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Integrantes:
● García Cruz Juan Carlos
● Salcedo Magaña Patricia
● Torres Aguilar Erika
● Uribe Vazquez Tania Denisse
La exposición de adultos a Bisfenol-A (BPA) en
ratas Wistar reduce la calidad del esperma con la
interrupción del eje hipotalámico-pituitario-
testicular.
Introducción.
El bisfenol A (BPA) es un compuesto químico empleado en:
- Plásticos de policarbonato
- Resinas epoxídicas
- Empaques de comida
- Selladores dentales
Introducción.
● Síndrome de disgenesia
testicular
● Hipospadias
● Criptorchidismo
● Cáncer testicular
● Baja producción de
espermatozoides
BPA ● Disruptor endocrino con la
actividad estrogénica
● Baja afinidad a receptores
nucleares de estrógeno
● Potencia equivalente a
etilestradiol, medidas por el
receptor membranal de
estrógeno (GPR30)
● Interviene en procesos de
relacionado como la
producción de andrógeno.
● Sustancias tóxicas pueden alterar la
energía y disminuir la fecundación
espermática.
● El estrés oxidante es inducido por
sustancias tóxicas es la causa más
común de daño a los
espermatozoides.
En este estudio se evaluó:
● Producción de espermatozoides
● Reservas y tiempo de tránsito
● Integridad del acrosoma y membrana plasmática
● Actividad mitocondrial
● Regulación del eje hipotalámico-pituitario-testicular; analizado con la expresión
génica de la liberación de gonadotropina (Gnrh1), receptor de andrógeno (Ar),
receptor de estrógeno alfa (Esr1) y beta (Esr2) en el hipotálamo, el receptor de la
liberación de gonadotropina, hormona luteinizante (Lhb), folículo estimulante
beta (Fsnb), Ar, Esr1, Esr2 en pituitaria .
● Concentración de testosterona , estradiol, LH y FSH
Material y Métodos
Diseño Experimental
- Se emplearon 30 ratas macho (Rattus norvergicus) cepa Wistar.
- Se dividieron en 3 grupos como se muestra a continuación:
- El BPA se administró junto con aceite de maíz (0.25 mL/kg) entre 7:00 y 8:00 a.m.
- La administración comenzó en el día postnatal 50 (PND50) hasta el 90 (PND90).
- La eutanasia se realizó en el PND105.
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
No. de ratas 10 10 10
Dosis diaria BPA
(mg/kg)
vía oral.
0 (Control) 5 25
Dosis de BPA
Se basaron en el NOAEL (No-observed-adverse-effect level) para toxicidad
reproductiva reportado anteriormente por: “FAO/WHO, 2010; Schwetz and Harris,
1993 ” el cual es de 50 mg/kg.
Condiciones de hacinamiento de las ratas
- Comida (Nuvilab CR-1, Nuvital, PR, Brazil) y agua a libertad.
- Ciclos de luz / oscuridad (12:12 h).
- Control de temperatura (23±1 ℃).
Conteo de espermatozoides
- Los testículos y el epidídimo (caput, corpus
y cauda) fueron pesados.
- La túnica albugínea es removida.
- La parénquima* es homogeneizada con
5mL de solución salina - Tritón 0.5 % por
sonicación durante 30 s a 12 kHz.
* Compuesto de túbulos seminíferos y células
intersticiales
Parénquima
Conteo de espermatozoides
- Las muestras se diluyen 10 veces en solución salina.
- Se cuentan las cabezas de esperma con un contador de células sanguíneas.
- Los resultados se reportaron como número de espermatozoides por testículo y por gramo de
testículo.
- Dichos valores se dividieron entre 6.1 para calcular la producción diaria de espermatozoides
(DSP).
- Los segmentos del epidídimo recibieron el mismo tratamiento y se calculó el total de
espermatozoides en cada parte del epidídimo.
- Se calculó el tiempo promedio de tránsito de los espermas en cada porción del epidídimo
dividiendo el total de espermas en cada parte del epidídimo entre el DSP del testículo
correspondiente.
Determinación de la integridad,
actividad y morfología de los
espermas.
Colecta de espermas
- Después de la eutanasia se colectaron 20 μL de un líquido tras el corte del epidídimo.
- Se suspendió en 200 μL en una solución de “semen extender” tris fructosa-ácido cítrico a
37℃
- Las muestras se procesaron para evaluar los aspectos que a continuación se explicarán.
Integridad del Acrosoma- Tinción simple con rosa de bengala al 1%, verde rápido (FCF) al 1%, etanol (40 %) en buffer
de fosfatos (pH=7.2).
- Se incubaron 5 μL de cada muestra con 5 μL de la solución anterior por 1 minuto a 37 ℃.
- Se realizó el extendido de la muestra y observó a 1000 x.
- Se contaron 200 espermas por muestra y se clasificaron por acrosoma intacto y no intacto.
Integridad de la membrana plasmática
- Tinción simple con eosina (1%) y nigrosina (10%).
- Se mezclaron 5 μL de cada muestra con 5 μL de la solución anterior.
- Se realizó el frotis.
- Se contaron 200 espermas a 1000x .
- Se clasificaron por membrana intacta o no intacta.
Sin alteración en la
membrana
Con alteración en la
membrana
Actividad mitocondrial.- Se evaluó la actividad de la citocromo oxidasa
- Se empleó una solución de Diaminobencidina (DAB) 1 mg/mL disuelta en un buffer de
fosfatos (pH=7.4).
- Se incubaron 10 μL de cada muestra con con 300μL de la solución anterior (precalentada a
37 ℃ por 1 hora en la oscuridad)
- Se depositaron 10 μL en un portaobjetos y se realizó el extendido de la muestra a 37 ℃ en la
oscuridad.
- Se añadió formaldehído (10%) para fijar la muestra.
- Se observaron 200 espermas por muestra en un microscopio de contraste de fases (400x) y
se clasificó de acuerdo al grado de tinción de éstos.
Clasificación Grado de tinción
DAB I 100 %
DAB II > 50%
DAB III < 50 %
DAB IV 0 %
Morfología de los espermas
- Las muestras se diluyeron 1:10 en un buffer de fosfatos con formaldehído al 12.5%.
- Examinar como muestra húmeda en un microscopio de contraste de fase a 400x.
Cuantificación hormonal
- Sangre se colectó por punción cardiaca y se centrifugó a 3500 rpm por 15 minutos.
- La concentración en suero de la hormona folículo-estimulante (FSH) y de la hormona
luteinizante (LH) se determinaron por un inmunoensayo quimioluminiscente usando la
tecnología “Luminex xMAP”.
- Las concentraciones de testosterona y estradiol se determinaron por
electroquimioluminiscencia usando kits comerciales. (Elecsys Testosterone II and Estradiol II
Immunoassay kits, Roche Diagnostics)
PCR - Después de la eutanasia se extrajo la glándula hipófisis y el hipotálamo.
- Se aisló el ARN total empleando el reactivo TRIzol.
- El pellet de RNA se resuspendió en 30 μL de agua libre de RNAsas.
- La absorbancia y concentración fueron determinadas por espectrofotometría (Nanovue Plus).
- 2 μg de RNA de cada tejido fueron sometidos a transcripción reversa empleando “MML-V
Reverse Transcriptase kit”.
- Con la PCR se llevó a cabo la duplicación de los genes: Gnrh1, Gnrhr, Lhb Fshb, Ar, Esr1 y
Esr2
- Se emplearon 2 μLde cDNA, 6.5mL SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), y 10
pmol/L de cada primer.
- La intensidad de la fluorescencia fue cuantificada, y las secuencias amplificadas fueron
analizadas por un sistema detector de secuencias (ABI Prism 7500; Applied Biosystems.
ResultadosLos resultados se analizaron por Análisis de Varianza (ANOVA) y
posteriormente una prueba Tukey.
Se analizaron las siguientes características causadas por la
exposición a BPA
● La disminución de la producción de esperma, las reservas de
esperma y los espermatozoides
● Afecta la integridad del acrosoma y la membrana plasmática
actividad mitocondrial y morfología espermática
● Interrumpe las concentraciones séricas de hormonas
● Modulación la expresión de genes implicados en el eje
hipotalámico-pituitario-testicular
La disminución de la producción de esperma las reservas de esperma y
los espermatozoides
Disminución en las reservas de esperma y reducción en el tiempo de
tránsito en el caput, corpus y cauda.
epidídimo
● Afecta la integridad del acrosoma y la membrana plasmática
actividad mitocondrial y morfología espermática
● Interrumpe las concentraciones séricas de hormonas
● Modulación la expresión de genes implicados en la pituitaria.
● Modulación la expresión de genes implicados en el hipotalamo.
Discusión
de resultados
El aumento en la rapidez del
movimiento de los espermatozoides
a través de los segmentos del
epidídimo, puede comprometer su
maduración.
“El tiempo de tránsito del esperma desde la cabeza hasta la cola del
epidídimo se redujo en los grupos tratados con BPA.”
● La exposición a BPA está
relacionada con una baja
expresión de antioxidantes,
● aumento en la generación de
ROS.
Estrés oxidativo, causa más común
de daño a esperma.
“Se observó el incremento de espermatozoides defectuosos: alto daño en
acrosomas y membrana plasmática, así como baja actividad mitocondrial.”
Infertilidad
Un esperma con alta integridad en su
membrana y buena actividad
mitocondrial es más capaz de
interaccionar de forma adecuada con el
óvulo, aumentando las posibilidades de
fertilización.
Las células de Leydig -células intersticiales
que rodean los túbulos seminíferos- son
estimuladas por LH para producir
testosterona (participa en la iniciación de la
espermatogénesis).
Las células de Sertoli -células no
germinativas- son estimuladas por FSH para
producir estradiol y mantener las células
madre espermatogoniales.
➔ BPA puede contribuir a que ocurran
defectos en espermatogénesis y en la
maduración de espermas.
“BPA causó desbalance de LH y FSH.”
Reducción de LH → Disminución en la
producción de testosterona.
↓ Testosterona → ↓ DHT (que tiene el
doble de actividad androgénica que la
testosterona).
➔ El epidídimo requiere de andrógenos
para completar el transporte y
almacenamiento de espermatozoides
antes de la eyaculación.
“Disminución en la concentración de LH”
Testosterona es responsable del
mantenimiento de las funciones de las células
de Sertoli después de su conversión a estradiol
por la aromatasa.
Pequeñas cantidades de estradiol son vitales
para la actividad de las células de Sertoli
(ESR1 Y ESR2 en núcleo y citoplasma, GPER
en membrana plasmática).
Pero altas cantidades comprometen la
producción de espermas.
“Disminución en la concentración
de FSH”
>
Bisfenol-AEstradiol
Etinilestradiol
Afinidad por ESR1, 2 y GPER
Dietilestilbestrol
y
“En pituitaria (hipófisis), los niveles relativos de mRNA de Gnrhr, Lhb
y Fshb se vieron aumentados.”
Es un intento de la pituitaria, por
reestablecer los niveles normales de LH,
FSH y testosterona.
Aumento en Ar (receptor andrógeno) y
ESR2 sugieren que un mecanismo de
retroalimentación negativo fue estimulado.
➔ Hay daño en el eje: H-P-T
Conclusiones
● La exposición de BPA causa reducción en la producción, reserva y tiempo de tránsito de
espermatozoides
● Se afectó la integridad del acrosoma, membrana plasmática y actividad mitocondrial.
● El patrón observado de expresión génica es indicativo de un intento por parte de la pituitaria
de restablecer el nivel normal de LH, FSH y la concentración de testosterona.
● Incluso en dosis consideradas que carecen de toxicidad reproductiva, la exposición al BPA
compromete la producción y la funcionalidad de los espermatozoides y altera el eje gonadal
hipotalámico - pituitario, lo que resulta en un estado de hipogonadismo hipogonadotrópico.
Conclusiones
● Se observó que a pesar que las dosis establecidas fueron basadas
en NOAEL, se presentaron efectos en la producción y funcionalidad
de los espermatozoides.
● La exposición a sustancias “de uso cotidiano”, en este caso a BPA,
puede provocar efectos que llegan a ser nocivos para salud de los
individuos.
Referencias
● Agroinfo, (2015), “Male reproductive system”, consultado el 27/04/18 en:
http://www.agriinfo.in/?page=topic&superid=9&topicid=120
● Fox S., (2011), “Fisiología Humana”, Editorial Mc Graw-Hill, 12va edición, México, pp: 698
● “Sperm morphology” obtenido a partir de: https://www.researchgate.net/figure/Asian-elephant-
sperm-morphology-A-Normal-B-Proximal-cytoplasmic-droplet-C-Abnormal_fig1_256102597
● Wisniewski P., (2015), “Adult exposure to bisphenol A (BPA) in Wistar rats reduces sperm
quality with disruption of the hypotalamic-pituitary-testicular axis, Elsevier, Toxicology. DOI:
10.1016/j.tox.2015.01.002