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Josué De Corta Hernáez
Extracción sólido-líquido de Alquilfenoles y Bisfenol A enlodos de depuración con ultrasonidos focalizados.
Influencia de la sonda y su uso
María Teresa Tena Vázquez de la Torre
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Máster en Química Avanzada
2012-2013
Título
Autor/es
Director/es
Facultad
Titulación
Departamento
TRABAJO FIN DE ESTUDIOS
Curso Académico
© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2013
publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]
Extracción sólido-líquido de Alquilfenoles y Bisfenol A en lodos de depuración con ultrasonidos focalizados. Influencia de la sonda y su uso, trabajo fin de
estudiosde Josué De Corta Hernáez, dirigido por María Teresa Tena Vázquez de la Torre (publicado
por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a lostitulares del copyright.
EXTRACCIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO DE
ALQUILFENOLES Y BISFENOL A EN
LODOS DE DEPURADORA CON
ULTRASONIDOS FOCALIZADOS.
INFLUENCIA DE LA SONDA Y SU USO
JOSUÉ DE CORTA HERNAEZ
SEPTIEMBRE 2013
ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
UNIVERSIDAD DE LA RIOJA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
UNIVERSIDAD DE LA RIOJA
EXTRACCIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO
DE ALQUILFENOLES Y BISFENOL
A EN LODOS DE DEPURADORA
CON ULTRASONIDOS
FOCALIZADOS.
INFLUENCIA DE LA SONDA Y SU
USO.
JOSUÉ DE CORTA HERNAEZ
SEPTIEMBRE DE 2013
Deseo hacer constar mi agradecimiento al Ministerio de Educación y
Ciencia por la financiación de este trabajo a través del proyecto
CTM2010-16935 del Plan Nacional de Investigación Científica y
Desarrollo e Innovación Tecnológica co-financiado con fondos FEDER.
Índice
ÍNDICE
Presentación 1
Objetivos 5
I.Introducción 9
1. Disrupción endocrina 11
2. Alquilfenoles y Bisfenol A 13
3. Exposición y determinación de APs y BPA en diferentes tipos de
muestra 14
4. Método de análisis 19
4.1. Extracción sólido-líquido con ultrasonidos focalizados 19
4.2. Extracción en fase sólida 21
4.3. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas 22
5. Diseño de experimentos 23
II.Experimental 29
1. Materiales y reactivos 31
2. Muestras 31
3. Extracción con líquidos presurizados 32
3.1. Extractor PLE 32
3.2. Preparación de la celda de extracción 33
3.3. Condiciones PLE 34
4. Extracción sólido líquido con ultrasonidos focalizados 35
4.1. Extractor FUSLE 35
4.2. Procedimiento FUSLE 36
5. Extracción en fase sólida 36
5.1. Sistema SPE 36
Índice
5.2. Procedimiento SPE 37
6. Derivatización 38
7. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas 39
7.1. Cromatógrafo de gases acoplado a espectrómetro de
masas 39
7.2. Condiciones de inyección 40
7.3. Condiciones cromatográficas 40
7.4. Espectrometría de masas 40
7.5. Tratamiento de datos 41
8. Análisis de las muestras 41
III.Resultados y discusión 43
1. Presentación del problema 45
2. Limpieza del extracto 47
2.1. Elección del sorbente 47
2.1.1. SPE en fase reversa (cartuchos C18) 47
2.1.2. SPE en fase normal (cartuchos de sílice y Florisil) 51
2.2. Estudio de las variables SPE 53
2.2.1. Volumen de elución 54
2.2.2. Porcentaje de AcOEt en la disolución del extracto 55
3. Extracción FUSLE. 57
3.1. Estudio de variables. 57
3.1.1. Consideraciones previas 57
3.1.2. Diseño central compuesto 60
3.1.3. Estudio del número de ciclos 65
4. Caracterización del método FUSLE-SPE-CG-MS 66
5. Estudio del tiempo de vida de la sonda 67
5.1. Influencia del uso de la sonda 67
5.2. Influencia del pulido de la sonda 79
IV.Conclusiones 83
V. Bibliografía 87
Presentación
1
PRESENTACIÓN
Presentación
3
Los alquilfenoles (APs) y el bisfenol A (BPA) son productos habituales en la
industria química. Los primeros (sobre todo el 4-n-octilfenol y el 4-n-
nonilfenol) se utilizan como agentes surfactantes en detergentes
industriales. El BPA se utiliza principalmente como aditivo en la fabricación
de plásticos de muchos tipos, desde resinas epoxi de ingeniería hasta
envases alimentarios.
El efecto de estos compuestos en la sociedad es importante ya que actúan
como disruptores endocrinos, provocando problemas medioambientales y de
salud pública.
Por sus características, los APs y el BPA se acumulan en el lodo generado en
las plantas EDAR (Estaciones de Depuración de Aguas Residuales), producto
que habitualmente se utiliza como relleno agrícola y como fuente de
energía. Este primer uso, además de ser el mayoritario, es una fuente
importante de entrada de estos compuestos a la cadena trófica.
En esta memoria se presenta el desarrollo, caracterización y aplicación de
un método para la determinación de APs y BPA en lodo de depuradora.
El método desarrollado se basa en una extracción sólido líquido con
ultrasonidos focalizados (FUSLE), para la limpieza del extracto se efectúa
una extracción en fase sólida (SPE) seguida por cromatografía de gases
acoplada a un detector MS (GC-MS) para la determinación.
Finalmente, este método ha sido empleado para estudiar la posible pérdida
de la eficiencia de la sonda con su uso, así como la influencia del pulido de
la sonda en la eficiencia.
Objetivos
5
OBJETIVOS
Objetivos
7
OBJETIVOS
El objetivo principal de este trabajo es desarrollar un método rápido, sencillo
y efectivo para la determinación de APs y BPA en lodos de depuradora.
Posteriormente este método se ha utilizado para estudiar la eficiencia
obtenida a medida que se usa la sonda FUSLE y la influencia del pulido de
ésta.
Para ello, se pretende cumplir los siguientes objetivos:
Establecer las mejores condiciones para la separación cromatográfica
y detección mediante espectrometría de masas de APs y BPA.
Desarrollar un método basado en extracción sólido líquido con
ultrasonidos focalizados seguido por una etapa de limpieza del
extracto (clean up) que consiste en una extracción en fase sólida y el
análisis final por cromatografía de gases acoplada a espectrometría
de masas.
Estudiar la influencia de las principales variables FUSLE que afectan
a la extracción de los APs y BPA en lodo de depuradora, como la
potencia, el tiempo y el número de ciclos.
Optimizar las principales variables que afectan a la SPE, como la
naturaleza del sorbente, el volumen de elución y el porcentaje de
AcOEt en la disolución del extracto.
Caracterizar el método desarrollado en términos de exactitud,
repetibilidad y precisión intermedia.
Aplicar el método desarrollado para estudiar la influencia de la sonda
y su uso en la eficacia extracción.
Estudiar el efecto del pulido de la sonda en la recuperación.
Introducción
9
INTRODUCCIÓN
Introducción
11
INTRODUCCIÓN
1. Disrupción endocrina
El control y coordinación de las actividades fisiológicas de los seres vivos se
basa en la transmisión de información entre las distintas células. Dicha
comunicación ocurre a través de varios sistemas: señalización paracrina,
sistema nervioso y sistema endocrino.
Los dos primeros ocurren de forma rápida y altamente dirigida, mientras
que en el sistema endocrino la transmisión de la información sucede de
manera no dirigida a través de mensajeros químicos específicos
(hormonas), que se distribuyen a los tejidos por el torrente sanguíneo. Para
poder hacer llegar el mensaje, la hormona debe unirse a su correspondiente
receptor en la célula diana, cuando esto ocurre se da una serie de
reacciones químicas que activan la célula para llevar a cabo una función
específica. El tiempo de respuesta puede ir desde algunos segundos (como
la adrenalina) a periodos de tiempo más largos (como el ciclo menstrual o el
crecimiento del esqueleto). La regulación endocrina se desarrolla a través de
estados sucesivos de equilibrio dinámico, de acuerdo con unos patrones
genéticamente establecidos, aunque sometidos a la influencia de factores
ambientales. En determinadas circunstancias, estos patrones pueden
experimentar cambios que perjudican a los individuos que los sufren.
La disrupción endocrina es un mecanismo que afecta al funcionamiento del
sistema endocrino. Los disruptores endocrinos son las sustancias
susceptibles de producir desajustes en dicho funcionamiento alterando, por
Introducción
12
distintos mecanismos, los efectos que fisiológicamente deberían producir las
hormonas en los organismos.
Los disruptores endocrinos son sustancias de naturaleza muy diversa como
dioxinas (dibenzo-p-dioxinas), plaguicidas, ftalatos, PCBs (bifenilos
policlorados), etc.
Muchos estudios sugieren que la disrupción endocrina es la causa de
alteraciones como (Birnbaum y col. 2013):
La reducción de la edad de llegar a la pubertad (Gayle y col. 2010).
El cáncer de testículo, próstata y mama.
Evidencias de infertilidad masculina.
Recuento y calidad del esperma.
Obesidad y diabetes (Babrauskas y col. 2011).
Autismo (Volk y col. 2013).
Deficiencias en el sistema inmune.
Alteraciones en la vida de las especies salvajes, mayoritariamente
relacionadas con cambios en la reproducción.
En un nuevo informe del Programa de las Naciones Unidas para el Medio
Ambiente (PNUMA) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) se pide que
se siga investigando y que estudios más exhaustivos y mejores métodos
analíticos podrían reducir el riesgo de enfermedad y generar ahorros
considerables para la salud pública.
El trabajo presentado en esta memoria se centra en la determinación de los
alquilfenoles y el bisfenol A en lodos, empleando la técnica de extracción
FUSLE. Además, se realiza un estudio de la influencia de la vida de la sonda
FUSLE en las características analíticas del método desarrollado.
Introducción
13
2. Alquilfenoles y Bisfenol A
Los alquilfenoles se utilizan como detergentes industriales por su carácter
surfactante no iónico y como aditivos en pinturas y algunos plásticos,
aunque también se encuentran en textiles y cuero, como metabolitos de los
APEOs (etoxilatos alqilfenólicos) (Nota Técnica de Prevención 758, 2011).
En este trabajo se estudian ocho alquilfenoles, 4-t-butilfenol, 4-n-butilfenol,
4-n-pentilfenol, 4-n-hexilfenol, 4-n-heptilfenol, 4-t-octilfenol, 4-n-octilfenol
y 4-n-nonilfenol.
R= t-butil, n-butil, n-pentil, n-hexil, t-octil, n-heptil, n-octil y n-nonil
Fig.I.1.Estructura de los alquilfenoles
Los alquilfenoles más mencionados son el 4-n-octilfenol y el 4-n-nonilfenol,
ya que son los más perjudiciales, pero es importante estudiar el resto de
alquilfenoles ya que estos dos compuestos se degradan al resto por
transformaciones biológicas de acortamiento progresivo de cadena bajo las
condiciones aerobias y anaerobias en los procesos de depuración (Chang y
col. 2005).
El bisfenol A (BPA, 4,4´-(propano-2,2-diil)difenol) es un producto industrial
que fue sintetizado por primera vez por condensación de dos grupos fenol y
una molécula de acetona en 1891. Se utiliza predominantemente como un
Introducción
14
monómero en la fabricación de polímeros como policarbonato, resinas epoxi,
polisulfona o poliacrilato, como antioxidante e inhibidor al final de la
polimerización en plásticos de cloruro de polivinilo (PVC) y como precursor
para la síntesis del retardador de llama tetrabromobisfenol A. Estos
polímeros son materiales destinados a envases de alimentos, contenedores
para microondas, utensilios de cocina, equipamiento médico y materiales
dentales entre otras (Geens y col. 2012).
Fig.I.2. Estructura del bisfenol A
3. Exposición y determinación de APs y BPA en diferentes
tipos de muestra
Hay que tener en cuenta que los efectos de estos compuestos sobre el
organismo dependen de factores como el ámbito de exposición, el sexo y la
edad del individuo.
Son muchos los estudios sobre los niveles de APs y BPA en fluidos
biológicos, estos estudios se centran principalmente en la determinación de
4-n-octilfenol, 4-n-nonilfenol y bisfenol A (Benjamin y col. 2003; Calafat y
col. 2005; Vanderberg y col. 2007). En la tabla I.1 se muestran los niveles
de APs y BPA descritos en la bibliografía en diferentes fluidos biológicos.
Introducción
15
Tabla I.1 Niveles de APs y BPA y limites de detección (LOD) en fluidos
biológicos
Fluido biológico Compuesto Nivel
(ng/mL) LOD (ng/mL) Referencia
Sangre de cordón
umbilical
4-t-butilfenol 0.54 0.05
Benjamín y
col. 2003
4-n-butilfenol 0.80 0.05
4-t-octilfenol 1.15 0.05
4-n-octilfenol 4.17 0.05
4-n-nonilfenol 15.17 0.05
Bisfenol A 4.05 0.05
Orina
4-n-nonilfenol 1.28 0.1 Calafat y col.
2005 Bisfenol A 1.33 0.1
Suero humano Bisfenol A 0.2-20 -
Vanderberg y
col 2007
Placenta Bisfenol A 11.2-104.9 -
Leche materna Bisfenol A 0.28-0.97 -
Es importante estudiar la presencia de estos compuestos en lodo por varios
motivos:
Tanto los APs como el BPA son compuestos hidrófobos y en las
sucesivas etapas de depuración se acumulan en los subproductos
sólidos (lodos), adsorbidos sobre la superficie o precipitados por
iones metálicos (principalmente Ca2+ y Mg2+) (Fernández-San Juan y
col. 2009).
El lodo de depuradora es reutilizado principalmente como fuente de
energía y como abono agrícola (RD 1310/1990). Esta segunda forma
de reutilización es una vía de entrada de los APs y el BPA en la
cadena trófica.
Introducción
16
Es una fuente de información sobre contaminación química y riesgos
potenciales asociados a la reutilización del lodo como relleno
agrícola, fuente de energía o abono (Martínez-Moral y Tena 2011).
Muchos estudios se han centrado en el desarrollo y puesta a punto de
métodos de análisis de APs y BPA en lodo de depuradora. Estos métodos
suelen constar de 3 etapas: extracción, limpieza de los extractos o clean up
y determinación de los analitos.
En la tabla I.2 se muestran algunos ejemplos indicando las técnicas, los
compuestos determinados, los niveles hallados y los LODs encontrados.
Introducción
17
Introducción
18
Introducción
19
4. Método de análisis
El método empleado en este trabajo se basa en la técnica de extracción
FUSLE, seguida por una etapa de limpieza mediante SPE en fase normal. La
determinación de los analitos en los extractos se realiza por cromatografía
de gases acoplada a espectrometría de masas.
También se empleo la técnica de extracción PLE selectiva en algunos
análisis.
4.1. Extracción sólido-líquido con ultrasonidos focalizados
La extracción sólido-líquido con ultrasonidos focalizados es una técnica
relativamente nueva que permite superar la lenta extracción (30-60 min) y
la baja reproducibilidad de la extracción sólido-líquido usando un baño de
ultrasonidos.
La extracción mediante FUSLE es muy rápida, económica y ha mostrado
resultados similares a los de otras técnicas de extracción como la extracción
asistida por microondas (Errekatxo y col. 2008; Navarro y col. 2009; Sanz-
Landaluce y col. 2006).
La técnica FUSLE se basa en los fenómenos de cavitación. Las ondas de
ultrasonidos generadas atraviesan el líquido creando ondas de compresión y
depresión a velocidades muy elevadas. Durante la fase de depresión se
generan y crecen en el interior del líquido numerosas burbujas minúsculas,
llamadas burbujas cavitacionales, (ver Figura I.3. fase A y B). Durante la
segunda fase, la compresión, se ejerce una presión enorme sobre estas
burbujas, de tal manera que se comprimen, cargándose de energía (ver
Figura I.3. fase C) hasta que se produce la implosión (ver Figura I.3. fase D)
con la consiguiente expulsión de esa enorme cantidad de energía
Introducción
20
(http://www.soltec.it/d1/en/principles-ultrasonic-cleaning ; Capelo y col.
2005).
Figura I.3. Proceso de cavitación: formación de cavidades e implosión.
Como resultado de esta implosión, se alcanzan a nivel puntual y
microscópico temperaturas y presiones muy elevadas, de hasta 5000 K y
2000 atm, y velocidades de chorro de disolvente de hasta 280 m/s (Suslick
1998). Todas estas características, que no se alcanzan con estas
magnitudes en otras técnicas, favorecen que la extracción sea más eficiente
y rápida.
Asimismo, el tamaño de las burbujas es muy pequeño en comparación con
el volumen total de líquido. De este modo, el calor que se produce se disipa
muy rápidamente y no se aprecian cambios significativos en las condiciones
del entorno. Por todo esto, a la cavitación se le conoce también como
“ebullición fría” (Navarro y col. 2009). Sin embargo en segundos o pocos
minutos la muestra comienza a calentarse y se ha demostrado que trabajar
en baño de hielo mejora la extracción (Capelo y col. 2005). Es por esta
razón, que su uso puede ser de especial interés para la extracción de
compuestos termolábiles que se descompondrían usando otras técnicas
como PLE, MAE o SFE.
Pero éstas no son las únicas ventajas que ofrece la técnica FUSLE. La
aplicación de ultrasonidos es 100 veces más potente que en los baños de
ultrasonidos tradicionales (Errekatxo y col. 2008), ya que la micropunta
Introducción
21
emisora se sumerge directamente en la disolución a extraer y la potencia de
ultrasonidos aplicada es mayor. Además hay que tener en cuenta, que
cuando la burbuja cavitacional colapsa cerca de la superficie de una
partícula sólida, los micro-chorros del disolvente se propagan por su
superficie a gran velocidad, causando una erosión mecánica del sólido y
provocando la ruptura de la partícula. Esto produce la reducción de tamaño
de partícula y aumenta el área total de muestra expuesta al disolvente.
Por todo ello, se concluye que el uso de ultrasonidos focalizados puede ser
muy útil para el desarrollo de nuevos procedimientos de extracción sólido-
líquido.
Por este mismo fenómeno, las sondas están sujetas a un desgaste natural,
provocado por la erosión de la superficie de emisión de ultrasonidos y la
reducción de su acción. Este desgaste es mayor a medida que se aumenta la
potencia de ultrasonidos en los sucesivos usos. Por lo que se recomienda su
pulido cuando esto ocurre.
4.2. Extracción en fase sólida
La extracción en fase sólida es una técnica eficaz y simple para la limpieza
de extractos que es, al mismo tiempo, rápida y económica. Una columna
SPE consiste en un lecho de adsorbente de partículas mantenido entre dos
discos porosos en un tubo desechable. La SPE permite la preconcentración
de la muestra con un riesgo mínimo de pérdida o contaminación de la
misma. El componente de interés resulta retenido en una fase sólida
mientras que los contaminantes de la matriz se eluyen.
Las etapas de la extracción en fase sólida son:
Activación. En la que se utiliza un disolvente orgánico para
humidificar la fase.
Introducción
22
Acondicionamiento. La fase estacionaria se acondiciona con el mismo
disolvente de la muestra.
Retención. Las interacciones entre los componentes de la muestra y
la fase estacionaria controlan la retención en el adsorbente de SPE.
Para maximizar las interacciones, la muestra debe cargarse en el
adsorbente de SPE a una velocidad controlada.
Lavado. Usando un disolvente o serie de disolventes de fuerza
creciente los contaminantes pueden eliminarse del adsorbente de
SPE hasta que sólo queden retenidos los analitos de interés.
Elución. Se efectúa mediante un eluyente adecuado y un caudal de 1
ml/min. El adsorbente de SPE y las interacciones analito-adsorbente
determinan el disolvente o mezcla de elución
4.3. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas
La cromatografía de gases es una técnica de separación muy apropiada para
la resolución de mezclas complejas. Pero los analitos, un vez separados,
detectados, e incluso cuantificados, han de ser identificados de manera
unívoca. El único dato que proporciona la GC es el tiempo de retención de
cada pico cromatográfico, y no es suficiente para una identificación
inequívoca, sobre todo en el análisis de muestras con elevado número de
componentes.
Por otro lado, la espectrometría de masas puede identificar de manera casi
indiscutible cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz de
identificar los componentes individuales de una mezcla sin una separación
previa, debido a la extrema complejidad del espectro obtenido por
superposición de los espectros individuales de cada componente.
Introducción
23
Por tanto, la asociación de las dos técnicas, GC y MS, da lugar a la técnica
combinada GC-MS que permite la separación e identificación de mezclas
complejas.
En resumen, en la GC-MS una mezcla de compuestos es inyectada en el
cromatógrafo de gases, donde se separa en la columna cromatográfica,
obteniendo la elución sucesiva de los componentes individuales aislados,
que pasan inmediatamente al espectrómetro de masas. Cada uno de estos
componentes se registra en forma de pico cromatográfico y se identifica
mediante su respectivo espectro de masas.
5. Diseño de experimentos
Normalmente durante la elaboración de un método analítico aparece un
número elevado de factores que necesitamos optimizar para obtener la
mejor señal o respuesta posible. Un estudio univariante, donde se estudia
cada factor por separado, implica un gran número de experimentos, lo que
supone más tiempo, material, personal y, debido a todo esto, más dinero.
Asimismo, la información proporcionada con este método no es relevante en
muchos casos porque no tiene en cuenta las interacciones entre los factores
estudiados.
Un diseño de experimentos es una aplicación matemática y estadística clave
en el desarrollo de un método analítico, para evaluar con el menor número
posible de experimentos la influencia y significación de cada factor y sus
interacciones, y así optimizar la variable respuesta de manera eficiente.
En muchos casos, para reducir inicialmente el elevado número de factores a
tener en cuenta, se realiza un diseño factorial para descartar los que no
fueran importantes o significativos. En este trabajo, después de realizar una
selección de los factores FUSLE que deseábamos optimizar, decidimos
continuar con solo dos factores, por lo que no se consideró necesario
Introducción
24
realizar un diseño factorial y directamente se efectuó un diseño central
compuesto.
Un diseño central compuesto (CCD) es un diseño de segundo orden que nos
permite cuantificar la influencia de los factores significativos mediante
superficies de respuesta y funciones de deseo. Fue presentado por primera
vez por Box y Wilson (1951) en el articulo “On the Experimental Attainment
of Optimum Conditions” y es el diseño más utilizado en el ajuste de
superficies de respuesta de segundo orden (Park y col. 2008; Montgomery
1991; Box y col. 1951).
Para encontrar las condiciones óptimas de los factores que maximicen,
minimicen o cumplan unas condiciones específicas en la variable respuesta,
en general, que proporcionen la mejor respuesta, es necesario utilizar una
serie de técnicas estadísticas y matemáticas para obtener una aproximación
adecuada de la relación o dependencia entre la variable respuesta y los
factores o variables independientes. Para ello, suponemos que la variable
respuesta se ajusta a una función de segundo orden, de tal manera que
consideramos que las interacciones de tercer orden o superior entre los
factores son despreciables o no significativas frente a las de primer o
segundo orden. La función de este modelo no lineal donde existe curvatura
debido a las interacciones de segundo orden entre los factores, tiene la
siguiente forma:
donde y es la respuesta, x los factores, β los coeficientes y e el error
asociado a la respuesta.
Introducción
25
Para comenzar con el diseño, es necesario establecer el dominio
experimental que es el intervalo de valores que pueden tomar los factores a
estudiar. Para definir estos factores y su rango, nos basamos en la
experiencia previa, bibliografía, las necesidades de la experimentación
(criterios de rentabilidad, limitaciones experimentales,…) y el equipo a
utilizar.
El CCD es en realidad un diseño factorial 2k con varios puntos centrales, en
función del número de factores, que se complementa con 2k puntos axiales
o estrella. En un diseño factorial 2k cada factor tiene dos niveles que
representan los extremos del dominio experimental del diseño factorial: el
superior (+1) y el inferior (-1) y los puntos factoriales equivalen a todas las
combinaciones posibles de estos dos niveles. Asimismo, los puntos axiales
se corresponden a todas las posiciones del espacio donde todas las
coordenadas son cero, excepto una que es ±, es decir, (±, 0,0,…0), (0,
±,0,…0)… (0, 0,0,…±).
Los puntos factoriales permiten la estimación de los efectos de los factores
y sus interacciones, y los puntos axiales permiten evaluar el efecto de los
términos cuadráticos del modelo junto con el punto central con el que se
detecta el efecto de la no linealidad de cada factor. Asimismo, con las
réplicas del punto central se determina la varianza en la respuesta o el error
experimental del diseño.
Para aumentar la eficiencia del diseño es necesario que sea rotable y
ortogonal. El criterio de rotabilidad establece que la varianza de la respuesta
que predice el modelo, depende únicamente de la distancia del punto al
origen y no de su dirección. De este modo, todas las estimaciones que nos
proporciona el modelo son igualmente precisas en toda la región de estudio.
Para conseguir esto, definimos el valor de alfa para crear la región esférica
del diseño de tal manera que englobe los puntos factoriales, es decir, los
Introducción
26
vértices del cubo. Para obtener la rotabilidad, el valor de alfa depende del
número de factores en el estudio y viene dado por:
Asimismo, es importante establecer el criterio de la ortogonalidad para
conseguir que los parámetros del diseño puedan estimarse de forma
independiente, sin que exista una correlación. Este criterio se establece
fijando el número de réplicas del punto central en función del número de
factores a estudiar. Con dos factores se realizan 5 réplicas y con tres son
necesarias 8 réplicas.
Finalmente es muy importante aleatorizar los experimentos para evitar
llegar a falsas conclusiones.
En el caso de un CCD de dos factores (ver Figura I.4), como en este trabajo,
los puntos factoriales corresponden a los vértices de un cuadrado, y los
puntos axiales o estrella se encuentran en los puntos medios de las aristas
del cuadrado a una distancia de 1,41 veces mayor a la de los extremos del
dominio experimental, por lo que teniendo en cuenta las 8 réplicas del punto
central que se optó por hacer, es necesario realizar 16 experimentos.
No hay que olvidar que estos modelos dependen del dominio experimental
que decidamos, por lo que no explican la relación real entre los factores y la
variable respuesta en todo el dominio existente. Sin embargo, son una
buena aproximación, sobre todo cuanto menor es el intervalo de estudio de
los factores.
Introducción
27
Figura I.4.Esquema de un diseño central compuesto 22.
Experimental
29
EXPERIMENTAL
Experimental
31
EXPERIMENTAL
1. Materiales y reactivos
Se usaron acetato de etilo y n-hexano de grado HPLC y cartuchos para SPE
de sílice de 1 g y 6 mL, de C-18 de 500 mg y 6 mL, y de florisil de 1 g y 6
mL suministrados por Schalab (Barcelona, España).
Los patrones de 4-t-butilfenol (t-Bu), 4-n-butilfenol (Bu), 4-n-pentilfenol
(Pen), 4-n-heptilfenol (Hep), 4-n-octilfenol (Oct), 4-n-nonilfenol (Non) y el
reactivo derivatizante (BSTFA, N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida)
fueron suministrados por Alfa Aesar GmbH & Co (Karlsruhe, Alemania). El 4-
n-hexilfenol (Hex) fue adquirido en Acros Organics. El 4-t-octilfenol (t-Oct)
fue obtenido de Dr Ehrenstorfer GmbH (Augsburgo, Alemania), y el bisfenol
A (BPA) de Sigma Aldrich (Madrid). El BPA marcado isotópicamente (BPA-
d16) fue adquirido en Cambridge Isotope Laboratories, Inc (EEUU).
2. Muestras
Las muestras de lodo de depuradora fueron proporcionadas por plantas
EDAR de La Rioja. Tras su recepción y etiquetado, las muestras se
almacenaron en congelador, -5ºC, y protegidas de la luz, hasta su análisis.
Para su análisis, se liofilizaron en un tubo Falcon durante al menos 48 horas.
El liofilizador utilizado fue el modelo Virtis Sentry Freezemobile 3S + L.
Una vez liofilizado el lodo, se trituró con un molino refrigerado con agua a
10-15ºC modelo IKA Labortechnik A10. La refrigeración del molino es
necesaria para evitar la pérdida de los analitos, que son volátiles, porque
durante la molienda la muestra se calienta. El lodo liofilizado y molido se
almacenó en el tubo Falcon en refrigerador (+4ºC) y protegida de la luz,
hasta su análisis.
Experimental
32
3. Extracción con líquidos presurizados
3.1. Extractor PLE
Se utilizó un extractor ASE200 (Accelerated Solvent Extractor) de Dionex,
equipado con celdas de acero inoxidable de 11 mL. Los disolventes son
conducidos hasta la celda de extracción mediante una bomba de alta
presión. El equipo lleva incorporado un carrusel en el que se pueden
disponer 24 celdas de extracción de 1, 5, 11, 22 o 33 mL. La celda que
contiene la muestra se introduce de forma automática en el horno donde se
llena con el disolvente hasta que alcanza la presión y la temperatura
programadas para la extracción. Transcurrido un tiempo de extracción
estática, la celda se vacía mediante el paso de disolvente, a continuación, el
sistema se purga con nitrógeno. En la Figura II.1. se muestra un esquema
del extractor PLE utilizado.
Fig.II.1. Esquema del extractor PLE utilizado
Experimental
33
El extracto se recoge en un vial colector situado en el carrusel inferior con
capacidad para 26 viales colectores de 40 ó 60 mL y otros 4 viales para
residuos. En la Figura II.2. se muestra una fotografía del extractor ASE200.
Este equipo permite trabajar con presiones desde 500 a 3000 psi y con
temperaturas comprendidas entre temperatura ambiente y 200 ºC.
Fig.II.2. Equipo ASE200, A. Distribuidor de disolventes, B. Carrusel de
celdas de extracción, C. Carrusel de viales colectores
3.2. Preparación de la celda de extracción
Cada celda se preparó colocando en el fondo 2 filtros de celulosa, sobre los
filtros se dispone 1 g de desecante. Se añade la mezcla de muestra con
desecante y sorbente y, a continuación, se rellena completamente con
desecante, colocando encima otro filtro de celulosa (ver Figura II.3).
Experimental
34
Fig.II.3. Esquema de la forma de llenado de la celda de extracción
3.3. Condiciones PLE
Las condiciones experimentales utilizadas para realizar la PLE son las
mismas propuestas por Martínez-Moral y Tena 2011:
Disolvente: Diclorometano
Temperatura: 130 ºC
Presión: 1500 psi
Tiempo: 1 minuto
Nº de ciclos: 1 ciclo
Experimental
35
4. Extracción sólido líquido con ultrasonidos focalizados
4.1. Extractor FUSLE
Todos los procesos FUSLE fueron efectuados con un equipo de ultrasonidos
focalizados SONOPULS 2070 provisto de una sonda con una micropunta de
titanio de 3 mm y una cámara de insonorización como el que se muestra en
la Figura II.4.
Fig.II.4. Equipo SONOPULS 2070 usado en FUSLE. A) Convertidor de
ultrasonidos, B) Resonador, C) Sonda de titanio, D) Baño de hielo, E)
Cámara de insonorización, F) Generador.
Experimental
36
4.2. Procedimiento FUSLE
Los tratamientos FUSLE fueron efectuados a 0ºC en un baño de hielo. En
todos los casos se pesaron 0,5 g de lodo seco y las muestras se extrajeron
con 10 mL de acetato de etilo, durante un periodo de tiempo comprendido
entre 20 y 120 s, a una potencia de ultrasonidos entre 20 y 70 %, al 50%
del ciclo del pulso, y entre una y tres veces. Durante el estudio de vida de la
sonda y la influencia del pulido de la sonda las muestras se extrajeron ya en
las condiciones óptimas, las cuales son 30 s, 70% de potencia y dos ciclos.
La micropunta fue sumergida en la mezcla muestra-disolvente dentro de un
vial cilíndrico de fondo plano, a unos 5 mm de distancia del fondo. Los
extractos obtenidos se centrifugaron durante 5 min a 2500 rpm en un
equipo Orto Alresa modelo Digicen. El sobrenadante se guarda y al sólido se
le añaden 5 mL de acetato de etilo y se centrifuga. Este proceso se repite
dos veces. Se juntan todos los sobrenadantes y se evaporaron hasta unos
250 µL bajo corriente de nitrógeno usando un evaporador Turbo Vap II
(Zymark, Hopkinton, MA, EEUU)
5. Extracción en fase sólida
Esta técnica se ha utilizado para realizar una limpieza de los extractos
FUSLE y PLE antes del análisis cromatográfico.
5.1. Sistema SPE
Para llevar a cabo la extracción en fase sólida se utilizó un sistema de vacío
modelo VisiprepTM SPE Vacuum Manifold con 12 puertos, como el que se
muestra en la Figura II.5.
Experimental
37
Fig.II.5. Sistema de vacio empleado para realizar la SPE
5.2. Procedimiento SPE
El extracto concentrado después de la evaporación en el Turbo Vap II (unos
250 µL) se mezcla con n-hexano o con agua a pH 2.5, según sea el sorbente
contenido en el cartucho SPE. La mezcla se pasa por el cartucho a una
velocidad de 1 mL/min.
Si se requiere, el cartucho se lava y se seca bajo vacio antes de la elución
con acetato de etilo. El eluyente obtenido se evapora en el Turbo Vap II y el
residuo se reconstituye en 2 mL con acetato de etilo que se almacenan en
viales de 2 mL a -5ºC en ausencia de luz hasta su análisis por cromatografía
de gases acoplada a espectrometría de masas. En la Figura II.6 se muestran
los extractos finales listos para el análisis.
Experimental
38
Fig.II.6. Extractos finales en acetato de etilo que se analizan mediante GC-
MS.
6. Derivatización
Para llevar a cabo el análisis de estos compuestos mediante GC-MS es
necesario formar derivados más volátiles y menos polares. Esta etapa de
derivatización se realizó bajo las condiciones descritas por Martínez-Moral y
Tena 2011, añadiendo 50 µL de BSTFA a 500 µL de extracto y calentando a
50ºC durante 15 min.
La reacción que se lleva a cabo es una sililación, reemplazo de un hidrógeno
ácido con un grupo alquilsililo (ver figura II.7).
Figura II.7. Reacción de sililación del BSTFA
Experimental
39
7. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas
7.1. Cromatógrafo de gases acoplado a espectrómetro de
masas
Se utilizó un cromatógrafo de gases modelo Varian 3900 acoplado a un
detector MS de trampa de iones Varian 2100T (Walnut Creed, CA, EEUU)
equipado con una columna capilar de sílice fundida de 30 m x 0.25 mm con
una fase estacionaria de 0.25 µm de espesor, de composición 5% de
polidifenilsiloxano – 95% de polidimetilsiloxano. Para automatizar las
inyecciones se utilizó un muestreador automático CombiPAL (CTC Analytics,
Zwingen, Suiza) (ver Figura II.8).
Fig.II.8. Sistema cromatográfico. 1) Cromatógrafo de gases, 2)
Espectrómetro de masas de trampa de iones, 3) Automuestreado CombiPAL.
Experimental
40
7.2. Condiciones de inyección
El volumen de inyección fue 1 µL. El inyector se programo a 280ºC.
Inicialmente se utilizó una relación de división del flujo 1:20 durante 0.01
minutos, seguida de una inyección sin división (splitless) durante 2 minutos
y finalmente la relación de división se fijo en 1:50 hasta el final del
cromatograma.
7.3. Condiciones cromatográficas
Para la separación de la mezcla de los 10 analitos derivatizados la rampa de
temperatura del horno cromatográfico comenzó con una temperatura inicial
de 50ºC durante los dos primeros minutos, tras los que asciende hasta
100ºC a un ritmo de 30ºC/min, a continuación aumenta a un ritmo de
10ºC/min hasta 200ºC, y finalmente aumenta hasta 300ºC a un ritmo de
10ºC/min, mantenidos durante 8 minutos.
Como gas portador se utilizó helio (99.996%) a un caudal de 2 mL/min.
7.4. Espectrometría de masas
La ionización se realizó mediante impacto electrónico y la detección fue en
modo SIS (Selected Ion Storage). Los iones de cuantificación de los analitos
derivatizados y los tiempos de retención se detallan en la tabla II.1.
Experimental
41
Tabla II.1. Tiempo de retención e iones de cuantificación de los derivados de
los analitos.
Compuesto Tiempo de retención (min) Iones de cuantificación
4-t-butilfenol 8.40 207
4-n-butilfenol 9.20 179 + 222
4-n-pentilfenol 10.42 179 + 236
4-n-hexilfenol 11.35 179 + 250
4-t-octilfenol 11.49 207 + 208
4-n-heptilfenol 12.83 179 + 264
4-n-octilfenol 13.84 179 + 292
4-n-nonilfenol 14.61 197 + 358
BPA 16.34 357 + 358
BPA-d16 16.19 368 + 369
7.5. Tratamiento de datos
Los cromatogramas se procesaron utilizando el programa MS Data Review
6.5, de Varian MS Workstation. Para el tratamiento de datos y la
representación gráfica se utilizó Microsoft Excel 2007. Statgraphics se utilizó
para el diseño de experimentos.
8. Análisis de las muestras
El método se calibró mediante una recta de calibrado usando patrones
externos y áreas de pico relativas a un patrón interno (BPA-d16). En cada
análisis se obtuvo una recta de calibrado con 7 puntos, que incluían 0, 10,
100, 250, 500, 750, 1000 ng/mL. Las disoluciones de calibrado y las
muestras se procesaron en orden aleatorio.
En todos los casos se obtuvieron coeficientes de correlación R2 superiores a
0.99. En la Fig.II.9. se muestra el cromatograma correspondiente a una
disolución patrón de 1000 ng/mL.
Experimental
42
Fig.II.9. Cromatograma GC-MS de una disolución patrón de 1000 ng/mL de
cada compuesto. Identificación de picos: derivados sililados de 1) t-Bu,
2) Bu, 3) Pen, 4) Hex, 5) t-Oct, 6) Hep, 7) Oct, 8) Non y 9) BPA
Resultados
43
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados
45
RESULTADOS
1. Presentación del problema
La determinación de APs y BPA en lodo de depuradora se ha llevado a cabo
anteriormente en nuestro laboratorio utilizando el método descrito por
Martínez-Moral y Tena 2011 basado en PLE-CG-MS. También se trato de
aplicar la técnica FUSLE para el tratamiento de los lodos antes del análisis
por GC-MS.
Sin embargo, durante el estudio del efecto del tiempo de uso de la sonda
que se presenta en esta memoria, se observó que para ciertas muestras los
métodos anteriormente establecidos no eran adecuados. Como se puede ver
en el cromatograma de la Fig.III.1, la señal correspondiente al patrón
interno para algunas muestras era muy superior a la de las disoluciones de
calibrado, cuando la señal de patrón interno debería ser del mismo orden
para extractos de muestra y disoluciones de calibrado.
Fig.III.1. Cromatograma GC-MS del extracto FUSLE de una muestra y una
disolución de calibrado correspondiente a la señal del BPA-d16 (modo SIS
m/z=368).
Resultados
46
En la Fig.III.1. se puede apreciar la diferencia entre las señales
correspondientes al BPA-d16, a pesar de que el extracto y la disolución de
calibrado contienen la misma cantidad de BPA-d16. En azul se muestra la
señal del patrón interno de uno de los puntos de la recta de calibrado (1000
ppb) y en rojo se representa la señal obtenida para un extracto de muestra.
Con el BPA ocurre algo similar. En la Fig.III.2. se muestran las señales de
un extracto de muestra para el BPA y del patrón de 1000 ppb. Unas señales
tan grandes para el BPA en los extractos no son normales, lo que plantea
dudas sobre los resultados obtenidos.
El mismo problema se detectó en los extractos PLE. Lo que nos indicó la
existencia de algún compuesto en la matriz que produce interferencia en la
determinación GC-MS de BPA y BPA-d16.
Fig.III.2. Cromatograma GC-MS de un extracto FUSLE de muestra y una
disolución de calibrado correspondiente a la señal del BPA (modo SIS
m/z=357+358).
Por ello, se ha propuesto la inclusión de una etapa de limpieza mediante
SPE para los extractos PLE y FUSLE. A continuación se presentan los
resultados obtenidos en el desarrollo del método de limpieza.
Resultados
47
2. Limpieza del extracto
2.1. Elección del sorbente
Una vez detectada la presencia de una interferencia, se procedió al
desarrollo de un método de limpieza del extracto. En este caso se optó por
una extracción en fase sólida. En primer lugar, se realizó la selección del
sorbente más adecuado para retener los compuestos de interés y eliminar la
interferencia del extracto.
Para seleccionar el tipo de sorbente más adecuado para los compuestos de
interés se probaron distintos sorbentes disponibles: C-18, Florisil y sílice.
En los análisis se utilizo un lodo que contenía la interferencia y que fue
fortificado con 2 µg de APs y BPA por gramo de lodo.
2.1.1. SPE en fase reversa (cartuchos C18)
Se han descrito distintos métodos de limpieza mediante SPE en fase reversa
en el análisis de los analitos de estudio o semejantes (Gatidou y col. 2007;
Andréu y col. 2007; Vega-Morales y col. 2011; Mohapatra y col. 2012;
Samaras y col. 2013).
En la tabla III.1. se recogen las condiciones de trabajo descritas en los
trabajos citados.
Resultados
48
Tabla III.1.Condiciones SPE descritas para C-18.
Artículo Gatidou y col.
2007
Andréu y col.
2007
Vega-Morales
y col. 2011
Mohapatra y
col. 2012
Samaras y
col. 2013
Acondicionamiento 7 mL MeOH
6 mL agua
10 mL metanol 3x5 mL MeOH
3x5 mL agua
7 mL MeOH
3 mL agua
6 mL AcOEt
6 mL EtOH
6 mL agua
Muestra 100 mL agua 100 mL agua Agua 100 mL agua 100 mL
agua pH 2.5
Lavado
4x2.5 mL agua
2x5 mL
agua:metanol
9:1
2 mL agua
Secado 60 min 5 min Se secan
Elución
8 mL
DCM:Acetona
4:1
10 mL MeOH
2 mL MeOH
8 mL
MeOH:DCM
3:1
6 mL AcOEt
En todos los casos, el primer paso es redisolver el extracto evaporado en
agua, generalmente acidificada para evitar la desprotonación de los fenoles
y favorecer su retención en el C18.
Una vez estudiada la bibliografía se decidió usar una adaptación del método
descrito por Samaras y col. tal y como se recogen en la Fig.III.3. En este
estudio se emplearon cartuchos de 500 mg de C-18 y de 6 mL de capacidad.
También se probaron para la redisolución de los analitos en el residuo seco
del extracto distintos disolventes miscibles con agua, como acetato de etilo,
acetona y metanol.
El residuo se redisolvió en 250 µL de estos disolventes para a continuación
añadirle 100 mL de agua antes de pasarlo a través del cartucho.
Resultados
49
Acondicionamiento
- 6 mL acetato de etilo.
- 6 mL etanol.
- 6 mL agua pH 2.5.
Adición de muestra
- La mezcla de 250 µL de extracto en disolvente de
redisolución y 100 mL de agua a pH 2.5 se pasa por el
cartucho a 3 mL/min.
Lavado
- 2 mL de agua acidificada.
Secado
- 15 minutos con aire con ayuda de vacío.
Elución
- 6 mL de AcOEt.
Fig.III.3. Esquema del método SPE con cartuchos C18
El extracto SPE se evaporó a unos 500 µL y se llevó a 2 mL con AcOEt en
matraz volumétrico. De estos, se tomaron 500 µL y se añadieron 50 µL de
BSTFA y 10 µL de piridina para formar los correspondientes derivados
sililados antes del su análisis mediante CG-MS. Las recuperaciones
obtenidas se muestran en la Tabla III.2.
Extracción en fase sólida para APs y BPA con C-18 como
sorbente
Resultados
50
Tabla III.2. Recuperaciones SPE para distintos disolventes iniciales.
Compuesto AcOEt Acetona Metanol
t-Butylphenol 119 ± 4 77 ± 14 97 ± 7
Butylphenol 110 ± 2 82 ± 8 99 ± 3
Pentylphenol 108 ± 4 75 ± 8 130 ± 9
Hexylphenol 110 ± 4 148 ± 30 131 ± 12
t-Octylphenol 86 ± 5 61 ± 16 95 ± 15
Heptylphenol 79 ± 6 80 ± 20 101 ± 26
Octylphenol 59 ± 8 74 ± 10 110 ± 0
Nonylphenol 76 ± 4 41 ± 21 137 ± 2
Recuperación media ± intervalo de confianza (95%, N=3)
A pesar de que en la mayoría de los casos las recuperaciones fueron
buenas, no se consigue eliminar la interferencia (ver Fig.III.4.), por lo que
el método de limpieza propuesto no es válido para las muestras.
Fig.III.4.Cromatograma CG-MS (modo SIS m/z=368) de extractos FUSLE de
una muestra sometida a SPE con cartuchos de C18 según en procedimiento
descrito en Fig.III.3., usando distintos disolventes de redisolución, y de un
blanco sin interferencia.
Resultados
51
2.1.2. SPE en fase normal (cartuchos de sílice y Florisil)
En la bibliografía se han descrito distintos métodos para el análisis de BPA y
APs (Grumetto y col. 2008; Bizkarguenaga y col. 2012; Fernández-Sanjuán
y col. 2009) con limpieza de los extractos mediante SPE en fase normal.
En el caso de fase normal el extracto de muestra debe ser disuelto en
disolventes no polares para conseguir la retención de los analitos en el
sorbente polar.
En este estudio, para realizar la limpieza en fase normal se emplearon
cartuchos de Florisil y cartuchos de sílice, ambos de 1 g y 6 mL.
Tabla III.3.Condiciones SPE descritas en la bibliografía para Florisil y sílice.
Articulo Grumetto y col. 2008 Bizkarguenaga y col.
2012
Fernández-Sanjuán y
col. 2009
Acondicionamiento 5 mL Hexano:AcOEt
96:4
5 mL n-hexano 20 mL Hexano:DCM 1:1
20 mL DCM:Acetona 1:1
Muestra
6 mL Hexano:AcOEt
96:4
8 mL AcOEt
8 mL n-hexano
Se lleva a 1 mL
100 mL Hexano:DCM/g
100 mL DCM:Acetona/g
Lavado 20 mL Hexano:AcOEt
93:7
Elución
20 mL AcOEt
15 mL n-hexano:tolueno
65:35
15 mL AcOEt:DCM:MeOH
40:40:20
20 mL Hexano:DCM 1:1
20 mL DCM:Acetona 1:1
Una vez estudiada la bibliografía, se decidió utilizar una adaptación del
método descrito por Grumetto y col. 2008. Un esquema del proceso SPE se
muestra en la Fig.III.5.
Resultados
52
Acondicionamiento
- 6 mL n-hexano/AcOEt 96:4.
Adición de muestra
- La mezcla de 250 µL de extracto en AcOEt y 6 mL de n-
hexano se pasa por el cartucho a 1 mL/min.
Elución
- 8 mL de AcOEt.
Fig.III.5. Esquema del método SPE con cartuchos de sílice y Florisil.
El extracto SPE obtenido se evapora hasta 500 µL y se lleva a 2 mL con
AcOEt en matraz volumétrico. A 500 µL de este extracto se le añaden 50 µL
de BSTFA para formar los derivados de los analitos y finalmente se inyecta
en el cromatografo.
En la tabla II.4. se muestran las recuperaciones obtenidas con sílice y
Florisil.
Tabla III.4.Recuperaciones SPE para cartuchos de sílice y Florisil.
Compuesto Sílice Florisil
t-Butylphenol 96 ± 3 55 ± 1
Butylphenol 100 ± 4 57 ± 1
Pentylphenol 98 ± 2 77 ± 2
Hexylphenol 105 ± 2 73 ± 1
t-Octylphenol 100 ± 3 46 ± 3
Heptylphenol 101 ± 3 54 ± 2
Octylphenol 23 ± 6 45 ± 3
Nonylphenol 109 ± 12 57 ± 2
Bisphenol A - 115 ± 7
Recuperación media ± intervalo de confianza (95%, N=3)
Extracción en fase sólida para APs y BPA con cartuchos de
sílice y Florisil
Resultados
53
Se obtuvieron recuperaciones cuantitativas (100%) para los APs con sílice y
para BPA con Florisil. Sin embargo, sólo con Florisil se consigue eliminar la
interferencia procedente de la muestra. Esto se muestra en la Fig.III.6.
Fig.III.6. Cromatogramas CG-MS correspondientes a la señal del BPA-d16
(modo SIS m/z=368) obtenidos para extractos sometidos a SPE con
cartuchos de Florisil y sílice.
Para mejorar las recuperaciones obtenidas con los cartuchos de Florisil se
estudió la optimización de las variables de la SPE.
2.2. Estudio de las variables SPE
Antes de proceder al estudio de variables se llevó a cabo un estudio de
distribución del analito durante las diferentes etapas del proceso de SPE. De
esta forma se puede conocer que etapa puede mejorarse para alcanzar el
100% de recuperación de los analitos.
Resultados
54
Para ello, se estudió el porcentaje de analito que queda en:
a) El material de vidrio utilizado antes de añadir la muestra al cartucho.
b) La muestra eluida del cartucho.
c) Sucesivas eluciones con disolvente de elución.
El recipiente donde se mezcla el extracto con el hexano y la pipeta Pasteur
usada para añadirlo se lavaron con acetato de etilo para disolver los analitos
que se hayan podido quedar retenidos en las paredes.
Los resultados obtenidos muestran que en este proceso se pierde
aproximadamente un 5% de los analitos. Las pérdidas se reducen si al
terminar de pasar la muestra también pasamos dos veces 2 mL de n-
hexano por las paredes del mismo recipiente que contenía la muestra.
2.2.1. Volumen de elución
Para determinar el volumen óptimo de elución, esta etapa se realizó usando
3 alicuotas de 2 mL. Cada alícuota se analizó como se ha descrito
anteriormente. Los resultados de recuperación se muestran en la tabla III.5.
Tabla III.5.Recuperaciones de las eluciones.
Compuesto 1ª Elución 2ª Elución 3ª Elución
t-Butylphenol 59 ± 7 2 ± 1 -
Butylphenol 60 ± 8 - -
Pentylphenol 69 ± 6 - -
Hexylphenol 80 ± 9 - -
t-Octylphenol 69 ± 7 - -
Heptylphenol 82 ± 9 - -
Octylphenol 66 ± 8 - -
Nonylphenol 71 ± 8 - -
Bisphenol A 97 ± 11 3 ± 1 -
Recuperación media ± intervalo de confianza (95%, N=4)
Resultados
55
La mayor proporción de los analitos se eluyen en los primeros 2 mL y una
pequeña parte en la segunda alícuota. En la tercera ya no se detecta
analito. Por lo tanto, se selecciona un volumen de 4 mL para eluir los
compuestos del cartucho.
2.2.2. Porcentaje de AcOEt en la disolución del extracto
El extracto obtenido tras la extracción FUSLE o PLE en acetato de etilo no es
adecuado para realizar una SPE en fase normal. Para mejorar la retención
de los analitos es necesario disminuir la polaridad del disolvente. Para ello,
el extracto se lleva a sequedad o casi a sequedad (250 µL de AcOEt) y se
reconstituye con n-hexano. Los volúmenes de n-hexano que se estudian
fueron 3, 6, 12, 18 y 25 mL de n-hexano para 250 µL de AcOEt y 10 mL
para extractos llevados a sequedad que corresponden a un 7.7, 4, 2, 1.4, 1
y 0% de AcOEt.
Los resultados se muestran en la Fig.III.7. Como puede verse, al disminuir
el porcentaje de acetato de etilo aumenta la recuperación. La retención en el
Florisil aumenta al aumentar el volumen de n-hexano, por consiguiente, el
porcentaje de AcOEt seleccionado fue 0% y el volumen de n-hexano
añadido al extracto llevado a sequedad fue 10 mL.
Resultados
56
Resultados
57
Por lo tanto, las condiciones SPE con las que finalmente se realizaron los
análisis son:
Acondicionamiento:
- 5 mL de n-hexano
Adición de muestra
- Se añaden 10 mL de hexano al residuo seco del extracto y se
pasa por el cartucho a 1 mL/min.
Elución
- 4 mL de AcOEt.
El extracto SPE obtenido se evapora hasta 500 µL y se lleva a 2 mL con
AcOEt en matraz volumétrico. A 500 µL de este extracto se le añaden 50 µL
de BSTFA para formar los derivados de los analitos y finalmente se inyecta
en el cromatografo.
3. Extracción FUSLE.
3.1. Estudio de variables.
El objetivo principal de esta parte del estudio fue seleccionar las mejores
condiciones FUSLE para extraer los analitos del lodo seco de depuradora.
3.1.1. Consideraciones previas
Las variables que pueden influir durante el proceso de extracción con
ultrasonidos focalizados son:
La potencia de los ultrasonidos.
Resultados
58
El tiempo de extracción.
La composición del disolvente de extracción.
El número de ciclos de extracción.
La masa de muestra puesta en juego.
El tamaño de partícula del sólido a extraer.
La temperatura de extracción.
El tiempo de pulso.
La forma del vial.
De estas variables se estudiaron la potencia de ultrasonidos, el tiempo de
extracción y el número de ciclos de extracción. El resto de variables se fijó
de acuerdo con los resultados descritos en la bibliografía y nuestra
experiencia previa con esta técnica, tal como se describe a continuación.
a) Temperatura de extracción
Debe tenerse en cuenta que a mayor temperatura mayor es la solubilidad
del analito en el disolvente y se favorece la ruptura de la interacción analito-
matriz. En cambio, un aumento de la temperatura afecta negativamente a
los fenómenos de cavitación producidos durante la extracción con
ultrasonidos focalizados. Al aumentar la temperatura, las burbujas
cavitacionales se llenan rápidamente de vapor de disolvente, por lo que se
amortigua la implosión y la capacidad de extracción disminuye (Suslick y
col. 1998). La condición de compromiso se alcanza a 0ºC (Sanz-Landaluze y
col. 2006), por lo que se sumergen los viales en un baño de hielo.
Resultados
59
b) Tiempo de pulso
El tiempo de pulso indica que tanto por ciento de cada segundo emite el
equipo radiación ultrasonidos. Tienen que producirse dos etapas: 1) tiempo
de activación, tiempo requerido para producir burbujas cavitacionales
químicamente activas y con un tamaño que les permita producir una
implosión eficaz, y 2) tiempo de desactivación, intervalo entre cada pulso.
Se ha descrito que la radiación de ultrasonidos durante el 50% del ciclo
ofrecía los mejores resultados (Sun y Weavers 2006). Por lo que se decidió
establecer el tiempo de pulso al 50% del ciclo.
c) Forma del vial
Es importante para evitar “zonas muertas” donde no se produce la
cavitación. Para evitarlas, el vial debe ser lo más estrecho posible (Capelo,
J.L. y col. 2005) y la punta de titanio debe situarse a una distancia de unos
5 mm del fondo del vial.
d) La composición del disolvente de extracción
Esta variable ha sido estudiada por Martínez-Moral y Tena 2011. En este
trabajo se estudió el efecto de la acetona, acetato de etilo, metanol y
diclorometano siendo el metanol el disolvente que mejores resultados
proporcionaba pero su evaporación era muy lenta y por eso se decidió
utilizar el acetato de etilo que permite buenas recuperaciones y una rápida
evaporación.
Por ultimo, el volumen del disolvente de extracción y la masa de muestra se
fijó en 10 mL y 0.5 g de muestra, respectivamente, de acuerdo con el
tamaño del vial y su geometría.
Resultados
60
3.1.2. Diseño central compuesto
Una vez fijados los valores de las variables antes comentadas se realizó un
diseño de experimentos central compuesto para encontrar la potencia de
ultrasonidos y el tiempo de extracción óptimos para la extracción de APs y
BPA de lodo de depuradora.
El diseño central compuesto se compone de un diseño factorial 22 con 4
puntos estrella dispuestos a ±del centro del dominio experimental y ocho
réplicas del punto central. Para conseguir la rotabilidad del diseño la
distancia fue de 1.41. De este modo, el diseño se compone de 16
experimentos llevados a cabo aleatoriamente que se detallan en la tabla
III.6.
Los niveles de las variables del dominio experimental del CCD se
corresponden con y. Los valores de la potencia de ultrasonidos
variaron desde el 20% al 70% y los niveles fueron 20, 27, 45 (valor
central), 63 y 70%. El tiempo de extracción se estudió entre 20 y 120 s y
los niveles fueron 20, 35, 70 (valor central), 105 y 120 s.
Las señales obtenidas para los APs y BPA en los experimentos se ajustaron
al correspondiente modelo polinómico de segundo grado.
Los resultados del CCD se recogen en las tablas III.7 y III.8, y en los
diagramas de Pareto de la figura III.8.
Resultados
61
Tabla III.6.Tabla de experimentos del diseño central compuesto.
Experimento Potencia, % Tiempo, s
1 (C) 45 70
2 (C) 45 70
3 21 70
4 (C) 45 70
5 (C) 45 70
6 28 35
7 45 120
8 28 105
9 (C) 45 70
10 (C) 45 70
11 63 35
12 (C) 45 70
13 45 20
14 (C) 45 70
15 63 105
16 70 70
(C): Punto central
Resultados
62
En la tabla III.7 se muestran los coeficientes ajustados de las variables y
sus interacciones. El análisis ANOVA realizado mostró que solamente cinco
de estos coeficientes eran significativos, con un nivel de confianza del 95%
(p-valor < 0.05): la potencia para los compuestos t-butilfenol, butilfenol,
pentilfenol y BPA, y el efecto cuadrático del tiempo de extracción para el
hexilfenol. Al eliminar los factores no significativos la potencia para el
pentilfenol y el efecto cuadrático del tiempo de extracción para el hexilfenol
dejaron de ser significativos, tal como se puede ver en los diagramas de
Pareto de la Fig III.8, donde se muestra la significación de los efectos para
cada compuesto.
Tabla III.7. Coeficientes del modelo que explica la señal en función de la
potencia y el tiempo obtenidos a partir de los resultados del diseño central
compuesto.
Compuesto Cte A B AA AB BB
t-Butilfenol 383∙102 -10.0* -418 0.715 2.00 1.93
Butilfenol 282∙102 110* -341 -0.573 1.58 1.53
Pentilfenol 282∙102 42.9* -335 -0.493 1.784 1.462
Hexilfenol 458∙102 -66.4 -563 -0.446 3.37 2.47*
t-Octilfenol 784∙102 -66.5 -931 -2.21 6.07 3.86
Heptilfenol 446∙102 -125 -553 -0.469 3.99 2.21
Octilfenol 141∙102 -355 121 2.76 1.66 -1.16
Nonilfenol 912∙102 -286 -114∙10 0.781 8.16 4.49
Bisfenol A 543∙102 -148* -470 2.11 8.26 0.751
A: Potencia
B: Tiempo de extracción
*: Factores estadísticamente significativos (p-valor < 0.05)
Resultados
63
Tabla III.8.Valores p del análisis ANOVA de los resultados del diseño central
compuesto.
Compuesto A B AA AB BB
t-Butilfenol 0.0124 0.1065 0.8490 0.4585 0.0614
Butilfenol 0.0111 0.0688 0.8567 0.4869 0.0768
Pentilfenol 0.0336 0.0779 0.8663 0.3974 0.0676
Hexilfenol 0.1145 0.1148 0.9189 0.2899 0.0434
t-Octilfenol 0.3481 0.1790 0.8131 0.3685 0.1213
Heptilfenol 0.1516 0.1159 0.9112 0.1987 0.0562
Octilfenol 0.8822 0.4356 0.5778 0.6350 0.3552
Nonilfenol 0.1678 0.0817 0.9264 0.1915 0.0542
Bisfenol A 0.0138 0.9149 0.8630 0.3503 0.8062
A: Potencia
B: Tiempo de extracción
En rojo: Factores estadísticamente significativos (p-valor < 0.05)
a) t-butilfenol
b) Butilfenol
Resultados
64
c) Bisfenol A
d) Pentilfenol
e) Hexilfenol
f) T-Octilfenol h) Heptilfenol
g) Octilfenol i) Nonilfenol
Fig.III.8.Diagramas de Pareto estandarizados de todos los efectos
(izquierda) y de los significativos (derecha) para el t-butilfenol, butilfenol,
bisfenol A, pentilfenol y hexilfenol. Diagramas de pareto de todos los efectos
para el t-octilfenol, octilfenol, heptilfenol y nonilfenol.
Resultados
65
De acuerdo con los resultados obtenidos del diseño de experimentos, la
potencia y el tiempo son los únicos efectos significativos, y su efecto es
positivo. Por lo tanto, se seleccionó una potencia del 70% y un tiempo de
extracción de 30 s.
3.1.3. Estudio del número de ciclos
Una vez establecidas las condiciones óptimas de tiempo y potencia, se
procedió a determinar el número de ciclos de extracción requeridos para
conseguir una extracción completa. Para ello, se realizaron de uno a tres
ciclos de extracción sobre una misma muestra de lodo fortificado. El estudio
se realizó por triplicado.
Los resultados se muestran en la Fig. III.9. Como puede verse la mayor
cantidad de analito se obtiene en el primer ciclo y en el segundo se obtienen
recuperaciones en torno al 10-15%. En el tercer ciclo las recuperaciones
obtenidas son en torno al 1-4%, por lo que finalmente se realizaran dos
ciclos en cada análisis.
Recuperación media ± intervalo de confianza (95%, N=3)
Fig.III.9. Recuperaciones obtenidas en cada ciclo.
Resultados
66
4. Caracterización del método FUSLE-SPE-CG-MS
El método completo se caracterizó para los nueve compuestos en términos
de recuperación, repetibilidad (DER intra-dia, %) y precisión intermedia
(DER inter-día, %).
Los valores de recuperación oscilaron entre el 21 y 47% para el BPA y el
heptilfenol respectivamente (ver tabla III.9).
La repetibilidad y la precisión intermedia del método se determinaron
mediante ANOVA. Se procesaron doce alícuotas de lodo seco fortificado
realizando cuatro repeticiones por día durante tres días. En la tabla IV.1 se
muestran los resultados obtenidos expresados como desviación estándar
relativa (DER). Como se puede observar, los valores de repetibilidad no
superaron el 22% en ningún caso exceptuando el BPA que obtuvo unos
valores elevados. Los valores de precisión intermedia fueron en todos los
casos menores de 11%.
En la Fig. III.10. se muestran los valores de recuperación obtenidos cada día
para cada compuesto.
Recuperación media ± intervalo de confianza (95%, N=4)
Fig. III.10. Recuperaciones medias obtenidas en tres días.
Resultados
67
Tabla III.9. Características del método FUSLE-SPE-CG-MS.
Compuesto Recuperación (%) Repetibilidad
(DER, %)
Precisión
intermedia (DER, %)
t-Butilfenol 32 19 9
Butilfenol 33 18 3
Pentilfenol 35 18 7
Hexilfenol 40 22 8
t-Octilfenol 47 19 9
Heptilfenol 40 15 7
Octilfenol 46 15 10
Nonilfenol 43 11 8
Bisfenol A 21 38 11
Repetibilidad calculada como la desviación estándar relativa intra-dia (n=4
réplicas x 3 días). Precisión intermedia calculada como la desviación
estándar relativa intra-dia (n=4 réplicas x 3 días).
5. Estudio del tiempo de vida de la sonda
5.1. Influencia del uso de la sonda
Como ya se menciona en la introducción de esta memoria las sondas están
sujetas a un desgaste natural, lo que provoca la erosión en la superficie de
emisión de ultrasonidos y la reducción de su acción. Este desgaste es mayor
a medida que se aumenta la potencia de ultrasonidos en los sucesivos usos.
Para comprobar la influencia del uso de la sonda se realizaron ciento diez
extracciones de lodo seco fortificado siguiendo el método descrito FUSLE-
SPE-CG-MS utilizando la misma sonda en todas las extracciones.
Resultados
68
A continuación, en las Figuras III.11-19 se muestran las cartas de control
para cada compuesto. Las líneas rojas corresponden a la media ± 3s (tres
veces la desviación estándar) y las amarillas a 2s (dos veces la desviación
estándar) de los 5 primeros análisis.
Fig.III.11. Evolución de la recuperación del t-butilfenol con el nº de
extracciones realizadas con la sonda.
Fig.III.12. Evolución de la recuperación del n-butilfenol con el nº de
extracciones realizadas con la sonda.
Resultados
69
Fig.III.13. Evolución de la recuperación del n-pentilfenol con el nº de
extracciones realizadas con la sonda.
Fig.III.14. Evolución de la recuperación del n-hexilfenol con el nº de
extracciones realizadas con la sonda.
Resultados
70
Fig.III.15. Evolución de la recuperación del t-octilfenol con el nº de
extracciones realizadas con la sonda.
Fig.III.16. Evolución de la recuperación del n-heptilfenol con el nº de
extracciones realizadas con la sonda.
Resultados
71
Fig.III.17. Evolución de la recuperación del n-octilfenol con el nº de
extracciones realizadas con la sonda.
Fig.III.18. Evolución de la recuperación del n-nonilfenol con el nº de
extracciones realizadas con la sonda.
Resultados
72
Fig.III.19. Evolución de la recuperación del BPA con el nº de extracciones
realizadas con la sonda.
Se puede observar en esta secuencia de análisis que hay una tendencia a
disminuir la recuperación obtenida a medida que la sonda ha tenido más
usos. En casi todos los casos se sobrepasa la línea de 3s inferior y no la
superior. Para el Hex, Oct y BPA no se sobrepasa la línea de 3s inferior por
lo que todavía se podría seguir usando la sonda sin observar diferencias
significativas en la eficacia. Se puede decir que para la extracción de APs y
BPA de lodo de depuradora, el número de usos de la sonda sería de unos
80.
En este trabajo también se hicieron fotografías de la sonda a medida que se
fueron realizando las extracciones para observar posibles cambios en la
punta de la sonda. En la Fig.III.20. se muestran las imágenes más
representativas de los cambios en la sonda.
Las instantáneas fueron tomadas con un microscopio Discoverytm VMS-004
capaz de hacer fotografías a x40 y a x400 aumentos.
Resultados
73
A) Sonda nueva
B) Sonda con 4 análisis
C) Sonda con 9 análisis
Resultados
74
D) Sonda con 30 análisis
E) Sonda con 70 análisis
F) Sonda con 110 análisis
Fig.III.20. Imágenes de la sonda durante el transcurso del estudio.
Resultados
75
En ellas se observa como en los primeros usos la punta de la sonda se va
desgastando de manera uniforme. A los 70 usos se observa la aparición de
irregularidades en la superficie de la punta. Sin embargo, esta erosión no
aparece a los 110 análisis.
También se han comparado los resultados obtenidos con dos sondas nuevas
para examinar la influencia del cambio de la sonda.
En la Tabla III.10. se muestra la comparación de la recuperación obtenida
con dos sondas nuevas. Se puede observar que hay diferencias significativas
para todos los compuestos excepto para el pentilfenol, el octilfenol y para el
BPA. Por ello, aunque las medias obtenidas no son muy distintas, no se
puede concluir que con dos sondas nuevas se vayan a obtener los mismos
resultados.
Tabla III.10. Comparación de dos sondas nuevas.
Compuestos Sonda N1 Sonda N2 p-valor
t-Butilfenol 33 ± 4 38 ± 4 0.0207
Butilfenol 32 ± 2 38 ± 3 0.0053
Pentilfenol 35 ± 4 39 ± 5 0.1242
Hexilfenol 39 ± 6 45 ± 3 0.0413
t-Octilfenol 47 ± 4 54 ± 4 0.0074
Heptilfenol 39 ± 3 44 ± 3 0.0159
Octilfenol 45 ± 5 49 ± 4 0.1420
Nonilfenol 42 ± 3 47 ± 4 0.0294
Bisfenol A 21 ± 6 24 ± 2 0.1442
Recuperación media ± intervalo de confianza (95%, N=4)
En rojo: valores con diferencias significativas (p-valor<0.05)
Resultados
76
A continuación, en la tabla III.11. se muestra la comparación de una sonda
nueva con otra que ha sido muy usada. Se puede concluir que hay
diferencias significativas entre las dos sondas para todos los compuestos
menos para el BPA.
Cabe destacar los valores de recuperación elevados conseguidos con la
sonda muy usada para algunos compuestos (>50%). Este hecho podría
explicarse por la formación de micropuntas en la superficie como
consecuencia de la erosión con el uso.
Tabla III.11. Comparación entre una sonda nueva y otra usada.
Compuestos Nueva (N1) Usada (MU1) p-valor
t-Butilfenol 33 ± 4 47 ± 4 0.0003
Butilfenol 32 ± 2 49 ± 2 0.0000
Pentilfenol 35 ± 4 53 ± 3 0.0000
Hexilfenol 39 ± 6 60 ± 2 0.0007
t-Octilfenol 47 ± 4 60 ± 4 0.0004
Heptilfenol 39 ± 3 57 ± 2 0.0000
Octilfenol 45 ± 5 60 ± 2 0.0002
Nonilfenol 42 ± 3 55 ± 2 0.0000
Bisfenol A 21 ± 6 22 ± 3 0.5587
Recuperación media ± intervalo de confianza (95%, N=4)
En rojo: valores con diferencias significativas (p-valor<0.05).
En la Fig.III.21 se muestran las fotografías de las cinco sondas utilizadas en
este trabajo:
- N1: sonda completamente nueva.
- N2: sonda completamente nueva.
- U: sonda usada en aproximadamente 250 usos de 30 segundos al 50% de
potencia.
- MU1: sonda muy usada, retirada por desgaste.
- MU2: sonda muy usada, retirada por desgaste.
Resultados
77
En ellas se observa como la superficie de la punta de las sondas nuevas
brilla y tiene surcos en forma de espiral mientras que la usada ya no tiene el
brillo inicial y se ha pulido de forma que ha desaparecido la espiral casi
completamente. La sonda MU1 presenta una superficie muy irregular, al
igual que la MU2 que presenta irregularidades siendo una de ellas una
micropunta que sobresale en el centro.
A continuación se muestra una grafica, Fig III.22. con las recuperaciones
obtenidas para cada compuesto con cada una de las sondas con las que se
hizo el estudio.
Como conclusión, se puede afirmar que la sonda y el uso de la misma
son una importante fuente de variación en los resultados obtenidos.
A) N1
B) N2
Resultados
78
C) U
D) MU1
E) MU2
Fig. III.21. Fotografías de las sondas utilizadas.
Resultados
79
Recuperación media ± intervalo de confianza (95%, N=4)
Fig. III.22. Recuperaciones de APs y BPA obtenidas con las distintas sondas.
5.2. Influencia del pulido de la sonda
En el manual del equipo de ultrasonidos focalizados, SONOPULS 2070,
encontramos un apartado en el que se comenta que todas las sondas están
sujetas a un desgaste natural, lo que provoca la erosión en la superficie de
emisión de ultrasonidos y la reducción de su acción. Por lo que pueden ser
pulidas y afiladas a fondo repetidamente, pero si el material se ha reducido
en aproximadamente 1 mm debido a la erosión o al afilado, la sonda no
deberá seguir usándose.
Por esta razón, se quiso estudiar la influencia del pulido en las distintas
sondas utilizadas. Para ello comparamos los valores de la recuperación de
APs y BPA obtenidas con tres sondas distintas antes y después de ser
pulidas. El pulido se realizó con una Dremel incorporada con un disco para
tronzar.
Las recuperaciones obtenidas y las comparaciones para examinar si hay
diferencias significativas entre ellas se muestran a continuación en las tablas
Resultados
80
III.12-14. Las fotografías de las sondas antes y después de ser pulidas se
muestran en las Fig.III.23-25. En la tabla III.12 se muestra el resultado
obtenido para la sonda U. En este caso no se compararon los resultados
porque es evidente que hay diferencias significativas en los resultados. En
todos los compuestos el pulido ha derivado en una disminución de la
recuperación de aproximadamente el 10%.
Fig.III.23. Sonda U antes y después de ser pulida respectivamente.
Tabla III.12. Recuperaciones con la sonda U antes y después de ser pulida.
Compuestos Antes Después
t-Butilfenol 46 ± 3 34 ± 3
Butilfenol 47 ± 1 33 ± 3
Pentilfenol 50 ± 4 35 ± 3
Hexilfenol 54 ± 3 40 ± 3
t-Octilfenol 61 ± 3 49 ± 4
Heptilfenol 54 ± 3 42 ± 2
Octilfenol 61 ± 3 48 ± 6
Nonilfenol 54 ± 4 44 ± 5
Bisfenol A 27 ± 5 16 ± 3
Recuperación media ± intervalo de confianza (95%, N=4)
En la tabla III.13. se muestran los resultados para MU1. En este caso se
observa que no hay diferencias significativas entre las recuperaciones
obtenidas para los APs (excepto para el Pen) antes y después del pulido de
la sonda.
Resultados
81
Por el contrario, la recuperación de BPA aumenta ligeramente tras el pulido
de la sonda MU1.
Tabla III.13. Recuperaciones de APs y BPA obtenidas con la sonda MU1
antes y después de ser pulida.
Compuestos Antes Después p-valor
t-Butilfenol 47 ± 4 47 ± 3 0.8442
Butilfenol 49 ± 2 46 ± 4 0.1367
Pentilfenol 53 ± 3 48 ± 4 0.0180
Hexilfenol 60 ± 2 54 ± 6 0.0609
t-Octilfenol 60 ± 4 59 ± 4 0.5671
Heptilfenol 57 ± 2 52 ± 5 0.0910
Octilfenol 60 ± 2 57 ± 3 0.0755
Nonilfenol 55 ± 2 53 ± 3 0.1210
Bisfenol A 22 ± 3 29 ± 4 0.0053
Recuperación media ± intervalo de confianza (95%, N=4)
En rojo: valores con diferencias significativas (p-valor<0.05).
Fig.III.24. Sonda MU1 antes y después de ser pulida respectivamente.
En la tabla III.14. se muestran los resultados para MU2. Estadísticamente,
no hay diferencias significativas entre los valores de recuperación obtenidos
antes y después del pulido exceptuando el caso del t-Bu y el Hep. Por lo que
podemos considerar que no hay diferencias al pulir la sonda en este caso.
Tabla III.14. Recuperaciones de APs y BPA obtenidos con la sonda “MU2”
antes y después de ser pulida.
Resultados
82
Compuestos Antes Después p-valor
t-Butilfenol 39 ± 2 36 ± 1 0.0166
Butilfenol 38 ± 5 34 ± 1 0.2174
Pentilfenol 41 ± 3 38 ± 2 0.0711
Hexilfenol 45 ± 2 42 ± 2 0.0543
t-Octilfenol 49 ± 6 49 ± 1 0.8358
Heptilfenol 44 ± 1 42 ± 1 0.0269
Octilfenol 49 ± 4 46 ± 3 0.2024
Nonilfenol 48 ± 9 45 ± 2 0.4821
Bisfenol A 23 ± 4 22 ± 3 0.4846
Recuperación media intervalo de confianza (95%, N=4)
En rojo: valores con diferencias significativas (p-valor<0.05).
Fig.III.25. Sonda MU2 antes y después de ser pulida respectivamente.
En conclusión, la influencia del pulido de sondas no ha sido apreciable para
las sondas que habían tenido un gran uso, puede ser debido a que ya
habían sobrepasado 1 mm de erosión en la punta. Para la sonda que tenía
un uso moderado el pulido a derivado en una disminución del rendimiento
de la sonda. Por lo que el pulido no es recomendable a ningún efecto en
estos casos.
Conclusión
83
CONCLUSIONES
Conclusión
85
CONCLUSIONES
1. Se ha desarrollado un método FUSLE-SPE-GC/MS para la determinación de
APs y BPA en lodo de depuradora.
2. La técnica FUSLE es más rápida y fácil de llevar a cabo que otras, como la
MAE o PLE. Asimismo, es una técnica de bajo coste frente a otras técnicas
de extracción.
3. Mediante un diseño central compuesto se han establecido las mejores
condiciones para la extracción FUSLE de los compuestos estudiados: 70%
de la potencia de ultrasonidos y un tiempo de extracción de 30 s.
4. Son necesarios dos ciclos de extracción para obtener mejores
recuperaciones de los analitos.
5. Se consigue eliminar las interferencias usando Florisil como sorbente en la
extracción en fase sólida.
6. Se han obtenido las mejores condiciones SPE para la extracción de los
compuestos a estudiar: 4 mL como volumen de elución y ausencia de AcOEt
en la redisolución del extracto.
7. El método desarrollado proporciona valores de recuperación entre el 32 y
47% (a excepción del BPA que la recuperación es de 21%).
8. El método presenta una desviación estándar relativa intra-día entre el 11 y
22% (a excepción del BPA 38%) y valores de desviación estándar relativa
inter-día entre el 7 y el 11%.
9. La sonda utilizada es una importante fuente de variabilidad en la
recuperación de APs de lodo.
Conclusión
86
10. Se ha demostrado que a medida que aumenta el uso de la sonda se tiende a
obtener una recuperación menor de los compuestos.
11. Se ha comprobado que el pulido de la sonda no tiene efectos positivos si se
quiere obtener mejores recuperaciones.
Bibliografía
87
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