La replicazione del DNA

Modelli proposti per la replicazione del DNA

� Alla fine degli anni 1950 erano stati proposti tre modelli per la replicazione del DNA

� Modello Conservativo

� Entrambe le eliche parentali rimangono unite insieme dopo la replicazione

� Modello Semiconservativo

� La doppia elica del DNA dopo la replicazione contiene una elica parentale ed una elica figlia (di nuova sintesi)

� Modello Dispersivo

� Le eliche parentali sono distribuite in maniera dispersa nelle doppie eliche del DNA dopo la replicazione

I tre modelli per la replicazione del DNA

Esperienza di

Meselson e Stahl

(1958)

Interpretazione dei dati

After one generation, DNA is “half-heavy”

After ~ two generations, DNA is of two types: “light” and

“half-heavy ”

This is consistent with only the semi-conservative model

La replicazione in E.coli (Cairns 1963)

La replicazione del DNA in vitro

� Studi pioneristici sulla replicazione in vitro del DNA

Arthur Kornberg - premio nobel nel 1959

Kornberg osservò replicazione utilizzando

� Estratto proteico di E. coli

� DNA stampo� DNA stampo

� Nucleotidi radiomarcati

� Incubazione per consentire la sintesi del DNA

� Aggiunta di acido per precipitare il DNA

� Centrifugazione per separare il DNA dai nucleotidi liberi

Arthur Kornberg

nel 1955-58 isola

la DNA polimerasi I

La sintesi avviene in direzione 3’ -> 5’

L’energia per la

formazione del

legame è portata

dal nucleotide

entrante e non

dalla catena in dalla catena in

crescita

Importante per la

correzione degli

errori

La DNA polimerasi I

La DNA polimerasi I

Attività esonucleasiche della DNA pol IEsonucleasi 3’->5’ proofreading

o correttore di bozze

Attività esonucleasiche della DNA pol IEsonucleasi 5’->3’ sintesi di riparo

Struttura ai raggi X del frammeno di Klenow della DNA-polI di E.coli

La DNA polimerasi I

Lo stesso sito attivo per i 4 dNTP

Gli ioni Mg stabilizzano la struttura dello stato di transizione pentacovalente

La DNA polimerasi I

La DNA polimerasi I

Incorporazione di un nucleotide errato 10000 volte più lenta

La DNA polimerasi I

• cambio conformazionale della

DNA pol I prima della

formazione del legame

covalente

• attività esonucleasica per

correggere l’errore

L’energia per la formazione del

legame è portata dal

nucleotide entrante e non dalla

catena in crescita

Meccanismo di proofreadingCorrezione della incorporazione errata di nucleotidi

(forme tautomeriche dei nucleotidi)

La DNA polimerasi richiede un innescoEstremità 3’-OH libera

La replicazione del DNA

La Replicazione necessita di un apparato

enzimatico complesso:

-DNA Polimerasi

-Proteine iniziatrici

-Primasi e Elicasi;

-Proteine che stabilizzano il DNAss e lo proteggono dalla

degradazione;

-Proteine che stimolano le DNA polimerasi.

-Topoisomerasi che eliminano i superavvolgimenti

-Ligasi

DNA elicasi

DNA elicasi-proteine esameriche processive aprono la doppia elica

DNA elicasi

Topoisomerasi rimuovono

i superavvolgimenti

introdotti dall’azione delle elicasi

DNA topoisomerasi

DNA topoisomerasi

Single strand DNA binding proteins (SSBP)

SSB Proteins

DNA

Filamento leader e filamento ritardato

Leading strand e lagging strand

Frammenti di Okazaki

Processività

Processività

Sliding clamp:

proteine con stuttura esagonale

conservate nell’evoluzione conservate nell’evoluzione

(PCNA negli eucarioti)

Sliding clamp isolate da differenti organismi.

Posizionate sul DNA utilizzando ATP

Fasi della replicazione

Eliminazione del primer

procarioti eucarioti

Reazioni catalizzate dalla DNA ligasi in E.coli.

Negli eucarioti NAD+ è rimpiazzato da ATP

LA REPLICAZIONE DEL DNAMeccanismi comuni tra procarioti ed eucarioti

DNA molecola a doppia elica Ogni elica funziona da stampo

Elica parentale Sintesi elica complementare

Sintesi del DNA 5’�3’ DNA-polimerasi

Richiesta di inneschi o primer RNA-polimerasiRichiesta di inneschi o primer RNA-polimerasi

Forca di replicazione Replicazione bidirezionale

Elica parentale 3’�5’ Replicazione continua(leading strand)

Elica parentale 5’�3’ Replicazione discontinua(lagging strand)

Frammenti di Okazaki 100-1000 nt

DNA-POL NEI PROCARIOTIDNA-polimerasi I - Riparo, rimozione primer, solo su doppia elica

(3 attività catalitiche)DNA-polimerasiEsonucleasi (3’�5’) Esonucleasi (5’�3’) Scissione proteolitica produce due frammentiFrammento piccolo (1-323) attività 5’�3’ EsonucleasiFrammento di Klenow (324-928) attività polimerasi e 3’�5’ esonucleasi

dominio 324-517 3’�5’ esonucleasi dominio 517-928 DNA-polimerasi (scissura profonda)

DNA-polimerasi II – RiparoDNA-polimerasi II – Riparo(2 attività catalitiche)

DNA-polimerasiEsonucleasi (3’�5’)

DNA-polimerasi III – Replicazione(2 attività catalitiche)

DNA-polimerasiEsonucleasi (3’�5’) (proofreading)

Cosituita da varie subunità ed un CORE catalitico composto da:Subunità α (Gene polC di E.Coli ) Attività polimerasiSubunità ε Attività 3’�5’ esonucleasiSubunità θ

REPLICAZIONE IN E.ColiInizio della replicazione nel locus OriC (~250bp AT-rich)

La proteina DnaA si lega ad OriC (richiesto ATP)Si associa la proteien DnaB (elicasi) esamerica –> unwinding (richiesto ATP)DNA-girasi (topoII) elimina supercoilingSSB proteins mantengono il DNA a singola elica

Sintesi dei primers o inneschiSintesi primer a RNA sulle leading e ladding strandsPrimosome (600 kDa contiene DnaB-elicasi e DnaG-primasi)

Sintesi del DNALa sintesi è catalizzata dalla DNApol-IIILa sintesi è catalizzata dalla DNApol-IIIReplisoma (2 DNA-pol-III una per lading ed una per lagging strand)2 subunità β formano un anello che scorre lungo il DNALa leading strand viene duplicata in maniera continua (1000 nt/sec) La lagging strand forma un loop e richiede un nuovo primer ogni 1000 nt

frammenti di OkazakiRimozione dei primers

DNA-pol-I rimuove i primers e sintetizza il DNAUnione dei frammenti

DNA-ligasi unisce le interruzioniTermine della replicazione

Regione terminatore, opposta a OriC (sequenze terminatrici TerE-F)Proteine Tus si legano ai siti Ter impedendo l’apertura dell’elica del DNA

replicatore: sequenze agenti in cis ricche in AT

verde:siti di legame dell’iniziatore

blu:elementi di apertura della doppia elica

l’iniziatore di E.coli, la proteina DnaA,è regolata da ATP e da SeqA

Iniziatore interagisce con il DNA e altri fattori

Inizio della replicazione in E.coli

Oloenzima della DNA pol III

REPLICAZIONE IN E.Coli

REPLICAZIONE IN E.Coli

Rimozione dei primer e completamento delle

interruzioni

Il problema della ri-replicazione

Controllo della ri-replicazione

Termine della replicazione

� Il termine della replicazione avviene a livello della

regione ter del cromosoma di E. coli

� La regione ter è ricca in G e T e segnala il termine

della replicazionedella replicazione

� La regione terminatore ter è specificamente legata

dal fattore Tus

� Tus impedisce il passaggio della forca di replicazione

inibendo l’attività elicasica

Terminazione della replicazione in E.coli

Proteina Tus-terminator utilization substance

DNA-POL NEGLI EUCARIOTIDNA polimerasi α: NUCLEARE

Attività primasiAttività esonucleasica assente (no proofreading)Processività moderata: 100 nt/secCoinvolta nella replicazione -> Replicazione lagging strand

DNA polimerasi β: NUCLEAREPartecipa al riparo del DNA

DNA polimerasi γ: MITOCONDRIALESimile nei cloroplasti -> Replicazione DNA non-nucleare

DNA polimerasi δ: NUCLEAREDNA polimerasi δ: NUCLEAREPriva di attività primasiSolo attività 3’�5’ esonucleasiProcessività elevata specie se associata a PCNA

PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN (PCNA)3 subunità a forma di anelloSimile alla subunità β della DNApol-III

Complesso PCNA-DNAPol δ -> Replicazione lagging/leading strand

DNA polimerasi ε: NUCLEAREElevata processività anche in assenza di PCNASolo attività 3’�5’ esonucleasiRiparo danni da radiazioni UV (Replicazione lagging strand)

REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTIInizio della replicazione

Siti di origine multipli (ogni 3-300 kb)Replicazione non simultanea in tutte le originiUnità di replicazione -> REPLICON con una origineAttivazione sequenziale di gruppi costituiti da 20-80 replicons adiacentiMeccanismo non completamente notoNel lievito:

Inizio replicazione -> ARS (Autonomously replicating sequences) Sequenze di 11bp adiacenti a regioni di DNA facilmente denaturabiliRichiesta attività elicasi (MCM)

Problemi correlati alla replicazione del DNA eucarioticoSincronizzazione della replicazione

Sincronizzazione con il ciclo cellulareStruttura cromatina

DNA eucariotico organizzzato in livelli strutturaliPrimo livello -> nucleosomiDisassemblaggio nucleosomi prima dell’apertura della doppia elicaRiassemblaggio dei nucleosomi dopo la duplicazione

Replicazione estremità 5’Incompleta duplicazione estremità 5’ terminaliTelomeri (sequenze ripetitive)Telomerasi -> duplicazione estremità terminali

“ “ “ “

Origini di replicazione multiple negli eucarioti

ogni 30000 300000 nucleotidi (10.000 100.000 ori nell’uomo)

E.coliLievito

1500

4200 kb40 kb

50.000 bp/min3.600 bp/min

Organismo No. direpliconi

Lunghezzamedia

velocità dellaforca

I repliconi dei genomi di vari organismi

LievitoDrosophilaXenopusTopoVicia faba

5003.500

15.00025.00035.000

40 kb40 kb

200 kb150 kb300 kb

3.600 bp/min2.600 bp/min

500 bp/min2.200 bp/min

Origini multiple della replicazione negli eucarioti

ORC lega e idrolizza ATP

ORC lega e idrolizza ATP

Sintesi del primer

negli eucarioti

switching della polimerasi

Struttura ai raggi X dell’antigene nucleare di proliferazione cellulare PCNA

Allungamento

I nucleosomi durante la replicazione

ORC: origin recognition complex

Cdc6, Cdt1: caricatori dell’elicasi

Cdk: chinasi ciclina dipendenti

Attivazione della CDK chinasi ciclina dipendente

I TELOMERIReplicazione estremità 5’ del lagging strand

L’ultimo primer utilizzato non può essere rimosso

Accorciamento del DNA alle estremità

• costituiti da ∼1000 ripetizioni di una piccola sequenza G-RICH (GGGGTTA)estensione a singola elica di 12–16 nucleotidi all’estremità 3’ (G-tail)

• G-tail funziona da stampo per il primer che inizia l’ultimo frammento di Okazaki della lagging strand

alle estremità

TELOMERI: Estremità di ciscun cromosoma

REPLICAZIONE TELOMERICAMentre la forca di replicazione si muove verso l’estremità del cromosoma la replicazione della lagging C-strand genera un DNA con una estremità 3’-sporgente a singolo filamento detta G-tail come risultato della eliminazione del primer di RNA dell’ultimo frammento di Okazaki.La replicazione della leading G-strand può duplicare completamente il DNA completamente il DNA lasciando una estremità piatta che però non è substrato della Telomersi. In questo caso l’estremità 3-sporgente (G-tail) viene generata mediante degradazione esonucleasica della C-strandLa telomerasi estende la G-strand mentre la DNA-polimerasi completa la sua duplicazione (attraverso il meccanismo convenzionale)

Le freccie indicano le estremita 3’

Le linee azzurre indicano la replicazione della leading e lagging strands

Le barre azzurre rappresentano i primers di RNA

Le linee rosse indicano l'allungamento prodotto dalla telomerasi

LA TELOMERASISintetizza e mantiene il DNA telomerico• È una ribonucleoproteina• La molecola di RNA contiene una sequenza (UAACCCC nei mammiferi)

complementare all’unità ripetitica telomerica (GGGGTTA nei mammiferi) • La subunita TERT ("TElomere Reverse Transcriptase") possiede l’attività catalitica• La telomerasi è una trascrittasi inversa (sintetizza DNA su stampo di RNA)

Mantenimento del DNA telomerico:

•G-rich strandTelomerasi

Rif (Rap1 interacting factors)

Cdc13 e Stn1G-tail binding

proteins

•C-rich strandDNA-polimerasi

RPAssDNA binding

protein

Rap1(repressor/activator-site

binding protein) in S. cerevisiae

TRF1(telomeric-repeat binding factor-1)

in humans

Rap1/TRF1Sequence specific

dsDNA binding protein

LA TELOMERASI

Struttura dell’oligonucleotide telomerico detto “quartetto G”

Discheratosi congenita: perdita della funzione della telomerasi

MALFUNZIONAMENTO NEI TELOMERI

La degradazione delle estremità 5’ non controllata provoca un aumento della estensione a singola elica in 3’ coperta da ssDNA binding proteins che può portare ad una esposizione delle sequenze telomeriche prima a doppia elica Una azione incontrollata della telomerasi può alterare le funzioni di capping a livello dei telomeri o sbilanciare la sintesi delle G.rich e C-rich strands, che possono portare all’accumulo di DNA in 3’

Controllo della lunghezza dei telomeriPOT:proteine di protezione dei telomeriTRF: fattori che legano le ripetizioni telomeriche

Farmaci antivirali

Molti antivirali interferiscono con gli enzimi coinvolti nel processovirale

Gli Inibitori della DNA polimerasi virale sono anche composti adattività antitumorale.

l'Ara-A o vidarabina è prevalentemente un antivirale, il suo analogoAra-C o citarabina è principalmente un farmaco antineoplastico;Ara-C o citarabina è principalmente un farmaco antineoplastico;

Anche la Timidilato Sintasi è bersaglio antivirale: questa può legare gliantimetaboliti, al posto dei metaboliti veri, incorporarli nel DNA eRNA virale con l'intervento di un apposito enzima provocando la suadistruzione, quindi eliminando l'infezione.

.

Nucleosidi purinici modificati allo zucchero(nucleosidi aciclici)

I nucleosidi aciclici nascono dall’esigenza di trovare inibitori della adenosinadeaminasi da somministrare assieme a Ara-A, per migliorarne l’effetto. Ilcomposto 9-(2-idrossietossimetil)adenina si rivelò essere un substrato perl’adenosina deaminasi. Il fatto che questo spezzone zuccherino potesseessere riconosciuto da un enzima fece ipotizzare che potesse esserericonosciuto anche da altri enzimi. Nacquero così gli aciclonucleosidi, il più

importante dei quali è l’aciclovir.importante dei quali è l’aciclovir.

Aciclovir : [9-(2'-idrossietossimetil)guanina], usato come tale o sottoformadi sale sodico. Agisce sulla DNA polimerasi virale. Struttura zuccherinaprofondamente modificata. L'aciclovir è un nucleoside ad ampio spettro e agrande selettività.

HN

NH

O

O

F

HN

N

F

O

OOHOH2C

HO

F

O

N

N

H3C

OH OH

HN CH3(CH2)4O

O

C

O

Fluorouracile Floxuridina Capecitabina

Formule di struttura di analoghi pirimidinici

OOHOH2C

HO

N

N

F

F

NH2

OOHOH2C

HO

HO

N

N

NH2

Fluorouracile Floxuridina Capecitabina

Citarabina Gemcitabina

Nucleosidi derivati dall’ adenina

N

N

NH2

N

N

HO H

H OH

OHO

HN

N

O

N

N

HO H

H OH

OOP

O

OH

HO

HO HO

VIDARABINA (AraA) Ara-Hx-MPUtilizzati contro Herpes simplex e varicella zosterAra A agisce con diversi meccanismi d’azione diminuisce resistenza ma aumenta tossicità.1) Come trifosfato inibisce DNA polimerasi2) Incorporata nel DNA (virus e ospite)3) Inibisce reazioni transmetilazione (metil transferasi)4) Inibisce dideossiadenosindifosfato da ADP (↓ ATP)

Nucleosidi pirimidinici modificati allo zucchero e alla base

N

N

NH2

OHO

I

O

HO H

H F

FIAC (5-iodo-1(2’-deossi-2’-fluoro-βD-arabinosofuranosil)citosina

Attivo contro HSV-1; HSV-2; citomegalovirus; Epstein Barr virus. Inibisce DNA polimerasi

Nucleosidi pirimidinici modificati allo zucchero

HN

N

O

H F

OHO

CH3

O

FMAU 1(2-deossi-2-fluoro-βD-arabinofuranosil)timina

Attivo contro HSV-1; HSV-2; citomegalovirus; Inibisce DNA polimerasi

HO H