Kapillris elektroforzisMikro-elektromigrcis technikk a laboratriumi diagnosztikbanFehrje-diagnosztika - tanfolyam

Elvlasztstechnika

Kromatogrfia (1903)

(Ultra)centrifugls (1908 / 1926) Theodor Svedberg

Elektroforzis (1930 / 1948) Arne Tiselius

Tmegspektrometria (1897)

Tiselius elektroforzis kszlke

Glelektroforzis (urea jelenltben)

Vasmentes s vassal teltett transferrin mintk. 6%T, 3%C; 100 V, 8C. Futtatsi id 17 ra.

Znaelektroforzis kapillrisban urea jelenltben------------

A kapillris elektroforzis kezdete

Stellan Hjertn (1958) - free zone electrophoresis 1-3 mm kvarccs

Franz Everaerts (1970-es vek eleje) ITP (Kendall, 1923!)Rauno Virtanen (1974) - potenciometrikus detektls, ZEF.E.P. Mikkers (1979) - znaelektroforzis tefloncsbenJ. Jorgenson (1981) - znaelektroforzis, EOF !

Elektroforetikus rendszerHjertn, 1958

Free zone electrophoresis (Stellan Hjertn, 1967)

Az els kapillris elektroforzis kszlkStellan Hjertn, 1967

A vndorls sebessge elektromos trben

vsebessg mmozgkonysg, mobilits (mobility)Eelektromos trerUalkalmazott feszltsglaz elvlaszt rendszer (ellenllssal rendelkez) hossza

Elektromos mozgkonysg (mobility)Elektroforetikus vndorls idelis (hg) oldatokbanA vndorls a tlts/tmeg hnyadostl s a viszkozitstl fgg

Az elektroforzis kzege

oldat papr gl oldat1930 1950 1955 1967

A poliakrilamid mtrix elnyei

majdnem teljesen idelis, ramlsmentes kzeg felbont kpessge nagya diffzi cskkentettviszonylag les znkban trtnik a komponensek vndorlsa

A szabad oldatban trtn elektroforzis elnyket eredmnyez, de kvetkezmnyekkel jr

elektroendozmzis

Az elektromos kettsrteg az veg felletn

Ketts rteg

elektrdok felletn

kolloid rszecskk felletn

Az endozmtikus ramls mozgkonysgaa vkuum dielektromos llandjaaz oldszer dielektromos llandjaviszkozitszta potencil

Elektroendozmtikus ramls (endosmotic flow)

Az ramlsi profil hatsa a zna-szlessgre A kialakul folyadkram dugszer profilt mutat.

Az endozmzis fggse a pH-tl

Kationok s anionok vndorlsa elektroozmzis jelenltben [cm2 V-1 s-1] (1 Tiselius egysg = 10-5 cm2V-1s-1)

Zna-elektroforzis elektroozmzis jelenltben

Pozitv, semleges s negatv komponensek elektroforziseBenziltrimetilammnium kloridot (1), benzil-alkoholt (2), acetilszaliciltot (3), 4-hidroxibenzotot (4) s benzotot (5) tartalmaz mintaoldat elektroferogramja

(Krlmnyek: kapillris: 57 cm x 75 m, trerssg: 263 V/cm, T=25C, =200 nm, puffer: 50 mM foszft, pH=7,0.)

Fedett kapillrisban a glelektroforzishez hasonl krlmnyek

Coated capillary

MetilcellulzNem keresztkttt poliakrilamidSznhidrtokAZ EREDMNY nincs elektroendozmzis !

A kapillris elektroforzis gyakorlataAutomatizlhatA kapillrist kondcionlni kell/lehetKapillris bevonat alkalmazhat (coating)Mintabevitel tbbfle mdon lehetsgesA tpegysg detektorhoz kzel es plusa fldeltVltozatos futtatsi krlmnyek (krnyezeti paramterek)puffer-adalkokTbbfajta elvlasztsi elven mkd rendszerVltozatos detektlsi mdszerek (egy ponton, teljes hosszban)Kirtkels, kalibrci

A kapillris elektroforzis kszlk2-100 mm fused silica kapillrislland hmrsklet (0 - 60 C)UV detektorNagyfeszltsg tpegysg0-30 kVMinta s elektrolit-tartlyok

Kapillris elektroforzis (1995)

Chip-kapillris elektroforzis kszlk (2005)

Kvarc-kapillris s mikrochip

furat

15 m

poliimid

borts

75 m

365 m

kvarc

A detektlsi mdszerek rzkenysgeDirekt mdszerek

UV-lthat fnyelnyels10-13-10-16 molFluoreszcencia10-15-10-17 molLzer-induklt fluoreszcencia (LIF)10-18-10-20 molAmperometria10-18-10-19 molVezetkpessg10-15-10-16 molTmegspektrometria10-16-10-17 mol

Az elektroforzis mdszereiOsztlyozs az elvlaszts elve alapjn

Az elektroforetikus elvlaszts fajti (1)Zna elektroforzis (ZE - CZE)

Izoelektromos fkuszls (IEF - CIEF)

Izotachoforzis (ITP - CITP)

Glelektroforzis (PAGE - CGE)

A vndorl komponensek tlts/tmeg (z/m) arnya alapjn

Az amfoter tulajdonsg komponensek izoelektromos pontja (pI) alapjn elre megformlt pH gradiensben

A vndorl komponensek mobilitsa (m) alapjn

SDS jelenltben a molekulatmeg (m) alapjn

Az elektroforetikus elvlaszts fajti (2)Micellris elektrokinetikus kromatogrfia (MEKC)

Kapillris elektrokromatogrfia (CEC)

A vndorl komponensek micellris megoszlsa alapjn

Az elektroendozmzis jelenltben vndorl komponensek s akromatogrfis ll fzis klcsnhatsa alapjn

Zna elektroforzis (ZE - CZE) A vndorl komponensek tlts/tmeg (z/m) arnya alapjn trtn elvlaszts

Megfelel a nem-denaturl gl-elektroforzisnek

Zna-elektroforzis elektroozmzis jelenltben

Szrum-elektroforzisNorml szrum kapillris zna-elektroforzise s agarz-elektroforziseTeljes fehrje-tartalom 70.6 g/l, albumin-tartalom 42.7 g/l. Kisrleti krlmnyek: 40 cm50 m kapillris, 20 kV; 200 nm, 20 C.A minta higtsi arnya 1:50.

Liquor-elektroforzisNorml liquor kapillris zna-elektroforzise s agarz-elektroforziseTeljes fehrje-tartalom 0.42 g/l, albumin-tartalom 0.23 g/l.Kisrleti krlmnyek: 40 cm50 m kapillris, 25 kV; 200 nm, 20 C.A minta nem volt higtva.

Izoelektromos fkuszls (IEF - CIEF) Az amfoter tulajdonsg komponensek izoelektromos pontja (pI) alapjn, elre megformlt pH gradiensben trtn elvlaszts

pH gradiens formlsa amfolitokkal amfoter tulajdonsg szintetikus vegyletek keverke (> 4000 fle molekula klnbz izoelektromos ponttal) j pufferkapacits >0 vezetkpessg az izoelektromos pontnl

Izoelektromos fkuszls (isoelectric focusing)

Transzferrin-formk detektlsa280 nm-en a fehrjemennyisg detektlhat,

460 nm-en a vassal teltett fehrjemennyisg detektlhatAz egyes transzferrin izoformk izoelektromos pontja kztti klnbsg kisebb, mint 0.3 pH egysg

Hemoglobin formk analzise izoelektromos fkuszlssalnorml Hb mintaHb minta diabteszes betegtlHb varinsok

Izotachoforzis (ITP - CITP)A vndorl komponensek mobilitsa (m) alapjn trtn elvlaszts

Izotachoforzis (isotachophoresis)A vndorl komponensek a mobilitsuknak (m) megfelel sorrendben vndorolnak az elvlaszts utn (azonos sebessggel)mzr-ion < mC-komponens < mB-komponens < mA-komponens < mvezet-ion

Uraemis beteg szruma

izotachoforetikus koncentrls nlkl nem vizsglhatk a kros mennyisgben felgyleml savak

Micellris elektrokinetikus kromatogrfia (MEKC)A vndorl komponensek micellris megoszlsa alapjn, azaz a molekulk hidrofbicitsa alapjn trtn elvlaszts

Micellakpzds

A felletaktv anyagok egy bizonyos koncentrci-rtk felett micellkat kpeznek.

CMC - kritikus micella koncentrci (cSDS = 8 mM)

SDS - > a dodecil-szulft anionok micellkat kpeznek, amelyekben a polris oldszer fel helyezkednek el a szulft-anion csoportok, s a micella magjt az apolris, hidrofb lncok alkotjk

Micellar elektrokinetic chromatography (Shigeru Terabe, 1985)Micellkat tartalmaz elektrolitban a micellba belp hidrofb komponensek,hidrofbicitsuknak megfelelen rvidebb-hosszabb ideig a micellval egytt vndorolnak az elektromos trben.

Tltssel nem rendelkez anyagok elektroforetikus/elektrokinetikus analziseA dodecil-szulft micellk segtsgvel 14 mono- s diszaccharid elvlasztsa lehetsges nagy felbontssal, mennyisgi analzis cljra is.

A cukrok jellve voltak a detektlhatsg rdekben

Glelektroforzis (PAGE - CGE) Miutn a kapillrisban nem szksges hordoz mtrix, ezrt a glelektroforzist csak az n. denaturl formban alkalmazzuk molekulasly meghatrozsra, vagy DNS analzisre.Fehrjket SDS jelenltben a molekulatmeg (m) alapjn lehet elvlasztani a gl-prusokon val tvndorls akadlyozottsga miattNukleinsavakat / oligonukleotidokat is molekulamret szerint vlaszthatunk el

Glelektroforzis

Alkalmazott mtrixok s polimer hlzatokagarzkeresztkttt poliakrilamid glnem keresztkttt poliakrilamid kolloid oldatahidroxietil-cellulz (HEC)hidroxipropil metil-cellulz (HPMC)metil-cellulz (MC)polivinil-alkohol (PVA)dextrnpolietiln-glikol (PEG s polietiln-oxid (PEO)polivinilpirrolidon (PVP)

Agarz gl

Poliakrilamid gl

Lineris polimerek hasznlata elvlasztsra

Polimer hlzatokon keresztl trtn vndorls ugyangy akadlyozott, mint egy keresztkttt gl esetben, teht a molekula mrettl fgg

Polimer oldatok alkalmazsa automatizlhatv teszi a gl-elektroforzis

A dodecil-szulft lncok hatsa fehrjemolekulkra s klcsnhatsa a molekulkkalA fehrjemolekulk az SDS oldatban denaturldnak s egyttal a dodecilszulft lncok a polipeptidlnchoz egyenletes eloszlsban hozztapadnak.Ennek kvetkeztben a klnbz polipeptidlncok mobilitsa azonos lesz, mert egy ktszer olyan hossz polipeptidlnchoz ktszer annyi dodecilszulft lnc ktdik, gy a z/m azonos lesz!

MegjegyzsekA teljes denaturcihoz a diszulfidhidak felbontsa is szksges! Ezt reduklszerekkel lehet elrni.)A polipeptidlnc sajt tltst a nagy negatv tlts eltakarja!

Fehrje-molekulasly standardok polimer oldaton trtn elektroforziseFluoreszcens detektls a dodecilszulft lncokhoz ktd fluoreszcens festkkel

Bioanalyzer 2100 (Agilent)

Polinukleotid elektroforzisA nukleinsavak tlts/tmeg-arnya gyakorlatilag azonos!

Mobilitsuk szabad-oldatban azonos!

DNS lncok vndorlsa glszr hats esetn

Oligonukleotidok gl-elektroforzise

DNS szekvenls elektroforzisselMaxam-Gilbert mdszerSanger mdszerGTCGATCG..CTGGACTGT...

DNS szekvenls kapillris elektroforzissel (genomics)

a szekvencia kzvetlenl leolvashat az elektroferogram-sorozatrl a ngyfle szn jellssel, az egymsra vettett elektroferogramok kzvetlen informcit adnak

Kapillris elektrokromatogrfia (CEC)Az elektroendozmzis jelenltben vndorl komponensek s a kromatogrfis ll fzis klcsnhatsa alapjn trtn elvlaszts

Kapillris elektrokromatogrfia

Kapillris elektrokromatogrfiaA vndorlst a kapillris fal mentn, s az llfzison kialakul elektroendozmzis biztostja!

Kapillris elektrokromatogrfis ll fzisokAz ll fzist vagy betltjk a kapillrisba, vagy - in situ - a kapillrisban hozzuk ltre a monomer oldatok beinjektlsa utn.

A szelektivitst az ll fzishoz kttt ligandumokkal (pl. CD, fehrjk, stb.)lehet vltoztatni

Elektrokromatogram. Minta: cytochrome c tripszines emszts utn. Kisrleti krlmnyek: izokratikus elvlaszts 25 s 55 fokon. Oszlop: 75m i.d. fused silica kapillris, 30cm, mozg fzis: 40% acetonitrile, 50mM foszft puffer, pH 2.5; 230kV; 214 nm/UV detektls.

Alkalmazsok

Kapillris zna-elektroforzisszrum-elektroforzis / liquor / follikulus folyadkKapillris zna-elektroforzis adalkanyag jelenltbenkirlis elvlasztsok ciklodextrinekkelkirlis elvlaszts fehrjkkelaffinits elektroforzisIzoelektromos fkuszlsGl-elektroforzis fehrje-profil analzisbakterilis fehrjkkls membrn-fehrjkGl-elektroforzis chip-technikvalCell-sorter chip-technikval

Myeloma multiplex, sclerosis multiplex

Szrum-elektroforzis A mdszer rutin-technika, egyszerre tbb kapillrisban

MegaBace - 96 minta egyidben

MegaBace kapillrisok

Kirlis elvlaszts kapillris elektroforzisselCiklodextrin befogad gyrvel a vndorlsi sebessg megvltozik, az enantiomerek egymstl elvlnak

Enantiomerek elvlasztsaHexobarbitl enantiomerek elvlasztsa fedett s kezeletlen kapillrisban

CEC s HPLC ligand-kicserldsselD,L Phe elvlasztsa hidroxiprolin-szrmazk oszloponCECcontinuous bedHPLCCEC + nyomsElectrophoresis 21 (2000) 3141-3144

Triptofn-szrmazkok elvlasztsa zna-elektroforzisseltriptofn metil-szter TME, triptofn etil-szter TEEtriptofn butil-szter TBE

Kapillris elektroforzis transzferrin jelenltbenHttrelektrolit: 10 mM MES, pH 6fedett (coated) kapillrispI (Tf) = 6Vndorls elektromos trben egy fehrje znn keresztla transzferrin znanem vndorolmintaminta transzferrin

A triptofn-szterek kt-kt komponensre vlnak sztTranszferrin jelenltben az enantiomerek elektroforetikus vndorlsa klnbzik egymstl, amely specifikus klcsnhatsra utal

Az elvlaszts mrtke fgg a transzferrin zna hossztlZnahossz

Labetalol optikai izomerek elvlasztsamodellezssel a kthelyek feltrkpezhetk

Fehrjk s endotoxinok klcsnhatsaA lipopoliszaccharidok a fehrjkkel val klcsnhats alapjn lthatk.A klnbz komplexek jellemz elektroferogramot adnakendotoxinhemoglobinendotoxin hemoglobin komplex0 h2 h

Chip-ekProtein 200 Plus LabChipCell Fluorescence LabChip

A kapillris elektroforzis nagy kalandja

Injektls chip-en

Tbbszrs analzis, reakcik alkalmazsa

Baktriumok fehrje-profilja gl-elektroforzissel

molekulasly szerinti elvlasztsfolyamatos detektls fluoreszcens festk alkalmazsvaltbb minta egyms utni elvlasztsa gyorsansszehasonlt kirtkels

Fehrje-profil analzisPseudomonas aeruginosa NIH Hungary 170000 trzs fehrje-profilja kapillris chip elektroforzissel molekulaszr polimer oldaton keresztl vasat tartalmaz s vasat nem tartalmaz tptalajon val tenyszts utn

sszehasonlt analzisek standardizlt krlmnyek kzttIgG mintk s standard fehrjekeverkek (teljes analzisid: 30 perc)

Gl-kp konverziA szmtgp ltal konvertlt kp / a standard fehrjk azonos pozciban!

Baktriumok fehrje-profilja

Sejt-analzis chip-en

CE - MSElectro-spray ionization