Download - Kapilláris elektroforézis Mikro-elektromigrációs technikák a laboratóriumi diagnosztikában
-
Kapillris elektroforzisMikro-elektromigrcis technikk a laboratriumi diagnosztikbanFehrje-diagnosztika - tanfolyam
-
Elvlasztstechnika
Kromatogrfia (1903)
(Ultra)centrifugls (1908 / 1926) Theodor Svedberg
Elektroforzis (1930 / 1948) Arne Tiselius
Tmegspektrometria (1897)
-
Tiselius elektroforzis kszlke
-
Glelektroforzis (urea jelenltben)
Vasmentes s vassal teltett transferrin mintk. 6%T, 3%C; 100 V, 8C. Futtatsi id 17 ra.
-
Znaelektroforzis kapillrisban urea jelenltben------------
-
A kapillris elektroforzis kezdete
Stellan Hjertn (1958) - free zone electrophoresis 1-3 mm kvarccs
Franz Everaerts (1970-es vek eleje) ITP (Kendall, 1923!)Rauno Virtanen (1974) - potenciometrikus detektls, ZEF.E.P. Mikkers (1979) - znaelektroforzis tefloncsbenJ. Jorgenson (1981) - znaelektroforzis, EOF !
-
Elektroforetikus rendszerHjertn, 1958
-
Free zone electrophoresis (Stellan Hjertn, 1967)
-
Az els kapillris elektroforzis kszlkStellan Hjertn, 1967
-
A vndorls sebessge elektromos trben
vsebessg mmozgkonysg, mobilits (mobility)Eelektromos trerUalkalmazott feszltsglaz elvlaszt rendszer (ellenllssal rendelkez) hossza
-
Elektromos mozgkonysg (mobility)Elektroforetikus vndorls idelis (hg) oldatokbanA vndorls a tlts/tmeg hnyadostl s a viszkozitstl fgg
-
Az elektroforzis kzege
oldat papr gl oldat1930 1950 1955 1967
-
A poliakrilamid mtrix elnyei
majdnem teljesen idelis, ramlsmentes kzeg felbont kpessge nagya diffzi cskkentettviszonylag les znkban trtnik a komponensek vndorlsa
-
A szabad oldatban trtn elektroforzis elnyket eredmnyez, de kvetkezmnyekkel jr
elektroendozmzis
-
Az elektromos kettsrteg az veg felletn
-
Ketts rteg
elektrdok felletn
kolloid rszecskk felletn
-
Az endozmtikus ramls mozgkonysgaa vkuum dielektromos llandjaaz oldszer dielektromos llandjaviszkozitszta potencil
-
Elektroendozmtikus ramls (endosmotic flow)
-
Az ramlsi profil hatsa a zna-szlessgre A kialakul folyadkram dugszer profilt mutat.
-
Az endozmzis fggse a pH-tl
-
Kationok s anionok vndorlsa elektroozmzis jelenltben [cm2 V-1 s-1] (1 Tiselius egysg = 10-5 cm2V-1s-1)
-
Zna-elektroforzis elektroozmzis jelenltben
-
Pozitv, semleges s negatv komponensek elektroforziseBenziltrimetilammnium kloridot (1), benzil-alkoholt (2), acetilszaliciltot (3), 4-hidroxibenzotot (4) s benzotot (5) tartalmaz mintaoldat elektroferogramja
(Krlmnyek: kapillris: 57 cm x 75 m, trerssg: 263 V/cm, T=25C, =200 nm, puffer: 50 mM foszft, pH=7,0.)
-
Fedett kapillrisban a glelektroforzishez hasonl krlmnyek
Coated capillary
MetilcellulzNem keresztkttt poliakrilamidSznhidrtokAZ EREDMNY nincs elektroendozmzis !
-
A kapillris elektroforzis gyakorlataAutomatizlhatA kapillrist kondcionlni kell/lehetKapillris bevonat alkalmazhat (coating)Mintabevitel tbbfle mdon lehetsgesA tpegysg detektorhoz kzel es plusa fldeltVltozatos futtatsi krlmnyek (krnyezeti paramterek)puffer-adalkokTbbfajta elvlasztsi elven mkd rendszerVltozatos detektlsi mdszerek (egy ponton, teljes hosszban)Kirtkels, kalibrci
-
A kapillris elektroforzis kszlk2-100 mm fused silica kapillrislland hmrsklet (0 - 60 C)UV detektorNagyfeszltsg tpegysg0-30 kVMinta s elektrolit-tartlyok
-
Kapillris elektroforzis (1995)
-
Chip-kapillris elektroforzis kszlk (2005)
-
Kvarc-kapillris s mikrochip
furat
15 m
poliimid
borts
75 m
365 m
kvarc
-
A detektlsi mdszerek rzkenysgeDirekt mdszerek
UV-lthat fnyelnyels10-13-10-16 molFluoreszcencia10-15-10-17 molLzer-induklt fluoreszcencia (LIF)10-18-10-20 molAmperometria10-18-10-19 molVezetkpessg10-15-10-16 molTmegspektrometria10-16-10-17 mol
-
Az elektroforzis mdszereiOsztlyozs az elvlaszts elve alapjn
-
Az elektroforetikus elvlaszts fajti (1)Zna elektroforzis (ZE - CZE)
Izoelektromos fkuszls (IEF - CIEF)
Izotachoforzis (ITP - CITP)
Glelektroforzis (PAGE - CGE)
A vndorl komponensek tlts/tmeg (z/m) arnya alapjn
Az amfoter tulajdonsg komponensek izoelektromos pontja (pI) alapjn elre megformlt pH gradiensben
A vndorl komponensek mobilitsa (m) alapjn
SDS jelenltben a molekulatmeg (m) alapjn
-
Az elektroforetikus elvlaszts fajti (2)Micellris elektrokinetikus kromatogrfia (MEKC)
Kapillris elektrokromatogrfia (CEC)
A vndorl komponensek micellris megoszlsa alapjn
Az elektroendozmzis jelenltben vndorl komponensek s akromatogrfis ll fzis klcsnhatsa alapjn
-
Zna elektroforzis (ZE - CZE) A vndorl komponensek tlts/tmeg (z/m) arnya alapjn trtn elvlaszts
Megfelel a nem-denaturl gl-elektroforzisnek
-
Zna-elektroforzis elektroozmzis jelenltben
-
Szrum-elektroforzisNorml szrum kapillris zna-elektroforzise s agarz-elektroforziseTeljes fehrje-tartalom 70.6 g/l, albumin-tartalom 42.7 g/l. Kisrleti krlmnyek: 40 cm50 m kapillris, 20 kV; 200 nm, 20 C.A minta higtsi arnya 1:50.
-
Liquor-elektroforzisNorml liquor kapillris zna-elektroforzise s agarz-elektroforziseTeljes fehrje-tartalom 0.42 g/l, albumin-tartalom 0.23 g/l.Kisrleti krlmnyek: 40 cm50 m kapillris, 25 kV; 200 nm, 20 C.A minta nem volt higtva.
-
Izoelektromos fkuszls (IEF - CIEF) Az amfoter tulajdonsg komponensek izoelektromos pontja (pI) alapjn, elre megformlt pH gradiensben trtn elvlaszts
-
pH gradiens formlsa amfolitokkal amfoter tulajdonsg szintetikus vegyletek keverke (> 4000 fle molekula klnbz izoelektromos ponttal) j pufferkapacits >0 vezetkpessg az izoelektromos pontnl
-
Izoelektromos fkuszls (isoelectric focusing)
-
Transzferrin-formk detektlsa280 nm-en a fehrjemennyisg detektlhat,
460 nm-en a vassal teltett fehrjemennyisg detektlhatAz egyes transzferrin izoformk izoelektromos pontja kztti klnbsg kisebb, mint 0.3 pH egysg
-
Hemoglobin formk analzise izoelektromos fkuszlssalnorml Hb mintaHb minta diabteszes betegtlHb varinsok
-
Izotachoforzis (ITP - CITP)A vndorl komponensek mobilitsa (m) alapjn trtn elvlaszts
-
Izotachoforzis (isotachophoresis)A vndorl komponensek a mobilitsuknak (m) megfelel sorrendben vndorolnak az elvlaszts utn (azonos sebessggel)mzr-ion < mC-komponens < mB-komponens < mA-komponens < mvezet-ion
-
Uraemis beteg szruma
izotachoforetikus koncentrls nlkl nem vizsglhatk a kros mennyisgben felgyleml savak
-
Micellris elektrokinetikus kromatogrfia (MEKC)A vndorl komponensek micellris megoszlsa alapjn, azaz a molekulk hidrofbicitsa alapjn trtn elvlaszts
-
Micellakpzds
A felletaktv anyagok egy bizonyos koncentrci-rtk felett micellkat kpeznek.
CMC - kritikus micella koncentrci (cSDS = 8 mM)
SDS - > a dodecil-szulft anionok micellkat kpeznek, amelyekben a polris oldszer fel helyezkednek el a szulft-anion csoportok, s a micella magjt az apolris, hidrofb lncok alkotjk
-
Micellar elektrokinetic chromatography (Shigeru Terabe, 1985)Micellkat tartalmaz elektrolitban a micellba belp hidrofb komponensek,hidrofbicitsuknak megfelelen rvidebb-hosszabb ideig a micellval egytt vndorolnak az elektromos trben.
-
Tltssel nem rendelkez anyagok elektroforetikus/elektrokinetikus analziseA dodecil-szulft micellk segtsgvel 14 mono- s diszaccharid elvlasztsa lehetsges nagy felbontssal, mennyisgi analzis cljra is.
A cukrok jellve voltak a detektlhatsg rdekben
-
Glelektroforzis (PAGE - CGE) Miutn a kapillrisban nem szksges hordoz mtrix, ezrt a glelektroforzist csak az n. denaturl formban alkalmazzuk molekulasly meghatrozsra, vagy DNS analzisre.Fehrjket SDS jelenltben a molekulatmeg (m) alapjn lehet elvlasztani a gl-prusokon val tvndorls akadlyozottsga miattNukleinsavakat / oligonukleotidokat is molekulamret szerint vlaszthatunk el
-
Glelektroforzis
Alkalmazott mtrixok s polimer hlzatokagarzkeresztkttt poliakrilamid glnem keresztkttt poliakrilamid kolloid oldatahidroxietil-cellulz (HEC)hidroxipropil metil-cellulz (HPMC)metil-cellulz (MC)polivinil-alkohol (PVA)dextrnpolietiln-glikol (PEG s polietiln-oxid (PEO)polivinilpirrolidon (PVP)
-
Agarz gl
-
Poliakrilamid gl
-
Lineris polimerek hasznlata elvlasztsra
-
Polimer hlzatokon keresztl trtn vndorls ugyangy akadlyozott, mint egy keresztkttt gl esetben, teht a molekula mrettl fgg
Polimer oldatok alkalmazsa automatizlhatv teszi a gl-elektroforzis
-
A dodecil-szulft lncok hatsa fehrjemolekulkra s klcsnhatsa a molekulkkalA fehrjemolekulk az SDS oldatban denaturldnak s egyttal a dodecilszulft lncok a polipeptidlnchoz egyenletes eloszlsban hozztapadnak.Ennek kvetkeztben a klnbz polipeptidlncok mobilitsa azonos lesz, mert egy ktszer olyan hossz polipeptidlnchoz ktszer annyi dodecilszulft lnc ktdik, gy a z/m azonos lesz!
MegjegyzsekA teljes denaturcihoz a diszulfidhidak felbontsa is szksges! Ezt reduklszerekkel lehet elrni.)A polipeptidlnc sajt tltst a nagy negatv tlts eltakarja!
-
Fehrje-molekulasly standardok polimer oldaton trtn elektroforziseFluoreszcens detektls a dodecilszulft lncokhoz ktd fluoreszcens festkkel
Bioanalyzer 2100 (Agilent)
-
Polinukleotid elektroforzisA nukleinsavak tlts/tmeg-arnya gyakorlatilag azonos!
Mobilitsuk szabad-oldatban azonos!
-
DNS lncok vndorlsa glszr hats esetn
-
Oligonukleotidok gl-elektroforzise
-
DNS szekvenls elektroforzisselMaxam-Gilbert mdszerSanger mdszerGTCGATCG..CTGGACTGT...
-
DNS szekvenls kapillris elektroforzissel (genomics)
a szekvencia kzvetlenl leolvashat az elektroferogram-sorozatrl a ngyfle szn jellssel, az egymsra vettett elektroferogramok kzvetlen informcit adnak
-
Kapillris elektrokromatogrfia (CEC)Az elektroendozmzis jelenltben vndorl komponensek s a kromatogrfis ll fzis klcsnhatsa alapjn trtn elvlaszts
-
Kapillris elektrokromatogrfia
-
Kapillris elektrokromatogrfiaA vndorlst a kapillris fal mentn, s az llfzison kialakul elektroendozmzis biztostja!
-
Kapillris elektrokromatogrfis ll fzisokAz ll fzist vagy betltjk a kapillrisba, vagy - in situ - a kapillrisban hozzuk ltre a monomer oldatok beinjektlsa utn.
A szelektivitst az ll fzishoz kttt ligandumokkal (pl. CD, fehrjk, stb.)lehet vltoztatni
-
Elektrokromatogram. Minta: cytochrome c tripszines emszts utn. Kisrleti krlmnyek: izokratikus elvlaszts 25 s 55 fokon. Oszlop: 75m i.d. fused silica kapillris, 30cm, mozg fzis: 40% acetonitrile, 50mM foszft puffer, pH 2.5; 230kV; 214 nm/UV detektls.
-
Alkalmazsok
-
Kapillris zna-elektroforzisszrum-elektroforzis / liquor / follikulus folyadkKapillris zna-elektroforzis adalkanyag jelenltbenkirlis elvlasztsok ciklodextrinekkelkirlis elvlaszts fehrjkkelaffinits elektroforzisIzoelektromos fkuszlsGl-elektroforzis fehrje-profil analzisbakterilis fehrjkkls membrn-fehrjkGl-elektroforzis chip-technikvalCell-sorter chip-technikval
-
Myeloma multiplex, sclerosis multiplex
-
Szrum-elektroforzis A mdszer rutin-technika, egyszerre tbb kapillrisban
-
MegaBace - 96 minta egyidben
-
MegaBace kapillrisok
-
Kirlis elvlaszts kapillris elektroforzisselCiklodextrin befogad gyrvel a vndorlsi sebessg megvltozik, az enantiomerek egymstl elvlnak
-
Enantiomerek elvlasztsaHexobarbitl enantiomerek elvlasztsa fedett s kezeletlen kapillrisban
-
CEC s HPLC ligand-kicserldsselD,L Phe elvlasztsa hidroxiprolin-szrmazk oszloponCECcontinuous bedHPLCCEC + nyomsElectrophoresis 21 (2000) 3141-3144
-
Triptofn-szrmazkok elvlasztsa zna-elektroforzisseltriptofn metil-szter TME, triptofn etil-szter TEEtriptofn butil-szter TBE
-
Kapillris elektroforzis transzferrin jelenltbenHttrelektrolit: 10 mM MES, pH 6fedett (coated) kapillrispI (Tf) = 6Vndorls elektromos trben egy fehrje znn keresztla transzferrin znanem vndorolmintaminta transzferrin
-
A triptofn-szterek kt-kt komponensre vlnak sztTranszferrin jelenltben az enantiomerek elektroforetikus vndorlsa klnbzik egymstl, amely specifikus klcsnhatsra utal
-
Az elvlaszts mrtke fgg a transzferrin zna hossztlZnahossz
-
Labetalol optikai izomerek elvlasztsamodellezssel a kthelyek feltrkpezhetk
-
Fehrjk s endotoxinok klcsnhatsaA lipopoliszaccharidok a fehrjkkel val klcsnhats alapjn lthatk.A klnbz komplexek jellemz elektroferogramot adnakendotoxinhemoglobinendotoxin hemoglobin komplex0 h2 h
-
Chip-ekProtein 200 Plus LabChipCell Fluorescence LabChip
-
A kapillris elektroforzis nagy kalandja
-
Injektls chip-en
-
Tbbszrs analzis, reakcik alkalmazsa
-
Baktriumok fehrje-profilja gl-elektroforzissel
molekulasly szerinti elvlasztsfolyamatos detektls fluoreszcens festk alkalmazsvaltbb minta egyms utni elvlasztsa gyorsansszehasonlt kirtkels
-
Fehrje-profil analzisPseudomonas aeruginosa NIH Hungary 170000 trzs fehrje-profilja kapillris chip elektroforzissel molekulaszr polimer oldaton keresztl vasat tartalmaz s vasat nem tartalmaz tptalajon val tenyszts utn
-
sszehasonlt analzisek standardizlt krlmnyek kzttIgG mintk s standard fehrjekeverkek (teljes analzisid: 30 perc)
-
Gl-kp konverziA szmtgp ltal konvertlt kp / a standard fehrjk azonos pozciban!
-
Baktriumok fehrje-profilja
-
Sejt-analzis chip-en
-
CE - MSElectro-spray ionization