om

Leuk

emie

And

ere

hem

atol

ogis

che

mal

igni

teit

Neu

rolo

gisc

h

Gee

n

And

ere

Aan

tal

Klinische gegevens bij aanvraag

Belang opsporen hematologische metastasen in cerebrospinaal vocht

• Prognostisch• Intensificatie van de therapie

Intrathecale chemotherapie & Radiotherapie

Nevenwerkingen:

oa. -secundaire maligniteiten

-verminderde cognitieve capaciteit -groeiretardatie...

Diagnostic test Abnormal finding % of patients with abnormal findings

Lumbar puncture Elevated CSF proteinElevated CSF pressureLow CSF glucosePositive CSF cytology on initial lumbar puncturePositive CSF cytology after three lumbar punctures

75%50%40%50%

85%

Neuro-imaging studies

Abnormal findings 50%

Laboratory and imaging findings in patients with leptomenigeal carcinomatosis (ref. Grossman et al. Cancer treatment reviews, 1999: 25:103-119)

Diagnostic test Abnormal finding % of patients with abnormal findings

Lumbar puncture Elevated CSF proteinElevated CSF pressureLow CSF glucosePositive CSF cytology on initial lumbar puncturePositive CSF cytology after three lumbar punctures

75%50%40%50%

85%

Neuro-imaging studies

Abnormal findings 50%

Laboratory and imaging findings in patients with leptomenigeal carcinomatosis (ref. Grossman et al. Cancer treatment reviews, 1999: 25:103-119)

Goudenstandaard

Gouden standaard: cytologie

• Sensitiviteit: 50-70%• Goede specificiteit

1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde?

-het aantal vals negatieve resultaten verminderen?

-Quid specificiteit?

2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal

28

14

3 2 2 2 2

2

4

31 1

4

20

0

5

10

15

20

25

30

35

0-1 >1-5 >5-10 >10-15 >15-20 >20-50 >50

Cytose

Aan

tal s

tale

n

uitgevoerd (N)

geannuleerd (N)

Overzicht van uitgevoerde en geannuleerde stalen

(2002-2003)

(cellen/µl)

Vragen

1.Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde?

-het aantal vals negatieve resultaten verminderen?

-Quid specificiteit?

2.Wat zijn de condities voor een geschikt staal

3.Zijn deze annulaties terecht?

Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol?

1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde?

Guidelines:

“Flow cytometrische immunofenotypering van cerebrospinaal vocht kan klinisch nuttig zijn bij patiënten met een vermoeden van maligne lymfomen of leukemie”

Mo

ria

rty

Va

lde

z

Ro

ma

Su

bira

Fe

rna

nde

z

Fin

n

Urb

ani

ts

Fre

nch

Klinische F.U.

ReferentietestOnafh+blind?

Referentietest

Referentieteststeeds uitgevoerd?

Test onafh. van andere infouitgevoerd

Geen

Nee

Nee

nvt

nvt

?

?

?2x

niet2x niet

Ja

JaCNS

invasie?

?Ja

Ja

?CNS

invasie?

Cytologie

Validatie in 2°onafh groep?

Ja

Validiteitstudies

JaJa ?

Nee

Ja

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%V

alde

z

Rom

a

Sub

ira

Fer

nand

ez A

bell

an

Fin

n

Urb

anit

s

Fre

nch

Andere

leukemie

Lymfoblastisch lymfoom

lymfoom

Vermoeden lymfoom

Niet hematologische maligniteit

geen gegevens

Patiëntenspectrum

Ro

ma

Su

bira

Fe

rna

n-

dez Fin

n

Urb

ani

ts

Fre

nch

Aantal patiënten

Aantal CSV-stalen-totaal

-Valide cyto+IF

-Concordante

-Discordante

-Onduidelijk

negatief

positief

Cyto+/IF-

Cyto-/IF+

Cyto?/IF-

Cyto-/IF?

43 31 51 18 32

53

51

4078% 2812

11

29

168

168

15894%14711

9

36

1

1

352

291

28397%26914

8

1 * + 1 *2 * + 1 *

36

25

1768%116

5

1 + 13

3

3

31

27

1970%145

8

7

6

5

1

1

35

23

1369%94

3

2 1

Roma et al.

Subira et al.

Urbanits et al.

Pre

vale

nti

e

Aa

nta

l sta

len

Sensitiviteit Specificiteit

Cyto IF Cyto IF

0,412

0,102

0,485

51

167

27

0,57

0,65

0,46

1,00

1,00

0,92

0,93

0,98

1,00

1,00

1,00

1,00

Sensitiviteit/specificiteit werd berekend -met ‘klinische follow-up’ als gouden standaard-met gebruik van aantal stalen

Concordante en discordante data

Concordant Discordant Twijfel

Negatief PositiefCyto +

IF-Cyto-IF+

16 7 1 2 4

Resultaten 2002-2003

77%

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0-1 >1-5 >5-10 >10-15 >15-20 >20-50 >50

Cytose

Aan

tal s

tale

n

twijfel

discordant

concordant

Concordante en discordante resultaten in functie van de cytose

(cellen/µl)

Besluit• Er is een grote concordantie tussen

immunofenotypering en cytologisch onderzoek

• Combinatie van immunofenotypering en cytologisch onderzoek kan het aantal vals negatieve resultaten verminderen.

• De specificiteit van immunofenotypering dmv flow cytometrie is zeer goed

1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde?

Houding t.o.v. discordante resultaten?

Quid: Negatief (of twijfelachtig) resultaat bij cytologie en positieve immunofenotypering

• Hematologie: Beschouwen als positief resultaat. Aanpassen therapie

• Pediatrische hemato-oncologie: geen aanpassing therapie.

2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal?

- Geen anticoagulans; geen fixatie OK- Onmiddelijk transport naar labo- Beschikbare klinische of diagnostische informatie moet samen met het staal opgestuurd worden- Bewaring op kamertemperatuur OK- Analyse binnen de : -3 uur (Subira)

-8 uur (Australasian group)-24 uur (Finn)

Stalen worden soms pas na 24 uur geanalyseerd!

2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal?

-Lysis van erythrocyten door externe lyserende reagentia is aanvaardbaar-Globaal voor immunofenotypering: Idealiter: 500000-1000000 cellen per tube.

Bij cytose van 50 cellen/µl: 10 ml nodig !!!Ideale aantal cellen wordt dus zelden gehaald.

3. Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol?

Guidelines-“There is a strong consensus among all conference participants that every attempt should be made to derive useful information from any specimen submitted for analysis.” -Flagging criteria intrinsiek aan staal: hypocellulariteit(US-Canadian Consensus)

-Welke verwerpingscriteria worden gehanteerdin originele studies?

-Is het detecteren van zeer kleine aantallen blasten/lymfoomcellen zinvol?

3. Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol?

Vooraf gestelde verwerpingscriteria

Achteraf gestelde verwerpingscriteria

RomaLymfoom+ leukemie

Onvoldoende events aanwezig. Aantal wordt niet gespecifiëerd

Subira Leukemie-RBC aanwezig-<1ml

Fernandez ALL-RBC aanwezig-<1ml

FinnVnl lymfoma

Geen<200 events in diagn popul. >24 uur oud OF

<10000 cellen (in totaal)

Urbanits lymfoma-<1ml-<1000 cellen

French Varia

-talrijke RBC aanwezig

-<1000 cellen+<20% lymfo’s-<5 cellen op cytospin

->3 dagen oud

1

2

2 3

5

1

1

5

2

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

<1 >1-5 >5-10 >10-15 >15-20 >20-50 >50

Cytose

Per

cent

age

twijfel

Positief

Negatief

Resultaat immunofenotyperingen bij lymfomen in functie van de cytose

(cellen/µl)

Resultaat immunofenotyperingen bij leukemie in functie van de cytose

1

1

3

1

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

<1 >1-5 >5-10 >10-15 >15-20 >20-50 >50

Cytose

Per

cent

age

tw ijfel

Positief

Negatief

(cellen/µl)

Is het opsporen van kleine aberrante populaties zinvol ?

Leukemie• CNS leukemie wordt meestal gedefiniëerd als de

aanwezigheid van leukemische blasten (na cytocentrifugatie) in cerebrospinale vochten met meer dan 5 leukocyten per microliter.

• Klinisch belang van blasten bij cytose<5/µl is onduidelijk.

Gilchrist et al.: geen verhoogd risico voor CNS-relapse of andere relapse dan CNS-negative patiënten. (ALL) Tubergen et al. : De ‘disease free survival’ is na 5 jaar niet verschillend.Bürger et al.: goede prognose en hebben geen intensificatie van CNS-gerichte therapie nodig. (ALL)Abott et al.: geen prognostisch belang. (AML)Mahmoud et al.: een verhoogd risico op relapse en hebben mogelijks een meer intensieve intrathecale therapie nodig. (ALL)

CAVE: Sommige studies (oa Bürger et al. ,Abott et al.) patiënten met blasten in cerebrospinaal vocht met normale cytose, een meer intensieve behandeling kregen dan patiëntenzonder blasten in het cerebrospinaal vocht.

• Zowel op hematologie als op pediatrische hemato-oncologie wordt er weinig onderscheid gemaakt tussen:– Blasten aanwezig in CSV met een cytose

onder de 5/µl EN– Blasten in CSV met cytose boven de 5/µl.

Houding kliniek t.o.v. blasten bij lage cytose?

• Belang van detectie van zeer kleine populaties onduidelijk

Lymfomen

Besluit• Ook bij een gering aantal cellen zullen soms

maligniteiten kunnen gediagnosticeerd worden• Bij minder dan 10000 cellen zullen sommige

analyse resultaten niet meer betrouwbaar kunnen geïnterpreteerd worden

• Op basis van klinische praktijk in UZ: onvoldoende argumenten om stalen onder een bepaalde cytose te annuleren.

3. Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol?

TO DO

• Indien een staal minder dan 10000 cellen bevat: enkel immunofenotypering uitvoeren indien diagnostisch fenotype van lymfoom/leukemie gekend is.

• Indien na analyse blijkt dat er minder dan 200 events hebben plaatsgevonden in de diagnostische populatie: “te weinig events aanwezig voor betrouwbare analyse” aan protocol toevoegen

• Bij toekomstige stalen: nagaan met hoeveel events ‘10000 cellen’ overeenkomt

TO DO

Nu: voor B-cell lymphoma:minstens 2 panels van antistoffen, nl:

CD45/CD19/kappa lichte keten CD45/CD19/lambda lichte ketenInvestigeren of we kunnen overschakelen naar 1

panel, nl: CD19/kappa lichte keten/lambda lichte keten

(drie-kleuren analyse) CD45/CD19/kappa lichte keten/lambda lichte

keten (vier-kleuren analyse)

TO DO

• Op stalen die ouder zijn dan 24 uur: geen immunofenotypering meer uitvoeren.

• Stalen die voor 15u00 op het laboratorium toekomen nog dezelfde dag analyseren.

TO DO

• Aanpassen op intranet:– Aanpassen afname-instructies:

• Minimum 2 ml cerebrospinaal vocht opvangen in een steriel buis met schroefdop.

• Op vrijdag moet staal voor 12 uur op laboratorium toekomen

– Aanpassen uitvoeringsfrequentie:• Geen Immunofenotyp. Diagn & MRD in

cerebrospinaalvocht tijdens het week-end.