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7/28/2019 Lab Callos

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Escuela Politcnica del Ejrcito Cultivo de Tejidos Vegetales 2013-06-16.

OBTENCIN DE CALLOS A PARTIR DE ZANAHORIA (Daucus carota)

AYALA, Christian. FREIRE, Viviana.

RESUMEN. Los callos son cmulos de clulas indiferenciadas que se dividendesordenadamente. Son una herramienta para varios procesos del cultivo de tejidosdebido a su caracterstica de poder regenerar cualquier rgano.Para obtener callos a partir de raz de zanahoria (Daucus carota), se desinfectaron lasmuestras con detergente y cloro. Se obtuvieron los explantes de una zona cercana alcambium, para que de esta manera la proliferacin celular sea ms abundante. Losexplantes fueron sembrados en un medio MS enriquecido con azcar, BAP y 2,4-D y se loevalu durante 3 semanas.

Al final de las tres semanas se encontr que el 22% de los explantes estabancontaminados. Y que el 69% ya haba iniciado con el proceso de formacin de callo.La falta de tiempo de cultivo evito que se obtengan callos completos ya que estos

requieren de uno a tres meses de cultivo para aparecer.

INTRODUCCIN.

Los callos son masas celulares amorfasproducto de la proliferacin de las clulasdel parnquima. No presentan

organizacin y son centros localizados deactividad meristmatica (Lallana y Lallana,2003).

En muchas especies los callos aparecencomo producto de una herida a fin deregenerar las porciones perdidas de laplanta. Pero mediante el uso de tcnicasde cultivo in vitro se puede inducir el

aparecimiento de callos en distintosrganos y tejidos de varias especiesvegetales (Dodd y Lorin, 1982 cit. porLallana y Lallana 1991)


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Lallana y Lallana 1991)


Los cultivos de callos son ampliamenteusados en Biotecnologa, ya que son una

herramienta que se aplica para lamanipulacin gentica, tcnicas demicropropagacin, embriognesis yorganognesis indirecta, y para laproduccin de productos de interscomercial (McDonald, 1995 cit. porBadillo, et al., 2008).

El uso de Daucus carota (zanahoria) parael cultivo de callos se ha realizado desdela realizacin de los primeros cultivosexperimentales en 1939 (Lallana yLallana, 2003).

Stewart y Reinert (1958 cit. por Dodd yRoberts, 1985) as como Roca y Mroginski(1991) han establecido a la zanahoriacomo un organismo modelo para laproduccin de callo.

En esta prctica se usaran explantes de

Daucus carota con el fin de inducir laformacin de callo en cultivo in vitro.

MATERIALES Y MTODOS

con 3 gotas de Tween 20. Finalmente selleva las muestras sumergidas en cloro a

la cmara y se realizan 3 lavados conagua estril.

Para la siembra se obtiene un fino cortetransversal de la zanahoria, asegurndoseque se observe el cambium. Se divide elexplante en cuatro pedazos triangulares

asegurndose de eliminar todo el tejidoquemado por el cloro.

Se siembran cuatro explantes en cadafrasco con medio MS enriquecido con 30 gde azcar, 0.5 mg/L de BAP y 3mg/L de2,4-D.

RESULTADOS.

La siembra de los explantes de zanahoriase realiz el 22 d mayo, y se los evalocada semana a fin de observar comoavanzaba el cultivo de callos. La tabla

completa de las observaciones semana asemana puede observarse en el Anexo 1.

Durante la primera semana se pudo


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Figura 1. A) Contaminacin bacterianaen los explantes. B) Explanteshinchados.

Durante la segunda y tercera semana seobserv como los explantes seguancreciendo y se iniciaba la formacin decallo. Algunos tomaron una ligeracoloracin verdosa (ver Figura 2).

Grfica 1. Contaminacin en losexplantes luego de tres semanas.

En cuanto a la diferenciacin de losexplantes al final de las 3 semanas seobtuvo que el 69% de los explantes inici

el proceso de formacin de callo.

22%0%

78%

Contaminacin

Contaminacin

bacteriana

Contaminacin

con hongos

Sin

contaminacin

6%

25%

69%

0%

Desdiferenciacin

Sin cambios

Ensanchamiento

Formacin parcialde calloFormacin total de

callo

A B


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Como en este caso los cultivos semantuvieron por tres semanas y por este

motivo solo se pudo observar elaparecimiento de callos parciales.

El crecimiento de los callos depende de lazona de toma del explante. Explantes delfloema dan lugar a un crecimiento muypobre. Explantes obtenidos de zonas

cercanas al cambium son los quepresentan una gran proliferacin(Gautheret, 1959 cit. por Dodd y Roberts,1985).

Como se observa en la Figura 2, en elrecuadro B, los explantes obtenidos de

una zona cercana al cambium hanadquirido un tamao considerable, y demantener el cultivo por ms tiempo sehubiera esperado la obtencin de callosde gran tamao.

La induccin de callos en zanahoria puede

dar como resultado la obtencin de callosfriables o no friables, siendo siemprepreferible un callo friable que presenta

Los callos crecen generalmente demanera lenta y para evitar que les falten

los nutrientes deben realizarse subcultivoscada 28 das (en el caso de zanahoria)(SEDICI, S/A).

Es importante tener en cuenta el tamaodel inculo al momento del subcultivo, yaque porciones muy reducidas de callo,

ocasionaran una tasa de crecimiento muybaja (Lallana y Lallana, 2003).

CONCLUSIONES

A fin de obtener una buena proliferacinde callo en es necesario obtener un buen

explante. En el caso de Daucus carota elmejor crecimiento de callo se logra conexplantes de zonas cercanas al cambium.

Al final de las tres semanas se encontrque el 22% de los explantes secontaminaron con bacterias y que el 69%

ya se encontraban en proceso deformacin de callo.

Se obtuvo tan solo inicios de formacin de


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SERRANO, M. PIOL, M. (1991).Biotecnologa Vegetal. Sntesis Editorial.

BADILLO, J. OLIVER, M. MORENO, K.PACHECO, V. CORTES, H. (2009).Manual de Laboratorio de Cultivo deTejidos. Departamento de Bioprocesos.Instituto Politcnico Nacional. Mxico D.F.,Mxico.

DODD, J. ROBERTS, L. (1958).Experiments in Plant Tissue Culture.Segunda Edicin. Cambridge UniversityPress. USA.

SEDICI, Cultivo in vitro. Universidad

Nacional de La Plata. Buenos Aires,Argentina.

.


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Escuela Politcnica del Ejrcito Cultivo de Tejidos Vegetalts 2013-05-10.

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ANEXO 1

EVALUACIN SEMANAL DE LOS CULTIVOS DE CALLO DE Daucus carota

FECHA DE EVALUACI N: 28-05-2013

N DE FRASCO EXPLANTECONTAMINACIN

(HONGO O BACTERIA)DESDIFERENCIACIN* OBSERVACIONES

1

Raz 1 Bacteriana 0

Presencia de tejido

necrosado por el cloro

Raz 2 Bacteriana 1

Raz 3 No contaminacin 0Raz 4 No contaminacin 0

2

Raz 1 Bacteriana 1 NingunaRaz 2 Bacteriana 1 NingunaRaz 3 No contaminacin 1 Ninguna

Raz 4 No contaminacin 1 Ninguna

3

Raz 1 No contaminacin 1 NingunaRaz 2 No contaminacin 1 NingunaRaz 3 No contaminacin 1 Ninguna


4

Raz 1 No contaminacin 1 NingunaRaz 2 No contaminacin 1 NingunaRaz 3 No contaminacin 1 Ninguna

Raz 4 No contaminacin 1 Ninguna* Escala 0ningn cambio, 1 inicio de encorvamiento del explante o ensanchamiento, 2 formacin parcial de callo, 3 formacin completa de callo


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EVALUACIN SEMANAL DE LOS CULTIVOS DE CALLO DE Daucus carota(cont.)

FECHA DE EVALUACIN: 07-06-2013



1

Raz 1 Bacteriana 1

Presencia de tejidonecrosado por el cloro

Raz 2 Bacteriana 1Raz 3 No contaminacin 1Raz 4 No contaminacin 0

2

Raz 1 Bacteriana 1 NingunaRaz 2 Bacteriana 1 Ninguna


Raz 4 No contaminacin 2El explante presenta

coloracin verdosa enuna punta

3

Raz 1 No contaminacin 2

Ligera coloracin verdeRaz 2 No contaminacin 2Raz 3 No contaminacin 2


4


Ligera coloracin verdeRaz 2 No contaminacin 2Raz 3 No contaminacin 1

Raz 4 No contaminacin 2* Escala 0 ningn cambio, 1 inicio de encorvamiento del explante o ensanchamiento, 2 formacin parcial de callo, 3 formacin completa de callo


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EVALUACIN SEMANAL DE LOS CULTIVOS DE CALLO DE Daucus carota(cont.)

FECHA DE EVALUACI N: 10-06-2013



1

Raz 1 Bacteriana 1

Presencia de tejidonecrosado por el cloro

Raz 2 Bacteriana 1Raz 3 No contaminacin 1


2

Raz 1 Bacteriana 1 NingunaRaz 2 Bacteriana 2 Ninguna


Raz 4 No contaminacin 2El explante presenta

coloracin verdosa enuna punta

3


Ligera coloracin verde



4


Ligera coloracin verdeRaz 2 No contaminacin 2


* Escala 0 ningn cambio, 1 inicio de encorvamiento del explante o ensanchamiento, 2 formacin parcial de callo, 3 formacin completa de callo

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