R. Horváth

SprSpráávnvnáá laboratornlaboratorníí praxe praxe vv molekulmolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickéé

diagnostice diagnostice

Global Nucleic Acid Testing Market to Reach US$5.6 Global Nucleic Acid Testing Market to Reach US$5.6 Billion by 2015, According to New Report by Global Billion by 2015, According to New Report by Global Industry Analysts, Inc. Industry Analysts, Inc.

Global market for nucleic acid testing is projected to reach US$5.6 billion US$5.6 billion by the year 2015. Growing demand for nucleic acid testing in developing customized medicines and in enhancing the healthcare sector within the life sciences industry is expected to accelerate the market in the coming years.

Nucleic Acid Testing: A Global Market Report San Jose, California (Vocus) June 3, 2010

Detekce nukleovDetekce nukleovéé kyseliny mikroorganismkyseliny mikroorganismůů

Z pohledu klinickZ pohledu klinickéé diagnostiky se jedndiagnostiky se jednáá o tzv. o tzv. ppřříímou diagnostickou metodamou diagnostickou metoda

Mikroorganismus nebo jeho Mikroorganismus nebo jeho ččáásti (NK) sti (NK) musmusíí ve vzorku být pve vzorku být přříítomntomnéé

PPřřevaevažžuje metodický postup ovuje metodický postup ověřěřeneníí podezpodezřřeneníí na pna přříítomnost tomnost konkrkonkréétntníího mikroorganismu (i v bakteriologii)ho mikroorganismu (i v bakteriologii)

Metody molekulMetody molekuláárnrníí biologickbiologickéé diagnostikydiagnostiky

UspoUspořřááddáánníí laboratolaboratořříí a jejich vybavena jejich vybaveníípro detekci NK pomocpro detekci NK pomocíí PCR.PCR.

Work Work –– flow : flow : •Zamezení kontaminace amplifikačním produktem•Zamezení kontaminace PCR izolovanou NK•Efektivita práce (ergonomie)

VybavenVybaveníí::•Zázemí personální a materiálové propusti ; sklady ; úklid ; likvidace odpadu•PROSTOR 1 Úprava vzorku a izolace - provádí se v Biohazard boxu•PROSTOR 2Příprava amplifikační reakce – provádí se v laminárním nebo v tzv. PCR boxu•PROSTOR 3vybavení pro gelovou elektroforézu NK

(samostatný prostor; dobře oddělený od 1 a 2 a na konci work-flow)

DalDalšíší specifickspecifickéé vybavenvybavenííDrobné lab.vybavení (pipety, centrifuga, termoblok,..)TermocyklerTermocykler (certifikovaný CE IVD, verifikovaný, validovaný)automatickautomatickéé izolizoláátory / liquid handling systems / detektory / liquid handling systems / detekččnníí automatyautomaty

ProstoryProstory-specifické požadavky podle ISO 12128 (BL3 /UTZ3) a legislativa pro zajištění bezpečností zdraví při práci -Biologické zbraně / GMO

SprSpráávnvnáá laboratornlaboratorníí praxe praxe –– kontrola kvalitykontrola kvalityÚÚččelem je snelem je sníížženeníí pravdpravděěpodobnosti nesprpodobnosti nespráávných výsledkvných výsledkůů

Rizika nesprávných výsledků – důsledkem v klinice může být nesprávná diagnóza, neodhalení příčiny onemocnění, chybný postup v průběhu léčbyNesprávné výsledky: Kontrola:

Falešná pozitivita systém laboratorních kontrol Falešná negativita systém laboratorních kontrolChybná specifita výsledku systém lab.kontrol ; EHKChybná kvantifikace systém lab.kontrol ; EHK

Postupy QC•Vnitřní technologická kontrola kvality – systém laboratorních kontrol všech kroků detekce•Externí (mezilaboratorní) technologická kontrola kvality – srovnání výsledků laboratoře s mezinárodními standardy (EHK)•Vnitřní procesní kontrola kvality a externí kontrola kvality řízení procesů – systém řízení jakosti (ISO); dokumentace; externí kontrola notifikovanou osobou; specifické legislativní předpisy na úrovni zemí a na úrovni EUCertifikace použitých materiálů a přístrojů – výrobce odpovídá za správnost výsledků při správném použití ; nutná je Kontrola kvality vývoje, výrobyCertifikace / akreditace prostředí – laboratořeNormy ISO 17125 a ISO 15189 ; ISO 12128 ; ISO 9001

MezilaboratornMezilaboratorníí kontrola kvality kontrola kvality

MezilaboratornMezilaboratorníí kontrola kvality kontrola kvality SystSystéém externm externíích kontrol v mikrobiologickch kontrol v mikrobiologickéé diagnostice (EHK)diagnostice (EHK)

Klíčovou roli v systému kontroly kvality práce hraje externí kontrola kvality.

Za přípravu externích kontrol je zodpovědná specializovaná externí instituce

státní zdravotní ústavy / instituce privátní a státní

Mezinárodní instituce (Instadt, Německo; QCMD Skotsko aj.),

Metodika:Metodika:•Umělé kontrolní vzorky jsou rozeslány účastnícím se laboratořím•Laboratoře provedou příslušná kvalitativní či kvantitativní stanovení a výsledky pošlou zpět•Instituce pak srovnáním výsledků zjistí rozptyl v naměřených hodnotách, stanoví přijatelnou míru odchylky a posoudí, které laboratoře se do této odchylky vešly. Těm pak vystaví certifikát, kterým laboratoř prokazuje kvalitu své práce.

PPřřehled metod uehled metod užžíívaných vaných v rutinnv rutinníí klinickklinickéé diagnosticediagnostice

HybridizaHybridizaččnníí metody metody hybridizace se znahybridizace se značčenou DNA sondou enou DNA sondou -- RutinnRutinníí ppřři detekci streptokoki detekci streptokokůů, gonokok, gonokokůů čči chlamydii chlamydiíí (zn(znáámmáá jako jako „„GenProbeGenProbe““))

in situ hybridizace in situ hybridizace -- patologickpatologickéé laboratolaboratořře (HPV)e (HPV)

bDNAbDNA (branched DNA; vyu(branched DNA; využžíívanvanáá napnapřřííklad firmou BayerDiagnostics, USA)klad firmou BayerDiagnostics, USA)--namnamíísto amplifikace sekvence NK vyusto amplifikace sekvence NK využžíívváá amplifikace signamplifikace signáálu navlu naváázanzanéého ligandu, ke ho ligandu, ke kterkteréému dojde pouze v pmu dojde pouze v přříípadpaděě pozitivnpozitivníího výsledku detekce ho výsledku detekce

„„hybrid capture assayhybrid capture assay““ -- hybridizace s RNA sondou ; detekuje se hybrid RNA/DNA hybridizace s RNA sondou ; detekuje se hybrid RNA/DNA --pompoměěrnrněě spolehlivspolehliváá a levna levnáá a ma méénněě citlivcitliváá detekci virdetekci virůů HBV, HCMV a detekci a typizaci HBV, HCMV a detekci a typizaci papilomavirpapilomavirůů (výrobce Digene). (výrobce Digene).

StripovStripováá metoda metoda -- kombinace hybridizakombinace hybridizaččnníích metod se sondami nanesenými na prouch metod se sondami nanesenými na proužžccíích ch pappapííru s chromatografiru s chromatografiíí--výhodou je jednoduchost provedenvýhodou je jednoduchost provedeníí dandanáá ččtenteníím výsledku jako m výsledku jako „„ččáárovrovéého kho kóódudu““--Nevýhodou je nNevýhodou je níízkzkáá citlivost a opakovatelnostcitlivost a opakovatelnost--OmezenOmezenéé orientaorientaččnníí poupoužžititíí pro rozlipro rozliššovováánníí typtypůů virvirůů hepatitid; HPV typizace, detekce hepatitid; HPV typizace, detekce ADeV, RotavirADeV, Rotavirůů,,……

AmplifikaAmplifikaččnníí metodymetodyPolymerPolymeráázovzováá řřetetěězovzováá reakce reakce (PCR) (PCR) –– zcela pzcela přřevaevažžujujííccíí–– standardizovatelnstandardizovatelnáá–– automatizovatelnautomatizovatelnáá–– dostatek klinických studidostatek klinických studiíí

NASBA (nucleic acid sequence based amplification)NASBA (nucleic acid sequence based amplification)

LigLigáázovzováá řřetetěězovzováá reakce (LCR reakce (LCR –– ligase chain reaction)ligase chain reaction)

a dala dalšíší …………..PCR PCR –– podrobnpodrobněěji viz dji viz dáále le

PPřřehled metod uehled metod užžíívaných vaných v rutinnv rutinníí klinickklinickéé diagnosticediagnostice

AmplifikaAmplifikaččnníí metody detekce NK. Polymermetody detekce NK. Polymeráázovzováářřetetěězovzováá reakce (PCR)reakce (PCR)

• PCR - pro průkaz většiny mikroorganizmů, včetněbakterií, kvasinek, plísní, prvoků a DNA-virů

• reverzně-transkripční PCR (rtPCR) - pro průkaz • nested PCR / single-tube nested PCR • multiplex PCR• kvantitativní PCR (qPCR)

Způsob analýzy amplifikace

Real-time PCR s detekcí amplifikačního produktu v reálném čase

End-point PCR s elektroforetickou analýzou amplifikačního

RutinnRutinníí poupoužžititíí mol.dg. metod v klinickmol.dg. metod v klinickéé praxi praxi

KLINICKKLINICKÉÉ PRACOVIPRACOVIŠŠTTĚĚIndikace k vyIndikace k vyššetetřřenenííOdbOdběěr vzorkur vzorku

Interpretace klinickInterpretace klinickááKlinickKlinickéé vyuvyužžititíí výsledkuvýsledkuNNáásledný postupsledný postup

LABORATOLABORATOŘŘ

Uchování vzorkuÚprava vzorkuIzolace NKAnalýza NKLaboratoní a klinickáinterpretace

Transport Transport

PPřřededáánníívýsledku výsledku

konzultacekonzultace

RutinnRutinníí poupoužžititíí mol.dg. metod v klinickmol.dg. metod v klinickéé praxi praxi DIAGNOSTICKÝ PROCES / DETEKCEDIAGNOSTICKÝ PROCES / DETEKCE

KLINICKKLINICKÉÉ PRACOVIPRACOVIŠŠTTĚĚIndikace k vyIndikace k vyššetetřřenenííOdbOdběěr vzorkur vzorku

Interpretace klinickInterpretace klinickááKlinickKlinickéé vyuvyužžititíí výsledkuvýsledkuNNáásledný postupsledný postup

LABORATOLABORATOŘŘ

Uchování vzorkuÚprava vzorkuIzolace NKAnalýza NKLaboratonía klinická interpretace

Transport Transport

PPřřededáánníívýsledku výsledku

konzultacekonzultace

Metodika odbMetodika odběěru a transportu ru a transportu klinických vzorkklinických vzorkůů do laboratodo laboratořře e

Metodami molekulMetodami molekuláárnrníí diagnostiky lze vydiagnostiky lze vyššetetřřit it ttéémměřěř jakjakéékoliv vzorkykoliv vzorky

Specifika odbSpecifika odběěrrůů::

ZvýZvýššenenéé riziko kontaminace riziko kontaminace -- hrozhrozíí zvlzvlášášttěě ppřři odbi odběěru vzorku ru vzorku

SprSpráávnvnáá volba vzorku pro pvolba vzorku pro přříímou dg.metodu mou dg.metodu -- je nezbytnje nezbytnéé odebrat vzorek, ve odebrat vzorek, ve kterkteréém lze pm lze přředpokledpokláádat v dandat v danéé ffáázi onemocnzi onemocněěnníí ppřříítomnost sledovantomnost sledovanéého ho mikroorganizmu mikroorganizmu

NenNeníí ttřřeba zachovat mikroorganizmy eba zachovat mikroorganizmy žživotaschopnivotaschopnéé -- vzorky lze zmrazit vzorky lze zmrazit

Nutnost jiNutnost jižž ppřři odbi odběěru rozliru rozliššovat vzorky pro detekci DNA a RNA ovat vzorky pro detekci DNA a RNA –– rozdrozdííl v l v technologii zpracovtechnologii zpracováánníí vzorku a rozdvzorku a rozdíílnlnáá stabilita (transport a uchovstabilita (transport a uchováánníí vzorku)vzorku)

Nutnost pNutnost přřesnesnéé specifikace vyspecifikace vyššetetřřeneníí jijižž ppřři odbi odběěru vzorku ru vzorku -- ccíílenlenéé vyvyššetetřřovováánnííkonkrkonkréétntníích mikroorganizmch mikroorganizmůů nebo alesponebo alespoňň skupin mikroorganizmskupin mikroorganizmůů(Je to d(Je to dááno nutnostno nutnostíí poupoužžititíí specifických komplementspecifických komplementáárnrníích sekvencch sekvencíí ; specifickými technologiemi ; specifickými technologiemi ; specifickými odb; specifickými odběěrovými materirovými materiáály, apod.) ly, apod.)

ZpracovZpracováánníí vzorku pvzorku přřed izolaced izolacíí NK NK

• Vzorky před izolací NK převést do stavu vhodného pro zvolenou izolační metodu

– Převedení do formy roztoku nebo alespoň suspenze

– Koncentrace materiálu (zvýšení citlivosti detekce)

– Homogenizace vzorků (tkáně, sputum – vyšší výtěžky NK a vyššípravděpodobnost záchytu hledaného agens)

• Nutnost minimalizovat rizika pro laboratorní personál. rizikové mikroorganizmy: Mycobacterium tuberculosis, Francisella tullarensis, leptospiry,

Coxiella burnetii, viry chřipky, SARS, Ebola, viry hepatitid, případně i viry HIV, HPV, apod.

Izolovaná RNA HCV je považována za infekční !

PPřřehled nejehled nejččastastěěji zpracovji zpracováávaných vzorkvaných vzorkůů–– ttěělnlníí tekutiny tekutiny -- 11

Periferní krev•vkládá se do izolace NK přímo •Je homogenní, ale obsah buněčných frakcí je variabilní•V krvi lze NK inf.agens kvantifikovat•Je možné izolovat frakce•pro detekci NK bakterií a kvasinek při podezření na generalizovanou infekci nebo bakteriemii (například sepse, borelióza, kvasinky, toxoplazmóza či malárie apod.)•při potřebě vyšetření virů, jejichž životní cyklus zahrnuje infekci buněk krve (parvovirus, cytomegalovirus, EBV apod.).•Krev není zcela sterilní materiál ! •Obsahuje specifický inhibitor polymerázy Hem

Plazma či sérum•vkládá se do izolace NK přímo •Je homogenní•V plasmě lze NK inf.agens kvantifikovat•Plazma je nejdůležitějším vzorkem pro detekci virů, které se uvolňují do krve, především virů hepatitid C a B. •Plasma není zcela sterilní ; obsahuje volné NK•Plazmu nezahřívat !

Moč•Vkládá se do izolace NK přímo•Je homogenní / snadno homogenizovatelná / obsahuje variabilní koncentrace frakcí•Pro detekci STD a močových infekcí : chlamydie, méně často gonokoky ; legionely, borelie, viry •Lze koncentrovat centrifugací (C.trachomatis)•Běžně odebraná moč je kontaminovaná / katetrizovaná moč•Může obsahovat inhibitory PCR (produkty rozpadu krve)

PPřřehled nejehled nejččastastěěji zpracovji zpracováávaných vzorkvaných vzorkůů–– ttěělnlníí tekutiny tekutiny --22

Sputum•Před izolací se ztekucuje a homogenizuje •Nehomogenní viskózní materiál•Obsahuje variabilní podíl buněčné frakce. •Pro vyšetření respiračních patogenů – mykobakterie, legionely, chlamydie a mykoplazmata, bordetely, vzácněji virů (cytomegalovirus, …) apod.

Punkáty •Vkládá se přímo do izolace NK•Nehomogenní a variabilní; často obsahují inhibitory PCR•punktáty synoviální tekutiny z kloubů - borelie ; punktáty perikardia ,…

Sperma•Vkládá se přímo do izolace NK •Nehomogenní / variabilní•při podezření na pohlavně přenosné choroby nebo pro vyloučení chlamydiové infekce u vzorku určeného pro in vitro fertilizaci.

Mozkomíšní mok (CSF, likvor)•Vkládá se přímo do izolace NK•Homogenní primárně sterilní materiál / pro diagnostiku boreliózy ve stadiu napadení CNS, neurotropních virů (včetně HSV a VZV), méně často pak pro průkaz bakteriálních původců meningitid apod. •lze centrifugací zkoncentrovat.

Plicní aspiráty, výplach hrdla, BAL•Vkládá se přímo do izolace NK•Variabilní a nehomogenní•Pro diagnostiku respiračních infekcí

PPřřehled nejehled nejččastastěěji zpracovji zpracováávaných vaných vzorkvzorkůů

–– ostatnostatníí materimateriáálylyVýtěry a stěry•Provádějí se pomocí sterilního tamponu nebo kartáčku•Stěry ze sliznic respiračního traktu - respirační patogeny•Výtěry z pochvy, stěr z cervixu, výtěr s uretry - pro detekci původců STD (chlamydie, gonokoky, mykoplazmata, ureaplazmata, papilomaviry aj.)•Předizolační úprava: tampony s výtěrem se vloží do fyziologického roztoku a třepáním se do něj uvolnízachycený klinický materiál / možno centrifugací zkoncentrovat

Biopsie, vzorky pevných tkání•Nehomogenní – před izolací NK homogenizace•biopsie jater pro detekci virů hepatitid, kožní biopsie pro detekci borelií nebo dermatomykóz, vzorky chlopnípacientů s infekční endokarditidou, plicní biopsie pro detekci mykobakterií nebo plísní apod

Vzorky z katetrů, implantátů apod. •Nehomogenní ; komplikovaný odběr•mikroorganizmy uchycené v podobě biofilmu na površích •Před izolací NK nutno mikroby z povrchu uvolnit do roztoku (seškrabováním či sonifikací) •Z povrchů cévních katetrů lze detekovat původce septických stavů, mimo jiné i původce systémových mykóz u pacientů s febrilní neutropenií ; dále kloubní náhrady, umělé chlopně, cévní protézy, ..Stolice •Vkládá se přímo do izolace NK•vysoká míra inhibice ; speciální metody úpravy a izolace NK•Pro detekce halikobaktera, rotaviru, ADeV,..

Izolace nukleových kyselin pro Izolace nukleových kyselin pro úúččely molekulely molekuláárnrníímikrobiologickmikrobiologickéé diagnostiky diagnostiky -- 11

Účelem je purifikace NK vhodné pro vložení do PCR

- izolovat NK-zkoncetrovat (zvýšení citlivosti detekce)-zbavit příměsí / inhibitorů

Izolace nukleových kyselin pro Izolace nukleových kyselin pro úúččely molekulely molekuláárnrníímikrobiologickmikrobiologickéé diagnostiky diagnostiky -- 22

Metoda „kolonková“PRINCIP:vazba NK na amorfní SiO2

1.Vzorek je lyzován2.2.NK se zachytNK se zachytáávváá na kolonkna kolonkáách na SiOch na SiO223.Navázané NK na fritě kolonky jsou proplachovány v proplachovacích roztocích s využitím separace na kolonceseparace na kolonce4.Čistá NK je uvolněna elucí do roztoku o nízkéiontové síle

PLUSNízká cena

MINUSVyšší pracnostNižší standardnostObtížnější automatizace

Metoda „magnetická“PRINCIP:vazba NK na Ab vázané na magnetickém nosiči

1.Vzorek je lyzován 2.2.NK se zachytNK se zachytáávváá na magnetickna magnetickéé kulikuliččky ky pokrytéspecifickými anti-NK protilátkami 3.Navázané NK na kuličkách jsou propláchnuty s využitím separace magnetem separace magnetem v proplachovacích roztocích 4.Čistá NK je eluována specifickými roztoky

PLUSAutomatizace Jednoduchost práceStandardní výsledky

MINUScena

Izolace nukleových kyselin pro Izolace nukleových kyselin pro úúččely molekulely molekuláárnrníímikrobiologickmikrobiologickéé diagnostiky diagnostiky –– vliv na citlivost detekcevliv na citlivost detekce

Citlivost molekulárních biologických metod je v diagnostice významně ovlivněna již ve fázi izolace NK

Velkou roli zde hrajívstupní objem zpracovávaného vzorku

míra zkoncentrování NK ve vzorku

izolace

1000 ul vzorku 100 ul izolátu NK PCR zkumavka (50 ul reakční objem)

10 ul izolátu

2000 k/ml

zakoncentrování 10x

20 000 k/ml2 000 k/ul

= 1/10 do PCR

200 k

Analýza NK pro Analýza NK pro úúččely ely molekulmolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickéé diagnostiky diagnostiky -- 11

Účelem je analýza izolované NK– průkaz, případně i kvantifikace NK patogenních mikroorganismů

PCR metoda - příprava Master Mixů a kontrolního materiálu

V rutinnV rutinníí praxi praxi -- komerkomerččnníí PCR kityPCR kity

In house metody a komerIn house metody a komerččnníí metody metody detekce NK v klinickdetekce NK v klinickéé mikrobiologii mikrobiologii -- CE IVD CE IVD

KomerKomerččnníí diagnostika diagnostika -- zdravotnickzdravotnickéé ppřříípravky pro in vitro diagnostiku NK infekpravky pro in vitro diagnostiku NK infekččnníích agens ch agens V současné době se v regionu EU nesmí na trh uvádět zdravotnické přípravky pro in vitro diagnostiku (tzv. in vitro devices, zkr. IVD) bez prohlprohlášášeneníí o shodo shoděě. Toto prohlášení se rutinně označuje jako CE IVD CE IVD a je vystavováno či vydáváno oprávněnými institucemi v souladu se smsměěrnicrnicíí Rady 98/79/ES Rady 98/79/ES ve znění pozdějších předpisů, jejichžpožadavky jsou převzaty nanařříízenzeníím vlm vláády dy ČČR R čč. 453/2004 Sb. . 453/2004 Sb. Certifikát se vydává pro každý typ diagnostika zvlášť a garantuje, že daný přípravek je vyráběn za podmínek splňujících požadavky citované směrnice.

V současné době působí na evropském trhu řada výrobců in vitro diagnostických zdravotnických přípravků v oboru molekulární diagnostiky. Přípravky pro automatizované provozy velkých laboratoří dodávají zejména společnosti Roche, Abbott Laboratories, SiemensRoche, Abbott Laboratories, Siemens. Pro laboratoře zpracovávající menší objemy vzorků jsou určeny například výrobky od firem Digene, Nanogene, GeneProof, Quiagen Digene, Nanogene, GeneProof, Quiagen aj. Výrobci přípravků pro humánní molekulárnídiagnostiku jsou podle nařízení vlády č. 453/2004 Sb. a 246/2009 Sb. povinni se registrovat a registrovat musí takésvé jednotlivé produkty. POZOR – registrovat se musí i diagnostické laboratoře. Registrace se provádí u národních ministerstev zdravotnictví.

In house metodyIn house metodyV případě, že si laboratoř komerční diagnostika nekupuje, ale připravuje si je sama, hovoříme o tzv. in house nebo home-made diagnostice. Laboratoř, která se pro tento způsob práce rozhodla, musí provádět rozsrozsááhlhléé validavalidaččnníístudie a musstudie a musíí kontrolovat kakontrolovat kažždou dou ššararžži pi přřipravených ipravených „„mastermixmastermixůů““ i vi vššech kontrolech kontrol. V případě, že tak nečiní, hrozípoměrně vysoké nebezpečí zkreslení výsledků vyšetření či vzniku chyb. To přímo ohrožuje pacienty a nese s sebou riziko eventuálních právních důsledků pro příslušné zdravotnické zařízení či laboratoř. Zkušenosti laboratořípracujících s vlastními metodami však nejsou jednoznačně špatné a jejich výsledky mohou být i lepší než u laboratořínakupujících diagnostika. Také náklady na samotnou reakci bývají nižší, než u komerčních diagnostik, ovšem za cenu vysokých nepřímých nákladů.

SprSpráávnvnáá laboratornlaboratorníí praxe praxe -- Riziko faleRiziko faleššnnéé pozitivity pozitivity ZZáákladnkladníí problprobléém: m:

VysokVysokáá citlivost (jednotky kopicitlivost (jednotky kopiíí) X zvý) X zvýššenenéé riziko kontaminaceriziko kontaminace

KKřříížžovováá kontaminace kontaminace (cross-contamination) •při manipulaci silně pozitivních vzorků v blízkosti vzorků negativních (parvo, ADeV,..)•Opatření - optimalizace work-flow ; systém kontrol Kontaminace amplifikaKontaminace amplifikaččnníím produktemm produktem•Při nesprávném work-flow nebo nevyhovujícím prostorovém vybavení•výborný specifický templát pro PCR •Opatření – optimalizace work-flow ; systém kontrol ; enzymatická ochrana PCR Princip metody: dUTP v PCR reakci se začlení namísto části dTTP ; po přidání enzymu uracil-DNA-gylosylázy před započetím PCR reakce rozštěpí kontaminující amplikony (jež obsahují dUTP), a poté se při prvním cyklu PCR enzym denaturuje a inaktivuje

NespecifickNespecifickáá vazba oligonukleotidvazba oligonukleotidůů v průběhu PCR •Chybný design PCR (v důsledku polymorfizmů v cílové sekvenci templátu )•Selhání parametrů přístroje •Opatření – testy specifity během návrhu ; validace přístrojů ; účast na EHK ; CE IVD kity

SprSpráávnvnáá laboratornlaboratorníí praxe praxe -- Riziko faleRiziko faleššnnéé negativitynegativity

SelhSelháánníí izolace NKizolace NK•Izolace není zanedbatelná součást detekčního procesu !•Příčiny: vada izolačního kitu ; vada izolačního automatu ; lidské selhání•Opatření: CE IVD kity a validované přístroje ; systém kontrol

Inhibice Inhibice enzymů amplifikační reakce •Klinické vzorky obsahují inhibitory (hem, soli, zbytky z izolace NK, příliš vysoká koncentrace NK,..)•Závažný problém u vzorků stolice, moči, tkání, spermatu, biopsií a špatně odebrané krve•Opatření: vhodná izolační metoda ; systém kontrol (interní standard)•Pozor – inhibice může být jen částečná ; přesto ovlivní výsledek kvantitativního stanovení !

Polymorfismus cPolymorfismus cíílových nukleotidových sekvenclových nukleotidových sekvencíí•Chybný design PCR (v důsledku polymorfizmů v cílové sekvenci templátu )•Selhání parametrů přístroje nebo reakce (kitu)•Opatření – testy specifity během návrhu ; validace přístrojů ; účast na EHK ; CE IVD kity a validované přístroje ; neustálé inovace detekčního procesuPři návrhu - degenerované oligonukleotidy ; neustálé inovace detekční reakce s ohledem na vývoj poznatkůMůže dojít nejen k falešné negativitě, ale také jen k podhodnocení kvantifikace (jen částečná vazba oligonukleotidů snižuje efektivitu amplifikace)

ZtrZtrááta cta cíílovlovéé sekvence sekvence Vlivem selekce, mutace nebo ztrátou plasmidu nesoucího cílovou sekvenciOpatření: CE IVD kity a/nebo neustálá inovace ; účast na EHK ; odbornost personálu.

SystSystéém reakm reakččnníích kontrol NAT ch kontrol NAT -- 11

PozitivnPozitivníí kontrola (PK)kontrola (PK)•Testuje selhání amplifikace•Provádí se min.1 na celou vyšetřovanou sadu vzorků•Musí generovat pozitivní signál o určité očekávané intenzitě•Jako pozitivní kontrola slouží uměle připravený vzorek (plasmid,..)

PozitivnPozitivníí izolaizolaččnníí kontrola (PIK)kontrola (PIK)•Testuje celý detekční proces (přidává se do vzorku před izolací a projde celým procesem)•Provádí se min.1 na celou vyšetřovanou sadu vzorků•Musí generovat pozitivní signál o určité očekávané intenzitě•Jako pozitivní kontrola slouží uměle připravený vzorek (plasmid, izolát kmene,..)•Bývá nahrazována IS přidaným do vzorku před izolací

KvantitativnKvantitativníí standard / sada kalibrstandard / sada kalibráátorutoru•Několik ředění PK – slouží ke generování kalibrační křivky•Umožnuje kvantitativní stanovení NK ve vzorku•Jeho kvalita určuje přesnost kvantifikace

InternInterníí standardstandard•Kontroluje rizika falešné negativity v důsledku inhibice reakce •Je součástí KAŽDÉ jednotlivé reakce / detekce •je zpravidla uměle připraven (plasmid / MIMICs)•přidán přímo do amplifikační reakce - kontroluje inhibice PCR•přidán do vzorku před izolací NK– kontroluje izolaci a inhibici PCR zároveň(metodicky správnější ; u některých patogenů povinný postup)

MIMICs metodaMIMICs metodaInterní standardy se připravují nejčastěji jako úseky NK ohraničené sekvencemi primerů používaných pro amplifikaci specifické sekvence NK hledaného patogenu. Při detekci mikroorganizmů s genomem tvořeným DNA se používají interní standardy připravené tzv. MIMICS metodu, kdy je uměle připravený úsek NK ohraničený sekvencemi specifických primerů začleněn do plazmidu a ten je pak používán jako interní standard. HouseHouse--keeping kontrolakeeping kontrolaV případě detekce RNA virů, zejména hepatitidy C a HIV, je výhodné používat namísto takto uměle připraveného klonovaného interního standardu koamplifikaci tzv. house-keeping genů či transkriptů(gen v eukaryotické buňce, který je exprimován ve všech typech buněk a ve všech vývojových stadiích; produkty kódované provozními geny jsou nezbytné pro základní funkce buňky).

SystSystéém reakm reakččnníích kontrol NAT ch kontrol NAT -- 22

Effective control of inhibition in each reaction

Basic principle of quantitative kompetitive PCR sys tem

Pathogen DNA

DNA of internal standard

Primer 1 Primer 2

Positive sample Negative sample Inhibition

Specific signal

Effective control of inhibition in each reaction

Signal for internal standard

Kontrola falešn ě negativního výsledku- z důvodu inhibice nebo neú činné izolace vzorku

Specifický signál

Signál pro internístandard

00,51

1,52

2,53

3,54

2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50Cycle number

Flu

ores

cenc

y

00,20,40,60,81

2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50Cycle number

Flu

ores

cenc

y

00,20,40,60,81

2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50Cycle number

Flu

ores

cenc

y

00,51

1,52

2,53

3,54

2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50Cycle number

Flu

ores

cenc

y

00,20,40,60,81

2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50Cycle number

Flu

ores

cenc

y

00,51

1,52

2,53

3,54

2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50Cycle number

Flu

ores

cenc

y

Pozitivní vzorek Negativní vzorek Inhibice, neúčinná izolace

NegativnNegativníí kontrola (NK)kontrola (NK)•Kontroluje rizika falešné pozitivity v důsledku kontaminace PCR, master mixu, při přidávání vzorků•Provádí se min.1x na vyšetřovanou sadu vzorků•přidání sterilní vody (zaručeně bez přítomnosti NK) do amplifikační reakce namísto vzorku•Musí být negativní

IzolaIzolaččnníí negativnnegativníí kontrola (INK)kontrola (INK)•Kontroluje rizika falešné pozitivity v důsledku kontaminace procesu izolace NK •do procesu izolace NK je namísto vzorku vložena sterilní voda•Musí být negativní

Na rozdíl od negativní kontroly indikuje nejen přítomnost kontaminace v samotnéamplifikační reakci, ale také případnou kontaminaci při izolaci NK.

SystSystéém reakm reakččnníích kontrol NAT ch kontrol NAT -- 33

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika interpretaceinterpretace

Interpretace je určena pro klinické pracovníky

LaboratornLaboratorníí technologicktechnologickáá interpretace interpretace vychází ze znalosti metod je nutné znát pozitiva a limity metod

KlinickKlinickáá interpretaceinterpretacevyžaduje znalost klinické mikrobiologieprezentuje výsledky klinice ve využitelné podobě

ObecnObecnéé zzáásady interpretace sady interpretace laboratornlaboratorníí diagnostikydiagnostiky

DiagnDiagnóózu nestanovujzu nestanovujíí pracovnpracovnííci laboratoci laboratořře, ale oe, ale oššetetřřujujííccíí lléékakařř !!Využívá k tomu vedle poznatků o stavu pacienta i výsledky různých laboratorních vyšetření, a to včetně výsledků získaných molekulárněbiologickými metodami. Pro správnou interpretaci je tedy potřeba kombinovat výsledky molekulární diagnostiky s výsledky jiných laboratorních metod. Zejména jde o stanovení specifických protilátek (virové infekce, borelióza aj.) a nespecifických markerů infekce (například prokalcitonin, CRP).

POZOR!Konečná interpretace výsledků a stanovení diagnózy musí být vždy prováděny v souvislosti s klinickým stavem pacienta.

NelNelééččíí se laboratornse laboratorníí výsledek, ale pacient !!!výsledek, ale pacient !!!

LaboratornLaboratorníí interpretace mol.dg. metodinterpretace mol.dg. metodVÝSLEDKY LABORATORNVÝSLEDKY LABORATORNÍÍHO VYHO VYŠŠETETŘŘENENÍÍ

negativnnegativníí nnáález (lez (--) ) → přítomnost nukleové kyseliny mikroorganizmu ve vyšetřeném vzorku nebyla prokázána

kvalitativnkvalitativníí pozitivnpozitivníí nnáález (+) lez (+) → přítomnosti nukleové kyseliny mikroorganizmu ve vzorku byla prokázána

kvantitativnkvantitativníí pozitivnpozitivníí nnáález lez → přítomnost nukleové kyseliny mikroorganizmu ve vzorku byla prokázána a byla změřena kvantitativně (k/ml ; IU/ml ; IU/počet buněk ; k/g ; apod)

inhibice reakce inhibice reakce → klinický vzorek nebylo možné vyšetřit z důvodu příliš vysokého obsahu inhibitorů PCR nevhodný odbnevhodný odběěr r → klinický vzorek nevyhovuje svou povahou nebo způsobem transportu požadovanému vyšetření(pro PCR není vhodná sražená krev; sérum transportované při vysoké teplotě nebo déle než 4 hodiny při +4 °C nelze spolehlivě vyšetřit na virus hepatitidy C, apod.).KontrolyKontrolyV případě, že kontroly nevycházejí, jak mají, by výsledky všech souběžně kontrolovaných reakcí měly být považovány za „nevalidní“ a podle výsledků konkrétních kontrol by se měla opakovat buď PCR reakce, nebo i celádetekce.

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace –– 2a 2a

VysokVysokáá senzitivita stanovensenzitivita stanoveníí

VýhodnVýhodnéé při detekci obligátních patogenů, které se v zevním prostředí běžně nevyskytují (M. tuberculosis, borelie, viry hepatitid aj.), při testování krevních produktů (HCV, HBV, HIV) apod. KomplikaceKomplikace při interpretaci výsledků průkazu mikroorganizmůzpůsobujících latentní či inaparentní infekce bez klinického významu (EBV, cytomegalovirus, HHV6 aj.) nebo při detekci fakultativních patogenů a mikrobů vyskytujících se běžně v prostředí či jako součást mikroflóry (například stafylokoky, streptokoky, mykoplazmata, kvasinky a vláknité mikromycety), kde přílišná citlivost při nesprávné interpreataci může být zavádějící

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace –– 2b 2b

Teorie a praxe pTeorie a praxe přři dosai dosažženeníí maximmaximáálnlníí citlivosti stanovencitlivosti stanovenííCitlivost detekce konkrétní metody je zásadní parametr, jehož znalost je nezbytná pro správnou indikaci vyšetření i interpretaci výsledků.

LaboratoLaboratořř musmusíí znznáát citlivost svých metod !!!t citlivost svých metod !!!Metody molekulární diagnostiky mohou teoreticky zachytit i jedinou kopii DNA ve vzorku vkládaném do detekce, čímž převyšují citlivost většiny ostatních diagnostických metod používaných v rutinní mikrobiologické diagnostice, v reálu tomu tak ale být nemusí

HlavnHlavníím limitem amplifikam limitem amplifikaččnníích metod je ch metod je maximmaximáálnlníí momožžný ekvivalent vzorku, který lze do reakce vloný ekvivalent vzorku, který lze do reakce vložžit. it.

Čím vyšší je koncentrace patogena ve výchozím vzorku, tím vyšší je pravděpodobnost jeho záchytu.Citlivost metody pak můžeme zvýšit zkoncentrováním patogena v klinickém materiálu. To do jisté míry lze u bezbuněčných materiálů (likvor, moč, sérum, plazma), velmi obtížné je to však u vzorků obsahujících buňky, například při vyšetření plné krve

Příklad: Na uvedeném příkladu je demonstrováno porovnání citlivosti PCR metody s klasickými kultivačními postupy při průkazu mikroorganizmů v plnékrvi

•Limit při vyšetření plné krve metodou PCR je daný maximálním vkladem izolátu NK do reakce. Empirickou zkušeností je, že běžná reakce o objemu 50 µl je inhibována i čistou humánní NK, a to již koncentrací od 1 µg DNA výše. Toto množství NK zpravidla zizolujeme z asi 2 x 105 leukocytů, tedy běžně z ekvivalentu objemu 50 μl plné krve. Toto je tedy maximální možný vklad izolátu z periferní krve do PCR reakce. Pak ani při maximální možné citlivosti vlastní PCR reakce, tedy při schopnosti zachytit 1–10 kopií cílové sekvence na reakci s 95% pravděpodobností, nemůže být citlivost celé detekce vyšší než asi 20–200 kopií cílové sekvence na 1 ml plné krve! Lepšího výsledku s 95% pravděpodobností dosáhnout nelze

•Srovnejme nyní tento teoretický výsledek s možnostmi kultivačními. Do kultivace metodou tzv. hemokultury se vkládá až 10 ml plné krve. Teoreticky může i jediná bakterie vyrůst a její růst může být pokročilými metodami detekce CO2 detekován. Při „zcela optimálních“ podmínkách je pak teoretickácitlivost této metody 1 bakterie na 10 ml plné krve!

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace –– 3a 3a

KvantitativnKvantitativníí detekcedetekce•Možnost exaktně kvantifikovat infekční agens•Rozlišení latentní a aktivní infekce •Popis průběhu infekce •Hodnocení reakce na léčbu

Kvantifikace je zásadním přínosem zejména pro diagnostiku infekcí HCV a HBV, HIV, dále pak herpesvirů, CMV a EBV u imunodeficientních pacientů.

Zjištění množství viru v krvi, tzv. virové dávky, umožnísledovat účinnost terapie v reálném čase, což jinévirologické metody prakticky neumožňují

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace –– 3b 3b

Příklad využití kvantitativního stanovení

Pro správnou interpretaci výsledků kvantitativní PCR je potřeba znát symptomaticky symptomaticky kritickkritickéé kvantitativnkvantitativníí koncentrace koncentrace (hladiny) infekčních agens, které jsou specifické pro určité klinické situace a jsou spojené s určitými klinickými projevy.

U některých virů je určitá hladina viremie s experimentálně stanovenou pravděpodobností asociována s jistými klinickými příznaky. Na základě těchto hodnot je také možno zahájit či změnit terapii.

Příkladem použití může být sledování viremie, tzv. virové dávky (virus load), u infekce CMV, kdy bylo experimentálně zjištěno, že 5 000 kopií DNA viru CMV na 2 x 105 leu periferní krve je spojeno v 92 % případů se syptomatickým onemocněním u pacientůpo transplantaci jater.

Průkaz takové viremie pak umožňuje včas nasadit léčbu gancyklovirem a zabránit dalšímu rozvoji této potenciálně velmi nebezpečné infekce.

Bohužel, tyto hodnoty však nebyly dosud jednoznačně určeny či nejsou u řady mikroorganizmů k dispozici.

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace –– 3c 3c

Efekt pEfekt p řřesnosti kvantifikace pro klinickesnosti kvantifikace pro klinick éé poupou žžitit íí

Aby bylo mo žno efektivn ě odlišit r ůzné nam ěřenéhodnoty,

musí laborato ř znát rozptyl m ěření každé své metody

Laborato ř musí variabilitu svého testovat a musí být p řipravena o ní informovat klinika.

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace –– 3d 3d

Příklad:Postupně každý den byla měřena virová dávka CMV v plazmě pacienta. Výsledky uvádítabulka. Došlo skutečně k poklesu virové dávky, a tedy k účinku léčby? Pokud ano, kdy?

Experimentálně zjištěný rozptyl konkrétní metodiky kvantitativního stanovení virovénálože CMV byl:

Výsledky se porovnají se zjištěnými rozptyly použité metody qPCR. Analýza ukazuje, že mezi hodnotou z 1. a 2. dne vyšetření není rozlišitelný rozdíl, zatímco 3. den již došlo k významnému snížení virové nálože.

Vyšetření Výsledek (kopií/ml)1. den 15 000

2. den 9 000

3. den 1 400

Vložená koncentrace (kopií/µl) Rozptyl měření (kopií/µl)10 3–34

100 66–151

1000 660–1 513

10 000 5 623–17 782

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace –– 3e 3e

PoznPoznáámky ke kvantifikaci metodou PCRmky ke kvantifikaci metodou PCR

Infekci nelze objektivně kvantifikovat kdyžnení možné získanou hodnotu standardizovat

například vztáhnout na určitý objem, počet buněk, množství izolované NK apod. nebo nehomogenním rozložením agens (například biopsie, sputum,..)

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace -- 4 4

Rychlost detekceRychlost detekcemůže mít zásadní význam pro volbu efektivní terapie

Příklady využití rychlosti stanovení:•Septické stavy •Invazivní infekce meningokoky, hemofily či streptokoky•Virové infekce imunokompromitovaných pacientů•Akutní infekce centrálního nervového sysytému

Rychlost kompletní detekce: 3-4hALE - vyšetření je nákladnějšíU méně závažných infekcí je zpravidla ekonomicky výhodnější vyšetřovat vzorky ve větších objemech najednou, a čeká se tedy na dostatek vzorků

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace -- 1 1

KultivaKultivaččnněě neznezáávislvisláá detekcedetekce•metody umožňují detekovat, identifikovat a kvantifikovat mikroorganizmy, kterénelze standardními mikrobiologickými metodami kultivovat, nebo se kultivují obtížně. •v porovnání s kultivačními metodami neumožňují tyto metody izolaci kultury životaschopného mikroorganizmu pro další testování včetně fenotypově vyjádřenécitlivosti k antibiotikůmPříklady: •M. tuberculosis - lze sice v rutinních podmínkách kultivovat, ale na mikrobiologických půdách rostou velmi pomalu, a diagnostika se tak protahuje na několik týdnů (až 9 týdnů)•Borelie - kultivace je možná, ale pro rutinní diagnostiku není prakticky použitelná•Další obtížně kultivovatelná infekční agens - chlamydie, coxielly a původci infekčních endokarditid ze skupiny HACEK (Hemophillus sp., Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, Kingella kingae).•Mykologická dg. - pro průkaz původců dermatomykóz, aspergilů, kvasinek•Kultivace virů je z hlediska rutinní diagnostiky omezeně využitelná. Metody molekulárnídiagnostiky se proto v jejich detekci hojně využívají. Mezi nejčastější detekované viry patří zejména herpesviry, viry hepatitid, HIV, parvoviry či papilomaviry. •bakterie rostoucí v biofilmech

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace -- 5 5 Nedostatek Nedostatek úúdajdajůů ke klinickke klinickéé interpretaci interpretaci -- laboratornlaboratorníí a klinicka klinickéé dopadydopadyVysokVysokáá citlivost citlivost mění pohled na životní cykly mikroorganizmů a patogenezi některých onemocnění. Jak vysvětlit přítomnost dlouhodobě přetrvávající nízké hladiny NK patogenů, které by neměly být přítomny, avšak v těle pacienta přesto dlouhodobě přetrvávají? Jsou to zachovalé části bakterií, nebo jde o bakterie živé, ale v tak malých koncentracích, že je předchozí kultivační metody nedokázaly odhalit? Jak dlouho přetrvává NK rozložených bakterií v hostiteli? A když už získáme poznatky o přetrvávání volných NK v periferní krvi, je tomu tak v jiných tkáních?Příklady:

Jak se postavit k pozitivním detekcím gonokoků, a to i několik týdnů po ukončení standardní léčby, kdy by podle našich představ tyto patogeny měly být již dávno zlikvidovány? Jde o mrtvé patogeny, anebo se naopak mrtvé patogeny rychle rozloží a pozitivnívýsledky skutečně značí přítomnost patogenů živých?

Jak vysvětlit přítomnost NK borelií nebo herpesvirů v mozkomíšním moku pacientů bez příznaků infekčního onemocnění, u kterých by tento materiál měl být primárně sterilní.

Mění se také pohled na význam detekce patogenů v moči. Ačkoliv v diagnostice chlamydií se jejich průkaz v moči již považuje za spolehlivý marker chlamydiové infekce, stále chybí dostatečná data pro interpretaci nálezů NK v moči u mnoha jiných patogenů– zejména jde-li o stanovení gonokoků, borelií či legionel.

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika –– interpretace interpretace -- 6 6 Species versus genospecies Species versus genospecies -- Nomenklatura Nomenklatura Nomenklatura a pNomenklatura a přřejmenovejmenováávváánníím taxonm taxonůů, zm, změěny v klasifikaci,ny v klasifikaci,……příklad: dnes zejména identifikovaná pohlavní stadia plísníProblém může nastat ve fázi sdělování výsledků klinickým pracovníkům, kteří nemají ani tušení, že namísto známého aspergila najednou mají pozitivní nález „nějaké Emericelly“.

Genespecies a genotypy Genespecies a genotypy detekce cílové sekvence spíše respektuje genetické podobnosti a odlišnosti nežfenotypové - často taková typizace ani pojmenování neodpovídá tradičním srotypům.příklad: Například se takto klasifikují skupiny legionel, kde je již dávno známo více patogenních legionel než jeden původně za patogenní druh označovaný – Legionella pneumophilla. Podobně se na základě sekvenčních analýz popisují genotypy papilomavirů, leptospir, apod.

Pro laboratoře to nemá valný význam, svou diagnostiku tím měnit nemusí. Klinikové jsou na terapii známých patogenů připraveni, nová jména ale často neznají. Je to logické a laboratoře by měly s tímto počítat.

MolekulMolekuláárnrníí mikrobiologickmikrobiologickáá diagnostika diagnostika -- cenacena

Cena Cena -- nnááklady laboratornklady laboratorníího vyho vyššetetřřeneníí

Metody molekulární diagnostiky se tradičně považují za drahé

Důvody:Vysoké náklady na vývojVysoká cena vstupůVysoká cena přístrojůVysoké úhrady z pojistného

Pokud je použití indikováno správně, vyplatí seCena každého vyšetření je při nesprávné indikaci

příliš vysoká☺

SprSpráávnvnáá laboratornlaboratorníí praxepraxeNutnost neustNutnost neustáálléé inovaceinovace

Výrobce CE IVD diagnostika nebo v pVýrobce CE IVD diagnostika nebo v přříípadpaděě inin--house metody odborný personhouse metody odborný personáál laboratol laboratořře odpove odpovíídajdajííza sledovza sledováánníí nejnovnejnověějjšíších poznatkch poznatkůů a za adekva za adekváátntníí inovace kitinovace kitůů nebo akreditovannebo akreditovanéé metody metody

Jak na to?Jak na to?

Studium, odbornStudium, odbornéé ččlláánky, konferencenky, konferenceÚÚččast na EHKast na EHKZpZpěětntnáá vazba z kliniky vazba z kliniky

PPřřííklad ztrklad ztrááty plasmiduty plasmidu: při detekci C. trachomatis je mnoho rutinních metod cíleno do sekvence kryptického plazmidu, který je v buňce chlamydie obsažen v mnoha kopiích. To je sice výhodné kvůli zvýšení citlivosti detekce, na druhou stranu existuje významnéprocento kmenů chlamydií, které tento plazmid ztratily. Aby bylo možno detekovat takové kmeny, bylo potřeba metodu obohatit o současnou amplifikaci úseku genomové chromozomální DNA. Ta je v buňce přítomna vždy, ale jen v jedné kopii. Takto je možno detekovat s vysokou citlivostí kmeny s plazmidem a současně též kmeny bez plazmidu, i když někdy méně citlivě.

Evoluční poznámka – diagnostika samotndiagnostika samotnáá mmůžůže pe přředstavovat selekedstavovat selekččnníí tlaktlakV poslední době se ukazuje, že systematická diagnostika zaměřená na určité konkrétní sekvence NK ve spojení s účinnou léčbou, eradikací nebo prevencí může představovat reálný selekční tlak. Díky němu pak může dojít k selekci populací mikroorganismů, které diagnostice unikají. Takové mikroorganismy pak mohou dlouhodobě unikat pozornosti. Řešením tohoto nebezpečí je zejména neustálé sledování epidemiologických údajů a nejnovějších poznatků klinické mikrobiologie a neustálé zlepšovánídiagnostických metod. Příkladem je tlak ATB na detekovatelné gonokoky, kdy výsledkem bylo zvýhodnění a následné dramatickérozšíření nedekovatelné mutanty.