Universidad Autnoma Metropolitana

Unidad Xochimilco

Divisin de Ciencias Biolgicas de la Salud

Licenciatura en Qumica Farmacutica Biolgica

Obtencin de Metabolitos de Inters Industrial para la Salud

OBTE NCI N D E -FRUCTOFUR AN OSID AS A POR

Kluyveromicesmarx ianusA PARTI R DE SA CA ROS A C OMO FU ENTE D E

CAR BON O

Rosa Eugenia Reyes Reyes

Juan Esteban Barranco Florido

Alavez R. C; Garca P. D; Mungua L. R; Osorio S. A; Rodrguez N. S.

Contenido

Introduccin ............................................................................................................... 1

Marco terico ............................................................................................................. 1

Enzimas .............................................................................................................................. 1

Levadura ............................................................................................................................ 2

Kluyveromices marxianus ............................................................................................... 2

-fructofuranosidasa o invertasa (EC 3.2.1.26) ............................................................. 2

Produccin y regulacin catablica de enzimas .......................................................... 3

Mtodos analticos ........................................................................................................... 4

Cintica enzimtica ................................................................................................................................. 4

Concentracin de substrato................................................................................................................... 4

VMX ........................................................................................................................................................... 6

KMX ........................................................................................................................................................... 6

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica ....................................................................................... 7

Temperatura ............................................................................................................................................ 8

Concentracin de enzima ...................................................................................................................... 9

Inhibicin enzimtica .............................................................................................................................. 9

Hiptesis ................................................................................................................... 10

Objetivos .................................................................................................................. 10

Metodologa ............................................................................................................. 10

Microorganismo .............................................................................................................. 10

Medios de cultivo ............................................................................................................ 10

Inculo .................................................................................................................................................... 10

Fermentacin ......................................................................................................................................... 11

Condiciones de cultivo .................................................................................................. 11

Determinacin del crecimiento. .................................................................................... 11

Mtodos analticos. ........................................................................................................ 11

Determinacin de azcares reductores ............................................................................................. 11

Cuantificacin de protenas. ................................................................................................................ 12

Actividad enzimtica ............................................................................................................................. 13

Caracterizacin parcial de la -fructofuranosidasa de Kluyveromyces marxianus.

.......................................................................................................................................... 14

Determinacin del efecto del pH. ....................................................................................................... 14

Efecto de la temperatura. .................................................................................................................... 15

Catalizadores inicos de la enzima. ................................................................................................... 16

Determinacin de Km y Vmx aparente de la -fructofuranosidasa o Invertasa en clulas

libres. ...................................................................................................................................................... 16

REFERENCIA ........................................................................................................... 18

1

Introduccin

La importancia de las enzimas en la biotecnologa ha ampliado su campo de aplicacin en

la industria utilizndolas como herramientas para mejorar la produccin y la obtencin de

metabolitos.

Para la produccin de estos metabolitos se utilizan microorganismos los cuales pueden

ser bacterias, hongos y levaduras.

De estas ltimas podemos localizar al Kluyveromices marxianus, que forma parte de la

clase Ascomicetos, familia Saccharomycetaceae, sub-familia Saccharomycetoideae, del

gnero Kluyveromices y de la especie marxianus.

K. marxianus es una levadura utilizada en la industria debido a que una de sus

propiedades ms importante es la produccin de enzimas nativas, como -

fructofuranosidasa, -galactosidasa y pectinasas. La -fructofuranosidasa es un tipo de

enzima reprimible con actividad de invertasa.

Marco terico

Enzimas

Las enzimas presentan diversas ventajas sobre los catalizadores qumicos. Una de las

ms importantes es su especificidad para determinadas reacciones. Esta especificidad se

limita a una sola o a un grupo muy restringido de sustancias qumicas relacionadas con

ella, y excluye reacciones colaterales, con lo que se eliminan subproductos indeseables;

traducindose esto en un incremento de la productividad.

Estas catalizan las reacciones bajo condiciones moderadas de temperatura, presin y pH.

Esto disminuye los requerimientos energticos, y por tanto, los costos de produccin.

Las enzimas se encuentran en cualquier organismo vivo: plantas, animales o

microorganismos. Estos ltimos son la fuente preferida a nivel industrial, debido a que

presentan ventajas importantes en su produccin, como:

La sntesis de enzimas es ms predecible y controlable Se cuenta con un amplio espectro de caractersticas, tales como intervalos de pH,

resistencia a altas temperaturas Existe suficiente disponibilidad de materias primas con una composicin

relativamente constante Su produccin no est sujeta a variaciones estacionales, ni existe riesgo de

escasez por cambios climticos o situaciones geogrficas La manipulacin gentica ha incrementado considerablemente las posibilidades de

optimizar los rendimientos a travs de mutaciones, de seleccin de cepas y de condiciones de crecimiento y ms recientemente, mediante la tecnologa del DNA recombinante.

2

Diseo de enzimas mejoradas por ingeniera de protenas.

Las levaduras constituyen un importante grupo en cuanto a la produccin de diversas enzimas comerciales.

Levadura

Las levaduras son los microorganismos ms importantes desde el punto de vista

industrial, porque muchas de las especies pueden convertir los azucares en alcohol etlico

y dixido de carbono. Participan en la produccin de cerveza, vino, glicerol y dems. Las

clulas de levadura se utilizan tambin en la industria de la panificacin y como alimento

animal y humano, por su alto contenido proteco. (Hernndez, 2001)

Las levaduras son hongos microscpicos que, en un estadio de su ciclo biolgico, se

presentan en forma unicelular y se multiplican por gemacin. Este grupo de

microorganismos comprende unos 60 gneros y unas 500 especies. Se agrupan

principalmente en dos clases Ascomycotina y Basidiomycotina.

Entre las levaduras de uso industrial se encuentran Saccharomyces cerevisiae,

Saccharomyces ellipsoideus, Kluyveromices marxianus. Siendo esta ultima el eje de la

investigacin.

Kluyveromices marxianus

Kluyveromices marxianuses una de las dos levaduras que ms abundan en los productos

lcteos. Produce -galactosidasa y son fermentadoras potentes de los azcares, incluida

la lactosa (Jay, 1999), es capaz de hidrolizar la lactosa y de fermentar la galactosa. Posee

estatus GRAS (Generally Recognized As Safe) y QPS (Qualified Presumption of Safety),

es decir, se considera segura para su uso en la industria de alimentos.

K. marxianus sintetiza dos tipos de invertasa; interna y externa, ambos tipos de enzima

presentan la misma actividad especfica sobre sacarosa.

-fructofuranosidasa o invertasa (EC 3.2.1.26)

La invertasa cataliza la hidrolisis de restos terminales no reductores -D-fructofuranosdicos de fructofuransidos.

La denominacin trivial de invertasa, con la que tambin se conoce, hace referencia al

hecho de que los productos de la reaccin son conocidos desde antiguo como azcar

invertido ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de

glucosa y fructosa que resulta de su hidrlisis es levorrotatoria, por lo que en el

proceso se origina un cambio de signo (de positivo a negativo) del valor de rotacin

ptica.

Un mecanismo de regulacin en la sntesis de la invertasa, en el cual existe interaccin de

molculas de sacarosa con el receptor en la membrana celular generando seales

3

qumicas que podran ser trasladadas y amplificadas por monofosfato de adenina cclico

(cAMP) en el ncleo celular comenzando la induccin de la sntesis de invertasa a nivel

de ADN. El ARNm podra trasladar la informacin de la sntesis de invertasa a los

ribosomas, para despus ser sintetizada y secretada al espacio periplsmico, o bien en la

pared celular. (Figura 1)

Figura 1. Sntesis de la invertasa

Estas enzimas, tienen actividad sobre los enlaces de tipo -fructosdico hidrolizando la

molcula de sacarosa a glucosa y fructosa (Figura 2)

Figura 2. Hidrlisis de la sacarosa

Produccin y regulacin catablica de enzimas

La expresin gentica es un mecanismo en los microorganismos, la glucosa y otras

fuentes de carbono (rpidamente metabolizables) reprimen la expresin de genes de

enzimas relacionadas con el metabolismo de otras fuentes de carbono. El grado de

represin causado por glucosa depende fuertemente de la enzima afectada y la cepa

usada. La represin por glucosa es el principal sistema de regulacin en levaduras en la

4

expresin de un gran nmero de enzimas involucradas en el metabolismo de

carbohidratos. En presencia de glucosa, la sntesis de las enzimas de la gluconeognesis,

del ciclo de Krebs, la respiracin y otras especficas para la asimilacin de galactosa,

maltosa y sacarosa son fuertemente reprimidas.

Mtodos analticos

Cintica enzimtica

La cintica enzimtica estudia el mecanismo, velocidad y los factores que modifican las

reacciones catalizadas por enzimas. Los factores que estudiaremos son la concentracin

de substrato, temperatura, pH, concentracin de enzima, e inhibidores enzimticos.

Concentracin de substrato

La concentracin del substrato tiene un efecto importante en la velocidad de las

reacciones enzimticas. El anlisis del efecto del cambio de concentracin de substrato,

proporciona informacin respecto del mecanismo de reaccin, especificidad y

propiedades cinticas de las enzimas.

En 1902, al estudiar la cintica de la hidrlisis de Sacarosa, Adrian Brown descubre la

saturacin de la enzima Invertasa (EC 3.2.1.26) y propone que la reaccin se efecta en

dos etapas, primero la enzima (E) y el sustrato (S), se unen para formar un complejo (ES):

Que se disocia liberando el producto (P)

En 1913, Leonor Michaelis y Maude L. Menten corrigieron el trabajo de Brown y Henri.

Aplican condiciones estrictas para la medicin de la actividad enzimtica, y suponen que

la formacin del complejo ES, es rpida y reversible, mientras que la liberacin del

producto es lenta.

Rpida Lenta

Con base en este supuesto, proponen el modelo del Equilibrio Instantneo para

determinar la relacin entre la concentracin de substrato y la velocidad de las reacciones

enzimticas y obtienen una relacin matemtica que describe dicho efecto, la cual se

conoce como la ecuacin de Michaelis y Menten:

Donde:

v = velocidad de la reaccin [S] = Concentracin de substrato VMAX = Mxima actividad enzimtica KM = Constante de Michaelis

5

La ecuacin de Michaelis y Menten es una hiprbola; para valores pequeos de [S] la

cantidad del substrato limita la velocidad; mientras que con valores grandes el lmite es la

cantidad de enzima. (Monroy, 2004)

Las condiciones de equilibrio instantneo, propuestas por Michaelis y Menten consisten

en suponer que E y S reaccionan muy rpidamente para formar ES mientras que la

disociacin del complejo hacia producto es relativamente lenta porque k2 es muy

pequea. Por lo tanto, el complejo ES se encuentra en equilibrio con E y S. En estas

condiciones, KM es igual a la constante de equilibrio de la disociacin del complejo ES:

Ya que k2 es pequea, a menudo es el factor que limita la velocidad y por ello se conoce

como la constante cataltica (kcat) de la enzima.

Grfico 1. Cintica de Michaelis

Aos despus, en 1925 George E. Briggs y John B. S. Haldane corrigieron el trabajo de

Michaleis al establecer que la suposicin de que k1 y k-1 son mucho mayores que k2 no

siempre se cumple, por lo tanto no se alcanza el equilibrio de la disociacin de ES. En su

lugar proponen que la concentracin de ES se encuentra en un Estado Estacionario en el

que la velocidad de formacin de ES, es igual a la de descomposicin por disociacin y

por formacin de producto. Con esta suposicin la ecuacin no cambia de forma pero KM

ya no es igual a la constante de disociacin de ES, ahora es:

6

Grfico 2. Variacin de la concentracin de E, S y es durante una reaccin enzimtica.

VMX

Es la mxima actividad que puede alcanzar una enzima, tericamente se logra en

condiciones de [S] grande, porque entonces la enzima se satura y trabaja tan rpido como

es posible. En la prctica es imposible que la enzima alcance el valor de VMAX, debido a

limitaciones de difusin de productos y sustratos, desde y hacia el sitio activo. (Aldave,

2004)

KMX

Si la suposicin de Michaelis y Menten es vlida, KM es la constante de disociacin de ES

a E + S, igual a k-1/k1. Por lo tanto, es una medida de la afinidad de la enzima por su

substrato. Si KM es grande significa que k-1 es grande o que k1 es pequea por lo que la

reaccin inversa es ms favorecida que la reaccin directa y con ello la afinidad de la

enzima por su substrato es baja. Por el contrario, si KM es pequea, la afinidad de la

enzima por el substrato es grande.

Por otro lado, segn Briggs y Haldane, KM representa el cociente (k-1 +k2)/k1, este

cociente sigue siendo la constante de disociacin de ES, pero ahora tanto hacia S como

hacia P, porque se supone que k2 contribuye en forma significativa a la desaparicin de

ES. De cualquier manera, valores de KM grandes representan baja afinidad por el

substrato y valores pequeos afinidad alta.

El valor de KM tambin corresponde a la concentracin de S en la cual v = VMAX/2, que se

interpreta como la concentracin a la cual la enzima est saturada slo a la mitad.

7

Cuando ms de una enzima cataliza una reaccin, o si no estamos seguros de cul es el

substrato verdadero de una enzima, los valores de KM indican la relacin ms apropiada.

Tpicamente, si la enzima trabaja con varios substratos podra suponerse que el substrato

con el KM ms bajo es el substrato verdadero. (Monroy, 2004)

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la reaccin. La

curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima (Fig. 2). En el caso ms

general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual la actividad es mxima se

denomina pH ptimo; dicho pH no tiene porque coincidir con el pH intracelular. La relacin

entre el pH y la actividad depende del comportamiento cido-base del enzima y del propio

sustrato. Sustrato y enzima (centro activo) pueden contener grupos funcionales cidos y

bsicos, siendo su grado de disociacin dependiente del pH, lo que determinar, entre

otros aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad de unin del sustrato al

centro activo del enzima (Km). Los estudios cinticos a diferentes valores de pH nos

proporcionan informacin sobre el mecanismo cataltico de los enzimas y la naturaleza de

los aminocidos ms directamente implicados en la catlisis. (Aldave, 2004)

Grafico3.Efecto del pH sobre la actividad de diversos enzimas.

El pH del medio afecta la actividad de las enzimas, porque muchos de los aminocidos

tiene restos ionizables. Los cambios de pH modifican el grado de ionizacin de todos o

alguno de estos grupos, lo que repercute en la ionizacin total de la molcula de enzima

modificando su actividad al menos por tres mecanismos.

1. Los pH extremos, por debajo de 4.0, o por arriba de 10.0, cambian el grado de

ionizacin de casi todos los restos de aminocidos de la enzima, de forma que

puede alterarse su estructura tridimensional. Si este cambio es suficientemente

grande, se desnaturaliza la enzima y se pier- de su actividad de forma irreversible.

Incluso, la disminucin del pH, que se presenta en las muestras de fluidos

8

corporales o de tejidos por dao o muerte celular, puede ocasionar la des-

naturalizacin de las enzimas.

2. Las variaciones de pH ms pequeas, entre 4 y 10, afectan a un nmero menor de

grupos ionizables, pero si stos estn presentes en el sitio activo, la actividad

enzimtica cambia en forma importante. Sin embargo, este cambio normalmente

es reversible.

3. La variacin del pH tambin puede alterar la ionizacin del substrato, y modificar la

unin enzima substrato.

Para muchas enzimas, el efecto del pH tiene forma de campana con un valor de pH

ptimo bien definido, pero para otras, la forma de la curva es muy diferente; por ejemplo,

cuando en la interaccin enzima substrato participan muchos grupos ionizables. Los

puntos de inflexin de la curva pH/actividad corresponderan a los pK de los grupos

responsables de la dependencia frente al pH. Este tipo de informacin se ha utilizado para

identificar de los aminocidos del sitio activo.

Grfico 4. Efecto del ph sobre la actividad enzimtica.

Algunas enzimas estn adaptadas para funcionar al pH propio de su ambiente. Por

ejemplo, la Pepsina tiene un pH ptimo de 2.0, que corresponde aproximadamente al pH

del jugo gstrico. Por otro lado, el pH ptimo de ciertas enzimas intracelulares est muy

alejado del pH intracelular; por ejemplo, la Glicerato cinasa (EC 2.7.1.31) tiene un pH

ptimo de 9.8, y la Fosfogliceratomutasa (EC 5.4.2.1) de 5.9. Esto puede deberse a que

las enzimas manifiestan propiedades di- ferentes in vitro e in vivo, donde la interaccin

con los componentes celulares pueda modificar su dependencia del pH. (Monroy, 2004)

Temperatura

Igual que ocurre en las reacciones qumicas, al aumentar la temperatura aumenta la

velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Esto se debe a que un mayor

nmero de molculas alcanzan la energa cintica necesaria para superar la energa de

activacin de la reaccin. Sin embargo, el aumento de temperatura tambin disminuye la

estabilidad de la estructura de las protenas y las enzimas comienzan a desnaturalizarse,

9

de modo que a medida que aumente la temperatura la actividad enzimtica tiende a bajar.

Como consecuencia de estos efectos opuestos del aumento de temperatura, existe una

Temperatura ptima en la cual la actividad enzimtica tiene un mximo. Es de suponer

que a la temperatura normal de los organismos las enzimas sean estables, y por lo tanto

estn por debajo de su temperatura ptima. (Aldave, 2004)

Grfico 5. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.

La mayora de enzimas se desnaturalizan rpidamente a 100 C y pierden mucha de su

actividad al ser expuestas a temperaturas superiores a 60 C, an por perodos de tiempo

cortos.

Concentracin de enzima

Como se explic antes, la velocidad de la actividad enzimtica, depende de la constante

cataltica y la concentracin del complejo enzima substrato

S la enzima se encuentra en condiciones de [S] constante, o de saturacin, su actividad

depende solamente de la concentracin de enzima con una cintica de orden 1 esto es, al

aumentar la concentracin de enzima la actividad enzimtica aumenta en la misma

proporcin. Este efecto tiene relevancia biolgica en los procesos de induccin

enzimtica, cuando la actividad de una enzima que no exista o estaba a un nivel muy

bajo, aumenta por la sntesis de la misma, provocada por la acumulacin de su sustrato.

(Hestrin, 1998)

Inhibicin enzimtica

Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a las enzimas y disminuyen su

actividad. Las clulas emplean como inhibidores molculas de intermediarios metablicos

10

o iones, para controlar la actividad enzimtica como parte de la regulacin del

metabolismo. En investigacin se usan inhibidores para estudiar las propiedades de las

enzimas. Muchos inhibidores enzimticos son usados como medicamentos, venenos,

pesticidas, etc. Existen dos tipos generales de inhibidores enzimticos: Reversibles e

Irreversibles.

Los inhibidores irreversibles se combinan o destruyen un grupo funcional de la enzima,

necesario para la actividad cataltica. Los inhibidores irreversibles se disocian muy

lentamente de la enzima porque se unen con fuerza, ya sea en forma covalente, la

mayora, o no covalente, por tal motivo se dice que no se pueden eliminar. (Lampen,

1980)

Hiptesis

La enzima -fructofuranosidasa producida por K. marxianus a partir de un medio rico en

sacarosa, presenta actividad enzimtica. Si se cambian las condiciones ptimas de

temperatura, pH y efecto de cationes modificara su actividad enzimtica

Objetivos

Analizar la actividad de la enzima -fructofuranosidasa mediante ensayos enzimticos y

parmetros cinticos de crecimiento.

Obtencin de la enzima -fructofuranosidasa.

Compara la actividad enzimtica mediante dos fuentes de carbono (sacarosa y

glucosa)

Modificar y evaluar las condiciones de la -fructofuranosidasa (pH, temperatura y

efecto de cationes).

Determinar parmetros cinticos y obtencin de Vmx y Km.

Metodologa

Microorganismo

Para este estudio se utilizara la levadura Kluyveromyces marxianus.

Medios de cultivo

Inculo

Se prepararan 50 mL del medio. Con una composicin de 5% de sacarosa, 0.5% de

extracto de levadura y 5 mg de ampicilina.

11

Fermentacin

Se utilizaran 2 medios de cultivo para la fermentacin, de acuerdo al control que se

requiere:

Control negativo

Se prepararan 150 mL con una composicin de 0.5 % de extracto de levadura y 1% de

glucosa.

Control positivo

Se prepararan 150 mL con una composicin de 0.5% de extracto de levadura y 1% de

sacarosa.

Todos los medios de cultivo se preparan en matraces de 250 mL con tapn de algodn, y

se ajustan a un pH de 4.5, esterilizar a 10 lb de presin por 10 minutos.

Condiciones de cultivo

Todos los medios de incuban a 30C con agitacin de 180 rpm.

Determinacin del crecimiento.

Cada hora tomar de 10 mL de la muestra a partir del tiempo cero durante 12

horas. Posteriormente guardar 5 mL en refrigeracin y con los 5 mL restantes

centrifugar a 5000 rpm a 4C. Al sobrenadante se le mide pH y azcares totales, el

paquete celular se resuspender en 5 mL de agua y se medir su absorbancia a una

DO de 660 nm, calcular a travs de acuerdo con la curva estndar de peso seco

vs. DO.

Los cinco mL de muestra para congelacin se colocarn en tubos falcon para

posteriormente medir la actividad enzimtica.

La curva estndar nos proporciona la ordenada al origen (b), la pendiente (m) y la

lectura (y)

Mtodos analticos.

Determinacin de azcares reductores

Realizar una curva de calibracin y cuantificar los azucares reductores por el

mtodo propuesto Miller,G.L.(1959)

Preparar curva estndar. Tabla 1

12

Preparar una mezcla de reaccin con un volumen final de 1.5 ml en agua destilada

1 ml del reactivo de DNS

Hervir las muestras por 5 minutos

Dejar enfriar a temperatura ambiente

Llevar a volumen final de 10 ml con agua destilada

Agitar y leer a 550 nm de UV/Vis

Tabla 1. Curva estndar azucares reductores

Glucosa

(ml)

H2O

(ml)

Vol final

(ml)

Conc. Final

glucosa

(g/ml)

Reactivo

DNS

(ml)

Hervir H2O

(ml)

0.0

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.5

1.4

1.3

1.1

0.9

0.7

0.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

0

100

200

400

600

800

1000

1

1

1

1

1

1

1

5 min

5 min

5 min

5 min

5 min

5 min

5 min

7.5

7.5

7.5

7.5

7.5

7.5

7.5

Cuantificacin de protenas.

Realizar la curva de calibracin con BSA como estndar y cuantificar las protenas

mediante la tcnica propuesta por Lowry,H y cols. (1951) Tabla 2.

Preparar la solucin estndar y procedimiento:

Albmina 1mg/ml. 10 mg para 10 ml de agua destilada.

Tomar 0.3 ml de esta solucin y agregar 2.7 ml de agua destilada para una

solucin de 100 g/ml

Colocar en un tubo alcuota de estndar de protena

Llevar a 1 ml con agua destilada

Agregar 3 ml reactivo E y agitar vigorosamente

Dejar reposar 10 min. a T. ambiente

Agregar 0.3 ml reactivo fenol 1:1, agitar

Dejar reposar a T. amb.

Leer a 540 nm UV-Vis

13

Tabla 2. Curva estndar cuantificacin de protenas

Std albmina

(ml)

Conc. Final

albmina

H2O

(ml)

Reactivo E

(ml)

Folin 1:1

(ml)

0

0.125

0.250

0.500

0.750

1.0

0

12.5

25

50

75

100

1

0.875

.750

.500

.250

0

3

3

3

3

3

3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

Actividad enzimtica

Establecer el tiempo para una segunda fermentacin.

Determinar la actividad enzimtica con las muestras en congelacin.

Centrifugar las muestras a 5000 rpm a 4 C.

Resuspender el extracto enzimtico en 5 mL de agua destilada (realizar 2

veces el lavado).

Preparar una solucin estndar de sacarosa 5% en amortiguador de

acetatos pH 5.0. esta reaccin deber realizarse a 50 C. durante 30 min,

con agitacin constante.

Medir los productos de la reaccin enzimtica por la tcnica de azcares

reductores.

Realizar la reaccin como se indica en la siguiente tabla. Tabla 3.

Tabla 3. Condiciones para la determinacin de la actividad enzimtica

Muestra

de

clulas

(mL)

Agua

destilada

(mL)

Sol.

Estndar

de

sacarosa

5%(mL)

Temperatura

de incubacin

Muestra

T=0

min

(mL)

Muestra

T=30

min

(mL)

DNS

despus

de 30

min

0.2

0.8 4.0

50 C 0.1

0.1

3

3

14

Leer las muestras a 550 nm. En el espectrofotmetro de UV/Vis.

Realizar las diluciones necesarias para que los valores de la absorbancia

obtenidos queden dentro de la curva estndar de calibracin.

Caracterizacin parcial de la -fructofuranosidasa de Kluyveromyces

marxianus.

Determinacin del efecto del pH.

El pH es determinado por medio de soluciones amortiguadoras en una escala de pH =

3.5 hasta pH= 8.5. Tabla 4.

Preparar las siguientes soluciones amortiguadoras:

Buffer de citrato-fosfato 0.1M pH 4-5.

Buffer de fosfatos 0.1 M pH 6-8.

Disolver en cada caso la sacarosa al 5%.

Realizar por duplicado.

Tabla 4. Determinacin de pH

pH Muestra

de

clulas

(mL)

Agua

destilada

(mL)

Sol.

Estndar

de

sacarosa

5%(mL)

Temperaura

de

incubacin

Muestra

T=0

min

(mL)

Muestra

T=30

min

(mL)

DNS

despus

de 30

min

4.0 0.2

0.8 4.0

50 C 0.1

0.1

3

3

5.0 0.2

0.8 4.0

50 C 0.1

0.1

3

3

6.0 0.2

0.8 4.0

50 C 0.1

0.1

3

3

7.0 0.2

0.8 4.0

50 C 0.1

0.1

3

3

8.0 0.2

0.8 4.0

50 C 0.1

0.1

3

3

15

Efecto de la temperatura.

Preparar una solucin estndar de sacarosa 5% en amortiguador de acetatos pH 5.0. Esta reaccin deber realizarse a diferentes temperaturas, durante 30 min, con agitacin constante. Tabla 5.

Tabla 5.Determinacin de temperatura

Muestra

de

clulas

libres

(mL)

Agua

destilada

(mL)

Sol. Std

Sacarosa

(mL)

Temperatura

C

Muestra

1

T=0 min

(mL)

Muestra

2

T=30 min

(mL)

DNS

despus

de 30

min (mL)

0.2 0.8 4 40 C 0,1 0.1 3

3

0.2 0.8 4 50 C 0.1 0.1 3

3

0,2 0.8 4 60 C 0.1 0.1 3

3

0.2 0.8 4 70 C 0.1 0.1 3

3

0.2 0.8 4 80 C 0.1 0.1 3

3

16

Catalizadores inicos de la enzima.

Preparar una solucin estndar con un amortiguador de acetatos a pH con sacarosa al 5%.

Agregar los cationes con una concentracin de 5mM para cada catin estudiado.

Tabla 6.Determinacin de catalizadores inicos de la enzima

Cationes

(mL)

Muestra

de

clulas

(mL)

Agua

destilada

(mL)

Sol.

Estndar

de

sacarosa

5%(mL)

Temperaura

de

incubacin

Muestra

T=0

min

(mL)

Muestra

T=30

min

(mL)

DNS

despus

de 30 min

Mg2+ 0.2

0.8 4.0

50 C 0.1

0.1

3

3

Fe3+ 0.2

0.8 4.0

50 C 0.1

0.1

3

3

Cu2+ 0.2

0.8 4.0

50 C 0.1

0.1

3

3

Zn2+ 0.2

0.8 4.0

50 C 0.1

0.1

3

3

El control tendr amortiguador de acetatos a pH 5.0 con sacarosa al 5 % sin ningn catin. La actividad enzimtica del control se tomar como 100 % y se compararn con los resultados de actividad enzimtica en presencia de cationes porcentualmente

Determinacin de Km y Vmx aparente de la -fructofuranosidasa o

Invertasa en clulas libres.

Preparar soluciones de acetatos pH 5.0 con diferentes concentraciones de sacarosa. (5%,2.5%,1%,0.5%,0.25%)

Medir la actividad a 3 diferentes tiempos.

Observar Tabla 7.

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Tabla 7. Determinacin de Km y Vmax

Concentracin de

sacarosa en % t1 t2 t3

5 0 5 10

2.5 0 4 8

1 0 3 6

0.5 0 2 4

0.25 0 1 2

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REFERENCIA

1. Hernndez, A. (2001) Microbiologa Industrial Ed. Trillas, 1ra Ed. pg. 7

2. Jay, M. (1999) Microbiologa moderna de los alimentos 4ta edicin Editorial

ACRIBIA, S.A.

3. Monroy. M, Ordorica, M. A. (2004), Termodinmica, Cintica y Enzimas

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4. Aldave, M. Jorrn J. (2004) Estudio cintico de la actividad invertasa de levadura

de panadera. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular.

5. Hestrin S, Feingold DS, Schramm M (1998): -Fructofuranosidade (invertase) from

yeast. Methods in Enzymology 1: 251-257.

6. Lampen JO (1980): Yeast and Neurospora invertases. En: Boyer PD (ed): The

Enzymes, 3 ed. Vol V. Academic Press (New York, USA), pp 291-305.