lab odontologÃa 4 al 6[1]

LABORATORIO Nº4

Enzimología 1.

Caracterización de la Fosfatasa Ácida de Aorta de Bovino; efecto del pH y de

la temperatura

Introducción

Las enzimas son catalizadores biológicos, que aumentan la velocidad de

una reacción, disminuyendo la energía de activación de la misma. Se caracterizan

por medio de Km: constante de Michaelis-Menten y de la Vmáx: velocidad máxima

de reacción. La velocidad de una reacción se puede estimar:

a) midiendo la desaparición de sustrato en el tiempo o

b) midiendo la aparición de producto en el tiempo.

El termino fosfatasa se utiliza para describir a aquellas enzimas que

catalizan la hidrólisis de derivados del ácido ortofosfórico. Dependiendo del tipo de

enlace que se hidroliza se clasifican en:

a) Fosfomonoesterasa (enlace fosfoester)

b) Fosfodiesterasa (enlace fosfodiester)

b) Anhídrido fosfórico hidrolasa (enlace pirofosfato).

Las fosfomonoesterasas se clasifican en específicas (un único

sustrato) y no especificas (reconocen a varios sustratos distintos). Estas últimas, a

su vez, dependiendo del pH óptimo, se clasifican en alcalina o ácida.

Las fosfatasas están presentes en prácticamente todos los órganos

animales. Se encuentran involucradas en el metabolismo de carbohidratos, ácidos

nucleicos, fosfolípidos y en la formación de los huesos.

En este práctico se estudiará una fosfomonoesterasa no específica que se

extraerá de la aorta de bovino y cuyo pH óptimo está en el rango ácido (fosfatasa

ácida).

Mecanismo de reacción:

En este práctico se usará como sustrato p-nitrofenilfosfato el que al

hidrolizarse genera para-nitrofenol. Este compuesto a pH alcalino presenta un

color amarillo el cual puede ser cuantificado por espectrofotometría a 410 nm. A

esta longitud de onda el coeficiente de extinción molar, eM, es = 17500 M-1 cm-1.

Para determinar la concentración del producto coloreado, se mide la

absorbancia a 410 nm, frente a un blanco que contiene todos los reactivos menos

el sustrato. Aplicando la ley de Lambert y Beer, se calcula la concentración molar

del producto formado. Ley de Lambert - Beer : A = e·c·l, donde A es la

absorbancia, e es el coeficiente de extinción molar, c es la concentración en

moles/L y l es el diámetro de la celda. La velocidad de reacción se obtiene al

relacionar la cantidad de producto formado en el tiempo, mediante la siguiente

ecuación: V = [p-nitrofenol] / Dt. Donde v es la velocidad de la reacción enzimática,

Dt es el tiempo de incubación.

Para determinar los parámetros característicos de una enzima con

comportamiento de Michaelis Menten, se realiza el estudio del efecto de la

concentración de sustrato frente a la velocidad de la reacción. En un principio se

observa que al aumentar la [S] aumenta la velocidad de reacción, hasta que llega

un momento en que aunque se aumente la [S], la velocidad se mantiene

constante. Esta es la Vmáx y se alcanza cuando la enzima se satura con sustrato:

Sin embargo la determinación de Km y Vmáx desde este gráfico no es muy

adecuada, ya que se requiere de gran cantidad de puntos para construir la zona

curva. En cambio si se tratará de una línea recta, esta queda determinada con tres

puntos y es más fácil, extrapolar o interpolar, o calcular una pendiente o una

intersección. Es así como Lineweaver y Burk, linealizaron el comportamiento de

Michaelis-Menten obteniendo una recta que queda representada en el siguiente

gráfico:

Objetivos

* Cuantificar la velocidad de una reacción enzimática

* Aplicar los conceptos teóricos adquiridos en la caracterización de una enzima.

* Encontrar el pH y la temperatura optima de la fosfatasa ácida de aorta de bovino

* Determinar Km y Vmáx de la fosfatasa ácida de aorta de bovino gráficamente y

de la

ecuación de la recta

* Cuantificar la velocidad de la reacción enzimática en presencia de un inhibidor

Materiales por Grupo Reactivos

30 tubos de ensayos solución tampón citrato pH: 3; 4,5; 5,6; 7,5; 9.

3 gradillas solución p-nitrofenilfosfato 30 mM

1 juego de micropipetas P1000, P200,P20 Solución MgCl2 50 mM

puntas azules y amarillas solución de TCA al 30%

3 cubetas solución de NaOH 0,1 M

pipeta vidrio 5 Ml + propipeta

cronometro

Calculadora

Material General

6 espectrofotómetros

4 baños termorregulados ( a 20ºC, 37ºC, 60ºC, 80ºC)

4 placas calefactoras con vaso pp de 250 mL

Hielo

Parafilm

Procedimiento Experimental

A: Efecto de pH

Para determinar el efecto del pH en la actividad enzimática se realizarán

reacciones en distintos soluciones tampón citrato de pHs: 3,0; 4,5; 5,6; 7,5 y 9,0

Prepare una serie de tubos según indica la tabla 1. La enzima debe agregarse en

último lugar.

Tabla Nº1

Volumen (mL) B C 1 2 3 4 5

p-nitrofenilfosfato - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

MgCl2 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

1,25 mL buffer pH 0 0 3,0 4,5 5,6 7,5 9,0

H2O 2,25 2,25 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Enzima 0,5 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

B: blanco no contiene sustrato

C: Control: No contiene enzima y mide la hidrólisis espontánea del sustrato

MgCl2: La enzima es dependiente del magnesio para su actividad.

Cada tubo debe mezclarse por inversión suavemente e incubar a 37ºC por 30 min.

Terminada la incubación, realice los siguientes pasos para cada tubo:

1. Agregar 1 mL de solución de TCA al 30%, mezclar por inversión y dejar en

hielo. El ácido tricloro acético (TCA) detiene la acción enzimática por

desnaturalización ácida de la enzima.

2. Transferir una alícuota de 1mL a un tubo que contenga 5 ml de NaOH 1,0 M. A

pH básico el producto p-Nitrofenol tiene un máximo de absorción a 410 nm.

3. Lea en el Espectrofotómetro cada tubo a 410 nm, usando el tubo B como

blanco. Anote los valores de absorbancia leídos con tres cifras. Al valor de la

absorbancia de cada tubo experimental debe restarle la absorbancia del tubo C.

4. Una vez realizado los cálculos necesarios grafique V (velocidad) versus pH. Se

deberá obtener un valor máximo de velocidad que corresponderá al pH óptimo.

Resultados Actividad Efecto pH

Tabla resultados Nº1

Nº tubo a pH Absorbancia

a pH

Concentración

Producto mM

Velocidad de la

reacción

3.0

4.5

5.6

7.5

9.0

B: Efecto de la temperatura en la reacción enzimática

Se estudiará la reacción a las temperaturas 0ºC, 20ºC; 37ºC; 60ºC; 80ºC y 100ºC.

Prepare los siguientes tubos según la tabla 2

Tabla Nº 2

Volumen (mL) B C T

p-nitrofenilfosfato 0 0,5 0,5

MgCl2 0,25 0,25 0,25

buffer pH 5,6 1,25 1,25 1,25

H2O 1,0 1,0 1,0

Enzima 0,5 0 0,5

1. Prepare seis veces el tubo C (C1, C2,…C6) y seis veces el tubo T (T1, T2…T6).

Mezcle cada tubo por inversión suavemente e incube 30 min. a las temperaturas

indicadas. Es decir un tubo C y tubo T para cada temperatura ( Ej. C1 y T1 a 0ºC)

2. Una vez terminada la incubación se procede para cada tubo en forma idéntica a

la descrita para el efecto del pH (desde el punto 1). Es decir:

1. Agregar 1 mL de solución de TCA al 30%, mezclar por inversión y dejar en

hielo. El ácido tricloro acético (TCA) detiene la acción enzimática por

desnaturalización ácida de la enzima.

2. Transferir una alícuota de 1mL a un tubo que contenga 5 ml de NaOH 1,0 M. A

pH básico el producto p-Nitrofenol tiene un máximo de absorción a 410 nm.

3. Lea en el Espectrofotómetro cada tubo a 410 nm, usando el tubo B como

blanco. Anote los valores de absorbancia leídos con tres cifras. Al valor de la

absorbancia de cada tubo (discuta con sus profesores la factibilidad de usar el

tubo C como blanco). Una vez realizados los cálculos correspondientes corregir

los valores de cada tubo Ti con el correspondiente Ci, grafique V (velocidad)

versus TºC. Determine la temperatura óptima para la enzima

4. Una vez realizado los cálculos necesarios grafique V (velocidad) versus

temperatura. Se deberá obtener un valor máximo de velocidad que corresponderá

a la temperatura óptima.

Resultados Actividad Efecto Temperatura

Tabla resultados Nº2

Nº tubo

a T ºC

Absorbancia a Tº

T C B

Absorbancia

corregida

Concentración

Producto mM

Velocidad de la

reacción

0

20

37

60

80

100

Una vez realizados los cálculos correspondientes corregir los valores de

cada tubo Ti con el correspondiente Ci, grafique V (velocidad) versus TºC.

Determine la temperatura óptima para la enzima.

LABORATORIO N° 5: DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS

1. Determinación enzimática de glucosa

2. Determinación química de la glucosa

Objetivos

Que el alumno:

1. Conozca y domine un método de cuantificación de glucosa

1. Relacione sus conocimientos teóricos con la aplicación práctica y la clínica

2. Domine el fundamento de la reacción

3. Adquiera habilidades y destrezas para realizar la técnica


Fundamento:

La glucosa es oxidada por la enzima glucosa-oxidasa a gluconato y peróxido de

hidrógeno de acuerdo a la siguiente ecuación

Glucosa + O + HO HO + gluconato (GOD)

2HO + fenol + 4-AP Quinonimina + 4 H O (POD)

Reactivos

Reactivo 1 : Compuesta por solución buffer tris 92 mmol/l pH 7.5 y fenol 0.3

mmol/l

Reactivo 2 : Compuesto por glucosa –oxidasa 15.000 U/L . peroxidasa 1000 U/l y

4 –aminofenazona 2.6 mmol/l.

Preparación y estabilidad de las soluciones:

Mezclar ambas soluciones (Reactivo 1 + Reactivo 2) como lo indica el fabricante

Así tenemos listo el reactivo de trabajo el cuál es estable 1 mes entre 2° y 8°C o 7

días a temperatura ambiente

Muestra: suero, plasma o líquido-céfalo-raquídeo (LCR.). La glucosa en el

plasma o suero es estable hasta 3 días mantenida entre 2° a 8° C

Procedimiento:

Blanco Estándar Muestra

Estándar- 20 l -

Muestra- - 20 l

Reactivo2 ml 2 ml 2 ml

1. Mezclar e incubar por 10 minutos a 37° C o 30 minutos a temperatura

ambiente.

2. Medir la absorbancia a 505 nm, sin olvidar ajustar el espectrofotómetro con el

blanco de reactivos.

3. El color es estable por 30 minutos.

Cálculos:

Absorbancia de la muestra

Glucosa (mg/dl ) = x concentración Estándar

Absorbancia del estándar

Mg/dl x 0.0555 = mmol/l

Linealidad: El método es lineal hasta 500 mg/dl

Si la concentración de la glucosa en mayor que 500 mg/ dl, diluir la muestra con

solución salina y repetir la determinación multiplicando por el factor de dilución.

Valores de referencia

Nota: No interfieren en la determinación la presencia de: hemoglobina (4 g/l) ;

bilirrubina (20 mg/l ; creatinina (100 mg/l) ; galactosa 81g/l) y edta (2 g/l)

Bibliografia :

Trinder,P.Ann.Clin.Biochem. 6,24(1969).

Dingeon, B.Ann.Biol.Clin. 33,3(1975)

Lott, J.A.Clin.Chem. 21,1754(1975)

Determinación química de la glucosa

Objetivos

1. Demostración de la Ley de Lambert-Beer.

2. Realizar una Curva de calibración para cuantificar azucares reductores

2. Aplicar la espectrofotometría para la determinación de azucares reductores por

el Método del 3,5-dinitrosalicilato (DNS)

Materiales por grupo Reactivos

Espectrofotómetro Solución Patrón Glucosa 2

mg/mL

4 cubetas Solución 3,5-Dinitrosalicilato

20 tubos de ensayos de 10 mL Muestra Problema Glucosa

(Suero humano)

Placa calefactora

Vortex

2 vasos pp de 250 mL

Micropipetas P1000, P200, P20

1 pipeta graduada de 5 mL

Pizeta

Procedimiento experimental

Curva de Calibración: Determinación de Azucares Reductores por el Método

DNS

Este método se basa en la capacidad de los monosacáridos y algunos

disacáridos en reducir al 3,5-dinitrosalicilato (color amarillo) en medio alcalino

caliente. El compuesto reducido 3-amino-5-nitrosalicilato es de color anaranjado.

La intensidad de este color es directamente proporcional a la cantidad de agente

reductor presente en la muestra.

1. Prepare 8 tubos de ensayos, márquelos y proceda a agregar según la tabla Nº1

2. Coloque simultáneamente todos los tubos en baño María hirviente por 5

minutos

3. Enfríe rápidamente colocando los tubos en agua fría corriente

4. Agregue 3,5 mL de H2O destilada a todos los tubos

5. Lea en el espectrofotómetro a 540nm

6. No olvide ajustar con el Blanco

El tubo rotulado como blanco contiene agua (el solvente del patrón de

glucosa) y el reactivo DNS. Recuerde que este compuesto es coloreado, lo cual

significa que absorbe luz. La absorbancia del blanco debe restarse a la

absorbancia de los tubos que contienen las muestras. Otra forma de proceder es

ajustar el espectrofotómetro con el tubo blanco llevando la lectura de absorbancia

a “cero”.

El tubo rotulado MP corresponde a un suero humano que Ud. deberá

determinar la concentración de glucosa. Realice una dilución 1 en 10, tome 100 L

de esta dilución, agregue 900 L de H2O y 500 L de DNS. Sí la lectura de la MP

está fuera del rango de la curva de calibración deberá repetir con otra dilución.

El rango donde la concentración es directamente proporcional a la

absorbancia de la solución va de 0,05 a 0,50 mg de glucosa. (Para calcular la

concentración de glucosa en cada tubo no debe olvidar que el patrón tiene

concentración 2 mg/mL y la relación para el cálculo de concentración cuando se

realiza una dilución: V1 x C1 = V2 x C2)

Tabla Nº 1

Nº Tubo Vol. L Patrón

glucosa 5 mg/ml

Volumen

H2O L

Volumen

DNS L

Absorbancia

a 540 nm

Concentración

Glucosa

1 10 990 500

2 20 980 500

3 40 960 500

4 60 940 500

5 80 920 500

6 100 900 500

MP 500

blanco 0 1000 500

Resultados

1. Construya una curva de calibración para Glucosa, en papel milimetrado,

Absorbancia (eje y) versus Concentración Glucosa en mg/ml (eje x)

2. Determine la concentración de la muestra problema desde el gráfico curva de

calibración para Glucosa

3. Determine una ecuación que le permita calcular la concentración de cualquier

muestra conocida su absorbancia.

4. Determine la concentración de la muestra problema usando la ecuación

deducida por Ud. Compare los valores encontrados (no olvide que realizó una

dilución)

5. Calcule la concentración de glucosa en suero y exprésela en g / dL

6. Compare los resultados obtenidos por ambos métodos y discútalos.

LABORATORIO N°6: LIPIDOS Y ENZIMAS

Determinación de Colesterol, GOT y GPT

Determinación de Colesterol Libre

Objetivos: que el estudiante:

1. Conozca y domine un método de cuantificación de colesterol

2. Relaciones sus conocimientos teóricos con la aplicación práctica y la clínica

3. Conozca y domine el fundamento de la técnica

1. Adquiera habilidades y destrezas para manejar la técnica

2. Relacione sus conocimientos teóricos en el uso de las enzimas en los

métodos de bioanálisis clínico.

3. Investigue sobre la importancia de la determinación de colesterol

Fundamento o principio:

El colesterol y los ésteres del colesterol son liberados desde las lipoproteínas por

detergentes. La enzima colesterol esterasa hidroliza los ésteres de colesterol

formándose HO en la siguiente reacción enzimática de oxidación del colesterol

por la colesterol oxidasa según la siguiente ecuación:

Ester de colesterol + HO colesterol + ácidos grasos

Colesterol + O colesterol-4-en-ona + HO

HO + 4AP + fenol quinonimina + HO

La cantidad de quinonimina de color rojo formada es

proporcional a la concentración de colesterol

Colesterolesterasa

Colesterol Oxidasa

Peroxidasa

Reactivos:

Reactivo 1: Pipes pH 6.9 90 mmol/l

Fenol 26 mmol/l

Peroxidasa 1250 U/l

Colesterol Esterasa 300 U/l

Colesterol Oxidasa 300 U/l

4-aminofenazona 0,4 mmol/l

Preparación y estabilidad del reactivo: Reactivo listo para usar, el reactivo es

estable entre 2° y 8°C hasta la fecha de expiración como se especifica en el

frasco.

Evitar la luz directa del sol.

Muestra: suero. Estable hasta 3 meses a –20°C y hasta 7 días mantenido a +4°C

Procedimiento

Blanco EstándarMuestra

Standard- 20 l -

Muestra- - 20 l

Reactivo de

trabajo

2 ml 2 ml 2 ml

1. Mezclar e incubar a 37°C por 5 minutos o 10 minutos entre 15° y 25°C

2. Medir la Absorbancia del estándar y la muestra, ajustando el espectrofotómetro

con el blanco de reactivo a 505 nm. El color es estable por 30 minutos.

Cálculos:

Abs. de la muestra

Concentración de colesterol = x concentración del

estándar

Abs. del estándar

mg/dl x 0.0258 = mmol/l

Concentración del estándar: 200 mg/dl

Linealidad del método:

El método es lineal hasta una concentración de 600 mg/dl (15.4 mmol/l)

Si la concentración de colesterol es mayor de 600 mg/dl en el suero o plasma diluir

la muestra con solución salina y repetir la determinación, multiplicando el resultado

por el factor de dilución.

Bibliografia

Trinder P.Ann.Clin. Biochem 6.24(1969)

Flegg H. M. Ann.Clin Biochem 10,79 (1972)

Richmond W. Scand J.Clin. Lab. Supp. 26 Abstract 3,25 (1972)

Deeg R. And Ziegenohrm, J.Clin. Chem 28,1574 (1982)

Determinación de Transaminasas Séricas

Introducción

A: Determinación de GOT

La enzima Glutámico oxalacético transaminasa, GOT, (E.C. 2.6.1.1) cataliza la

reacción de transferencia del grupo amino del aminoácido ácido aspártico al

aceptor a-cetoglutarato, según la siguiente reacción:

GOT

a-cetoglutarato + ácido aspártico ¾® ácido glutámico +

oxalacetato

Sí acoplamos la reacción anterior a la reacción de reducción del oxalacetato a

través de la enzima malato deshidrogenasa (MDH), podemos cuantificar la

actividad de GOT. La enzima MDH requiere de NADH+H+ como cofactor.

MDH

oxalacetato + NADH+H+ ¾® malato + NAD

A 340 nm NADH+H+ presenta el máximo de absorción en tanto que el cofactor

oxidado, NAD, prácticamente no absorbe a esa longitud de onda. La disminución

de la absorbancia por unidad de tiempo del NADH+H+ a 340 nm es directamente

proporcional a la actividad de la enzima GOT. Para realizar esta actividad práctica

Ud. recibirá un kit reactivo que contiene las siguientes sustancias:

Reactivo A: Tampón Tris-HCl pH 7,7 30 mM, Aspartato de sodio 280mM, EDTA 7

mM

Reactivo B: NADH+H+ 0,25 mM, MDH ³ 600 U/L, LDH ³ 250 U/L, a-

cetoglutarato, sal sódica 12 mM.

Al momento de usar se mezclan ambos reactivos y se conservan entre 2 y 8 ºC y

es estable durante 5 días conservado a esta temperatura. Se incluye LDH para

eliminar el piruvato endógeno durante la fase final.

Se usa como muestra suero o plasma obtenido con heparina, EDTA o citrato. El

suero no debe presentar hemólisis.


Espectrofotómetro Reactivo A

Cubetas Reactivo B

Pizeta

Vaso pp de 250

Micropipetas p1000, p200


Mezclar según se indica en la siguiente tabla

Volumen (mL)

Reactivo A y B a 37ºC 1,0

Suero 0,1

Después de 1 minuto medir la absorbancia a intervalos de 1 min. durante 10

minutos a 340 nm. Cuide que la temperatura permanezca estable a 37ºC. Es

posible operar a 30 ºC. Determine DA / min desde un gráfico Absorbancia versus

tiempo en minutos. Use este valor para determinar la actividad GOT en el suero

que esta analizando.

Cálculos:

a 37 ºC UI/L = DA / min x 2570

a 30ºC UI/L = DA / min x 1770

Valores de Referencia

Hombres hasta 40 UI/L a 37 ºC (y 25 UI/L a 30 ºC)

Mujeres hasta 35 UI/L a 37 ºC (y 23 UI/L a 30 ºC)

B: Determinación de GPT:

La glutámico pirúvico transaminasa, GPT (E. C. 2.6.1.2.) es la enzima que cataliza

la transferencia del grupo amino del aminoácido alanina a a-cetoglutarato,

liberando piruvato según la siguiente reacción:

GPT

a-cetoglutarato + alanina ¾® ácido glutámico + piruvato

Sí acoplamos la reacción anterior a la reacción de reducción del piruvato a través

de la enzima láctica deshidrogenasa (LDH), podemos cuantificar la actividad de

GPT. La enzima LDH requiere de NADH+H+ como cofactor.

LDH

Piruvato + NADH+H+ ¾® lactato+ NAD

A 340 nm NADH+H+ presenta el máximo de absorción en tanto que el cofactor

oxidado, NAD, prácticamente no absorbe a esa longitud de onda. La disminución

de la absorbancia por unidad de tiempo del NADH+H+ a 340 nm es directamente

proporcional a la actividad de la enzima GPT. Para realizar esta actividad práctica

Ud. recibirá un kit reactivo que contiene las siguientes sustancias:

Reactivo A: Tampón Tris-HCl pH 7,7 30 mM, Alanina 450 mM, EDTA 6 mM

Reactivo B: NADH+H+ 0,25 mM, LDH ³ 250 U/L, a-cetoglutarato, sal sódica 12

mM.

Al momento de usar se mezclan ambos reactivos y se conservan entre 2 y 8 ºC y

es estable durante 5 días conservado a esta temperatura.

Se usa como muestra suero o plasma obtenido con heparina, EDTA o citrato. El

suero no debe presentar hemólisis.


Espectrofotómetro Reactivo A

Cubetas Reactivo B

Pizeta

Vaso pp de 250

Micropipetas p1000, p200


Mezclar según se indica en la siguiente tabla

Volumen (mL)

Reactivo A y B a 37ºC 1,0

Suero 0,1

Mezclar e incubar 5 a 10 minutos a 37ºC. Después de 1 minuto medir la

absorbancia a intervalos de 1 min. durante 10 minutos a 340 nm. Cuide que la

temperatura permanezca estable a 37ºC. Es posible operar a 30 ºC en este caso

debe emplear 0,1 mL de suero y 1,0 mL de reactivo. Determine DA / min. desde un

gráfico Absorbancia versus tiempo en minutos. Use este valor para determinar la

actividad GOT en el suero que esta analizando.

Cálculos:

a 37 ºC UI/L = DA / min x 3570

a 30ºC UI/L = DA / min x 1770

Valores de Referencia

Hombres hasta 40 UI/L a 37 ºC (y 25 UI/L a 30 ºC)

Mujeres hasta 35 UI/L a 37 ºC (y 23 UI/L a 30 ºC)

Cuestionario

1. Investigue por qué se deben conocer los valores de GOT y GPT

2. Investigue como interfiere y en que concentración citrato y EDTA (usado como

anticoagulante).

3. ¿Qué diferencia hay entre suero y plama sanguíneos?

4. ¿Da lo mismo utilizar suero o plasma en las determinaciones de GOT y GPT?

Explique

5. Investigue como es el espectro de absorción del NAD y del NADH. ¿Cómo se

relacionan con esta actividad experimental?

INFORME LABORATORIO Nº1

Titulación de aminoácidos. Determinación de pKa1, pKa2, pI.

INTEGRANTES GRUPO: SECCION: …… FECHA:………….

1…………………………………………………..2…………………………………………………..3…………………………………………………..

RESULTADOS

1. Complete siguiente tabla: (debe adjuntar los gráficos correspondientes y los cálculos en el grafico o al reverso del) (2 puntos)

aa pK1 pK2 pKR pI

2. Dibuje la estructura predominante a cada pH de cada aminoácido estudiado en

la titulación (2 puntos):

Aminoácido 1:………………



Discusión: (2 puntos):

Busque en bibliografía los valores de pKa1, pKa2 , pKR y pI, informados para los

aminoácidos que Ud. tituló y compare con sus resultados.

Conclusión:

INFORME LABORATORIO Nº2 Espectrofotometría. Determinación de Proteínas séricas por los métodos de Biuret y Bradford

INTEGRANTES GRUPO: SECCION: …… FECHA:………….1…………………………………………………..2…………………………………………………..3…………………………………………………..

Resultados (4 puntos)

1. Curva de Calibración: Determinación de Proteínas por el Método de

Bradford


Albúmina 1 mg/ml

Volumen

H2O L

Volumen

Bradford

L

Absorción

a 595 nm

Concentración

Proteína

1 2 998 1000

2 4 996 1000

3 6 994 1000

4 8 992 1000

5 10 990 1000

6 15 985 1000

MP 1000

blanco 0 1000 1000

Grafico Nº1: Curva de Calibración: Determinación de Proteínas por el Método

de Bradford (Papel Milimetrado)

Cálculos: Ejemplo de cálculo de dilución y de la determinación de la concentración de proteínas en suero humano.

2. Curva de Calibración: Determinación de Proteínas por el Método de Biuret


Albúmina 20

mg/ml

Volumen

H2O L

Volumen

Biuret L

Absorción

a 540 nm

Concentración

Proteína

1 2 998 1000

2 4 996 1000

3 6 994 1000

4 8 992 1000

5 10 990 1000

6 15 985 1000

MP 1000

blanco 0 1000 1000

Grafico Nº2: Curva de Calibración: Determinación de Proteínas por el Método

de Biuret (Papel Milimetrado)

Discusión (2 puntos)

Conclusión

INFORME LABORATORIO Nº3

Electroforesis de Proteínas

Determinación de la Masa Molar de una Proteína


1. Resultados. Incluya la Fotografía

Rf estándar MM estándar Rf MP MM proteína

Problema

1

2

3

4

5

6

Cálculos: Ejemplo de cálculo para un estándar y cálculos para la Muestra

problema


Conclusión

INFORME LABORATORIO Nº4 : Enzimología.

Extracción y Caracterización de la Fosfatasa Ácida de Aorta de Bovino;

efecto del pH y de la temperatura


Resultados (

1. Efecto del pH sobre la Actividad enzimática

Nº tubo a pH Absorbancia

a pH

Concentración

Producto mM

Velocidad de la

reacción

3.0

4.5

5.6

7.5

9.0

blanco

control

Cálculos. Efecto de pH

Gráfico: Efecto del pH sobre la actividad enzimática

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Nº tubo a T ºC Absorbancia

a Tº

Concentración

Producto mM

Velocidad de la

reacción

0

20

37

60

80

100

blanco

control

Cálculos. Efecto de la Temperatura sobre la actividad enzimática

Grafico: Efecto de la Temperatura sobre la actividad enzimática

INFORME LABORATORIO N° 5: DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS


2. Determinación química de la glucosa


Resultados

Determinación Enzimática de Glucosa


Absorbancia

Concentración Glucosa

Cálculos:

Determinación química de la glucosa:

Escriba la reacción entre Glucosa y 2,4 dinitrosalicilato en medio alcalino

TABLA Nª1Nº Tubo Vol. L Patrón

glucosa 5 mg/ml

Volumen

H2O L

Volumen

DNS L

Absorbancia

a 540 nm

Concentración

Glucosa

1 10 990 500

2 20 980 500

3 40 960 500

4 60 940 500

5 80 920 500

6 100 900 500

MP 500

blanco 0 1000 500

Cálculos:


Conclusión

INFORME LABORATORIO Nº6 : LIPIDOS Y ENZIMAS

Determinación de Colesterol, GOT y GPT


Resultados

1. Determinación de Transaminasas Séricas: GOT y GPT

A. Determinación de GOT

Tiempo (min) Absorbancia

Gráfico Absorbancia vs tiempo

Cálculos: Determinación actividad GOT

2. Determinación de GPT:

Tiempo (min) Absorbancia

Gráfico Absorbancia vs tiempo

Cálculos: Determinación actividad GOT

1. Determinación de Colesterol Libre


Absorbancia

Concentración Colesterol

Cálculos:

Discusión

Conclusión

Anexo 1

Uso de micropipetas

Las micropipetas se utilizan para tomar pequeños volúmenes que van de 0,01 a 1000µL

Partes de la pipeta

A) EmboloB) EmpuñaduraC) Expulsor de puntasD) MangoE) PantallaF) CollarG) ConoH) Punta o tips

Ajuste del volumen:El volumen de la pipeta se muestra claramente en la pantalla

situada en el mango. El ajuste del volumen se lleva a cabo

girando fácilmente el émbolo o la rueda en dirección de las

agujas del reloj o en contra las agujas del reloj (dependiendo

de la cantidad que se requiera).

IMPORTANTE: Cada pipeta tiene un rango en el cuál se puede trabajar, si se fuerza el

embolo o rueda fuera del rango, se daña el mecanismo de la pipeta descalibrándola (lo que

significa que después no toma el volumen que señala la pantalla).

Las pipetas que utilizaremos en el laboratorio son:

BC

D

E

G

A

F

H

p20 tiene un rango de entre 2 y 20 µL

p200 tiene un rango de entre 20 a 200 µL

p1000 tiene un rango de entre 200 a 1000 µL

No pipetear por debajo y por sobre el volumen que tiene cada una de las pipetas, ejemplo: si

está usando la p20 y necesita tomar 21 µL, debe pasar a la pipeta siguiente que sería la p200

que va de 20 a 200 µL.

En la pantalla usted podrá ver el orden de los números y significan lo siguiente p20 decena p200 centena p1000 unidad de mil

unidad decena centena decimal unidad decena

ejemplo 2,5 µL 125 µL 990 µL

Inserción y expulsión de puntas:

Antes de insertar la punta asegúrese que el cono esté limpio. Presione la

punta en el cono de la pipeta firmemente para asegurar su correcta

inserción. El ajuste es correcto cuando se forma un anillo visible entre la

punta y el cono de la micropipeta.

Cada pipeta viene provista de un dispositivo expulsa puntas que reduce el resigo

de contaminación por manipulación. El dispositivo expulsa puntas debe ser

presionado con firmeza, para asegurar su expulsión, asegúrese que esta se

realiza en un contenedor de desechos.

Pipeteo:

Certifique que la punta está firmemente insertada en el cono. Para que los

resultados sean satisfactorios deberá presionarse el émbolo de forma suave y lenta,

particularmente con líquidos viscosos.

025

125

099

Posición de partida Primera parada Segunda parada

Mantenga la pipeta verticalmente mientras tenga líquido en la punta. Asegúrese que el

contenedor donde va a realizar la dispensación está limpio y que la pipeta, la punta y el

líquido estén a la misma temperatura.

a) Presione el botón del émbolo hasta la primera parada o tope.

b) Sitúe la punta (2 a 3 mm) debajo de la superficie del líquido y suavemente libere el

émbolo. Retirar cuidadosamente la punta del líquido, tocando contra la pared del

recipiente para libera el exceso de líquido.

c) El líquido es dispensado presionando el émbolo hasta la primera parada. Luego de

una corta interrupción continuar presionando en émbolo hasta la segunda parada o

tope.

d) Este procedimiento vaciará completamente la punta asegurándonos la precisión de

la dispensación.

Recomendaciones para un buen pipeteado:

a) Mantener la pipeta verticalmente y situar la punta unos mm por debajo de la

superficie del líquido.

b) Cuando se dispensen líquidos espesos o viscosos es conveniente aspirar y

dispensar por lo menos 5 veces antes de realizar el pipeteo definitivo.

c) Controlarlos movimientos de la mano manteniéndolos constante.

d) Cuando se pipeteen líquidos que tienen temperatura diferente a la del medio

ambiente, enjuagar varias veces la punta antes e usarla.

Anexo 2

Uso de espectrofotómetro

Enchufar y encender el espectrofotómetro al menos 10 minutos antes de se utilizado. (para

que se caliente la fuente de luz).

Seleccionar el filtro que corresponda a la determinada longitud de onda.

Girando la rueda.

Una vez escogida la longitud de onda, seleccione la opción de absorbancia

apretando la tecla (1), y lleve el espectro a cero apretando la tecla (2).

Para realizar las mediciones le cubeta o celdilla debe ubicarse

de acuerdo a la dirección del haz de luz, para verificar la

dirección levantando la tapa y mirando en el interior. La cubeta

se debe usar por el lado transparente, no por el lado achurado.

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lab odontologÃa 4 al 6[1]

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