new actividad lipolÍtica en cultivos de · 2011. 5. 11. · actividad lipolÍtica en cultivos de...

ACTIVIDAD LIPOLÍTICA EN CULTIVOS DE

Kluyveromyces marxianusUniversidadede Vigo

M. A. Longo, B. Bouzas, M. Costas, F.J. Deive

Dpto. de Ingeniería Química, Universidad de VigoCampus Lagoas-Marcosende, 36200 Vigo

Tel.: 986 81 39 90, Fax: 986 81 23 80 E-mail: [email protected] http://bioprocesos.uvigo.es

Enzimas lipolíticas

IntroducciónIntroducción

ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos

ResultadosResultados

ConclusionesConclusiones

PerspectivasPerspectivas

AgradecimientosAgradecimientos

Reacciones hidrólisis y síntesisAmplio rango de especificidad de sustratoRegio- y enantioselectividadEstables a alta temperatura y medio orgánicoOperación en condiciones suaves de P y T

LIPASAS / ESTERASAS

Enzimas lipolíticas


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





APLICACIONES

ALIMENTARIA(margarinas, panadería)

DETERGENTES(eliminación de

manchas grasas)PAPEL

(eliminación depósitos resina)

TRATAMIENTOAGUAS RESIDUALES

FARMACÉUTICAQUIMICA FINACOSMÉTICA

CURTIDO(desengrasado

de pieles)

Tendencias

Importante esfuerzo investigador


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Optimización y escalado de la producciónPurificación y caracterizaciónAplicaciones (principalmente medio orgánico)Estabilidad: inmovilización, modificaciónClonación y expresión de genesScreening de nuevos organismos productores (mesófilos, extremófilos)

Objetivos


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Estudio de la producción de enzimas lipolíticas por Kluyveromyces marxianus

Condiciones de cultivo:

- Composición del medio

- Aireación / Agitación

Estudio preliminar de propiedades

Materiales y métodosMicroorganismo, medio y condiciones de cultivo


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Extracto levadura (3 g/L)Extracto malta (3 g/L)Glucosa (10 g/L)Peptona micológica (5 g/L)Agar (20 g/L)

Cultivo en placa (30ºC, pH 4,5)

Kluyveromyces marxianus CECT 1018Cepa

Detección actividad lipasa/esterasa: + tributirina (10 g/L)

Glucosa (20 g/L)Extracto levadura (3 g/L)Extracto malta (3 g/L)Peptona micológica (5 g/L)KH2PO4 (1 g/L)

Materiales y métodosMicroorganismo, medio y condiciones de cultivo

Cultivo en medio líquido (pH 4,5)

Matraces 250 mL / 150 mLmedio, tapones celulosa30ºC120 rpm (incubador orbital)


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Materiales y métodosDeterminaciones analíticas

Biomasa: turbidimetría 570 nmLipasa: valoración automática (pHstato), sustrato tributirina

Análisis

Centrifugado 10000 rpm, 10 min, 4ºCResuspensión biomasa, medida actividad sobrenadante

Tratamiento muestrasIntroducciónIntroducción

ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Halos transparentes alrededor de las

colonias


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Detección de actividad lipolíticaScreening - Cultivo en placas agar/tributirina

Actividad lipasa/esterasa7 días de cultivoDilución 1:106

Cultivo en medio líquidoEfecto de la adición de inductores

Acido oleico (10 mM)Acido palmítico (10 mM)Aceite de oliva (10 g/L)Aceite de girasol (10 g/L)Aceite de maíz (10 g/L)Tributirina (10 g/L)Glicerol (10 g/L)

La producción de lipasas/esterasas suele verse favorecida por la presencia de compuestos

lipídicos en el medio (inductores)

Efecto variable según cepa


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Cultivo en medio líquidoEfecto de la adición de inductores

Biomasa: 2-4 g/L

Adición de tributirinapara producción de

lipasa

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12 14

Activ

idad

lipo

lític

a (U

/mL)

0

20

40

60

80

Biom

asa

(mg/

mL)

0

4

8

12

16

20

24

28 Acido oleicoAcido palmíticoAceite olivaAceite girasolAceite maízGlicerolTributirina

Actividad: < 10 U/mL

x 4x 4--88

x 6x 6


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Acido oleico: 16 g/L (x 4-8)

Tributirina: 60-70 U/mL (x 6)

Cultivo en medio líquidoEfecto de la concentración de tributirina

Concentración tributirina (g/L)2.5 5 10 15 20 30

Activ

idad

lipo

lític

a (U

/mL)

0

20

40

60

80

Biom

asa

(mg/

mL)

0

1

2

3

Biomasa: 1,5-2 g/L

Concentración de tributirina en el medio = 5 g/L

Actividad: 40-80 U/mL

30%30%


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





[TB] = 5 g/L: 30% superior

Peptona sojaPeptona micológicaPeptona caseínaExtracto carneExtracto levaduraMixta compleja

UreaAsparraginaGlicinaKNO3

(NH4)2SO4

Cultivo en medio líquidoSelección de fuentes de carbono y nitrógeno

Fuentes C

GlucosaFructosaGlicerolAlmidónGlucosa-Almidón (80:20)

SacarosaMaltosaLactosa

Fuentes N


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Cultivo en medio líquidoSelección de la fuente de carbono

Glucosa

Fructosa

Sacarosa

Maltosa

Lactosa

Glu-AlmAlmidón

Glicerol

Activ

idad

lipo

lític

a (U

/mL)

0

20

40

60

80

Biom

asa

(mg/

mL)

0

1

2

3

Mono- y disacáridos (Glu, Fru, Lac, Sac)

Mayor crecimiento (1-2 g/L)Mayor actividad (65-80 U/mL)

Maltosa, glicerol, almidónBajo crecimiento (0,5 g/L) y

actividad (20 U/mL)

Fuente CGlucosa


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Cultivo en medio líquidoSelección de la fuente de nitrógeno

Mixta (L

M)

Extr. carne

Extr. levadura

Pept. caseína

Pept. mico

l.

Pept. soja

(NH4)2SO4KNO3

Glicina

Asparragina

Urea

Act

ivid

ad li

polít

ica

(U/m

L)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Bio

mas

a (m

g/m

L)

0

1

2

3

Fuentes complejasMayor crecimiento (0,6-2,2 g/L)

y actividad (50-160 U/mL)

Fuentes inorgánicas, aminoácidos

Baja biomasa y actividad

Fuente NPeptona de soja

30%30%

100%100%


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Peptona soja

Cultivo en medio líquidoConcentración fuentes C, N, P

• Actividad extracelular• Biomasa (Actividad intracelular)

• [Glucosa]• [Peptona soja]• [KH2PO4]

Diseño factorial rotable 23 (α =1,68)

Variables independientes

Variables objetivo


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos




AgradecimientosAgradecimientos- α - 1 0 + 1 + α

Glucosa [C] 6 20 40 60 74

Peptona de soja [N] 6 20 40 60 74

KH2PO4 [P] 0 1 2,5 4 5

Valores reales (g/L) de las variables codificadas

Cultivo en medio líquidoConcentración fuentes C, N, P – Biomasa

1

2

3

4

5

6

010

2030

4050

6070

80

010

2030

4050

6070

Biom

asa

(mg/

mL)

Glucos

a (g/L

)

Peptona de soja (g/L)

Glucosa (g/L)10 20 30 40 50 60 70

Pept

ona

de s

oja

(g/L

)

10

20

30

40

50

60

70

1.8 2.0

2.0

2.22.4

2.62.8

3.03.2

3.43.6

3.84.0

4.24.4

4.64.8

Variables significativas (P < 0,1)[C], [N]

[Biomasa] (g/L) = 1,33 + 0,02 [C] – 0,0002 [C]2 + 0,02 [N] – 0.0003 [N]2 + 0,0006 [C][N]


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





[Glucosa] = 74 g/L[Peptona soja] = 74 g/L

Cultivo en medio líquidoConcentración fuentes C, N, P – Actividad extracelular

0

20

40

60

80

100

120

140

160

010

2030

4050

6070

80

010203040506070

Lipa

sa (U

/mL)

Glucos

a (g/

L)

Peptona de soja (g/L)

Glucosa (g/L)

10 20 30 40 50 60 70

Pept

ona

de s

oja

(g/L

)

10

20

30

40

50

60

70

80

60

45

65

50

70

55

75

6065

7075

80 85 90 95100

135130125120110115

105

[Lipasa] (U/mL) = 54,1 – 0,56 [C] + 0,02 [C]2 + 1,71 [N] – 0,02 [N]2

Variables significativas (P < 0,1)[C], [N]


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





[Glucosa] = 74 g/L[Peptona soja] = 35 g/L

Cultivo en medio líquidoEfecto aireación - agitación

Variación del volumen de carga en los matraces (aireación)


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Volumen de carga (mL)0 30 60 90 120 150

Activ

idad

lipo

lític

a (U

/mL)

0

20

40

60

80

Bio

mas

a (m

g/m

L)

0

1

2

3

4

Biomasa favorecida al aumentar la aireación

(< volumen carga)

Escasa variación en actividad lipolítica, en

el rango ensayado

150 rpm

Cultivo en medio líquidoEfecto aireación - agitación

Variación de la velocidad de agitaciónIntroducciónIntroducción

ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Biomasa y actividad favorecidas a120-150 rpm

Descenso a agitación elevada (180 rpm),

posible estrés celular

Agitación (rpm)60 120 150 180

Act

ivid

ad li

polít

ica

(U/m

L)0

20

40

60

80

Bio

mas

a (m

g/m

L)

0

1

2

150 mL

Propiedades de la enzima obtenida

Propiedades de interés

Estabilidad térmica

Estabilidad pH

Tolerancia a disolventes orgánicos

Estudio del crudo enzimático


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Propiedades de la enzima obtenidaEstabilidad térmica en medio acuoso

Tiempo (días)0 2 4 6 8 10

Activ

idad

resi

dual

(a/a

0)

0.20

0.40

0.60

0.80

0.10

1.00

Actividad residual del 80% durante 9 días a 50ºC

80%80%

50ºC, pH 4.0IntroducciónIntroducción

ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos






Tiempo (min)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Act

ivid

ad re

sidu

al (a

/a0)

0.20

0.400.500.60

0.80

0.10

1.00

tt1/21/2 = 16 = 16 minmin

100ºC, pH 4.0

Tiempo de vida media superior a otras lipasas mesofílicas (p.ej. C. rugosa) y

similar a algunas termofílicas


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos






Ek

E k

E 22

21

1 αα ⎯→⎯⎯→⎯ 1

( ) ( ) ( ) 221 +−−

−−

−−

+= ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ ααααα tk-exp kk

ktk-exp kk

kkk

k1a 2

12

11

12

22

12

11

Ajuste a modelo de desactivación en serie (2 etapas)

Posible existencia de varias especies con actividad lipolítica

k1 = 0,11 min-1

k2 = 0,01 min-1

α1 = 0,43α2 = 0


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





pH2 3 4 5 6

Act

ivid

ad re

sidu

al (%

)

0

20

40

60

80

100

120

Propiedades de la enzima obtenidaEstabilidad relativa a pH

24 h, 25ºC

Actividad residual 80-100% a pHinferior a 6,0

(poco común en lipasas conocidas)


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Propiedades de la enzima obtenidaTolerancia a disolventes orgánicos

Tiempo (días)0 1 2 3 4 5 6 7

Act

ivid

ad r

esid

ual (

a/a 0

)

0.20

0.40

0.60

0.80

0.10

1.00

25ºC, agitación

Disolventes (80%):n-hexanon-heptanociclohexano

> 70%> 70%

Actividad residual superior al 70% durante 6 días en presencia de

disolventes orgánicos


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Conclusiones

Actividad lipolítica en K. marxianus

Presenta propiedades prometedoras: termoestable, resistente a pH ácido y disolventes orgánicos

Medio de cultivo (enzima extracelular): tributirina (5 g/L), glucosa (74 g/L), peptona de soja (35 g/L)

Aireación y agitación (enzima extracelular): favorables niveles medio-altos


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Perspectivas futuras

Protocolo purificación ⇒ Secuenciación

Caracterización: PM, pI, pH y T óptimos, estabilidad, especificidad

Aplicaciones: reacciones de hidrólisis y de síntesis

Escalado de la producción


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Agradecimientos


ObjetivosObjetivos

MétodosMétodos





Este trabajo ha sido financiado por la Xunta de Galicia

(PGIDT03PXIB30103PR)

ACTIVIDAD LIPOLÍTICA EN CULTIVOS DE

Kluyveromyces marxianusUniversidadede Vigo

M. A. Longo, B. Bouzas, M. Costas, F.J. Deive

Dpto. de Ingeniería Química, Universidad de VigoCampus Lagoas-Marcosende, 36200 Vigo

Tel.: 986 81 39 90, Fax: 986 81 23 80 E-mail: [email protected] http://bioprocesos.uvigo.es

new actividad lipolÍtica en cultivos de · 2011. 5. 11. · actividad lipolÍtica en cultivos de...

Documents