klasick É a molekul Árn Í metody v klinick É a...
TRANSCRIPT
KLASICKKLASICKÉÉ A MOLEKULA MOLEKULÁÁRNRNÍÍ
METODY V KLINICKMETODY V KLINICKÉÉ A A
ONKOLOGICKONKOLOGICKÉÉ CYTOGENETICE.CYTOGENETICE.
Zuzana ZemanovZuzana Zemanováá
CENTRUM NCENTRUM NÁÁDOROVDOROVÉÉ CYTOGENETIKYCYTOGENETIKYÚÚstav klinickstav klinickéé biochemie a laboratornbiochemie a laboratorníí diagnostiky diagnostiky
VFN a 1. LF UKVFN a 1. LF UKPRAHAPRAHA
CYTOGENETIKACYTOGENETIKA
velmi velmi úúzce specializovanzce specializovanáá vvěědeckdeckáá discipldisciplíínana
zabývzabýváá se studiem struktury, funkce a evoluce se studiem struktury, funkce a evoluce chromosomchromosomůů a jejich chova jejich chováánníím v prm v průůbběěhu dhu děělenleníí
zzáároderodeččných i somatických bunných i somatických buněěkk
sleduje zmsleduje změěny a nepravidelnostiny a nepravidelnosti ttěěchto proceschto procesůů, , kterkteréé vedou ke vzniku povedou ke vzniku poččetnetníích a strukturnch a strukturníích ch odchylek chromosomodchylek chromosomůů v bunv buněčěčných jných jáádrechdrech
ZZáákladnkladníí meznmeznííky v rozvoji lidskky v rozvoji lidskéécytogenetiky:cytogenetiky:
StanovenStanoveníí ppřřesnesnéého poho poččtu lidských chromosomtu lidských chromosomůů -- 19561956
PrvnPrvníí popsaný syndrom spojený s trisomipopsaný syndrom spojený s trisomiíí chromosomu 21 chromosomu 21 -- 19591959
PrvnPrvníí popsanpopsanáá specifickspecifickáá chromosomovchromosomováá aberace u aberace u nnáádorovdorovéého onemocnho onemocněěnníí (CML, Ph(CML, Ph--chromosom) chromosom) -- 19601960
PruhovacPruhovacíí techniky barventechniky barveníí chromosomchromosomůů -- 1968 a1968 ažž 19701970
MolekulMolekuláárnrníí cytogenetikacytogenetika a rozvoj metody fluorescena rozvoj metody fluorescenččnníí in in situsitu hybridizace (FISH) hybridizace (FISH) -- 19881988
CytogenetickCytogenetickéé vyvyššetetřřeneníí::
KlinickKlinickáá cytogenetikacytogenetika →→→→→→→→ stanovenstanoveníí karyotypu nemocných s karyotypu nemocných s vrozenými vývojovými vadami, geneticky podmvrozenými vývojovými vadami, geneticky podmíínněěnými nými syndromy apod.syndromy apod.
PrenetPrenetáálnlníí diagnostika diagnostika →→→→→→→→ ururččeneníí chromosomovchromosomovéé výbavy plodvýbavy plodůů
In vitroIn vitro fertilizacefertilizace →→→→→→→→ vyvyššetetřřeneníí oocytoocytůů, spermi, spermiíí, , blastomerblastomera a blastocystblastocyst
NNáádorovdorováá cytogenetikacytogenetika →→→→→→→→ zpzpřřesnesněěnníí diagndiagnóózy a urzy a urččenenííprognprognóózy nzy něěkterých nkterých náádorových onemocndorových onemocněěnníí
LaboratoLaboratořře hygienicke hygienickéé sluslužžby by -- testovtestováánníí mutagennmutagenníích ch úúččinkinkůůchemických lchemických láátek na lidský organismus na tek na lidský organismus na úúrovni chromosomrovni chromosomůů; ; radiaradiaččnníí cytogenetikacytogenetika..
VYVYŠŠETETŘŘOVANOVANÉÉ TKTKÁÁNNĚĚ::
••lymfocyty perifernlymfocyty periferníí krvekrve
••bubuňňky plodovky plodovéé vodyvody••bubuňňky ky choriovýchchoriových klkklkůů
••bubuňňky placentyky placenty••perifernperiferníí krev plodukrev plodu
••kokožžnníí fibroblastyfibroblasty••bubuňňky vyky vyššetetřřovaných orgovaných orgáánnůů
••bubuňňky kostnky kostníí ddřřeneněě••bubuňňky solidnky solidníích nch náádordorůů
analýza chromosomanalýza chromosomůů-- ve svve svěětelntelnéém mikroskopum mikroskopu
-- mitosa mitosa -- bunbuněčěčnnéé dděělenleníí-- stadium metafstadium metafáázeze
SomatickSomatickáá bubuňňka:ka:DiploidnDiploidníí sada chromosomsada chromosomůů: : 22 p22 páárrůů autosomautosomůů
2 pohlavn2 pohlavníí chromosomychromosomymumužž 46,XY46,XYžžena 46,XXena 46,XX
ChromosomovChromosomovéé aberace:aberace:odchylky v poodchylky v poččtu nebo struktutu nebo struktuřře chromosome chromosomůů
(vrozen(vrozenéé x zx zíískanskanéé))
ChromosomovChromosomovéé aberace:aberace:
I. VrozenI. Vrozenéé (konstitu(konstituččnníí)) odchylkyodchylky jsou zjsou záákladem pkladem přři i vzniku vzniku chromosomchromosomáálnlněě podmpodmíínněěných klinických ných klinických syndromsyndromůů (nap(napřř. . DownDownůůvv syndrom); obvykle jsou syndrom); obvykle jsou ppřříítomny ve vtomny ve vššech buech buňňkkáách tch těěla.la.
II. ZII. Zíískanskanéé odchylkyodchylky chromosomchromosomůů nalnaléézzááme v me v nnáádorových budorových buňňkkáách; majch; majíí klonklonáálnlníí charakter charakter (postihuj(postihujíí jen urjen urččititéé bunbuněčěčnnéé klony).klony).
heterochromosomovheterochromosomovéé x x autosomovautosomovéé
CHROMOSOMOVCHROMOSOMOVÉÉ ABERACEABERACE
I. I. NUMERICKNUMERICKÉÉ ODCHYLKYODCHYLKY -- aneuploidieaneuploidie
•• zmnozmnožženeníí jednotlivých chromosomjednotlivých chromosomůů -- napnapřř. trisomie apod.. trisomie apod.(n+1)(n+1)
•• ztrztrááta jednotlivých chromosomta jednotlivých chromosomůů -- monosomiemonosomie(n(n--1)1)
CHROMOSOMOVCHROMOSOMOVÉÉ ABERACEABERACEI. I. NUMERICKNUMERICKÉÉ ODCHYLKYODCHYLKY -- euploidieeuploidie
= po= poččetnetníí zmzměěny, kterny, kteréé postihujpostihujíí celou chromosomovou sadu celou chromosomovou sadu ((triploidietriploidie, , tetraploidietetraploidie apod.)apod.)
CHROMOSOMOVCHROMOSOMOVÉÉ ABERACEABERACE
II. II. STRUKTURNSTRUKTURNÍÍ PPŘŘESTAVBYESTAVBY
translokacetranslokace
reciprokreciprokáá nereciproknereciprokáá
inserceinserce delecedelece inverseinverse
KLINICKKLINICKÁÁ CYTOGENETIKACYTOGENETIKA
stanovenstanoveníí karyotypu nemocných s vrozenými karyotypu nemocných s vrozenými vývojovými vadamivývojovými vadami
ururččeneníí chromosomovchromosomovéé výbavy plodvýbavy plodůů --prenatprenatáálnlníí diagnostikadiagnostika
stanovenstanoveníí karyotypu nemocných s karyotypu nemocných s genetickýmygenetickýmypodmpodmíínněěnými syndromy nými syndromy
poruchy fertilityporuchy fertility
NNÁÁDOROVDOROVÁÁ CYTOGENETIKACYTOGENETIKA
•• ZabývZabýváá se studiem zse studiem zíískaných chromosomových zmskaných chromosomových změěn n v buv buňňkkáách benignch benigníích a malignch a maligníích tumorch tumorůů..
•• V souV souččasnasnéé dobdoběě byly u vbyly u věěttššiny lidských neoplasiiny lidských neoplasiííprokprokáázzáány buny buňňky se strukturnky se strukturníími mi čči poi poččetnetníími mi zmzměěnami karyotypu.nami karyotypu.
•• VVěěttššinu studovaných lidských neoplasiinu studovaných lidských neoplasiíí ppřředstavujedstavujííhemoblastozyhemoblastozy. .
•• Teprve v poslednTeprve v posledníích letech se objevujch letech se objevujíí i výsledky i výsledky vyvyššetetřřeneníí bunbuněěk solidnk solidníích nch náádordorůů u vu věěttšíších souborch souborůůnemocných. nemocných.
CHROMOSOMOVCHROMOSOMOVÉÉ ABERACE V ABERACE V NNÁÁDOROVÝCH BUDOROVÝCH BUŇŇKKÁÁCH:CH:
I. NI. NÁÁHODNHODNÉÉ
•• postihujpostihujíí nnááhodnhodněě kterýkoliv chromosom nkterýkoliv chromosom náádorovdorovéébubuňňkyky
•• objevujobjevujíí se nse nááhodnhodněě u ru růůzných nemocných s rzných nemocných s růůznými znými diagnosamidiagnosami
II. NENII. NENÁÁHODNHODNÉÉ -- SPECIFICKSPECIFICKÉÉ
•• vyskytujvyskytujíí se u urse u urččitých konkritých konkréétntníích typch typůů nnáádordorůů•• mohou se podmohou se podíílet na vzniku a vývoji nlet na vzniku a vývoji náádorudoru•• slousloužžíí jako nezjako nezáávislý diagnostický a prognostický vislý diagnostický a prognostický
ukazetelukazetel
CHROMOSOMOVCHROMOSOMOVÉÉ ABERACE:ABERACE:
I. I. ZTRZTRÁÁTA GENETICKTA GENETICKÉÉHO MATERIHO MATERIÁÁLULUmonosomie, delecemonosomie, delece
II. II. ZMNOZMNOŽŽENENÍÍ GENETICKGENETICKÉÉHO MATERIHO MATERIÁÁLULUtrisomie, tetrasomie atd.trisomie, tetrasomie atd.duplifikaceduplifikace, amplifikace, amplifikacetriploidietriploidie, tetraploidie atd., tetraploidie atd.
III. III. PPŘŘEMEMÍÍSTSTĚĚNNÍÍ GENETICKGENETICKÉÉHO MATERIHO MATERIÁÁLULUtranslokace (reciproktranslokace (reciprokéé, nereciprok, nereciprokéé))inverse, inserce atd.inverse, inserce atd.
PotvrzenPotvrzeníí diagndiagnóózyzy
StanovenStanoveníí prognprognóózyzy
MonitorovMonitorováánníí úúspspěěššnosti lnosti lééččbyby potvrzenpotvrzeníí remise remise
vvččasný zasný zááchyt relapsuchyt relapsu
MonitorovMonitorováánníí úúspspěěššnosti transplantace bunnosti transplantace buněěk kostnk kostníí ddřřeneněě
(d(dáárci oparci opaččnnéého pohlavho pohlavíí, markery, chromosomov, markery, chromosomovéé polymorfismy)polymorfismy)
KonvenKonvenččnníí cytogenetickcytogenetickáá analýza v analýza v onkohematologiionkohematologii::
V dneV dneššnníí dobdoběě je nezbytnou souje nezbytnou souččááststíí vyvyššetetřřeneníínemocných s nemocných s hemoblastozamihemoblastozami..
METODY:METODY:KONVENKONVENČČNNÍÍ CYTOGENETICKCYTOGENETICKÁÁ ANALÝZA:ANALÝZA:
kultivace bunkultivace buněěk a zpracovk a zpracováánníí bunbuněčěčných kultur ných kultur (nap(napřř. lymfocyty perifern. lymfocyty periferníí krve 72h, bukrve 72h, buňňky kostnky kostníí ddřřeneněě 24h atd.)24h atd.)
barvenbarveníí chromosomchromosomůů -- do r.1969 do r.1969 GiemsovoGiemsovo barvivo nebo barvivo nebo orceinorcein
od r.1970 pruhovod r.1970 pruhováánníí chromosomchromosomůů -- rrůůznznéé techniky techniky (nej(nejččastastěěji tzv. Gji tzv. G--pruhy; dpruhy; dáále Rle R--pruhy, Cpruhy, C--pruhy atd.)pruhy atd.)
vyhodnocenvyhodnoceníí chromosomových aberacchromosomových aberacíí aberacaberacíí podle ISCN podle ISCN nomenklatury (1995), standardizovannomenklatury (1995), standardizovanéé zzáápisypisy
MOLEKULMOLEKULÁÁRNRNĚĚ CYTOGENETICKCYTOGENETICKÉÉ METODY (FISH)METODY (FISH)
PruhovPruhováánníí chromosomchromosomůů::
→→→→→→→→ zzáávisvisíí na na spiralizacispiralizaci a stupni kondenzace chromosoma stupni kondenzace chromosomůůprofprofáázeze -- aažž 2000 pruh2000 pruhůů, , prometafprometafáázeze -- 850 pruh850 pruhůů, , metafmetafáázeze -- 400 400
aažž 450 pruh450 pruhůů na haploidnna haploidníí sadu (1 pruh = 5 asadu (1 pruh = 5 ažž 10 Mb DNA)10 Mb DNA)
medium kolchicin hypotonie fixace preparace
kre
v, k
ostn
í dřeň
barv
en
í
inkubace při 37°C
Postup při kultivaci a přípravě preparátů k cytogenetickému vyšetření
38,X,-Y,del(2)(q33q35),der(6)r(6)(p25q21)ins(6;?)(q13;?),add(8)(p11),der(9)t(9;17)(p11;q11),der(10)t(10;17)(p11;q11),-
13,der(14;22)(q10;q10),-15,-17,-18,der(19;21)(q10;q10)del(19)(q13),-21/37,idem,-der(6)r(6)ins(6;?)/37-39,idem,del(1)
(q11)/35-38,idem,add(7)(q32)/38,idem,del(7)(q32)/38,idem,dup(11)(q13q23)/38-39,idem,der(X)t(X;7)(p22;p11),der(6)t(6;19)(p21;q13),-7,der(7)t(6;7)(p21;q36),-der(14;22),+r1,+mar1/38-39,idem,der(7)del(7)(q32)ins(7;7)(q32;q11q22)
ins(7;7)(q22;q11q32)ins(7;7)(q32;q32q22)t(7;?)(q22;?)t(?;19)(?;q11)/37-38,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),der(7)/39-40,idem,
i(5)(p10),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+der(16)t(5;16)(q22;q13),+add(17)(p11),-20/38,idem,-der(10)t(10;17),+der(17;20)
(q10;q10),+der(18)t(10;18)(q11;q11),-20/38,idem,-der(10)t(10;17),-der(14;22),+der(14;22)add(22)(q13),+der(17;20),
+der(18)t(10;18),-20/40,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?)(q13;?),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+12,+add(17)(p13),-20, der(22)t(20;22)(q11;p11),+mar2/40,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+12,+der(17) r(17;?)
(p13q25;?),-20,der(22)t(20;22),+mar2/39-40,idem,inv(4)(p11q27),-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?), der(10)t(10;17),+i(10)
(q10),+12,+der(17)r(17;?),-20,der(22)t(20;22),+mar2/39,idem,der(3)r(3;?),-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?),-der(10)t(10;17),
+i(10)(q10),+der(17;20),-20,+mar2/76-77,idemx2/73-75,idemx2,der(X)t(X;7)x2,der(6)t(6;19)x2,-7,-7,der(7)t(6;7)x2,-
der(14;22)x2,+r1x2/73-76,idemx2,der(7)x2/73-74,idemx2,der(7)x2,-der(6)r(6)ins(6;?)/78-80,idemx2,-der(6)r(6)ins (6;?)x2,+ins(6;?)x2,-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10)x2,+12,+12,+add(17)(p13)x2,-20,-20,der(22)t(20;22)x2,+mar2x2/79-
80,idemx2,-der(6)r(6)ins(6;?)x2,+ins(6;?)x2,-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10)x2,+12,+12,+der(17)r(17;?)x2,-20,-20,der(22)
t(20;22)x2,+mar2x2/66-74,idemx2,-1,del(4)(q21),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22),+add
(17)(p11)x2/72-74,idemx2,-1,del(4),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22)x2, +i(14)(q10)/73-74,idemx2,-1,del(4),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22),+i(17)(q10)/72-73,idemx2,-1,-der(6)
r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+der(10)t(10;19)(p11;q11),-der(14;22)/69-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)
t(10;17)x2,+der(10)t(10;19),-der(14;22),t(16;17)(q24;q21)/72-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,
+der(10)t(10;19),-der(14;22),+mar3,+mar4/72-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+der(10)t(10;19),-
der(14;22)x2,+i(14)(q10)/150-300,idemx4-8/150-200,idemx4-5,del(4),-der(10)t(10;17)x4-5,+i(10)(q10)x2-3,-der(14;22)x4-5,+i(14)(q10)x2-3/160-400,idemx4-10,der(7) del(7)(q32)ins(7;7)(q32;q11q22)ins(7;7)(q22;q11q32)ins(7;7)(q32;q32
q22)t(7;?)(q22;?)t(?;19)(?;q11) x4-10/158-300,idemx4-8,-der(6)r(6)ins(6;?)x4-8,+ins(6;?)x4-8,-der(10) t(10;17)x4-8,
+i(10)(q10) -x4-8,+12,+12,+12,+12,+12,+12,+add(17)(p13)x2-4,+der(17)r(17;?)x2-4,-20,der(22)t(20;22)x4-8,+mar2x4-
8/150-400,idemx4-10,-der(10)t(10;17)x4-10,+der(10)t(10;19)x2-5,-der(14;22)x2-5,+t(16;17)x2-5,+mar3x2-5,+mar4x2-5
Adenokarcinom pankreatu
Gorunova et al., Genes Chromosomes Cancer 26:312-321, 1999
VÝHODY KONVENČNÍ CYTOGENETICKÉANALÝZY:
UmoUmožňžňuje buje běěhem jednoho experimentu analyzovat hem jednoho experimentu analyzovat celý genomcelý genom
PPřřispispěěla k identifikaci vla k identifikaci věěttššiny geniny genůů zahrnutých ve zahrnutých ve specifických pspecifických přřestavbestavbááchch
LIMITY KONVENČNÍ CYTOGENETICKÉANALÝZY:
TechnickTechnickéé faktory (rozlofaktory (rozložženeníí chromosomchromosomůů v v mitose, kvalita pruhovmitose, kvalita pruhováánníí))
NNíízký mitotický indexzký mitotický index
KryptickKryptickéé bunbuněčěčnnéé klony (patologickklony (patologickéé bubuňňky se v ky se v kultivaci kultivaci ččasto nedasto neděěllíí))
KryptickKryptickéé translokace a inserce, subtilntranslokace a inserce, subtilníí ppřřestavby estavby
KomplexnKomplexníí ppřřestavbyestavby
Metody molekulMetody molekuláárnrníí cytogenetiky:cytogenetiky:RadioaktivnRadioaktivníí in in situsitu hybridizace (ISH) hybridizace (ISH) –– od roku 1969od roku 1969
FluorescenFluorescenččnníí in situin situ hybridizace (hybridizace (FFIISSHH) ) –– 19861986jednobarevnjednobarevnáá / dvoubarevn/ dvoubarevnáá
MnohobarevnMnohobarevnáá FISHFISH ((NederlofNederlof et al.)et al.) -- 19891989
KomparativnKomparativníí genomovgenomováá hybridizace (hybridizace (CCGGHH) ) -- 19921992
„„24 barevn24 barevnáá FISH (FISH (mmFFIISSHH,, SSKKYY )) -- 19961996
MnohobarevnMnohobarevnéé pruhovpruhováánníí s vysokou resolus vysokou resoluččnníí
schopnostschopnostíí ((mmBBAANNDD) ) -- 19981998
MICROCHIPS, MICROARRAYS MICROCHIPS, MICROARRAYS -- 19981998
FLUORESCENFLUORESCENČČNNÍÍ IN SITUIN SITU HYBRIDIZACEHYBRIDIZACE(FISH)(FISH)
•• velmi citlivvelmi citliváá molekulmolekuláárnrněě--cytogenetickcytogenetickáá metodametoda
•• umoumožňžňuje hodnotit karyotyp a detekovat uje hodnotit karyotyp a detekovat numericknumerickéé a strukturna strukturníí chromosomovchromosomovéé odchylky v odchylky v bubuňňkkáách v mitose i v nedch v mitose i v neděěllííccíích se ch se interfinterfáásnsnííchchjjáádrechdrech
•• dopldoplňňuje a upuje a upřřesesňňuje výsledky zuje výsledky zíískanskanéé konvenkonvenččnníícytogenetickou analýzoucytogenetickou analýzou
FLUORESCENFLUORESCENČČNNÍÍ IN SITUIN SITU HYBRIDIZACE (FISH)HYBRIDIZACE (FISH)
METAFMETAFÁÁZEZE INTERFINTERFÁÁZEZE
FLUORESCENFLUORESCENČČNNÍÍ IN SITUIN SITU HYBRIDIZACE (FISH)HYBRIDIZACE (FISH)
Cytogenetický preparátDvouřetězcová značená DNA
Denaturace buněčné DNA fixovanéna cytogenetickém preparátu Denaturace DNA sondy
Hybridizace DNA sondy ke komplementárním úsekůmcílové DNA fixované na cytogenetickém preparátu
Analýza fluorescenčních signálůve fluorescenčním mikroskopu
MOMOŽŽNOSTI APLIKACE FISHNOSTI APLIKACE FISH
RRůůznznéé biologickbiologickéé materimateriáály:ly:
•• histologickhistologickéé řřezyezy
•• tktkááňňovovéé preparpreparááty (rty (růůznzněě zpracovanzpracovanéékultivovankultivovanéé i nekultivovani nekultivovanéé bubuňňky)ky)
•• izolovanizolovanáá bunbuněčěčnnáá jjáádradra
•• chromosomovchromosomovéé preparpreparáátyty
FISH V ONKOCYTOGENETICEFISH V ONKOCYTOGENETICE
Diagnostika leukemiDiagnostika leukemiíí a preleukemia preleukemiíí::
•• detekce podetekce poččetnetníích a strukturnch a strukturníích odchylekch odchylek•• ururččeneníí ppůůvodu marker chromosomvodu marker chromosomůů•• monitorovmonitorováánníí úúččinkinkůů terapieterapie•• detekce residudetekce residuáálnlníích leukemických bunch leukemických buněěk po k po
terapiiterapii•• ururččeneníí ppůůvodu bunvodu buněěk po transplantaci kostnk po transplantaci kostníí
ddřřeneněě
Diagnostika solidnDiagnostika solidníích nch náádordorůů
Centromerickésondy
Malovací sondy pro celéchromosomy (wcp)
nebo jejich části (pcp)
Lokusspecifické
sondy
Mnohobarevnémalovací sondy
Telomerickésondy
DNA sondy pro FISHDNA sondy pro FISH
Sondy pro specifickSondy pro specifickéé chromosomovchromosomovééstruktury:struktury:
StanovenStanoveníí numerických odchylek, ovnumerických odchylek, ověřěřeneníí ppůůvodu vodu centromercentromer markermarker--chromosomchromosomůů, ur, urččeneníí ppůůvodu bunvodu buněěk po TKD od dk po TKD od dáárcrcůů opaopaččnnéého pohlavho pohlavíí
αα--satelitnsatelitníí DNA DNA -- centromerycentromery
metafmetafááze x interfze x interfáázeze
CENTRUM NCENTRUM NÁÁDOROVDOROVÉÉ CYTOGENETIKY VFN A 1.LF UKCYTOGENETIKY VFN A 1.LF UKCENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha
Sondy pro jedineSondy pro jedineččnnéé genovgenovéé sekvence:sekvence:tzv. lokustzv. lokus--specifickspecifickéé sondysondy
MapovMapováánníí polohy genpolohy genůů na chromosomech, detekce strukturnna chromosomech, detekce strukturníích pch přřestavebestaveb
metafmetafááze x interfze x interfáázeze
detekce strukturndetekce strukturníích pch přřestavebestaveb
translokactranslokacíí
inzercinzercíí
amplifikacamplifikacíí
delecdelecíí
inverzinverzíí
LokusLokus--specifickspecifickéé sondysondy
Sondy pro mnohoSondy pro mnohoččetnetnéé chromosomovchromosomovéé sekvence sekvence (tzv. malovac(tzv. malovacíí sondy):sondy):
obsahujobsahujíí sekvence z celých chromosomsekvence z celých chromosomůů nebo jejich nebo jejich ččááststíí (parci(parciáálnlníí sondy)sondy)
UrUrččovováánníí strukturnstrukturníích pch přřestaveb (translokace a delece vestaveb (translokace a delece věěttšíšího rozsahu), ho rozsahu), identifikace pidentifikace půůvodu markervodu marker--chromosomchromosomůů
pouze metafpouze metafááze ze
VÝHODY FISH:
RelativnRelativněě rychlý procesrychlý proces
Detekce specifických aberacDetekce specifických aberacíí
VysokVysokáá specifitaspecifita a citlivosta citlivost
InterfInterfáázickzickáá FISHFISH
Detekce Detekce delecdelecíí spojených se vznikem spojených se vznikem ffúúznznííchch gengenůů
AutomatickAutomatickéé systsystéémy pro analýzu obrazu z my pro analýzu obrazu z fluorescenfluorescenččnníího mikroskopuho mikroskopu
LIMITY KLASICKÉ JEDNOBAREVNÉ ADVOUBAREVNÉ FISH:
UmoUmožňžňuje sledovat jen omezený pouje sledovat jen omezený poččet cet cíílových lových sekvencsekvencíí fixovaných na preparfixovaných na preparáátutu
Neposkytuje informace o celNeposkytuje informace o celéém m genomugenomu
ZZáávisvisíí na dostupnosti DNA sondna dostupnosti DNA sond
UmoUmožžnnňňujeuje detekci pouze omezendetekci pouze omezenéého poho poččtu tu specifických aberacspecifických aberacíí
simultsimultáánnnníí poupoužžititíí nejmnejméénněě ttřříí rrůůzných zných fluorochromfluorochromůů ke ke specifickspecifickéému znamu značčeneníí DNA sond (kromDNA sond (kroměě DAPI) DAPI)
PrvnPrvníí úúspspěěššný mFISH experiment:ný mFISH experiment:
NederlofNederlof P.M., Robinson D., P.M., Robinson D., AbukneshaAbuknesha R., R., WiegantWiegant J., J., HopmanHopmanA.H., A.H., TankeTanke H.J., H.J., RaapRaap A.K.:A.K.: ThreeThree--colorcolor fluorescence in situ fluorescence in situ hybridizationhybridization for the for the simultaneoussimultaneous detectiondetection of of multiplemultiple nucleicnucleicacidacid sequencessequences. . CytometryCytometry 10: 2010: 20--27, 1989.27, 1989.
AminoAmino methyl methyl coumarincoumarin aceticacetic acidacid –– AMCAAMCATetramethylrhodamineTetramethylrhodamine isothiocyanateisothiocyanate –– TRITCTRITCFluoresceine Fluoresceine isithiocyanateisithiocyanate -- FITCFITC
mnohobarevnmnohobarevnáá FISH (FISH (mmFFIISSHH):):
mmFFIISSHH
CENTRUM NCENTRUM NÁÁDOROVDOROVÉÉ CYTOGENETIKY, III. INTERNCYTOGENETIKY, III. INTERNÍÍ KLINIKA VFN A 1.LF UKKLINIKA VFN A 1.LF UK
KombinatoriKombinatoriáálnlníí znaznaččeneníí::smsmííchcháánníímm n n fluorochromfluorochromůů zzíískskááme me 22nn--11 rrůůzných barevných kombinaczných barevných kombinacíí
FLUOROCHROMY PRO FLUOROCHROMY PRO mmFFIISSHH::
• DIETHYLAMINOKUMARIN (DEAC, NEN Life
Science Products)
• SPECTRUM ORANGE (VYSIS)
• TEXAS RED (Molecular Probes)
• ALEXA 488 (Molecular Probes)
• CY 5 (Amersham Life Sciences)
• DAPI (4,6 diamidino 2-phenylindol)
45,X,45,X,--X,t(3;11),del(5)(q13q33),der(10)t(X;10),del(10)(q),der(17)t(X;10X,t(3;11),del(5)(q13q33),der(10)t(X;10),del(10)(q),der(17)t(X;10;17) ;17)
KOMPARATIVNÍ GENOMOVÁ HYBRIDIZACE (CGH)
Celková genomová DNAz testovaných buněk
Celková genomová DNAz normálních buněk
Kohybridizace na cytogenetickýpreparát s normálními chromosomy
Detekce a vizualizace
Buňky s normálním karyotypem
Buňky s amplifikací nebo polysomií Buňky s delecí nebo monosomií
VÝHODY MOLEKULVÝHODY MOLEKULÁÁRNRNĚĚ--CYTOGENETICKÝCH METOD:CYTOGENETICKÝCH METOD:
•• UmoUmožňžňujujíí hodnocenhodnoceníí i velmi nekvalitni velmi nekvalitníích mitos, kterch mitos, kterééjsou jinak pro cytogenetickou analýzu nevhodnjsou jinak pro cytogenetickou analýzu nevhodnéé..
•• PoskytujPoskytujíí informace i z nedinformace i z neděěllííccíích se nebo terminch se nebo termináálnlněědiferencovaných bundiferencovaných buněěk.k.
• Výrazně zkracují dobu nutnou k získání a interpretaci výsledků.
Metody FISH tak významnMetody FISH tak významněě ppřřispispíívajvajíí ke zpke zpřřesnesněěnníícytogenetickcytogenetickéého nho náálezu a ke zleplezu a ke zlepššeneníí a zrychlena zrychleníídiagnostiky a pdiagnostiky a přříípadnpadněě llééččby nemocných s rby nemocných s růůznými znými typy geneticky podmtypy geneticky podmíínněěných onemocnných onemocněěnníí..