LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM FARMAKOTERAPI PENYAKIT INFEKSI

DETEKSI BAKTERI PATOGEN

NAMA:

AYU APRILLIANI 260110140078

PUTRI RARASWATI 260110140079

UMMI HABIBAH 260110140080

AYYU WIDYAZMARA 260110140081

ANGGIA DIANI 260110140082

SITI NURROHMAH 260110140083

AI SITI RIKA FAUZIAH 260110140084

NISA MAULANI 260110140085

TIFFANY SABILLA 260110140086

NURMALIA SARASWATI 260110140087

ADAM RENALDI 260110140090

FAMI FATWA 260110140095

RHEZA ANDIKA 260110140105

LABORATORIUM FARMAKOTERAPI PENYAKIT INFEKSI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

JATINANGOR

2015

I. Tujuan

Untuk mengetahui ada atau tidaknya bakteri patogen yang dapat menghemolisis

darah pada ekstrak

II. Prinsip

1. Hemolisis Bakteri

Ekspresi dari hemolisis bakteri dapat diketahui ada atau tidaknya zona

bening disekeliling koloni bakteri. Terdapat 3 tipe sifat hemolisis yaitu

alpha, beta, dan gama (Alderberg, 2001)

2. Agar Darah

Media Agar Darah merupakan media differensial yang berfungsi

membedakan bakteri berdasarkan kemampuan bakteri melisiskan sel darah

merah. Ekspresi dari hemolisis bakteri dapat diketahui ada atau tidaknya

zona bening disekeliling koloni bakteri (Alderberg, 2001)

3. Teknik Aseptis

Proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari mikroba

kontaminan, teknik aseptis digunakan sepanjang percobaan berlangsung,

baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikan (Anton, 2008).

III. Teori Dasar

Hemolisis adalah rusaknya jaringan darah akibat lepasnya hemoglobin dari

stroma eritrosit (butir darah merah). Hemolisis dapat disebabkan karena

penurunan tegangan permukaan membrane sel dan dipengaruhi oleh beberapa

faktor, seperti pelarut organik, saponin, garam empedu, sabun, enzim, dan faktor

lain yang merusak komplek lemak-protein dari stroma. Faktor hemolisis ini

ditemukan pada bisa ular famili Elapidae (Cormack, 2008).

Membran sel darah termasuk membran yang permeabel selektif. Membran

sel darahmerah mudah dilalui atau ditembus oleh ion-ion H+, OH-, NH4+, PO4,

HCO3-, Cl-, dansubstansi seperti glukosa, asam amino, urea, dan asam urat.

Sebaliknya sel darah merah tidak dapat ditembus oleh Na+, K+, Ca2+, Mg2+,

fosfat organik, hemoglobin dan protein plasma.Secara umum membran yang

dapat dilalui atau di tembus oleh suatu substansi dapat dikatakan bahwa membran

ini permeabel terhadap substansi tersebut. Membran yang betul-betul semi

permeabel adalah membran yang hanya bisa di tembus oleh molekul air saja,

tetapi tidak dapat di tembus oleh substansi lain (Watson, 2009).

Prinsip dari hemolisis yaitu sel darah merah akan mengalami lisis

biladirendam dalam larutan (eritrosit melemah). Sedangkan tujuan dari hemolysis

dalam sediaan darah tebal berfungsi untuk melisiskan eritrosit sehingga parasite

yang ditemukan lebih banyak. Pada peristiwa hemolisis,

semakin tinggi konsentrasi lingkungan maka semakin lambat proses

hemolisis terjadi dan sebaliknya apabila konsentrasinya rendah maka proses

hemolisis akan semakin cepat. (Jonathan, 2006).

Dalam dunia mikrobiologi hemolisis digunakan untuk mengklasifikasi

mikroorganisme tertentu dengan cara mengamati kemampuan koloni bakteri

untuk menginduksi hemolisis bila ditanam pada agar darah. Ada 3 jenis hemolisis,

yaitu:

1. Hemolisis Alfa

Jenis hemolisis alfa atau yang biasa disebut juga hemolisis sebagian adalah

penurunan hemoglobin sel darah merah untuk methemoglobin dalam medium

sekitar koloni. Hal ini menyebabkan perubahan warna cokelat atau hijau

dalam medium. Warna dapat disamakan dengan memar sel. Pemeriksaan

mikroskopis sel darah merah alpha-hemolyzed menunjukkan bahwa membran

sel yang utuh. Hemolisis Alfa disebabkan oleh oksidasi besi dalam

hemoglobin yang mengacu pada lisis parsial dari sel darah merah dan

hemoglobin (Brown, 2001).

2. Hemolisis Beta

Hemolisis beta atau yang biasa disebut hemolisis total didefinisikan sebagai

lisis seluruh sel darah merah. Jenis hemolisis ini ditandai dengan sebuah zona

transparan yang jelas pada media di sekeliling koloni mikroba (Brown, 2001).

3. Hemolisis Gamma

Hemolisis Gamma disebut juga non-hemolisis. Mikroba dikategorikan sebagai

hemolisis gamma apabila ketika pengujian tidak terjadi perubahan karena

mikroba tidak dapat melisiskan sel darah merah (Brown, 2001).

Ada dua macam hemolysis, yaitu:

Hemolisis osmotik yang terjadi karena adanya perbedaan yang besar antara

tekanan osmosa cairan didalam sel darah merah dengan cairan yang berada

disekeliling sel darah merah. Tekanan osmosa sel darah merah adalah sama

dengan osmosa larutan NaCl 0, 9 %, bila sel darah merah dimasukkan

kedalam larutan NaCl0, 8 % belum terlihat adanya hemolisa, tetapi sel darah

merah yang dimasukkan kedalamlarutan NaCl 0, 4 % hanya sebagian saja dari

sel darah merah yang mengalami hemolisis dan sebagian lagi sel darah

merahnya masih utuh. Perbedaan ini desebabkan karena umur seldarah merah

yang sudah tua, membran sel mudah pecah, sedangkan sel darah merah yang

muda, membran selnya masih kuat. Bila sel darah merah dimasukkan kedalam

laritan NaCl 0,3 %, semua sel darh merah akan mengalami hemolisa sempurna

(Wulangi, 1993).

Hemolisis kimiawi membran sel darah merah dirusak oleh macam-macam

substansi kimia. Seperti,kloroform, aseton, alkohol, benzena dan eter,

substansi lain adalah bisa ular, kalajengking,dan garam empedu. (Wulangi,

1993).

Patogen merupakan organisme yang mengakibatkan makhluk hidup

menderita. Menderita dalam arti umum adalah merasakan sakit dan gelisah, akan

tetapi tumbuhan tidak dapat merasakan sakit dan gelisah. Pengertian Patogenesis

adalah proses dimana mekanisme infeksi dan mekanisme perkembangan suatu

penyakit. Infeksi adalah invasi inang oleh mikroba yang memperbanyak dan

berasosiasi dengan jaringan inang. Infeksi berbeda dengan penyakit. Kapasitas

bakteri menyebabkan penyakit tergantung pada patogenitasnya. Dengan kriteria

ini, bakteri dikelompokan menjadi 3, yaitu agen penyebab penyakit, patogen

oportunistik, nonpatogen (Purnomo, 2006).

Agen penyebab penyakit adalah bakteri patogen yang menyebabkan suatu

penyakit (contohnya Salmonella spp.). Patogen oportunistik adalah bakteri yang

berkemampuan sebagai patogen ketika mekanisme pertahanan inang diperlemah

(contoh E. coli menginfeksi saluran urin ketika sistem pertahanan inang

dikompromikan (diperlemah). Nonpatogen adalah bakteri yang tidak pernah

menjadi patogen. Namun bakteri nonpatogen dapat menjadi patogen karena

kemampuan adaptasi terhadap efek mematikan terapi modern seperti kemoterapi,

imunoterapi, dan mekanisme resistensi. Bakteri tanah Serratia marcescens yang

semula nonpatogen, berubah menjadi patogen yang menyebabkan pneumonia,

infeksi saluran urin, dan bakteremia pada inang terkompromi (Rollins, 2000).

Bahaya biologi (mikroba) pada pangan perlu mendapat perhatian karena jenis

bahaya ini yang sering menjadi agen penyebab kasus keracunan pangan.

Escherichia coli merupakan bakteri patogen yang sering menyebabkan keracunan

pangan dan juga menjadi salah satu mikrobaindikator sanitasi.Sedangkan

Staphylococcus aureus merupakan bakteri yang biasa menghuni hidung, mulut,

tenggorokan, maupun kulit. Keberadaan Escherichia coli pada pangan dapat

menunjukkan praktek sanitasi lingkungan yang buruk sedangkan adanya

Staphylococcus aureus mengidentifikasi praktek higiene yang kurang (Wijaya,

2009).

Selama 3 dasawarsa terakhir, telah berkembang sejumlah metode baru dalam

identifikasi mikroba patogen pada produk pangan. Contoh metode-metode

identifikasi yang telah dikembangkan untuk meningkatkan kemampuan

identifikasi bakteri patogen seperti terlihat pada Tabel 1. Beberapa teknik tersebut

pada awalnya diperuntukkan bagi keperluan mikrobiologi medis/klinis, seperti

PCR dan ELISA. Teknik PCR sendiri telah diterima sebagai standar internasional

untuk identifikasi bakteri patogen pada produk pangan sejak beberapa tahun

terakhir (Dwiyitno, 2010).

Bakteriosin merupakan antimikroba yang digunakan untuk menonaktifkan

mikroba. Pengendalian bakteri patogen dapat dilakukan dengan kombinasi antara

bakteriosin yang dihasilkan bakteri asam laktat dan suhu tinggi (Arques et al.

2005)

IV. Alat, Bahan dan Gambar Alat

Alat:

1. Cawan petri

2. Inkubator

3. Mikro pipet

4. Ose loop

5. Tabung reaksi

6. Volume pipet

7. Vortex

Bahan:

1. Agar darah

2. Ekstrak

3. Larutan NaCl fisiologis steril

Gambar Alat

Cawan Petri Inkubator Mikro pipet

Ose loop Tabung Reaksi Volume Pipet

Vortex

V. Prosedur

1. Alat dan bahan disiapkan

2. Ekstrak ditimbang seberat 0,5 g. Dilarutkan dalam 4,5 mL NaCl fisiologis yang

berada dalam tabung reaksi I. kemudian dikocok dengan Vortex.

3. Ambil 0,5 mL larutan dari tabung reaksi I ke dalam tabung reaksi II yang berisi

4,5 mL NaCl fisiologis.

4. Ambil 0,5 mL larutan dari tabung reaksi II ke dalam tabung reaksi III yang berisi

4,5 mL NaCl fisiologis.

5. Oleskan dengan menggunakan ose loop penuh ke media agar darah.

6. Diinkubasi selama 18-24 jam dalam inkubator.

VI. Data pengamatan

1. Pengamatan Kemampuan Hemolisis Bakteri dalam Ekstrak Daun

Salam (Syzygium polianthum)

No. Perlakuan Hasil

1. Alat dan bahan yang sudah

disterilisasi disiapkan

Tersedia alat dan bahan-bahan yang

bebas bakteri

2. Ekstrak daun salam ditimbang

sebanyak 0,5 gram pada cawan

petri kecil dengan menggunakan

neraca analitik yang sudah ditara

terlebih dahulu

Didapatkan ekstrak daun salam

sebanyak 0,5 gram

3. Ekstrak daun salam sebanyak 0,5

gram tersebut diencerkan dengan

4,5 mL NaCl fisiologis steril

(perbandingan 1:10), dan

dihomogenkan dengan mesin

vortex.

Didapatkan suspensi ekstrak daun

salam yang homogen dengan

konsentrasi 10%

4. Ekstrak daun salam tersebut

diencerkan dengan cara diambil

0,5 mL ekstrak dengan

menggunakan mikropipet dan

dimasukkan pada tabung reaksi

lain yang berisi 4,5 mL NaCl

fisiologis steril. Campuran

ekstrak dihomogenkan dengan

mesin vortex.

Didapatkan suspensi ekstrak daun

salam yang homegen dengan

konsentrasi 1% dengan faktor

pengenceran 10-1

5. Ekstrak daun salam tersebut

kembali diencerkan dengan cara

diambil 0,5 mL ekstrak dengan

menggunakan mikropipet dan

dimasukkan pada tabung reaksi

lain yang berisi 4,5 mL NaCl

fisiologis steril. Campuran

ekstrak dihomogenkan dengan

mesin vortex.

Didapatkan suspensi ekstrak daun

salam yang homegen dengan

konsentrasi 0,1% dengan faktor

pengenceran 10-2

6. Cawan petri yang berisi agar

darah ditandai untuk membagi

daerah cawan Petri menjadi

menjadi bagian.

Cawan berisi agar darah terbagi

menjadi tiga daerah

7. Masing-masing ekstrak daun

salam yang telah dibuat

dioleskan pada permukaan agar

darah pada daerah yang berbeda

sebanyak satu Ose penuh

Masing-masing bagian diinokulasi

dengan ekstrak daun salam

8. Cawan berisi agar darah

diinkubasi selama 24 jam dan

diamati hasilnya

Di dapatkan hasil demikian.

2. Perhitungan

Larutan 1

0,5 gram Ekstrak dalam 4,5 mL NaCl fisiologi steril

= 10 %

Larutan 2 (Pengenceran 10-1

)

0,5 mL x 10 % = 5 mL x M

M = 1 %

Larutan 3 (Pengenceran 10-2

)

0,5 mL x 1 % = 5 mL x M

M = 0,1 %

VII. Pembahasan

Praktikum kali ini mengenai pengujian ekstrak yang diinokulasi pada media

agar darah (blood agar). Tujuannya adalah untuk mengetahui apakah dalam

ekstrak yang diuji terdapat bakteri yang dapat menghemolisis darah sehingga

dapat ditetapkan eksrak ini dapat digunakan sebagai obat atau tidak. Prinsip dari

praktikum ini yaitu adanya perubahan pada media blood agar ketika dihemolisis

oleh bakteri yang terdapat dalam ekstrak dengan pengerjaan mengikuti aturan

teknik aseptis.

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi

senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut

yang sesuai (Depkes RI, 2000). Ekstrak yang diuji adalah ekstrak daun salam.

Ekstrak ini perlu diuji karena ekstrak ini selanjutnya akan digunakan sebagai

bahan dasar suatu sediaan yang diharapkan mempunyai efek terapeutik dan tidak

berbahaya bagi pasien. Berdasarkan aturan yang telah ditetapkan oleh BPOM,

ekstrak tidak boleh mengandung mikroba pathogen. Sehingga hasil dari pengujian

ekstrak pada blood agar ini yaitu dapat diketahui apakah ekstrak mengandung

mikroba pathogen yang dalam pengujian ini mikroba yang dapat menghemolisis

darah.

Blood agar digunakan untuk isolasi, menumbuhkan berbagai macam bakteri

pathogen dan menetapkan bentuk hemolisa dari bakteri tersebut. Media kultur ini

kaya nutrien yang menyediakan kondisi pertumbuhan bakteri yang optimal. pH

media ini sekitar 6,8 untuk menstabilkan sel darah merah dan menghasilkan media

hemolisa yang jelas. Kandungan yang didapat pada agar darah seperti nutrien

substrat (ekstrak hati dan pepton), NaCl, agar agar, darah domba. Media Agar

Darah (blood agar plate) merupakan media differensial yang berfungsi

membedakan bakteri berdasar kemampuan bakteri melisiskan sel darah merah.

Ekspresi dari hemolisis bakteri dapat diketahui ada atau tidaknya zona bening di

sekeliling koloni bakteri.

Pada pengujian ekstrak ini, seperti biasanya pada lab mikro biologi, kerja

yang dilakukan harus secara aseptis. Tujuannya yaitu untuk mencegah

kontaminasi mikroorganisme dan mencegah kontaminasi ruangan dan praktikan

dengan mikroorgansime. Menurut Pelczar dan Chan (2007), teknik aseptis sangat

penting dalam pengerjaan mikrobiologi yang memerlukan ketelitian dan

keakuratan disamping kesterilan yang harus selalu dijaga agar terbebas dari

kontaminan yang dapat mencemari. Cara kerja dalam lab mikrobiologi sangat

mempengaruhi terhadap hasil pengujian. Ketika pengerjaan di lab tidak aseptis,

maka dimungkinkan hasil yang didapat tidak akurat karena adanya kontaminasi

dari luar. Teknik aseptis ini dapat dilakukan dengan cara mensterilisasikan

terlebih dahulu peralatan gelas yang akan digunakan. Selain itu, saat melakukan

kerja, harus selalu di dekat api agar terhindar dari kontaminasi luar yang dapat

menyebabkan kesalahan pada hasil pengujian.

Langkah pertama yang harus dipersiapkan dalam percobaan kali ini adalah

membuat blood agar. Blood agar adalah media pertumbuhan mikroorganisme

yang digunakan untuk mengetahui apakah mikroorganisme tersebuat dapat

menghemolisis darah atau tidak dapat menghemolisis darah. Selain itu, dengan

menggunakan blood agar dapat diketahui apakah mikroorganisme tersebut

pathogen atau tidak. Blood agar merupakan media diferensial, bukan media

selektif. Media blood agar juga disebut media universal karena dapat digunakan

untuk menumbuhkan beragam jenis bakteri. Cara pembuatan blood agar cukup

mudah, disiapkan cawan petri yang telah di sterilkan lalu darah yang steril

dimasukkan kedalam cawan petri tersebut. Setelah itu ditambahkan agar nutrient

kedalam cawan petri yang telah diisi darah. Agar nutrient digunakan sebagai

pemadat media, lalu cawan petri di goyang diatas meja membentuk angka 8 untuk

menghomogenkan darah dengan agar nutrient. Setelah itu dibiarkan beberapa

menit hingga blood agar memadat. Pembuatan blood agar dilakukan dengan cara

aseptis.

Untuk pembuatan larutan ekstrak daun salam, ditimbang ekstrak sebanyak

0,5 gram dan dilarutkan dengan 4,5 ml NaCl fisiologis steril lalu dikocok hingga

homogen. Setelah homogen dilakukan pengenceran bertingkat dengan sebanyak 2

kali pengenceran. Setelah larutan ekstrak dibuat dalam 3 konsentrasi, 10-1

, 10-2

,

dan 10-3

. Cawan petri yang telah diisi blood agar dibagi 3 bagian untuk

menggoreskan dengan konsentrasi yang berbeda. Setelah itu dilakukan

penggoresan kedalam media blood agar yang tadi telah dibuat sebelumnya, lalu

diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam. Saat inkubasi cawan petri harus

dengan keadaan terbalik agar tidak ada uap air.

Media blood agar ini digunakan untuk isolasi, menumbuhkan berbagai

macam bakteri patogen dan menetapkan bentuk hemolisa dari bakteri tersebut.

Media kultur ini kaya nutrien yang menyediakan kondisi pertumbuhan bakteri

yang optimal. pH media ini sekitar 6,8 untuk menstabilkan sel darah merah dan

menghasilkan media hemolisa yang jelas. Kandungan yang didapat pada agar

darah seperti nutrien substrat (ekstrak hati dan pepton), NaCl, agar agar, darah

domba.

Media Agar Darah merupakan media differensial. Metode uji hemolisis

berdasarkan kemampuan bakteri menghemolisis sel darah merah pada Blood

Agar Plate yang ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekeliling koloni

(Chamanrokh et al, 2007). Terdapat 3 tipe sifat hemolisis yaitu alpha, beta, dan

gama. Hemolisis alpha terjadi penurunan hemoglobin sel darah merah di sekitar

koloni sehingga sekeliling bakteri akan tampak warna hijau atau coklat dalam

medium. Hemolisis beta didefinisikan lisis lengkap dengan tampilan warna

transparan disekeliling bakteri pada medium. Tipe hemolisis gamma

menunjukan kurangnya tanda hemolisis atau tidak ada zona bening serta

perubahan warna.

Untuk membaca reaksi hemolitik pada lempeng Blood agar (agar darah),

cawan petri harus diangkat ke sumber cahaya dan diamati dengan cahaya yang

datang dari belakang (cahaya yang ditransmisikan).

Pada perlakuan praktikum ini digunakan 3 konsentrasi berbeda dari larutan

ekstrak daun salam yang tercemar bakteri untuk diuji ada tidaknya bakteri patogen

didalamnya yang memiliki kemampuan dalam lisis darah. Konsentrasi yang

digunakan yaitu 10-1

, 10-2

, 10-3

, dimana ketiga konsentrasi ini digoreskan pada

satu cawan petri yang sebelumnya telah dibagi menjadi tiga bagian sama besar.

Hasil yang diperoleh dari inkubasi selama 24 jam menunjukkan hasil bahwa

pada ekstrak yang daun salam yang diteliti tidak mengandung bakteri patogen

yang dapat menghemolisis darah yang sesuai dengan literatur yang ditetapkan.

Hal ini dapat diketahui dengan tidak adanya zona bening pada ekstrak yang

digoreskan pada blood agar. Ketika ada zona bening menunjukkan bahwa bakteri

patogen berhasil melisis media blood agar, jika itu terdapat pada eksrak maka

ektrak tersebut tidak dapat dijadikan untuk obat karena dapat membahayakan

kesehatan tubuh sedangkan pada ekstrak daun salam yang diteliti saat praktikum

tidak ditemukan bakteri yang berbahaya yang bersifat patogen.

VIII. Simpulan

Ekstrak daun salam yang diteliti tidak mengandung bakteri patogen yang dapat

menghemolisis darah ditandai dengan tidak adanya zona bening pada ekstrak yang

digoreskan pada blood agar.

DAFTAR PUSTAKA

Alderberg M, Jawetz. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Salemba Medika.

Anton, W. 2008.Mikrobiologi Umum. Malang :Universitas Brawijaya

Arques, J.L., E. Rodriguez, G. Gaya, M. Medina, B. Guamis, and M. Nunez.

2005. In-activation of Staphylococcus aureus in raw milk cheese by

combinations of high-pressure treatments and bacteriocin producing lactic

acid bacteria. sJ. Appl. Microbiol. (98): 254-260.

Brown, A. 2001. Benson : Microbiological Applications Lab Manual. 8th Ed.

New York : The McGraw-Hill Companies.

Cormack. 2008. Histologi veterinner. Jakarta : UI Press.

Dwiyitno. 2010. Identifikasi Bakteri Patogen pada Produk Perikanan Dengan

Teknik Molekuler. Squalen Vol. 5 No. 2.

Jonathan. 2006. Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Jakarta: EGC.

Novotny, L., Dvorska. L., Lorencova, A., Beran, V., and Pavlik, I. 2004. Fish: a

potential source of bacterial pathogens for human beings. Vet. Med.

Czech. 49 (9): 343358.

Purnomo, B. 2006. DASAR-DASAR PERLINDUNGAN TANAMAN :

Penggolongan Penyakitdan Patogen Tumbuhan.

Rollins, D.M. and Joseph, S.W. (2000). Pathogenic Microbiologi. Available at

http://www.life.umd.edu.com [30 November 2015]

Waswa, J., Irudayaraj, J., and Debroy, C. 2007. Direct detection of E. coli

O157:H7 in selected food systems by a surface plasmon resonance

biosensor. LWT. 40: 187192.

Watson, David G. 2009. Analisis Farmasi : Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi

dan Praktisi Kimia Farmasi Edisi 2. Jakarta : EGC.

Wijaya, R. 2009. Penerapan Peraturan Dan Praktek Keamanan Pangan Jajanan

Anak Sekolah Di Sekolah Dasar Kota Dan Kabupaten

Bogor.Skripsi.Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Wulangi, K.S. 1993. Prinsip-prinsip Fisiologi Hewan. Jakarta : Depdikbud.