LA COLORATION DES SECTION MINCE

STRUCTURE DES COLORANTS• affinité élective des structures intra et extracellulaires

pour un type de colorant bien déterminé– les substances alcalines (acidophiles) attirent les colorants

acides:• l’éosine (rouge)• acide picrique (jaune)• le vert rapide• l’orange G• la fuchsine acide (rouge)

– les substances acides (basophiles) fixent les colorants basiques:

• l’hématoxyline (bleu)• la safranine (rouge)• le carmin (rouge)• la thionine (bleu)• la fuchsine basique (rouge)

STRUCTURE DES COLORANTS

• Certains composés tissulaires fixent l’argent. Ce sont des structures argentaffines ou argyrophiles.

• Les structures qui fixent les sels de chrome (bruns) sont appelées chromaffines.

• Une substance qui ne peut être facilement colorée est dite chromophobe

CLASSIFICATION DES COLORANTS • Les colorants artificiels sont des corps complexes

dérivés de l'aniline

– Les colorants acides ont une affinité particulière pour les cytoplasmes et les substances fondamentales. Les structures qui ont une affinité pour ces colorants sont dites acidophiles

– Les colorants basiques se fixent de préférence sur la chromatine et les nucléoprotéines du cytoplasme. Les colorants basiques sont dits nucléaires et les substances qui se teignent dans leurs solutions sont dites basophiles.

• Les colorants naturels se trouvent dans la nature

– d'origine végétale (hématoxyline, orcéine, safran...)– d'origine animale : le carmin.

CLASSIFICATION DES COLORATIONS • Colorations panoptiques Elles confèrent aux structures des couleurs différentes sans que ces

couleurs soient révélatrices d'une composition chimique bien déterminée (trichrome de Masson, hémalun-éosine-safran, bleu de toluidine, May-Grünwald-Giemsa, Papanicolaou etc.)

• Colorations spéciales Elles sont destinées à visualiser des structures cellulaires ou tissulaires particulières en se basant sur leur composition chimique par des réactions histochimiques ou histoenzymatiques :- la réaction de Fouchet met en évidence les pigments biliaires ;- la réaction de Perls met en évidence le fer libre non lié à l'hémoglobine comme l'hémosidérine ou la ferritine ;- la réaction P.A.S met en évidence la composante glucidique de certaines substances ;- le Fontana-Masson qui met en évidence la mélanine ; les grains de neurosécrétion des cellules argentaffines ; - le noir soudan ou l'huile rouge O ou le rouge écarlate mettent en évidence les lipides sur les frottis ou les coupes à congélation ; - le rouge Congo met en évidence la substance amyloïde ; - la dihydroxyphénylalanine met en évidence la tyrosinase dans les cellules, - l'hématéine phosphotungstique de Mallory en évidence la fibrine, - l’aldéhyde fuchsine met en évidence les fibres élastiques etc.

PRINCIPALES METHODES DE COLORATIONS

• On utilise plusieurs modalités:

– des colorations progressives: par séjour de la substance à colorer dans le colorant, pendant un temps optimum au bout duquel on effectue un lavage

– des colorations régressives: sur coloration et élimination de l'excès de colorant par un différenciateur (alcool par exemple). C'est le cas de l'éosine qui colore les cytoplasmes et les noyaux en rouge. la différenciation ermet déliminer la coloration nucléaire alors que la coloration cytoplasmique persiste.

MÉCANISMES DE LA COLORATION • des facteurs chimiques interviennent le plus souvent:

– l'hématéine (NH+) va se fixer sur les acides phosphoriques des noyaux – l'éosine (CO-) se fixe sur les groupements positifs des protéines

cytoplasmqiues

• facteurs physiques

• facteurs de pénétration mécanique dans la coupe qui mesure 5 µm d'épaisseur

• des facteurs température

• Il faut noter que les laques sont parois nécessaires à la fixation de certains colorants, ou certains mordants (phénomènes de mordançage)

LA COLORATION HEMATOXYLINE EOSINE Technique

• Déparaffinage – Étape assurant la réhydratation de la coupe afin de la colorer3 bains de xylènes (2 à 3 min.)

• Réhydratation– alcool 100°, 95°, 70°(2 à 3 min.)

• Colorer dans l’Hématoxyline (10 min.)• Rincer à l’eau courante• Colorer dans une solution aqueuse d’Eosine à 1% (5 à 7 min.)• Rincer rapidement à l’eau courante• Déshydratation

– alcool à 70° puis 95°, alcool absolu (100°)• Xylènes 3 bains de xylènes (2 à 3 min.)• Montage avec baume de Canada

LE MONTAGE DES COUPES

• Permet:– la protection mécanique de la préparation– la conservation des colorations– l'obtention d'un degré de transparence et d'un indice de réfraction

avantageux d'un point de vue optique

•baume de Canada •lamelle couvre-objet

Attention!•aucune bulle d’air ne doit s’insérer entre la lame et la lamelle

RÉSULTATS

• Noyaux bleus à bleus-noirs• Cytoplasmes roses à rouges

COUPES DE CRYOTOME• C'est un microtome conçu spécialement pour la

réalisation à l'air libre, à température ambiante de coupes de tissu congelé.

• Le fragment, placé sur le plot du microtome est congelé (C02-chlorure de méthyle) puis coupé. La manipulation des coupes, qui adhèrent mal aux lames de verre, est délicate.

• La coloration se fait au Bleu de Toluidine.

CRYOSTAT • C'est un microtome placé

dans une enceinte réfrigérée.

• Le fragment tissulaire est préalablement congelé au C02.

• Les coupes adhèrent bien aux lames de verre et après séchage sont colorées par transferts successifs dans différents réactifs.

• De nombreuses colorations sont possibles.

AVANTAGES ET INCONVÉNIENTS DES COUPES CONGELÉE

• L'emploi du cryostat présente d'autres avantages : - les coupes sont fines et consomment donc peu de tissu- la finesse des coupes donne des conditions d'examen proches de celles de l'examen après inclusion en paraffine (~ 4 microns).- des grossissements x 400 peuvent être utilisés. Ils permettent une visualisation correcte des détails cytologiques.

• A noter que la congélation, quelque soit le système utilisé (cryotome ou cryostat) présente quelques inconvénients :- altération du fragment traité- examen de fragments de petite taille- tous les tissus ne nécessitent pas la même température de congélation : par exemple, le parenchyme mammaire se coupe bien à -25ºC mais pas la graisse qui nécessiterait des températures plus basses. Ceci explique que l'on obtient rarement le tissu adipeux péri-tumoral sur la lame.

COLORATION AVEC BLEU DE TOLUIDINE

DESHIDRATATION:- alcool à 90° puis 100°, 1-2’’

- xylène, 1-2’’

HYDRATATION:- alcool à 100° puis 90°, 1-2’’

COLORATION AVEC BLEU DE TOLUIDINE:

- 30-60’’

RINCER À L’EAU COURANTEDÉSHYDRATATION:- alcool à 90° puis 100°, 1-2’’

XYLÈNE:- 1-2’’

MONTAGE AVEC BAUME DE CANADA

RÉSULTATS

• Noyaux bleus à bleus-noirs• Cytoplasmes bleus claire