la replicazione del dna. la... · la natura semiconservativa della replicazione del dna...

55
La replicazione del DNA

Upload: others

Post on 27-Feb-2020

5 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La replicazione del DNA

Page 2: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La natura semiconservativa della replicazione del DNA

replicazione

replicazione

replicazione

In un ciclo di replicazione ciascuno deidue filamenti di DNA viene usatocome stampo per la formazione di unfilamento complementare di DNA.

Page 3: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Esperimento di Meselson e Stahl

La duplicazione del DNA avviene con un meccanismo semiconservativo

Page 4: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La duplicazione del DNA prevede la formazione di una forcella di replicazione

Page 5: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Sito di legame per l’ATP

le DNA elicasi

Aprono la doppia elica del DNA davanti alla forcella di replicazione

ad una velocità di circa 1000 nucleotidi al secondo.

Page 6: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

le DNA elicasi

Page 7: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

L’appaiamento delle basi è il fondamento della replicazione del DNA

Page 8: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La reazione fondamentale dellasintesi del DNA è l’aggiunta di undeossiribonucletide all’estremita’ 3’di una catena polinucleotidicanascente

DNA polimerasi

Page 9: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Sintesi di DNA catalizzata dalla DNA polimerasi

Formazione di un legame fosfodiesterico

Page 10: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Caratteristica importante della DNA polimerasi:

è primer-dipendente

Page 11: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Sintesi dell’ RNA primer: la DNA primasi (RNA polimerasi-DNA dipendente)

Ribonucleotidi trifosfati

Page 12: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La DNA polimerasiAttività polimerasica

Page 13: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La forcella di replicazione ha una struttura asimmetrica: i frammenti di Okazaki

Page 14: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Sintesi dei frammenti di Okazaki sul filamento

ritardato

I primers vengono rimossi da un enzima diriparazione del DNA (una RNAsi H) chericonosce un filamento di RNA in un’elicaRNA/DNA e lo frammenta.Le interruzioni lasciate vengono riempite dallaDNA polimerasi ed unite dalla DNA ligasi.

Page 15: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La DNA ligasi

Lega fra loro i frammenti di Okazaki dopo che sono stati distrutti i primers

Page 16: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Le proteine che legano il DNA a singolo filamento

il legame cooperativo delle proteine raddrizza la regione della catena

Regione a singolofilamento dello stampodi DNA con breviregioni a forcina

Monomeri diproteine che leganoil singolo filamentodi DNA

DNA polimerasi

Page 17: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La pinza scorrevole Tiene la DNA polimerasi associata al DNA a singolo filamento e larilascia quando incontra un doppio filamento di DNA (frammenti diOkazaki) sul filamento ritardato

pinza scorrevole

caricatore della pinza

Page 18: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La pinza scorrevoleIncrementa la processività della DNA polimerasi

Page 19: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La replicazione del filamento guida e del filamento in ritardo in E. coli è svolta da due DNApolimerasi che lavorano insieme come parti di un unico complesso

Il modello cosidetto a “trombone” per coordinare le due DNA polimerasi a livello di una forcareplicativa

Page 20: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Il procedere della forcella di replicazione

Page 21: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

catena di DNA neosintetizzata

DNA polimerasi sulfilamento leader

stampo del filamentoleader stampo del filamento

ritardato

rapida rotazionedell’elica di DNAnecessaria in questopunto

sarebbe necessaria troppa energia

DNA Topoisomerasi

Interagisce con un gruppo fosfato nelDNA rompendo temporaneamente unlegame fosfodiesterico

Il procedere della forcella di replicazione

Page 22: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Il procedere della forcella di replicazione

Topoisomerasi I

Topoisomerasi II

Page 23: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Le DNA topoisomerasi IUn’estremità della doppia elica di DNA non puo’ ruotare rispetto

all’altra estremità

Topoisomerasi di tipo I con la

tirosina nel sito attivo

La topoisomerasi I si lega covalentemente ad un fosfato nel DNA, rompendo così un legame

fosfodiestere

Le due estremità del DNA possono ora ruotare l’una rispetto all’altra, rilasciando la tensione accumulata

L’energia del legame fosfodiestere originale è conservata nel legame

fosfotirosinico, rendendo la reazione reversibile

La riformazione spontanea del legame fosfodiestere rigenera

sia l’elica del DNA che la DNA topoisomerasi I

1

2

3

4

6

5

Page 24: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Le DNA topoisomerasi II

elica di DNA 1dominio ATPasico

della topoisomerasi

elica di DNA 2

1. Legame dell’ATP edimerizzazione deidomini ATPasici

2. Rottura nell’elica diDNA 2

L’elica 1 passaattraverso larottura nell’elica 2

1. Chiusuradella rotturanell’elica 2

2. Rilasciodell’elica 1

elica di DNA 1

Page 25: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Binding proteins prevent single strands from rewinding.

Helicase protein binds to DNA sequences called origins and unwinds DNA strands.

5’

3’

5’

3’

Primase protein makes a short segment of RNA complementary to the DNA, a primer.

3’5’

5’3’

Replication

Page 26: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Overall direction

of replication

5’3’

5’

3’

5’

3’

3’5’

DNA polymerase III enzyme adds DNA nucleotides

to the RNA primer.

Replication

Page 27: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

5’

5’

Overall direction

of replication

5’

3’

5’

3’

3’

3’

DNA polymerase proofreads bases added and

replaces incorrect nucleotides.

Replication

Page 28: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

5’

5’3’

5’

3’

3’

5’

3’Overall direction

of replication

Leading strand synthesis continues in a

5’ to 3’ direction.

Replication

Page 29: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

3’

5’ 5’

5’3’

5’

3’

3’

5’

3’Overall direction

of replication

Okazaki fragment

Leading strand synthesis continues in a

5’ to 3’ direction.

Discontinuous synthesis produces 5’ to 3’ DNA

segments called Okazaki fragments.

Replication

Page 30: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

3’

5’ 5’

5’3’

5’

3’

3’

5’

3’Overall direction

of replication

Okazaki fragment

Leading strand synthesis continues in a

5’ to 3’ direction.

Discontinuous synthesis produces 5’ to 3’ DNA

segments called Okazaki fragments.

Replication

Page 31: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

5’ 5’

5’3’

5’

3’

3’

5’

3’Overall direction

of replication

3’

Leading strand synthesis continues in a

5’ to 3’ direction.

Discontinuous synthesis produces 5’ to 3’ DNA

segments called Okazaki fragments.

Okazaki fragment

Replication

Page 32: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

5’

5’ 3’

5’

3’

3’

5’

3’

3’

5’ 5’3’

Leading strand synthesis continues in a

5’ to 3’ direction.

Discontinuous synthesis produces 5’ to 3’ DNA

segments called Okazaki fragments.

Replication

Page 33: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

3’

5’

3’

5’

5’ 3’

5’

3’

3’

5’ 5’3’

Leading strand synthesis continues in a

5’ to 3’ direction.

Discontinuous synthesis produces 5’ to 3’ DNA

segments called Okazaki fragments.

Replication

Page 34: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

5’

5’

3’ 3’

5’

3’

5’ 3’

5’

3’

3’

5’

RNA primers are removed.

Replication

Page 35: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Polymerase activity of DNA polymerase I fills the gaps.

Ligase forms bonds between sugar-phosphate backbone.

3’

5’

3’

5’ 3’

5’

3’

3’

5’

Replication

Page 36: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La DNA polimerasiAttività di correzione di “bozze”

Page 37: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La DNA polimerasiAttività di correzione di “bozze”

direzione 3’-OH, 5’-P

Il nucleotide corretto ha un’affinità maggiore di quello non corretto con la DNA polimerasi ed è favorito dal punto di vista energetico

Page 38: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Correzione esonucleotidica delle “bozze” da parte della DNA polimerasi durante la replicazione del DNA

1

2

3

4

5

Page 39: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Eucarioti: il problema della replicazione dei telomeri. I telomeri sonole estremita’ dei cromosomi costituite da sequenze non codificantiripetute molte volte.

telomero

Page 40: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Chi riempie la regione lasciata libera dal primer?

Page 41: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La duplicazione delle estremità dei cromosomi:l’attività della telomerasi

Page 42: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti
Page 43: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La replicazione del telomero

DNA polimerasi α che ha attività diDNA primasi in una sua subunità

Page 44: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La duplicazione delle estremità dei cromosomi:l’attività della telomerasi

Se la telomerasi è inattiva i telomeri si

accorciano

Page 45: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La sintesi del DNA inizia alle origini di

replicazione

Page 46: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La sintesi del DNA comincia a livello della forcella di replicazione

Si forma una nuovastruttura a forma di Y

Page 47: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

I cromosomi batterici hanno in genere una singola origine di replicazione del DNA

Page 48: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

I cromosomi eucariotici contengono origini multiple di replicazione

Page 49: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Regioni diverse dello stesso cromosoma si replicano in momenti distinti della fase S

iniziale intermedia tardiva0-2 ore 3-5 ore 6-8 ore

Le numerose origini di replicazione non sono attivate tutte contemporaneamente

Page 50: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Struttura del punto di origine di replicazione del DNA negli eucarioti

50 coppie di nucleotidi

Sito di legame di ORC(Complesso di Riconoscimento

dell’Origine)

Sito di legame di Abf1

(proteina chefacilita il legame diORC al proprio sito)

Regione da svolgere ricca di

A e T

Page 51: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

La replicazione del DNA avviene soltanto durante la fase S del ciclo cellulare

Page 52: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Il ciclo cellulare viene regolato da proteine chiamate cicline che si associano conenzimi chiamati cinasi-dipendenti dalle cicline (CDK). Formano un complessoenzimatico attivo che fosforila numerosi substrati.

Page 53: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Meccanismo di inizio della replicazione del DNA negli eucarioti

Assicura che ciascuna origine di replicazione sia attivata una volta soltanto per ciclo cellulare

Page 54: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Meccanismo di inizio della replicazione del DNA negli eucarioti

Page 55: La replicazione del DNA. la... · La natura semiconservativa della replicazione del DNA replicazione replicazione replicazione In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti

Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli

editore S.p.A. Copyright © 2005