janaina serra azul monteiro evangelistalivros01.livrosgratis.com.br/cp066119.pdf · professora dra....
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
JANAINA SERRA AZUL MONTEIRO EVANGELISTA
ESTUDO DE EFEITOS VASCULARES, RENAIS E CITOTÓXICOS DO
VENENO DA SERPENTE Crotalus durissus cascavella
Fortaleza
Março de 2008
Livros Grátis
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2
JANAINA SERRA AZUL MONTEIRO EVANGELISTA
Estudo de Efeitos Vasculares, Renais e Citotóxicos do Veneno da
Serpente Crotalus durissus cascavella
Tese de Doutorado submetida à
Coordenação do Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia
da Faculdade de Medicina da Universidade
Federal Ceará, como requisito para obtenção
do título de Doutor em Farmacologia.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes
Co-Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho
Fortaleza
Março de 2008
3
E92e Evangelista, Janaina Serra Azul Monteiro Estudo de Efeitos Vasculares, Renais e Citotóxicos
do Veneno da Serpente Crotalus durissus cascavella / Janaina Serra Azul Monteiro Evangelista. 2008.
xxxf. Orientador: Profª. Dra. Maria Elisabete Amaral de
Moraes. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do
Ceará. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Fortaleza, 2008.
1. Crotalus cascavella. 2. Peptídeo Natriurético. 3. Pressão Arterial. 4. Perfusão. 5. Rim. I. Moraes, Maria Elisabete Amaral de (Orient.). II. Título.
CDD 615.942
4
JANAINA SERRA AZUL MONTEIRO EVANGELISTA
Estudos de Efeitos Vasculares, Renais e Citotóxicos do Veneno da Serpente
Crotalus durissus cascavella
Aprovada em: 31/03/2008
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________________
Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes (Orientadora)
________________________________________________________
Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho (Co-Orientador)
________________________________________________________
Prof. Dr. Manassés Claudino Fonteles
________________________________________________________
Prof. Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento
_______________________________________________
Prof. Dra. Alice Maria Costa Martins
5
CHEIRO DE MULHERCHEIRO DE MULHERCHEIRO DE MULHERCHEIRO DE MULHER
a mulher
tem um cheiro
que nenhum perfume tem
não é cheiro de rosa
não é cheiro de mato
é um cheiro de fato
que muito se quer
é um cheiro todo seu
cheiro próprio
de mulher
ChicoChicoChicoChico MMMMonteiroonteiroonteiroonteiro
6
AGRADECIMENTOS
7
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
AOS MEUS PAIS
Professora Dra. Helena Serra Azul Monteiro, pelo exemplo de vida, guerreira em todas as situações, obrigada pela motivação e orientação que vai além do aspecto maternal, familiar e profissional.
Ao Mestre Dr. Francisco Monteiro (Chico Passeata), meu pai querido, obrigada por sempre me incentivar e vibrar com as minhas conquistas e me erguer das minhas derrotas.
AO MEU ESPOSO
Ao meu esposo João José, pelo respeito e compreensão nas horas de
angústia, obrigada por estar sempre presente e com as palavras mais certas e objetivas nos momentos mais precisos.
AO MEU FILHO
Ao meu filhote João Filho pela demonstração de uma Vida cheia de
energia, e que tudo na vida vale a pena ser vivido, peço desculpas pela ausência em momentos difíceis e importantes, pelas brigas incontidas e desnecessárias, mas às vezes necessárias, obrigada por você existir!
AO MEU IRMÃO
Ao Meu irmão Manuel Carlos, que com poucas palavras, mas com suas
atitudes me ajudou a valorizar cada momento da minha vida, mostrando que a vida vale a pena ser vivida.
À minha cunhada Sandra pela nova amizade e ao meu sobrinho Samuel pela sua existência.
ÀS MINHAS AVÓS
Às minhas queridas Avós Socorro e Margarida, duas estrelinhas muito
brilhantes do Céu sabem que estarão sempre presentes no meu coração e na minha lembrança, obrigada por estar olhando por mim e vibrando por mais esta nova conquista.
AOS MEUS SOGROS
Ao meu ex e eterno professor Dr. Sérgio Evangelista, pelo exemplo de
vida e um grande profissional apaixonado pela Veterinária.
A minha admirável sogra, sempre presente e prestativa nos momentos mais oportunos, pelo exemplo de bondade e generosidade.
8
À DRA. BETE
Professora Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes, pela orientação da Tese, obrigada pela paciência e disponibilidade sempre em me ajudar em todos os momentos, que transcende a atividade didática profissional.
AO DR. ODORICO
Ao professor Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho, pela co-orientação
da Tese e pela oportunidade que foi me dada para a realização de uma parte dos experimentos no Laboratório de Oncologia Experimental (LOE).
AGRADECIMENTOS
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, pelos ensinamentos a mim emitidos.
Aos professores doutores Manoel Odorico de Moraes Filho, Manassés
Claudino Fonteles, Nilberto Robson Falcão do Nascimento e Alice Maria Costa Martins, que prontamente aceitaram o convite para participarem da Banca Examinadora.
À Professora Dra. Alice Maria Costa Martins pela prestimosa
colaboração e apoio na elaboração dos papers e discussão dos resultados, e como exemplo de dedicação e perseverança na realização de seus trabalhos.
Ao Professor Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento, pelo apoio e
colaboração para a elaboração deste trabalho, e como exemplo de prestatividade.
À Professora Dra. Letícia Veras Costa Lotufo pela dedicação durante a realização dos experimentos de citotoxicidade.
À Professora Dra. Raquel Montenegro pela disponibilidade e apoio
durante a realização dos experimentos de citotoxicidade.
À Professora Dra. Adriana Wanderley de Pinho pessoa, pelo apoio e colaboração durante a elaboração da Tese e como exemplo de generosidade.
Ao Dr. Alexandre Havt Bindá pela colaboração prestimosa na
realização dos experimentos com a Biologia Molecular Renal.
Ao professor Dalgimar Beserra de Menezes pela honrosa ajuda nos experimentos histopatológicos, na interpretação dos resultados e colaboração na elaboração dos papers.
Ao professor Marcellus Henrique Loiola Ponte de Souza pela
colaboração e orientação nos experimentos de dosagem de Nitrito.
9
À professora Dra. Diva Maria Borges Nojosa pela prestimosa dedicação, exposição ao risco da extração dos venenos das serpentes.
À doutoranda Inez Liberato Evangelista, obrigada pela amizade
incondicional em momentos de alegria e tristeza.
À doutoranda Renata de Sousa Alves pelo prestimoso apoio na realização dos experimentos e pela disponibilidade em ajudar sempre que possível, tanto na parte técnica experimental, como na discussão e análise dos resultados renais.
Ao mestrando Antônio Rafael Coelho Jorge pelo apoio voluntário
durante a realização dos experimentos de perfusão renal.
Ao doutorando Daniel Freire pela ajuda necessária nas análises estatísticas dos resultados obtidos, sendo um exemplo de prestatividade.
À doutoranda Antoniella Souza Gomes, pela prestimosa colaboração
na realização dos experimentos de dosagem de nitrito.
Ao mestrando do Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas (UECE) Clauber Mota de Sousa, pela prestimosa ajuda na realização dos experimentos de anel de aorta.
Aos alunos de iniciação científica da UFC Antônio Gomes Neto (Tange)
e Diego Maia pela colaboração necessária e fundamental durante a obtenção do veneno e apoio na realização de experimentos de pressão arterial.
Aos meus primeiros orientandos de iniciação científica da UECE
Glayciane Bezerra de Morais (Nina) e João Alison de Moraes Silveira, que muito me ajudaram com pouco tempo de orientação, mostrando a afinidade e o amor pela ciência.
À aluna e eterna monitora de Histologia e Embriologia Roberta Jeane
Bezerra Jorge da Universidade de Fortaleza, obrigada por sempre estar disposta a ajudar e enfrentar novos desafios.
À aluna Paula Priscila Costa pela sua valiosa colaboração na
realização dos experimentos de pressão arterial.
À aluna de iniciação científica da UFC Arinice Costa pela colaboração durante os experimentos de citotoxicidade.
À Beatriz Helena Moreira Serra Azul pela ajuda na organização do
material e cópias necessária para a realização desta Tese.
À bibliotecária Norma de Carvalho Linhares pela competência na orientação das normas de citação das referências bibliográficas.
Ao Instituto de Biomedicina da Universidade Federal do Ceará.
10
A todos os professores, colaboradores, técnicos e alunos do Instituto de
Biomedicina da Universidade Federal do Ceará pelo profissionalismo no apoio à execução dos experimentos.
A toda a minha FAMÍLIA e AMIGOS, que estiveram presentes e
solidários na realização deste trabalho.
11
ÍNDICE
12
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO 31 1.1. OFIDISMO: Aspectos Gerais e Epidemiológicos 34 1.2. O GÊNERO Crotalus 40 1.3. FISIOLOGIA DA REGULAÇÃO DA PRESSÃO ARTERIAL 41 1.4. INCIDÊNCIA DO CÂNCER 55 2. JUSTIFICATIVA 60 3. OBJETIVOS 63 3.1. OBJETIVOS GERAIS 64 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 64 4. MATERIAL E MÉTODOS 65 4.1. OBTENÇÃO DO VENENO BRUTO E FRAÇÕES DA SERPENTE Crotalus durissus cascavella
66
4.1.1. Purificação e isolamento do Peptídeo Natriurético da Crotalus durissus cascavella
67
4.2. ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO 60 4.3. MODELO EXPERIMENTAL DE PRESSÃO ARTERIAL EM RATOS
69
4.3.1. Análise histológica após inoculação do veneno bruto no sistema de pressão arterial
71
4.3.2. Análises estatísticas 72 4.4. MODELO EXPERIMENTAL DE ANEL DE AORTA DE RATOS 72 4.5. DOSAGEM DE NITRITO – DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO
73
4.6. MODELO DE PERFUSÃO DE RIM ISOLADO 74 4.6.1. Substâncias e reagentes utilizadas nos experimentos com perfusão renal
74
4.6.1.1. Solução perfusora e seu preparo 74 4.6.2. O sistema de perfusão renal 75 4.6.2.1. Calibração e preparo do sistema de perfusão renal 77 4.6.3. Técnica cirúrgica para isolamento e canulação do rim 79 4.6.4. Protocolo experimental 81 4.6.5. Avaliação bioquímica de perfusatos e urinas 81 4.6.6. Análise histológica dos rins perfundidos 82 4.6.7. Cálculo dos parâmetros funcionais renais 82 4.6.8. Análises estatísticas 84 4.7. MODELO DE PERFUSÃO EM LEITO VASCULAR MESENTÉRICO
84
4.8. BIOLOGIA MOLECULAR 85 4.8.1. Isolamento de RNA total 85 4.8.2. Reação de RT- PCR 86 4.8.3. Eletroforese em gel de agarose 88 4.9. ENSAIOS CITOTÓXICOS COM O VENENO BRUTO DA C.d.cascavella (Cdcasca)
89
4.9.1. Estudo da citotoxicidade em células tumorais in vitro 89 4.9.2. Análise dos dados 91 4.9.3. Inibição da síntese de DNA 91 4.9.3.1 Análise dos dados após a inibição da síntese de DNA pela 92
13
Bromodeoxiuridina (BrDU) 4.9.4. Viabilidade celular por exclusão do Azul de Tripan 92 4.9.5. Análise Morfológica – Coloração por Hematoxilina-Eosina (HE)
93
4.9.5.1 Análise dos dados após a análise morfológica pela coloração por HE
93
4.9.6. Atividade antiproliferativa em Células Periféricas Mononucleares do Sangue – Ensaio do Alamar Blue
94
4.9.7. Citometria de Fluxo 95 4.9.7.1. Determinação da integridade da membrana celular 95 4.9.7.2. Fragmentação do DNA 95 4.9.7.3. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria
96
4.9.7.4. Análise dos dados obtidos no citômetro de fluxo 96 4.10. ASPECTOS ÉTICOS 96 5. RESULTADOS 97 5.1. RESULTADOS DOS EXPERIMENTOS REALIZADOS COM O VENENO BRUTO DA Crotalus durissus cascavella (Cdcasca)
98
5.1.1. MODELO EXPERIMENTAL DE PRESSÃO ARTERIAL EM RATOS
98
5.1.1.1. Efeitos do Veneno Bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) nas Freqüências Cardíaca, Respiratória e na Pressão Arterial Média.
98
5.1.1.2. Efeitos do Veneno Bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) após bloqueio farmacológico com o L-Name na Pressão Arterial Média
101
5.1.1.3 Dosagem de nitrito após experimentos de pressão arterial com o veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca)
102
5.1.2. ANÁLISE HISTOLÓGICA APÓS INOCULAÇÃO DO VENENO BRUTO DA C.d.cascavella (Cdcasca) NOS ENSAIOS DE PRESSÃO ARTERIAL
104
5.1.3. PERFUSÃO EM LEITO VASCULAR MESENTÉRICO 109 5.1.3.1. Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) em leito vascular mesentérico
109
5.1.4 ENSAIOS CITOTÓXICOS 110 5.1.4.1 Efeitos citotóxicos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) pelo Método do MTT (sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium)
110
5.1.4.2 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a Incorporação de Bromodeoxiuridina (BrDU) e Inibição da Síntese de DNA
112
5.1.4.3 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) em Células Periféricas Mononucleares do Sangue – Ensaio do Alamar Blue
113
5.1.4.4 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a Viabilidade celular por exclusão do Azul de Tripan
114
5.1.4.5 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a fragmentação do DNA detectada por Citometria de Fluxo
115
5.1.4.6 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre o Potencial Transmembrânico da Mitocôndria detectado
116
14
por Citometria de Fluxo 5.1.4.7 Métodos de análise dos resultados 116 5.2 RESULTADOS DOS EXPERIMENTOS REALIZADOS COM O PEPTÍDEO NATRIURÉTICO (NP) DA Crotalus durissus cascavella (NPcasca)
117
5.2.1 MODELO EXPERIMENTAL DE PRESSÃO ARTERIAL EM RATOS
117
5.2.1.1 Efeitos do Peptídeo Natriurético da Crotalus durissus cascavella (NPcasca) nas Freqüências Cardíaca, Respiratória e na Pressão Arterial Média
117
5.2.1.2 Dosagem de nitrito após experimentos de pressão arterial com o peptídeo natriurético (NP) da C.d.cascavella (NPcasca)
119
5.2.2 ANEL DE AORTA 120 5.2.2.1. Efeito do Peptídeo Natriurético da C.d.cascavella (Npcasca) em banho isolado de aorta de ratos
120
5.2.3. PERFUSÃO DE RIM ISOLADO COM O PEPTÍDEO NATRIURÉTICO DA C.d.cascavella (Npcasca)
122
5.2.3.1. Grupo Controle Perfundido 122 5.2.3.2. Efeitos renais do Peptídeo Natriurético isolado da Crotalus durissus cascavella (NPcasca)
122
5.2.3.3. Análise histológica dos rins perfundidos pelo Peptídeo Natriurético da C.d.cascavella (NPcasca)
126
5.2.4 BIOLOGIA MOLECULAR DOS RINS APÓS PERFUSÃO RENAL DO PEPTÍDEO NATRIURÉTICO DA C.d.cascavella (NPcasca)
127
5.3. RESUMO DE TODOS OS RESULTADOS OBTIDOS COM AS DIVERSAS METODOLOGIAS
133
6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS 134 6.1. DISCUSSÃO DOS EFEITOS VASCULARES DO VENENO BRUTO DA Crotalus durissus cascavella (Cdcasca)
135
6.2. PROVÁVEL MECANISMO DE AÇÃO DO VENENO BRUTO DA Crotalus durissus cascavella (Cdcasca) NO SISTEMA VASCULAR
139
6.3. DISCUSSÃO DAS ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS PROVOCADAS PELO VENENO BRUTO DA Crotalus durissuscascavella (Cdcasca)
140
6.4. DISCUSSÃO DOS EFEITOS CITOTÓXICOS DO VENENO BRUTO DA Crotalus durissus cascavella (Cdcasca) 141 6.5. PROVÁVEL MECANISMO DE AÇÃO DO VENENO BRUTO DA Crotalus durissus cascavella (Cdcasca) NA ATIVIDADE CITOTÓXICA
145
6.6. DISCUSSÃO DOS EFEITOS VASCULARES DO PEPTÍDEO NATRIURÉTICO ISOLADO DA Crotalus durissus cascavella (NPcasca)
146
6.7. DISCUSSÃO DOS EFEITOS RENAIS DO PEPTÍDEO NATRIURÉTICO ISOLADO DA Crotalus durissus cascavella (NPcasca)
148
6.8. PROVÁVEL MECANISMO DE AÇÃO DO PEPTÍDEO NATRIURÉTICO ISOLADO DA Crotalus durissus cascavella
151
15
(NPcasca) 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS 152 7.1. Ações do Veneno Bruto da Crotalus durissus cascavella 153 7.2. Ações do Peptídeo Natriurético isolado da Crotalus durissus cascavella
154
8. CONCLUSÕES 155 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 156 10. RELAÇÃO DE PUBLICAÇÕES 174
16
LISTA DE ABREVIATURAS
17
LISTA DE ABREVIATURAS
ANP Peptídeo Atrial Natriurético (Atrial Natriuretic Peptide) BK Bradicinina BPF Bradycinim potentiator factor BrDU Bromodeoxiuridina CaCl2 . 2H2O Carbonato de Cloreto CA Crotoxina CB Componente Básico da Crotoxina Cdc Crotalus durissus cascavella Cdcasca Crotalus durissus cascavella Cdcc Crotalus durissus cascavella – Ceará Cdcm Crotalus durissus cascavella – Maranhão Cdcol. Crotalus durissus collilineatus Cdm Crotalus durissus marajoensis Cdru Crotalus durissus ruruima Cdt Crotalus durissus terrificus Cdtg Crotalus durissus trigonicus CK Proteína quinase CI50 Concentração Inibitória Média capaz de provocar 50% do
efeito máximo CNCZAP Coordenação Nacional de Controle de Zoonose e Animais
Peçonhentos. CNF Carbon Nanofiber CTX Crotoxina. DAB Diaminobenzidina DEPC Dietil Pirocarbonato DEPC-TE Tris-HCl e EDTA e Dietil Pirocarbonato DMSO Dimethyl sulfoxide (Dimetil sulfóxido) DNFB 2-4-dinitrofluorbenzeno ECA Enzima conversora de angiotensina EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid (ácido etilenodiamino
tetracético) EtBr Brometo de Etídio FU Fluxo urinário GMPc Guanosina monofosfato cíclico HCT-8 Linhagem de tumor de cólon HL-60 Linhagem tumoral de leucemia HPLC High Performance Liquid Chromatography HSA Human serum albumin IL-1ββββ Interleucina-1β IFN-γγγγ Interferon gama i.p. Intraperitoneal KCl Cloreto de potássio LAFAVET Laboratório de Farmacologia de Venenos, Toxinas e
Lectinas. L-Name Nitro-L-arginine methyl Ester LOE Laboratório de Oncologia Experimental MDA-MB435 Linhagem de tumor de mama MgSO4 . 7H2O Sulfato de magnésio
18
MTT Sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium
NaCl Coreto de sódio NaHCO3 Bicarbonato de sódio NaH2PO4.H2O Fosfato de sódio monobásico NCI National Cancer Institute NO Nitric Oxide (Óxido Nítrico) NOS Nitric oxide synthase NPcasca Peptídeo Natriurético da Crotalus durissus cascavella ••••OH Radical Hidroxil PBS Phosphate Buffered Saline (Tampão Salina Fosfato) PCR Polymerase Chain Reaction (reação de polimerase em
cadeia) PE Phenylephrine PGE2 Prostaglandina E2 PGI2
Prostaglandina I2 PI Iodeto de Propídio PLA2 Fosfolipase A2 PP Pressão de perfusão RFG Ritmo de filtração glomerular RPMI Roswell Park Memorial Institute RVR Resistência vascular renal SESA-CE Secretaria de Saúde do Estado do Ceará SF-295 Linhagem de tumor de sistema nervoso SINAN Sistema de Informações de Agravos de Notificação SINITOX Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas TBS Tampão Tris TFA Ácido Trifluoroacético TFA Tampão Trifluoroacetato TNF-α Fator de necrose tumoral- α TXA2 Tromboxano A2 UNIFAC Unidade de Farmacologia Clínica %pTCl- Percentual de cloro tubular proximal transportado %pTK+ Percentual de potássio tubular proximal transportado %pTNa+ Percentual de sódio tubular proximal transportado %TCl- Percentual de cloro tubular total transportado %TK+ Percentual de potássio tubular total transportado %TNa+ Percentual de sódio tubular total transportado
19
LISTA DE FIGURAS
20
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Símbolo da Medicina Veterinária. 32
Figura 02 Micrografia de luz da glândula de Duvernoy ou de veneno. Sendo evidenciado o Epitélio de Revestimento do Ducto Excretor Principal (DE); Túbulos Secretores (TS). Método de Alcian Blue (pH 2,5); aumento 160x.
33
Figura 03 Distribuição dos acidentes ofídicos segundo o gênero da serpente peçonhenta no Brasil no período de 1998 a 2000.
35
Figura 04 Foto ilustrativa da espécie Crotalus durissus cascavella. 36
Figura 05 Fosseta Loreal. 37
Figura 06 Dentes Inoculadores de Veneno. 37
Figura 07 Diferenças entre as caudas dos animais da família Viperidae. 37
Figura 08 Ausência de Fosseta Loreal e dentes inoculadores de veneno pouco desenvolvidos.
38
Figura 09 Distinção entre serpentes peçonhentas e não-peçonhentas. 39
Figura 10 Fotografias de exemplares de Crotalus durissus cascavella. 41
Figura 11 Ptose Palpebral. 43
Figura 12 Urinas características de um quadro de mioglobinúria. 44
Figura 13 Tipos de Câncer mais incidentes, estimados para 2008, na população brasileira, sem pele não melanoma.
57
Figura 14 Serpente Crotalus durissus cascavella submetida a uma câmara de vidro contendo gelo seco, para diminuição do seu metabolismo e seus reflexos.
66
Figuras 15ª/b
a) Cromatografia em HPLC de exclusão molecular do veneno total; b) Cromatografia da fração VI em HPLC de fase reversa, identificando o peptídeo natriurético isolado.
68
Figuras 16ª/b
Espectrometria de massa MALD-TOFF do NP2_Casca; b) Seqüência completa de aminoácidos da proteína.
69
Figura 17 Técnica Cirúrgica dos experimentos de Pressão Arterial em ratos anestesiados.
71
Figura 18 Sistema de perfusão de rim isolado com recirculação. 76
Figura 19 Representação gráfica do sistema de perfusão de rim isolado com recirculação.
77
Figura 20 Valores registrados de pressão de perfusão (PP) durante a calibração do sistema.
78
Figura 21 Valores registrados pelo Fluxômetro (L/h) durante a calibração do sistema.
78
Figura 22 Valores registrados de volume urinário (mL/min) durante a calibração do sistema.
79
Figura 23
Procedimento cirúrgico para perfusão de rim isolado. 80
Figura 24
Desenho esquemático do sistema de perfusão de leito vascular mesentérico.
85
Figura 25 Figura esquemática do Método MTT. 91
21
Figura 26
Efeitos do Veneno Bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) na freqüência cardíaca (FC) (a) e freqüência respiratória (FR) (b) de ratos anestesiados.
99
Figura 27 Efeitos do Veneno Bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) na pressão arterial média (PAM) em ratos anestesiados.
100
Figura 28
Efeitos do Veneno Bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) na pressão arterial média (PAM) de ratos anestesiados após bloqueio farmacológico com o L-NAME.
101
Figura 29
Dosagem de nitrito (µmol) após a inoculação do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) nos grupos experimentais de pressão arterial de ratos anestesiados.
102
Figura 30
Dosagem de nitrito (µmol) após o bloqueio farmacológico com L-NAME (10mg/Kg i.p.) 30 minutos antes da inoculação do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) nos grupos experimentais de pressão arterial.
103
Figura 31 Fotomicrografia de rim de rato evidenciando o glomérulo renal, ao final do experimento de pressão arterial com veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca).
104
Figura 32
Fotomicrografia de rim de rato evidenciando os túbulos renais, ao final do experimento de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) (0,3µg/mL).
105
Figura 33
Fotomicrografia de rim de rato evidenciando vaso sangüíneo intersticial, ao final do experimento de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) (0,3µg/mL).
105
Figura 34
Fotomicrografia de pulmão de rato ao final do experimento de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca).
106
Figura 35
Fotomicrografia de pulmão de rato ao final do experimento de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca).
107
Figura 36
Fotomicrografia de coração de rato ao final do experimento de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca).
107
Figura 37
Fotomicrografia de fígado de rato ao final do experimento de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) (0,3µg/mL).
108
Figura 38
Fotomicrografia de fígado de rato ao final do experimento de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca).
108
Figura 39
Fotomicrografia de cérebro de rato ao final do experimento de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca).
109
Figura 40
Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) (10µg/mL/min) na pressão do leito vascular mesentérico em preparações com endotélio intacto.
110
Figura 41
Efeitos citotóxicos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) pelo Método do MTT (sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium) sobre a inibição de crescimento tumoral da linhagem HL-60 (Leucemia).
111
Figura 42 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a incorporação de Bromodeoxiuridina (BrDU) e inibição da síntese de DNA nas células HL-60 (Leucemia) em 24 horas de incubação.
113
Figura 43 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a viabilidade de células por exclusão do Azul de Tripan.
114
22
Figura 44 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a fragmentação do DNA avaliada por fluorescência nuclear usando Iodeto de Propídeo (PI), Triton X-100 e citrato detectada por citometria de fluxo.
115
Figura 45 Efeitos do Peptídeo Natriurético da C.d.cascavella (NPcasca) na freqüência cardíaca (FC) (a) e freqüência respiratória (FR).
118
Figura 46 Efeitos do Peptídeo Natriurético da C.d.cascavella (Npcasca) na pressão arterial média (PAM) em ratos anestesiados.
119
Figura 47 Dosagem de nitrito (µmol) após a inoculação do Peptídeo Natriurético da C.d.cascavella (Npcasca) nos grupos experimentais de pressão arterial.
120
Figura 48 Curva dose-concentração-resposta do Peptídeo Natriurético da C.d.cascavella (Npcasca) em anéis de aorta torácica na presença de endotélio intacto (e+) ou endotélio desnudo (e-) pré-contraídos com fenilefrina (PE;1 µM).
121
Figura 49 Efeitos do peptídeo natriurético isolado da C.d.cascavella (NPcasca) na pressão de perfusão (PP) (a) e resistência vascular renal (RVR) (b).
123
Figura 50 Efeitos do peptídeo natriurético isolado da C.d.cascavella (NPcasca) no fluxo urinário (FU) (a) e ritmo de filtração glomerular (RFG) (b).
124
Figura 51 Efeitos do peptídeo natriurético isolado da C.d.cascavella (NPcasca) no percentual de transporte total tubular de sódio (%TNa+) (a) e no percentual de transporte tubular proximal de sódio (%pTNa+) (b).
125
Figura 52 Fotomicrografia de rim de rato após a perfusão renal com o peptídeo natriurético da C.d.cascavella (NPcasca).
126
Figura 53 Fotomicrografia de rim de rato após a perfusão renal com o peptídeo natriurético da C.d.cascavella (NPcasca).
127
Figura 54 Expressão gênica da cadeia 18S do RNA ribossômico amplificada em reação de PCR de rins de ratos perfundidos controles ou após perfusão com Peptídeo Natriurético isolado da serpente Crotalus durissus cascavella (NPcasca).
128
Figura 55 Expressão gênica do Óxido Nítrico Sintase Induzida (iNOS) amplificada em reação de PCR de rins de ratos perfundidos (n=4) controles ou após perfusão com o Peptídeo Natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella (Cdcasca).
128
Figura 56 Expressão gênica do TNF alfa (TNFα) amplificada em reação de PCR de rins de ratos perfundidos controles ou após perfusão com fator natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella .
129
Figura 57 Expressão gênica do IL-1 beta (IL-1β) amplificada em reação de PCR de rins de ratos perfundidos controles ou após perfusão com fator natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella.
129
Figura 58 Expressão gênica da ciclooxigenase 2 (COX-2) amplificada em reação de PCR de rins de ratos perfundidos controles ou após perfusão com fator natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella.
130
Figura 59 Avaliação da expressão gênica relativa do óxido nítrico sintase induzida em rins perfundidos de ratos controles ou tratados com o fator natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella.
130
Figura 60 Avaliação da expressão gênica relativa do TNF alfa em rins perfundidos de ratos controles ou tratados com o fator natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella.
131
Figura 61 Avaliação da expressão gênica relativa da IL-1 beta em rins perfundidos 131
23
de ratos controles ou tratados com o fator natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella.
Figura 62 Avaliação da expressão gênica relativa da COX-2 em rins perfundidos de ratos controles (n=4) ou tratados com o fator natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella.
132
24
LISTA DE TABELAS E QUADROS
25
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabela 01
Sequência dos primers específicos utilizados na reação de
polimerase em cadeia.
87
Tabela 02 Valores de IC 50 e EC 50 (µg/mL) para Veneno Bruto (VB)
e PLA2 extraída da C. d. cascavella avaliando
respectivamente, pelos métodos MTT e atividade
hemolítica.
112
Quadro 01
Classificação quanto à gravidade e soroterapia
recomendada.
45
Quadro 02
Linhagens de células cultivadas em meio de cultura
cedidas pelo National Cancer Institue (NCI-EUA).
90
Quadro
sem
numeração
RESUMO DE TODOS OS RESULTADOS OBTIDOS COM
AS DIVERSAS METODOLOGIAS
133
26
RESUMO E ABSTRACT
RESUMO
27
RESUMO
As serpentes do gênero Crotalus estão representadas no Brasil por apenas uma
espécie, a Crotalus durissus, o envenenamento pela sub-espécie Crotalus durissus
cascavella conduz à alteração sistêmica, sendo responsável pela causa preliminar
de morte após o acidente ofídico. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos
farmacológicos do veneno da serpente Crotalus durissus cascavella – Ce (Cdcasca).
Neste trabalho estudou-se as ações do Cdcasca no sistema vascular, avaliando os
parâmetros fisiológicos da pressão arterial e analisando as alterações histológicas no
coração, pulmão, rim, cérebro e fígado retirados após os experimentos de pressão
arterial. A atividade citotóxica do Cdcasca foi avaliada em quatro linhas humanas de
células tumorais: leucemia, tumor de mama, tumor de cólon e tumor do sistema
nervoso. Realizou-se uma investigação do provável mecanismo de ação do Cdcasca
utilizando-se as metodologias de viabilidade celular por exclusão de Azul de Tripan,
inibição na síntese de DNA, atividade antiproliferativa de células mononucleares
(Alamar Blue). A integridade da membrana celular, fragmentação do DNA e a
alteração do potencial transmembrânico mitocondrial foram analisados por citometria
de fluxo. Investigou-se a ação do Peptídeo Natriurético (NPcasca) isolado do veneno
da Cdcasca nos sistemas de pressão arterial, anel de aorta e perfusão renal. Após a
perfusão renal, os rins foram submetidos à análise histológica e ao estudo da
biologia molecular. Todos os parâmetros estudados foram analisados pelo ANOVA e
Student t-test, com p<0,05. Observou-se que o Cdcasca no sistema vascular causou
uma diminuição significativa nas freqüências cardíaca e respiratória, bem como na
pressão arterial média, havendo um aumento na produção de óxido nítrico no
sangue dos animais tratados. Realizou-se o bloqueio farmacológico com L-Name e
os efeitos nas freqüências cardíaca e respiratória e na pressão arterial média foram
abolidos. O veneno bruto Cdcasca não apresentou efeitos no leito vascular arteriolar
mesentérico. O veneno bruto da Cdcasca foi fortemente citotóxico na linhagem
tumoral de leucemia, onde ocorreu uma diminuição na viabilidade celular, bem como
um aumento na fragmentação do DNA. O NPcasca diminuiu as freqüências cardíaca
e respiratória e pressão arterial média. Ocorreu um aumento na produção de nitrito
no sangue dos animais tratados. Nos experimentos de anel de aorta onde utilizou-se
o NPcasca, observou-se um relaxamento dependente de endotélio. O NPcasca
promoveu aumento significativo na pressão de e na resistência vascular renal. O
28
fluxo urinário e o ritmo de filtração glomerular também aumentaram
significativamente. As alterações histológicas dos rins perfundidos foram discretas,
comparando-as com as alterações observadas com o veneno total. Nos
experimentos com rim isolado não houve alteração de expressão gênica de
mediadores inflamatórios. Através destes resultados concluímos que algum
componente do veneno Cdcasca seja responsável pelo efeito hipotensor e
citotoxicidade em células tumorais. O NPcasca apresentou um efeito hipotensor e
aumentou a diurese e natriurese. Não houve alteração de expressão gênica de
mediadores inflamatórios no tecido renal.
Palavras-chave: Crotalus durissus cascavella; Peptídeo Natriurético; Pressão Arterial; Perfusão
Renal.
29
ABSTRACT
The snakes from the genus Crotalus in Brazil are represented by only one specie,
Crotalus durissus. The poisoning by a sub-specie Crotalus durissus cascavella leads
to systemic alterations, and is responsible for preliminary cause of death after the
ophidic accident. This study aimed to evaluate the pharmacological effects of the
snake venom Crotalus durissus cascavella - Ce (Cdcasca). This work looked at the
actions of Cdcasca on the vascular system, assessing the physiological parameters
of blood pressure and analyzing the histological changes in the heart, kidney, lung,
brain and liver removed after the trials of blood pressure. The cytotoxic activity of
Cdcasca was examined in four lines of human tumor cells: leukemia, breast tumor,
colon tumor and nervous system tumor. There was an investigation of the likely
mechanism of action of Cdcasca using the methods of viability cell by the exclusion of
Trypan Blue, inhibition in the synthesis of ADN, antiproliferative activity of
mononuclear cells (Alamar Blue). The integrity of the cell membrane, the ADN
fragmentation and alteration of the mitochondrial transmembranic potential were
analyzed by flow cytometry. It was Investigated the action of a Natriuretic Peptide
(NPcasca) isolated from the venom of Cdcasca on a blood pressure system, on aortic
rings assay and renal perfusion. After renal perfusion, the kidneys were subjected to
histological analysis and study of its molecular biology. All parameters studied were
analyzed by ANOVA and Student t-test, p <0.05. It was observed that the Cdcasca
on the vascular system caused a significant decrease in heart and respiratory rates,
and in the mean arterial pressure, with an increase in the production of nitric oxide in
the blood of treated animals. There was made a pharmacological blockade with L-
Name and the effects on heart and respiratory rates and mean arterial pressure were
abolished. The total venom Cdcasca did not produced effects on the arteriolar
mesenteric vascular bed. The whole venom Cdcasca was strongly cytotoxic on tumor
line for leukemia, where there was a decrease in cell viability, as well as an increase
in fragmentation of ADN. The NPcasca produced a decreased in heart and
respiratory rates, and in the mean arterial pressure, with an increase in the production
of nitric oxide in the blood of treated animals. In the experiments using NPcasca on
aortic rings, there was a vasorelaxation dependent on endothelium. The NPcasca
promoted a significant increase in perfusion pressure, and in renal vascular
resistance. The urinary flow and the glomerular filtration rate also increased
30
significantly. The perfused kidneys histological alterations were discrete, compared to
the changes observed by the total venom Cdcasca. In experiments with isolated
kidneys there was no change in gene expression of inflammatory mediators. Through
these results we conclude that any component of poison Cdcasca is responsible for
lowering effect and cytotoxicity in tumor cells. The NPcasca presented a hypotensive
effects and increased the diuresis and natriurese. There was no change in gene
expression of inflammatory mediators in kidney tissue.
Keywords: Crotalus durissus cascavella; Natriuretic Peptide; Mean Arterial Pressure; Renal
Perfusion.
31
INTRODUÇÃO
32
1. INTRODUÇÃO
As serpentes estão presentes no imaginário humano representando vários
significados e simbologias: monstro devorador, tentação, traição, magia, poder
divino, virilidade sexual, sabedoria. Aquela que mata, mas que também cura através
de suas virtudes médicas e farmacêuticas, daí a justificativa de sua utilização nos
símbolos médicos e farmacêuticos (SANTOS, 1995) (figura 01).
FIGURA 01: Símbolo da Medicina Veterinária.
Fonte: www.google.com.br/ www.amigapublica.com.br
As serpentes possuem grande importância na cadeia ecológica do Ecossistema, por
serem as principais controladoras do número de pequenos roedores que são os
responsáveis pela transmissão de algumas doenças perigosas ao homem e
considerados verdadeiros devastadores de plantações. Na área biomédica, as
pesquisas realizadas com os venenos por elas produzidos têm se intensificado, uma
vez que frações enzimáticas separadas a partir dos mesmos são usadas na
fabricação de remédios.
A família Viperidae apresenta grande especialização no crânio, com
extrema mobilidade da maxila e outros ossos. O veneno das serpentes é produzido
por duas glândulas especiais localizadas na cabeça, atrás e abaixo dos olhos, que
nada mais são que glândulas salivares modificadas, onde a saliva é a própria toxina.
Elas possuem reservas para vários botes seguidos, sendo que, uma vez totalmente
extraído o veneno ou secreção, as glândulas só voltarão a estar totalmente cheia
após duas semanas (SANTOS, 1995).
33
Com a evolução da dentição e cinética craniana, ocorreu,
simultaneamente, o desenvolvimento da glândula venenosa, provavelmente a partir
de estruturas salivares especializadas do lábio superior, como a glândula de
Duvernoy, e do músculo compressor da glândula, derivado da musculatura temporal
anterior. Esse processo certamente foi independente para Elapidae (subfamília
Elapinae – ex. Micrurus) e Viperidae (subfamília Crotalinae – ex. Bothrops, Crotalus
e Lachesis).
Na morfologia da glândula aparecem quatro regiões bem definidas: a
glândula principal, que constitui a parte secretora e ocupa toda a porção posterior; o
ducto primário; a glândula acessória e o ducto secundário (figura 02).
A glândula principal é formada por túbulos muito ramificados, compostos
pelo epitélio que produz veneno. Existem complexos de células produtoras de muco
e o veneno produzido é armazenado no lúmen de diversos ductos coletores,
posteriores as glândulas de muco, que parecem cumprir a função de válvulas.
A glândula venenosa mostra um lúmen amplo, para acúmulo do veneno,
compensando o aspecto das células secretoras, que têm poucos grânulos de
secreção. A glândula acessória está bem caracterizada. Assim, esta família mostra
um mecanismo de mordida muito mais eficiente, apesar de suas toxinas serem
pouco diferenciadas dos modelos ancestrais, o que evidencia pela semelhança
química de proteases e neurotoxinas pré-sinápticas de seus venenos, comparadas
às enzimas digestivas de origem pancreática, consideravelmente “antigas”.
FIGURA 02: Micrografia de luz da glândula de Duvernoy ou de veneno. Sendo
evidenciado o Epitélio de Revestimento do Ducto Excretor Principal (DE);
Túbulos Secretores (TS). Método de Alcian Blue (pH 2,5); aumento 160x.
Fonte: www.scielo.br
34
O veneno é produzido pelas serpentes como um complexo enzimático com
finalidades principalmente digestivas, além de seu efeito defensivo contra
predadores e outros animais que representem perigo. A capacidade do veneno está
associada às ações tóxicas que neutralizam e matam a presa durante a sua captura
(BÜCHERL, 1971).
Entre 90 e 95% do peso seco dos venenos ofídicos têm propriedade
protéica, e são estas proteínas as responsáveis por quase a totalidade dos efeitos
biológicos encontrados. Entre as inúmeras atividades exercidas pelos componentes
protéicos, destacamos a ação enzimática e a presença de toxinas protéicas
específicas. A natureza proteinácea desses venenos foi estabelecida em 1843 por
Lucien Bonaparte (BON, 1997).
Diversas espécies de serpentes, principalmente as Viperidae, apresentam
substâncias inibidoras de proteases e fosfolipases no soro sangüíneo, evitando
danos ao próprio organismo numa possível inoculação acidental.
1.1. OFIDISMO: ASPECTOS GERAIS E EPIDEMIOLÓGICOS
A ocorrência do acidente ofídico, de modo geral, relaciona-se a fatores
climáticos e a crescente atividade humana nos trabalhos do campo. Elas acabam
representando um sério problema de saúde pública pela freqüência com que
ocorrem e pela morbi-mortalidade que ocasionam (PINHO & PEREIRA, 2001;
INSTITUTO BUTANTAN, 1996; CUPO, et al., 1985; CARDOSO et al., 2003).
Existem no mundo aproximadamente 3.000 espécies de serpentes, das
quais 10 a 14% são consideradas peçonhentas. A Organização Mundial de Saúde
estima que, anualmente, ocorra no mundo 1.250.000 a 1.665.000 acidentes por
serpentes peçonhentas, resultando em 30.000 a 40.000 mortes (PINHO et al., 2000).
De acordo com os dados publicados pelo Ministério da Saúde, ocorrem no Brasil
aproximadamente 20.000 casos de acidentes ofídicos por ano (figura 03). No Ceará,
no ano de 2002, foram registrados 1003 casos de acidentes por serpentes
peçonhentas, sendo, portanto um problema de Saúde Pública (INSTITUTO
BUTANTAN, 1996; PUORTO, 1992).
35
A identificação do animal causador do acidente, principalmente através da
avaliação dos sintomas da vítima, é um procedimento importante na medida que
possibilita a dispensa imediata de maioria dos pacientes picados por serpentes não
peçonhentas e viabiliza o reconhecimento das espécies de importância médica
regional além de auxiliar na indicação do antiveneno a ser administrado (INSTITUTO
BUTANTAN, 1996).
Dentre as serpentes peçonhentas encontradas no Brasil e de interesse
clínico, existem as pertencentes à família Viperidae, subfamília Crotalinae, com os
gêneros Bothrops (conhecida popularmente como jararaca ou urutu), Crotalus
(vulgarmente chamada de cascavel ou maracambóia) e Lachesis (também
conhecida como surucucu); e as pertencentes à família Elapidae com subfamília
Elapinae representada pela espécie Micrurus - conhecida como coral verdadeira ou
boicorá (NOGUEIRA & SAKATE, 2004; JORGE & RIBEIRO, 1990 e 1992).
90,05%
0,40%1,40%7,70%
Bothrops
Micrurus
Crotalus
Lachesis
FIGURA 03: Distribuição dos acidentes ofídicos segundo o gênero da
serpente peçonhenta no Brasil no período de 1998 a 2000.
Fonte: BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Manual de diagnóstico
e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília, 2001.
A ocorrência do acidente ofídico é marcada por fatores climáticos e de
aumento da atividade humana nos trabalhos no campo. Na nossa região do semi-
árido nordestino, por exemplo, a grande maioria dos casos ocorre de Janeiro a
Junho, época que coincide com os meses chuvosos (BRASIL, 2001; DA SILVA, et
al, 2003).
36
A fauna Ofídica Brasileira de interesse médico está representada pelos
gêneros (BRASIL, 2001):
• Bothrops
• Crotalus (figura 04) Família Viperidae
• Lachesis
• Micrurus Família Elapidae
FIGURA 04: Foto ilustrativa da espécie Crotalus durissus cascavella.
Fonte: www.animalworld.com.br
A família Viperidae caracteriza-se por apresentar:
• Fosseta Loreal: órgão sensorial termorreceptor situado entre o olho
e a narina (figura 05);
• Dentes Inoculadores bem desenvolvidos e móveis situados na
porção anterior do maxilar (figura 06) (BRASIL, 2001).
37
FIGURA 05: Fosseta Loreal.
Fonte: www.unoescjba.edu.br
FIGURA 06: Dentes Inoculadores de Veneno.
Fonte: www.unoescjba.edu.br
A característica da cauda do animal distingue, dentro da família Viperidae,
os três gêneros (figura 07).
Bothrops Crotalus Lachesis
FIGURA 07: Diferenças entre as caudas dos animais da família Viperidae.
Fonte: www.unoescjba.edu.br
38
A família Elapidae caracteriza-se por:
• Fosseta Loreal ausente e dentes Inoculadores pouco desenvolvidos
e fixos na porção anterior da boca (figura 08).
FIGURA 08: Ausência de Fosseta Loreal e dentes inoculadores de veneno
pouco desenvolvidos.
Fonte: www.unoescjba.edu.br
O reconhecimento das serpentes venenosas (segundo gênero), e até
mesmo a diferenciação básica entre serpentes peçonhentas e não-peçonhentas,
pode ser facilitado quando da utilização do esquema abaixo (figura 09):
39
FIGURA 09: Distinção entre serpentes peçonhentas e não-peçonhentas.
* As falsas corais podem apresentar o mesmo padrão de coloração das corais
verdadeiras, sendo distinguíveis pela ausência de dente inoculador.
**Na Amazônia, ocorrem corais verdadeiras desprovidas de anéis vermelhos.
Fonte: BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Manual de diagnóstico
e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília, 2001.
Segundo a FUNASA – Fundação Nacional de Saúde – (BRASIL, 2001) no
Brasil entre os anos de 1990 e 1993 foram notificados 81.611 casos de acidentes
ofídicos dentre os quais 6,2% (5.072) a serpente envolvida foi do gênero Crotalus
tendo ocorrido 95 óbitos, o maior índice encontrado.
No Ceará, entre os anos de 1992 e 1995 foram registrados 688 casos de
acidentes ofídicos, com 5 óbitos. Considerando-se os acidentes nos quais as
40
serpentes envolvidas foram identificadas, 469 casos, o gênero Crotalus foi o
responsável por 10,7% (50) dos acidentes, sendo também o responsável por 60%
dos óbitos (FEITOSA et al., 1997).
1.2. O GÊNERO Crotalus
O gênero Crotalus agrupa várias sub-espécies, porém todas pertencentes
à espécie Crotalus durissus, são conhecidos popularmente por cascavel, cascavel-
de-quatro-ventas, boicininga, boiçununga, boiquira, maracambóia, maracá dentre
outras (CUPO et al., 1988; BRASIL, 1998).
São características de áreas secas, arenosas e pedregosas, sendo
facilmente encontradas em campos abertos. Não ocorrem em florestas e no
Pantanal. Habitualmente não costumam atacar e, quando excitadas, denunciam sua
presença pelo ruído característico de seu guizo ou chocalho (JORGE & RIBEIRO,
1990; BRASIL, 1998).
No Brasil, a espécie Crotalus durissus distribui-se em cinco sub-espécies
(PINHO & PEREIRA, 2001):
• Crotalus durissus cascavella (encontrada nas áreas da Caatinga
do Nordeste, é uma serpente que ultrapassa 1,60 m de comprimento) (figura
10);
• Crotalus durissus terrificus (podem ser encontradas nas zonas
altas e secas da região Sul Oriental e Meridional);
• Crotalus durissus collilineatus (distribuídas nas áreas secas da
região Centro-Oeste, Minas Gerais e Norte de São Paulo);
• Crotalus durissus ruruima (observada na região Norte do país);
• Crotalus durissus marajoensis (observada na Ilha de Marajó).
A Crotalus durissus cascavella (figura 10) é uma serpente terrícola, de
hábitos predominantemente crepuscular e noturno, característica de clima quente e
seco. Alimenta-se principalmente de roedores, podendo atingir um comprimento
máximo de 1,50m. Possui dentição solenóglifa (Soleno=móvel), ou seja, dentes
móveis semelhantes a uma agulha de injeção que no momento do bote são
projetados para frente injetando veneno (GRANTSAU, 1991).
41
FIGURA 10: Fotografias de exemplares de Crotalus durissus cascavella.
Fonte: www.animalworld.com.br
A peçonha crotálica apresenta-se como um complexo tóxico-enzimático.
Podemos encontrar as enzimas fosfodiesterase, L-amino oxidase, 5-nucleotidase e
toxinas como a crotoxina, crotamina, convulxina, e giroxina (BARRAVIERA, 1991).
A crotoxina é o componente responsável pela alta toxicidade do veneno. È
uma neurotoxina pré-sináptica que atua nas terminações nervosas motoras inibindo
a liberação de acetilcolina pelos impulsos nervosos, principal fator responsável pelo
bloqueio neuromuscular e, portanto pelas paralisias motoras e respiratórias
observadas nos animais. Constituída por duas subunidades sendo uma de caráter
ácido, a crotapotina, e a outra de caráter básico, a fosfolipase A2. Sua toxicidade
está associada a sua porção ácida, enquanto que sua porção básica fosfolipásica
desempenha uma ação protetora uma vez que impede a ligação da crotoxina em
sítios de ação não específicos (MARTINS et al., 1998; MARTINS et al., 2002).
A crotamina é um peptídeo que atua na membrana das fibras musculares
alterando sua permeabilidade ao sódio, produzindo espasmos musculares em alguns
42
animais. É pouco tóxica e sua intoxicação pode ser considerada uma miotonia
experimental (MONTECUCCO & ROSSETTO, 2000).
A giroxina também é um peptídeo encontrado no veneno da serpente
Crotalus durissus terrificus com atividade mionecrótica e tipo-trombina. Produz
síndrome convulsiva em camundongos (BEGHINI et al.,2004).
A convulxina por sua vez é um glicopeptídeo de 72 kDa, isolado do veneno
da serpente Crotalus durissus cascavella, composto por uma cadeia 3α (13,9 kDa) e
uma cadeia 3β (12,6 kDa) que são unidas por pontes dissulfeto formando o
complexo heterodimérico α3 β3. A convulxina é um potente indutor da ativação
plaquetária e apresenta uma alta afinidade por plaquetas humanas (MARTINS et al.,
2002).
O Envenenamento Crotálico caracteriza-se por três ações principais:
I - NEUROTOXICIDADE: ocasionada principalmente pela fração crotoxina
que corresponde a uma neurotoxina de ação pré-sináptica, e atua nas terminações
nervosas inibindo a liberação de acetilcolina (Ach). Esta inibição é o principal fator
causador do bloqueio neuromuscular do qual resultam as paralisias motoras e
respiratórias apresentadas pelos pacientes (JORGE & RIBEIRO, 1990).
II - MIOTOXICIDADE: são produzidas lesões nas fibras musculares
estriadas esqueléticas (rabdomiólise) que geram a liberação de enzimas e
mioglobina para o soro do paciente que são posteriormente excretadas na urina.
Referências experimentais especificam a ação miotóxica do veneno como decorrente
das frações crotoxina e crotamina (MAGALHÃES et al., 1986).
III - AÇÃO COAGULANTE: decorrente da atividade do tipo trombina que
converte o fibrinogênio em fibrina de forma direta. O fibrinogênio acaba sendo
consumido rapidamente podendo levar a um quadro posterior de incoagulabilidade
sangüínea e manifestações hemorrágicas (geralmente discretas). Não se observa
redução do número de plaquetas (AMARAL et al., 1988).
As principais manifestações clínicas observadas nesse tipo de acidente
podem ser divididas em locais e sistêmicas:
LOCAIS
As manifestações são pouco importantes, não há dor, ou está é de
pequena intensidade. Observa-se parestesias local ou regional, que persistem por
43
tempo variável podendo ser acompanhada de edema discreto ou eritema no ponto
da picada (KUROKOWA & HONDA, 1983).
SISTÊMICAS
Gerais: precocemente podem ser observados sintomas como prostração,
mal-estar, náuseas, vômitos, sudorese, sonolência ou inquietação e sensação de
boca seca (xerostomia) (BRASIL, 1998; BRASIL, 2001).
Neurológicas: podem ser observadas já nas primeiras horas e melhoram a
partir do segundo dia posterior ao acidente. Caracterizam o “Faces Miastênica”
(Faces Neurotóxica de Rosenfeld) evidenciadas por ptose palpebral uni ou bilateral -
figura 11), flacidez da musculatura da face, alterações do diâmetro pupilar (midríase
lateral semiparalítica), incapacidade de movimentação do globo ocular
(oftalmoplegia), visão turva e/ou dupla (sintomas indicativos do comprometimento do
III, IV e VI pares cranianos). Também pode se instalar um quadro de paralisia
veloplatina, com dificuldade de deglutição, diminuição do reflexo do vômito, alteração
do paladar e olfato (KUROKOWA & HONDA, 1983; CUPO et al., 1988;
BARRAVIERA, 1990; BRASIL, 2001).
FIGURA 11: Ptose Palpebral.
Fonte: www.animalworld.com.br
Musculares: mialgias acompanhadas de discreto edema muscular, a fibra
muscular esquelética lesada libera quantidades variáveis de mioglobina que é
excretada pela urina caracterizando um quadro de mioglobinúria (figura 12 e quadro
01) que por sua vez constitui a manifestação clínica mais evidente da necrose da
musculatura esquelética (rabdomiólise) (AZEVEDO-MARQUES, 1985).
44
FIGURA 12: Urinas características de um quadro de mioglobinúria (1°, 2° e 3°
frasco da esquerda para direita) comparadas com uma urina normal (4° frasco
da esquerda para direita).
Fonte: www.google.com.br/ www.animalworld.com.br
Alterações da coagulação: pode haver incoagulabilidade sangüínea ou
aumento do tempo de coagulação (TC), porém são raros os sangramentos e
geralmente restritos às gengivas (gengivorragia) (AMARAL et al., 1988).
45
QUADRO 01: Classificação quanto à gravidade e soroterapia recomendada.
Manifestações
e
Tratamento
Classificação (Avaliação Inicial)
LEVE MODERADA GRAVE
Faces miastênica /
Visão turva ausente ou tardia
discreta ou
evidente evidente
Mialgia ausente ou discreta discreta intensa
Urina vermelha ou
marrom ausente
pouco evidente ou
ausente presente
Oligúria / Anúria ausente ausente presente ou
ausente
Tempo de
Coagulação
(TC)
normal ou alterado normal ou alterado normal ou
alterado
Soroterapia
(n° de ampolas)
SAC* / SABC**
05 10 20
Via de administração INTRAVENOSA
*SAC: Soro anticrotálico / ** SABC: Soro antibotrópico-crotálico.
Fonte: BRASIL. Ministério da Saúde. Fundação Nacional de Saúde. Manual de diagnóstico
e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília, 2001.
A maioria dos venenos exerce seus efeitos em quase todas as células e
tecidos; e suas propriedades farmacológicas são determinadas pela quantidade de
um constituinte específico e biologicamente ativo que se acumula num sítio de
reconhecimento onde é capaz de produzir injúria (CUMMINGS et al., 2000; RUSSEL
et al., 1996). Além disso, em acidentes ofídicos ocorrem reações inflamatórias
intensas com a liberação de muitos mediadores inflamatórios como as
prostaglandinas, as citocinas, a bradicinina, as frações do complemento e o fator de
agregação plaquetária (BARRAVIERA et al., 1995; PETRICEVICH, 2004).
46
Os venenos de serpentes peçonhentas apresentam uma infinidade de
substâncias com estruturas simples e complexas, cuja proporção e características
específicas variam entre as espécies (VARANDA & GIANNINI, 1994). Entre 90 e
95% do peso seco dos venenos ofídicos têm propriedade protéica, e são estas
proteínas as responsáveis por quase a totalidade dos efeitos biológicos encontrados.
Os componentes não protéicos dos venenos podem ser orgânicos ou
inorgânicos. Os constituintes inorgânicos conhecidos são cálcio, cobre, ferro,
potássio, magnésio, manganês, sódio, fósforo, cobalto e zinco (SANTORO et al.,
1999). Porém, nem todos são encontrados em todos os venenos e a quantidade
também varia para cada espécie. O papel biológico de cada um desses constituintes
inorgânicos não está claro. Alguns estudos sugerem que o cálcio, magnésio e
manganês são importantes para a estabilização de certas proteínas, enquanto que
outros, em particular, zinco, cobre, ferro e cobalto possivelmente atuam nos
mecanismos catalíticos de certos componentes enzimáticos como metaloproteases
(BJARNASON & FOX, 1994; PONCE-SOTO et al., 2002).
Entre os componentes orgânicos não protéicos encontramos aminoácidos
livres e pequenos peptídeos, carboidratos, lipídios, principalmente fosfolipídios e
aminas biogênicas (VARANDA & GIANNINI, 1994; AIRD, 2002). Entre as inúmeras
atividades exercidas pelos componentes protéicos, destacam-se a ação enzimática e
a presença de toxinas protéicas específicas.
Algumas enzimas são encontradas em todas as espécies, como a
fosfolipase A2 (BON, 2000). A atividade fosfolipásica é amplamente encontrada nos
venenos crotálicos (VALENTIM & LAMBEAU, 2000). As fosfolipases A2 (PLA2)
catalisam a hidrólise da ligação éster da posição sn-2 dos fosfolipídios de membrana
produzindo ácidos graxos e lisofosfolipídios (CHACUR et al., 2003). Elas estão entre
os componentes de venenos mais estudados, sendo a abundância e sua fácil
purificação algumas das razões apontadas para o interesse nesse componente
(VALENTIN & LAMBEAU, 2000).
Existem vários tipos de PLA2 que são classificadas de acordo com sua
localização nas células e com suas estruturas primárias (FORTE-DIAS et al., 1999;
LANDUCCI et al., 2000). As PLA2 citosólicas (PLA2c) e as secretórias (PLA2s); sendo
as primeiras intracelulares e de alto peso molecular (31-110kDa), enquanto as
segundas são extracelulares e de baixo peso molecular (14-18kDa) (FORTE-DIAS et
al., 1999). Até o ano de 2001, cerca de 199 fosfolipases A2 secretórias foram
47
identificadas e classificadas de acordo com suas estruturas primárias (DUNN &
BROADY, 2001). Além de serem encontradas em venenos de serpentes, as PLA2
secretórias ocorrem em uma grande variedade de fluidos biológicos como secreções
pancreáticas, exsudatos inflamatórios e venenos de artrópodes e de moluscos
(CHACUR et al., 2003).
Além da ação hemolítica, enzimas com atividade de PLA2 também
apresentam ações neurotóxicas pré-sinápticas e miotóxica, dando origem a necroses
e mioglobinúria (RANGEL-SANTOS et al., 2004; SANO-MARTINS, et al., 2001).
As enzimas trombina-símile ou tipo trombina estão presentes em um
número variado de espécies das subfamílias Crotalinae e Viperinae. Apresentam
ação coagulativa por atuarem no fibrinogênio, transformando-o em fibrina.
Diferentemente, essas enzimas liberam preferencialmente o fibrinopeptídeo A ou B,
enquanto a trombina sérica libera ambos. Isso caracteriza a formação de um
complexo de fibrina facilmente degradado por plasmina, gerando, assim, um quadro
de incoagulabilidade sanguínea por consumo de fibrinogênio (SANO-MARTINS, et
al., 2001).
Neurotoxinas são as toxinas mais amplamente estudadas sendo os
constituintes mais tóxicos dos venenos ofídicos. São divididas, de acordo com o sítio
de atuação, em pós-sinápticas e pré-sinápticas (MONTECUCCO & ROSSETTO,
2000; RANGEL-SANTOS et al., 2004).
As neurotoxinas pós-sinápticas mimetizam a ação do curare. Elas se ligam
aos receptores colinérgicos sem provocar despolarização, inibindo a transmissão
neuromuscular. Ocorrem nas serpentes da família Elapidae (RANGEL-SANTOS et
al., 2004). As toxinas pré-sinápticas agem possivelmente inibindo o influxo de cálcio,
evitando assim a liberação de acetilcolina. Têm letalidade maior que as toxinas pós-
sinápticas, são estruturalmente relacionadas com a PLA2 e podem agir como toxinas
mionecróticas. Foram encontradas também em serpentes da subfamília Crotalinae
como, por exemplo, a crotoxina, isolada da serpente Sul Americana Crotalus
durissus terrificus (LOMONTE et al., 2003; RANGEL-SANTOS et al., 2004).
As cardiotoxinas, assim como o fator lítico direto e as cobraminas, são
denominações usadas para toxinas de membrana que causam a despolarização
persistente das membranas celulares, excitáveis ou não, acarretando distúrbios
celulares como hemólise e citotoxicidade. Só têm sido isoladas de venenos
48
elapídicos, e são responsabilizadas, em associação com fosfolipases, pelas lesões
locais como edema e necrose, nos acidentes com najas (LOMONTE et al., 2003).
Recentemente foi demonstrado que as subunidades da crotoxina, isolada
do veneno de Crotalus durissus collineatus, induziam um aumento na secreção de
insulina (NOGUEIRA et al., 2005). Os autores sugerem que esse aumento na
secreção de insulina pode estar relacionado à liberação de ácido araquidônico pela
fosfolipase A2 dentro das células B do pâncreas.
Apesar de a crotoxina apresentar um perfil eletroforético semelhante nas
subespécies Crotalus durissus cascavella, Crotalus durissus collilineatus e Crotalus
durissus terrificus, existem diferenças em suas atividades, talvez relacionadas à
existência de isoformas dessa proteína (RANGEL-SANTOS et al., 2004). Além de
serem encontradas em venenos de serpentes, as PLA2 secretórias ocorrem em uma
grande variedade de fluidos biológicos como secreções pancreáticas, exsudatos
inflamatórios e venenos de artrópodes e de moluscos (CHACUR et al., 2003).
O efeito miotóxico é causado pela crotamina, que apresenta atividade
sinérgica à da crotoxina. Ela é capaz de induzir a despolarização do potencial de
membrana das células musculares. Esta ação provavelmente é exercida sobre os
canais de sódio, pela indução do influxo deste cálcio (LOMONTE et al., 2003; VITAL
BRAZIL, 1993).
A convulxina é uma toxina de alto peso molecular, pertencente à família
das lectinas do tipo C. Ela causa convulsões, alterações respiratórias e circulatórias,
além de induzir a agregação plaquetária ao ligar-se ao receptor GPV1 das plaquetas
(LIMA et al. 2005). A giroxina é pouco conhecida. Prado-Franceschi (1990) sugere
que esta toxina produz uma síndrome convulsiva peculiar em camundongos,
caracterizada por movimentos rápidos de rotação do corpo em torno de seu eixo
longitudinal.
Dentre as complicações locais e/ou sistêmicas mais comuns após o
envenenamento ofídico encontramos a Insuficiência Renal Aguda (IRA). Os efeitos
renais provocados por envenenamento ofídico revelam uma via complexa. Vários
componentes tóxicos dos venenos podem agir direto ou indiretamente nas células
renais (MARTINS et al., 1998; MARTINS et al., 2003; SCHRIER et al., 2004; ).
Nos últimos 50 anos, ocorreram avanços significativos no entendimento da
patogênese da IRA nefrotóxica e da IRA isquêmica, principalmente através de
49
modelos experimentais, no entanto, ocorreram poucas mudanças em termos de
mortalidade (SCHRIER et al., 2004).
Diversas alterações renais já foram descritas como decorrência do
envenenamento ofídico. Entre elas podemos citar glomerulonefrite, arterite e necrose
tubular, glomerulite e nefrite intersticial, arterite e necrose tubular, necrose cortical e
insuficiência renal (BOER-LIMA et al., 2002; SITPRIJA & BOONPUCKNAVIG, 1979;
RAAB & KAISER, 1966; SANT & PUNDARE, 1972; VARAGUNAM & PENABOKKE,
1970; BOER-LIMA et al., 1999; SCHRIER et al., 2004). Foram descritas ainda a
ocorrência de hematúria, mioglobinúria, hemoglobinúria e proteinúria (SANO-
MARTINS et al., 2001).
A Insuficiência Renal Aguda (IRA) descrita por vários autores (AIRD, 2002;
RIBEIRO et al., 1998) é a causa principal de mortes nos acidentes ofídicos mesmo
após o tratamento com soro antiofídico. O tratamento com soro não previne o
surgimento de insuficiência renal embora ele melhore o estado geral dos pacientes
(SITPRIJA & CHAIYABUT, 1999).
A IRA ocorre secundariamente aos processos de glomerulonefrite aguda,
necrose tubular aguda e necrose cortical renal (SCHRIER et al., 2004). Contudo a
sua patogênese não está totalmente esclarecida.
Os venenos ofídicos causam em nível glomerular uma proliferação do endotélio e
células mesangiais, com deposição de fibrina e crescimento epitelial ocasional, sem
provocar alterações na membrana basal (CRUZ-HÖFLING, et al., 2001). Três teorias
foram propostas para explicar a patogênese da lesão glomerular. A presença de um
componente irritante, a deposição de fibrina decorrente do processo de coagulação
intravascular ou uma reação imunológica (CRUZ-HÖFLING et al., 2001).
As alterações renais induzidas por venenos ofídicos foram estudadas por
diversos pesquisadores. Monteiro e Fonteles (1999), estudando o veneno de
Bothrops jararaca em rim isolado de rato, observaram que ele diminuía o fluxo
urinário, a pressão de perfusão, o ritmo de filtração glomerular e o transporte tubular
de sódio e de potássio.
Havt e colaboradores (2001) demonstraram que o veneno de Bothrops
jararacussu diminuía a pressão de perfusão, a resistência vascular renal e o
transporte de sódio e de potássio, produzia um aumento no ritmo de filtração
glomerular e no fluxo urinário, nos últimos 30 minutos de cada experimento. O
veneno de Bothrops moojeni apresentou efeitos semelhantes aos da de Bothrops
50
jararacussu em estudo também realizado em rim isolado de rato (BARBOSA et al.,
2002). Esse mesmo grupo de pesquisa, ao investigar os efeitos renais do veneno de
Bothrops jararaca, demonstrou que o fator de agregação plaquetária tem
participação na mediação da necrose tubular induzida pelo veneno (MONTEIRO &
FONTELES, 1999).
Inúmeras atividades inflamatórias têm sido descritas para as PLA2 de
venenos como indução de edema, recrutamento de células inflamatórias,
desgranulação de mastócitos entre outras (CHACUR et al., 2003).
Grandes avanços nas pesquisas com toxinas e enzimas ofídicas
desenvolveram-se nos últimos trinta anos com o advento das análises da estrutura
bioquímica, principalmente dos venenos elapídicos, em consequência de sua maior
letalidade. Contudo, novas descobertas como das toxinas das cascavéis americanas
e hipotensinas dos venenos botrópicos geraram grande interesse para os estudos
com a família Viperidae.
1.3. FISIOLOGIA DA REGULAÇÃO DA PRESSÃO ARTERIAL
O desenvolvimento e a manutenção de um nível de pressão arterial
adequado à perfusão dos tecidos é um requerimento básico para sobrevivência de
todos os mamíferos. Muitos mecanismos complexos interagem para o controle da
pressão em níveis relativamente estreitos de variação mesmo em condições de
estresse (SWENSON et al., 1988; COWLEY, 1992).
Vários mecanismos podem participar do processo de manutenção da
pressão arterial em níveis estáveis momento a momento ou em longo prazo. No
entanto, existem quatro principais sítios nos quais a pressão arterial pode ser
influenciada. Estes são os vasos de resistência (arteríolas), os vasos de capacitância
(veias), os rins e o coração. O primeiro deles está envolvido no controle da
resistência periférica e os restantes na regulação do débito cardíaco (SWENSON et
al., 1988).
Vários importantes mecanismos regulatórios operam nestes sítios através
de sistemas de controle neural e hormonal, os quais se sobrepõem aos sistemas
locais de controle (CUNNINGHAM, 2004; COWLEY, 1992). Esta complexa série de
sistemas neural e hormonal, além da regulação local, altera o funcionamento do
51
coração, sistema vascular e o volume sangüíneo para manter um nível constante da
pressão arterial e débito cardíaco adequados à demanda corporal (CUNNINGHAM,
2004).
Os mecanismos responsáveis pela manutenção da pressão arterial em
limites de variação estreitos podem ser divididos em processos agudos, que são
efetivos após um período de segundos a horas, e processos que se tornam efetivos
após dias ou semanas (GUYTON & HALL, 2002). Os primeiros são principalmente
neurais, utilizando receptores no coração e vasos sangüíneos para sensoriar a
pressão sangüínea e o sistema nervoso autônomo para regular a função cardíaca e
o diâmetro arteriolar e os controles em longo prazo são principalmente hormonais e
renais. Estes regulam tanto a resistência periférica como o volume sangüíneo
(SWENSON, 1988; COWLEY, 1992).
As informações aferentes de receptores sensitivos a distorção ou estímulo
químico (por exemplo: seio carotídeo, barorreceptores aórticos, corpos carotídeos e
aórticos, além de receptores presentes nos pulmões, parede dos átrios e ventrículos)
são carreadas por fibras em troncos nervosos autonômicos ao sistema nervoso
central. Todos os níveis do sistema nervoso central participam no controle
cardiovascular. Embora experimentos demonstrem certa autonomia e dominância no
controle da pressão sangüínea por centros da região bulbar, eles não devem,
necessariamente, ser considerados os principais integradores para uma resposta
autonômica quando as outras várias alças de controle estão intactas (SWENSON,
1988). As outras áreas têm uma função modificadora e complementar importante na
regulação do indivíduo intacto e a destruição de uma via ou centro pode resultar em
compensação pelas vias remanescentes (KORNER, 1979).
Os neurônios que desempenham secundariamente a função vasomotora
da medula espinhal estão sob o controle de uma ordem de neurônios superiores
localizados particularmente no assoalho do quarto ventrículo da medula oblonga. No
indivíduo intacto esses centros, por sua vez, são controlados por neurônios no
hipotálamo, tálamo, sistema límbico, córtex cerebral, entre outros, em resposta a
uma grande variedade de tipos de estimulação aferentes e outros estímulos de
entrada neurais que se tornam integrados em padrões de atividade vasomotora
(SWENSON, 1988; CUNNINGHAM, 2004).
Os centros vasomotores mostram automaticidade inata, na qual continuam
a descarregar e mantém a pressão sangüínea arterial por vasoconstrição mesmo
52
após a eliminação de todas as influências nervosas recebidas. A secção do tronco
cerebral acima do bulbo não afeta a pressão sangüínea; isso indica que os níveis
superiores não dominam o nível bulbar, mesmo podendo modificar seu estado de
atividade (KORNER, 1979; SWENSON, 1988).
As fibras vasoconstrictoras (simpáticas) são de maior importância no
controle agudo da pressão arterial e fluxo sangüíneo, incluindo os reflexos de ajuste
mediados por baro e quimiorreceptores. A vasodilatação, neste sistema de controle,
é predominantemente fruto de uma diminuição da freqüência e amplitude de disparos
destas fibras (CUNNINGHAM, 2004).
O principal mecanismo de controle agudo da pressão arterial é mediado
pelos receptores de pressão localizados no seio carotídeo e crossa da aorta
(CUNNINGHAM, 2004; SWENSON, 1988; VASQUEZ, 1994; GUYTON & HALL,
2002). Em condições normais, os barorreceptores localizados nas paredes do arco
aórtico e no seio carotídeo, são excitados pela passagem de cada onda de pressão
sistólica, descarregando trens de potenciais que se dirigem, através dos nervos
aferentes vago e glossofaríngeo, para região bulbar denominada núcleo do trato
solitário. Projeções neurais desse núcleo mantêm sob constante excitação os
neurônios pré-ganglionares vagais cardíacos, que se localizam principalmente no
núcleo dorsal do vago, núcleo umbíguo e região ventromedial bulbar.
O controle inibitório vagal no coração é mediado por fibras que suprem os
átrios, nodo sinoatrial e atrioventricular e em menor quantidade o músculo ventricular
(CUNNINGHAM, 2004; VASQUEZ, 1994). Simultaneamente o núcleo do trato
solitário, por intermédio da região caudal ventrolateral bulbar, mantém sob inibição
neurônios localizados na região rostral ventrolateral bulbar, cujas projeções para
coluna intermediolateral (local de origem dos neurônios simpáticos cardiovasculares)
têm como função à ativação de neurônios pré-gaglionares simpáticos
cardiovasculares. Caso a pressão arterial ultrapasse os limites ideais há um aumento
na freqüência de potenciais de ação e conseqüentemente um aumento da ação
inibitória do vago sobre a freqüência cardíaca e diminui a ação excitatória do
simpático sobre o débito cardíaco e a resistência vascular.
Contrariamente, quando a pressão arterial desvia-se para níveis inferiores
do normal, o resultado final é a inibição da ação vagal sobre o marcapasso e uma
ativação da ação simpática sobre o coração e vasos de resistência (CUNNINGHAM,
2004; VASQUEZ, 1994). Apesar da importância dos barorreceptores arteriais na
53
regulação aguda da pressão arterial, estes reflexos não são importantes para
regulação em longo prazo (COWLEY, 1992).
Além do controle vasomotor por meio de terminações nervosas no
músculo liso vascular existe outro tipo de controle neuro-humoral que é de natureza
autonômica, mas que atua sobre o músculo liso vascular através das catecolaminas,
principalmente adrenalina, circulantes no sangue. A liberação de adrenalina da
medula adrenal segue-se à estimulação dos nervos esplânicos, colunas laterais da
medula espinhal, centro vasomotor do bulbo ou hipotálamo (SWENSON, 1988).
Dale demonstrou em 1913, que a adrenalina isolada da glândula supra-
renal causa dois tipos distintos de efeitos, isto é, vasoconstrição em determinados
leitos vasculares e vasodilatação em outros. Ahlquist em 1948 revelou claramente a
existência de diferentes tipos de receptores. Os estudos subseqüentes com
agonistas e antagonistas adrenérgicos, confirmaram a existência de dois subtipos
principais de receptores α-adrenérgicos (α1 e α2) e três subtipos de receptores β-
adrenérgicos (β1, β2 e β3) (RANG et al., 2004).
Outros sistemas de controle neuro-humoral importantes tanto na regulação
aguda quanto em longo prazo, o Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona funciona
como um mecanismo de regulação do sódio e água corporal, pressão sangüínea e
balanço de potássio (OPARIL & HABER, 1974). A renina é uma enzima proteolítica
sintetizada, estocada e secretada principalmente pelos rins. A renina cliva a α2-
globulina, o angiotensinogênio, para formar um decapeptídeo relativamente
vasoinativo, a angiotensina I.
A enzima conversora (ECA ou dipeptidil dipeptidase, dipeptidil
carboxidase), transforma a angiotensina I em um octapeptídeo vasopressor ativo, a
angiotensina II. A angiotensina II, depois da vasopressina e endotelina, é o mais
potente vasoconstrictor de origem biogênica conhecido. Ela é rapidamente destruída
nos leitos capilares periféricos pelas angiotensinases. A angiotensina III é um dos
metabólitos produzidos na degradação da angiotensina II e é também, como seu
precursor, um potente estimulador da liberação de aldosterona (ZIMMERMEN &
DUNHAM, 1997).
A produção de renina é aumentada por um decréscimo na pressão arterial
renal, um decréscimo no volume de líquido extracelular, por estimulação de nervos
simpáticos do rim, ou alteração na carga de sódio tubular distal (SWENSON, 1988).
Além disso, um elevado nível de íons sódio, íons potássio, angiotensina II, ou
54
vasopressina (hormônio antidiurético, ADH), cada um inibe a liberação de renina. A
angiotensina II tem efeitos vasoconstritores diretos, estimula os neurônios
vasoconstritores centralmente e pode estimular a liberação de ADH (SWENSON,
1988; COWLEY, 1992). A aldosterona, por sua vez, exerce seus efeitos
principalmente nos túbulos distais e ductos coletores renais corticais e medulares,
provocando um aumento da reabsorção de sódio nos túbulos distais (SWENSON,
1988; COWLEY, 1992).
Deve-se considerar, no entanto, que os efeitos da aldosterona na excreção
de sódio depende do volume de ultrafiltrado que chega ao ducto coletor e da
composição do fluido luminal e extracelular (COWLEY, 1992). Estes parâmetros, por
sua vez, são determinados por outros sistemas efetores, como a angiotensina II,
prostaglandinas, atividade simpática renal e forças físicas peritubulares (SWENSON,
1988; COWLEY, 1992).
A vasopressina, ou hormônio antidiurético (ADH), tem duas ações de
máxima importância na regulação da pressão arterial, vasoconstrição e antidiurese.
A liberação de vasopressina tem um papel importante no controle agudo da pressão
arterial em processos que levam a hipovolemia (JOHNSTON et al., 1981,
SWENSON, 1988; COWLEY, 1992). Contrariamente, quando ocorre um aumento na
pressão dos átrios, há reflexamente uma inibição da liberação de vasopressina que
contribui para a diurese e natriurese em resposta a expansão de volume e à
distensão atrial conseqüente (CUNNINGHAM, 2004; COWLEY, 1992). Além da
vasopressina, outros mecanismos também participam desta resposta, como a
redução do tônus simpático renal, inibição da liberação de renina e liberação do
Peptídeo Atrial Natriurético (ANP) (De BOLD et al., 1981; CUNNINGHAM, 2004;
COWLEY, 1992).
O ANP é um peptídeo constituído de 28 aminoácidos com uma ponte
dissulfeto cisteína – cisteína formando um anel de 17 resíduos. Os grânulos
secretórios ocorrem no átrio de todos os vertebrados, o papel de elevações
sustentadas das concentrações de ANP no controle em longo prazo da pressão
arterial não é claro. No entanto, os níveis plasmáticos de ANP permanecem elevados
na insuficiência cardíaca, condição na qual ocorre uma expansão do volume
sangüíneo e aumento da pressão arterial (CERMAK et al.,1996;COWLEY, 1992).
55
O ANP exerce poderosos efeitos sobre o rim e o sistema vascular. A
liberação de ANP pode ocorrer durante a sobrecarga de volume em resposta ao
estiramento dos átrios. Os principais efeitos dos peptídeos natriuréticos consistem
em aumentar a excreção de sódio e de água pelo rim, em relaxar o músculo liso
vascular, em aumentar a permeabilidade vascular e em inibir a liberação e/ou ações
de vários hormônios e mediadores, incluindo aldosterona, angiotensina II, endotelina
e hormônio antidiurético (STABILE et al.,2004).
Um importante mecanismo para regulação de pressão arterial em longo
prazo é a natriurese pressórica, que se baseia no conceito de que a pressão arterial
é mantida em um nível necessário requerido pelos rins para excretar um volume de
urina equivalente ao incremento diário de volume (SWENSON, 1988; COWLEY,
1992).
A convergência de várias linhas de pesquisa levou ao reconhecimento de
que o óxido nítrico (NO) constitui uma molécula-chave de sinalização no sistema
cardiovascular e no sistema nervoso, além de desempenhar um papel na defesa do
hospedeiro (SHEN et al.,1995; NATHAN & XIE, 1994; SNYDER & BREDT, 1992).
Uma das funções fisiológicas do NO foi descoberta na vasculatura, quando
foi constatado que o fator de relaxamento derivado do endotélio (EDRF,
endothelium-derived relaxing factor), descrito por Furchgott e Zawadzski em 1980, é
responsável pela formação de NO pelas células endoteliais. Mostra-se
particularmente importante nos vasos de resistência em virtude da liberação
contínua, produzindo um tônus vasodilatador e contribuindo para o controle
fisiológico da pressão arterial (RANG et al., 2004; ZATZ & BAYLIS, 1998; HARE &
COLUCCI, 1995).
1.4. INCIDÊNCIA DO CÂNCER
A importância do câncer na área de Saúde Pública vem aumentando à
medida que ocorre o controle progressivo de outras doenças. O avanço da ciência e
da tecnologia tem possibilitado a melhoria dos meios de diagnóstico e de tratamento,
que aliados ao desenvolvimento sócio-econômico contribuem para um declínio das
taxas de mortalidade por enfermidades controláveis, tais como a tuberculose, a
desnutrição, o diabetes mellitus e outras afecções.
56
A urbanização, a industrialização e a maior expectativa de vida da
população são os principais fatores que contribuem para o aumento da incidência
das doenças crônico degenerativas, entre elas, o Câncer, visto que eles contribuem
para o aumento de agentes cancerígenos ambientais ou para uma maior e mais
prolongada exposição dos seres humanos a esses agentes.
Para o estabelecimento de medidas efetivas de controle do câncer fazem-
se necessárias informações de qualidade sobre sua distribuição de incidência e
mortalidade, o que possibilita melhor compreensão sobre a doença e seus
determinantes; formulação de hipóteses causais; avaliação dos avanços
tecnológicos aplicados à prevenção e tratamento, bem como a efetividade da
atenção à saúde. (http://www.inca.gov.br).
Em 2005, de um total de 58 milhões de mortes ocorridas no mundo, o
câncer foi responsável por 7,6 milhões, o que representou 13% de todas as mortes.
Os principais tipos de câncer com maior mortalidade foram: pulmão (1,3 milhão);
estômago (cerca de 1 milhão); fígado (662 mil); cólon (655 mil); e, mama (502 mil).
Do total de óbitos por câncer ocorridos em 2005, mais de 70% ocorreram em países
de média ou baixa renda. (http://www.inca.gov.br).
Estima-se que em 2020 o número de casos novos anuais seja da ordem
de 15 milhões. Cerca de 60% destes novos casos ocorrerão em países em
desenvolvimento. É também conhecido que pelo menos um terço dos casos novos
de câncer que ocorrem anualmente no mundo poderiam ser prevenidos. Parkin e
colaboradores (2001) estimaram para o ano de 2000 que o número de casos novos
de câncer em todo o mundo seria maior que 10 milhões. Os tumores de pulmão (902
mil casos novos) e próstata (543 mil) seriam os mais freqüentes no sexo masculino,
enquanto que no sexo feminino as maiores ocorrências seriam os tumores de mama
(um milhão de casos novos) e de colo do útero (471 mil). (http://www.inca.gov.br).
No Brasil, as estimativas para o ano de 2008 e válidas também para o ano
de 2009, apontam que ocorrerão 466.730 casos novos de câncer. Os tipos mais
incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os cânceres
de próstata e de pulmão no sexo masculino e os cânceres de mama e de colo do
útero no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada no
mundo. (http://www.inca.gov.br).
Em 2008 são esperados 231.860 casos novos para o sexo masculino e
234.870 para sexo feminino. Estima-se que o câncer de pele do tipo não melanoma
57
(115 mil casos novos) será o mais incidente na população brasileira, seguido pelos
tumores de próstata (49 mil), mama feminina (49 mil), pulmão (27 mil), cólon e reto
(27 mil), estômago (22 mil) e colo do útero (19 mil).
FIGURA 13: Tipos de Câncer mais incidentes, estimados para 2008, na
população brasileira, sem incluir pele não melanoma.
Fonte: MS/ Instituto Nacional de Câncer – INCA, Janeiro de 2008.
O Câncer é a 2º causa de morte no Brasil em números absolutos,
subseqüentes às doenças cardiovasculares, quando não são considerados os óbitos
por causas externas. A análise da tendência temporal mostra um aumento
significativo de sua participação percentual dentre todos os óbitos durante as últimas
décadas, fazendo com que as neoplasias malignas ocupem, progressivamente,
maior dimensão em termos de mortalidade no Brasil, constituindo assim, um
importante problema de Saúde Pública. Segundo estimativas do Ministério da Saúde,
mais de 300.000 novos casos de câncer são esperados por ano e aproximadamente
100 000 chegaram ao óbito (BRASIL, 2001).
Na Região Nordeste, as neoplasias representam a terceira causa de morte
por doença, consistindo de 6,34% dos óbitos atestados, ficando apenas 0,02 pontos
percentuais depois das doenças infecciosas e parasitárias. Nas demais regiões, os
58
neoplasmas seguem-se às doenças cardiovasculares, como causa de morte, e sua
proporcionalidade aumenta à medida que se desloca para os sul: 7,83% (Região
Norte), 9,89% (Região centro-oeste), 11,93% (região Sudeste) e 15,19% (Região
Sul), (SILVA, 1982; BRASIL, 2001).
A importância crescente das neoplasias malignas no quadro sanitário do
Brasil tem ampliado a discussão sobre o controle desse grupo de doenças, incluindo-
as como uma das prioridades do setor de saúde. Apesar de ainda existirem áreas
obscuras na compreensão da etiologia do câncer, já se tem, hoje, conhecimentos
suficientes para embasar que a quimioterapia utilizada no tratamento do câncer é
primordialmente oriunda de recursos naturais (PINKEL, 2000; DREWS, 2000).
Os estudos in vitro têm se mostrado um excelente modelo para teste das
potencialidades antitumorais de substâncias. A demonstração de que tumores
humanos podem originar linhagens celulares imortais, vem facilitando o estudo
destas substâncias diretamente em células humanas. Indubitavelmente a cultura de
células serve indistintamente aos diversos campos das ciências biológicas cuja
tendência é trabalhar a nível celular e molecular (EPSTEIN, 1990).
O processo inicialmente utilizado consiste numa avaliação calorimétrica da
atividade citotóxicas dos compostos em células neoplásicas humanas, sendo este
mais barato, prático e rápido que o método in vivo, permitindo uma avaliação de um
maior número de compostos, posteriormente, prosseguiremos com o nível molecular.
Uma vez que a maioria das drogas antineoplásicas utilizada na clínica com atividade
citotóxicas tem como principal alvo à molécula do DNA, isto nos leva a estudar
reatividade com o DNA, já que drogas anticancerígenas originadas de produtos
naturais podem interagir de diversas maneiras intercalando entre as fitas, clivando a
dupla fita ou a fita isolada, formando complexo estável com o DNA ou ligação
cruzada com proteínas (PINKEL, 2000).
A atividade citolítica das drogas antineoplásicas na síntese e replicação de
DNA, cirurgia e radiação demonstram sucesso limitado, visto que, remove e destrói
células normais juntamente com as células tumorais. A quimioterapia anticâncer
utilizando substâncias altamente tóxicas causa sérios efeitos adversos e
desconfortantes para o indivíduo, tal como a alopécia, um dos efeitos mais
desagradáveis dentre todos os outros. Desta forma, é grande o interesse na
pesquisa em busca de novos agentes antineoplásicos que apresentem um
mecanismo de ação diferenciado (EPSTEIN, 1990).
59
Os tratamentos de câncer através da quimioterapia precisam ser
modificados para a bioterapia utilizando agentes biológicos que apresentem pouco
ou nenhum efeito adverso. Atualmente anticorpos monoclonais e interferons estão
sendo utilizados na terapia anticâncer, porém existe um vasto campo de substâncias
naturais com um potencial na atividade antitumoral (PINKEL, 2000).
O estudo da ação antitumoral de substâncias biologicamente ativas
isoladas de venenos de serpentes é de extrema importância na atualidade, visto que,
vários enfoques científicos estão sendo tomados na descoberta de novos agentes
químicos mais seletivos e eficazes para o tratamento do câncer (EPSTEIN, 1990).
A quimioterapia pode ser utilizada como terapia propriamente dita ou como
adjuvante de outras formas de tratamento. Outras abordagens para o tratamento do
câncer, como, por exemplo, aquelas baseadas no conhecimento da patobiologia do
câncer, estão sendo investigadas e estão começando a produzir resultados (RANG
et al., 2004).
60
JUSTIFICATIVA
61
2. JUSTIFICATIVA
O grupo de pesquisa de Toxinologia, desde 1993 vem se dedicando ao
estudo de toxinas (microcystina-LR) (NOBRE et al., 1999) e venenos de serpentes
brasileiras, Bothrops jararacaca (MONTEIRO & FONTELES, 1999), Bothrops
jararacussu (HAVT et al., 2001), Bothrops moojeni (BARBOSA et al., 2002), Crotalus
durissus terrificus (MONTEIRO et al., 2001) e Crotalus durissus cascavella
(MARTINS et al., 1998, MARTINS et al., 2002). Esta pesquisa visa aprofundar o
estudo do veneno Crotalus durrissus cascavella em relação aos efeitos renais,
cardiovasculares e antitumorais na perspectiva de elucidação dos mecanismos
envolvidos na fisiopatologia do envenenamento na descoberta de ferramentas
farmacológicas e de substâncias com valor terapêutico.
O Laboratório de Farmacologia de Venenos, Toxinas e Lectinas
(LAFAVET) tem como interesse nas suas pesquisas científicas investigar na nossa
Biodiversidade venenos, toxinas e lectinas de animais produtores de substâncias
potencialmente tóxicas, na busca de novos compostos farmacologicamente ativos no
sistema de perfusão renal e no leito vascular mesentérico.
A Unidade de Farmacologia Clínica (UNIFAC) tem como objetivo
primordial qualificar os profissionais de saúde para conhecer a interação entre o
fármaco e o organismo, e assim entender a real necessidade do padrão de
qualidade na fabricação de um medicamento, sua forma de emprego, seu percurso
no organismo, seu mecanismo de ação, a mensuração de seus efeitos desejados e
adversos e a interação com alimentos e outros medicamentos administrados,
estando, desta forma, capacitado na área da pesquisa e desenvolvimento de
fármacos, o que lhes permitirá aplicar corretamente as leis que regulamentam o
desenvolvimento, produção, comercialização e farmacovigilância dos medicamentos,
resguardando os interesses da população no que diz respeito à qualidade, eficácia e
segurança dos mesmos.
O Laboratório de Oncologia Experimental (LOE) tem como objetivo
científico pesquisar diversas substâncias de origem animal e vegetal com potencial
citotóxico e farmacológico na inibição de crescimento tumoral, bem como indutor de
apoptose em diversas linhagens de células normais e tumorais.
O grupo LAFAVET (Laboratório de Farmacologia de Venenos, Toxinas e
Lectinas), juntamente com a UNIFAC (Unidade de Farmacologia Clínica) e LOE
62
(Laboratório de Oncologia Experimental), visam à integração de várias áreas da
farmacologia, a fim de estudar as ações citotóxicas do veneno da serpente Crotalus
durissus cascavella, purificar o veneno bruto para a obtenção de frações
farmacologicamente ativas, em busca de novas opções terapêuticas com menos
efeitos adversos e quando possível permitir a elucidação dos possíveis mecanismos
de ação de novas moléculas para o tratamento do câncer, utilizando para tal fim
linhagens de células neoplásicas humanas, onde se pode obter de forma mais
fidedigna os resultados da potencialidade antitumoral de novos compostos.
O presente trabalho é o resultado de uma colaboração de vários
laboratórios, que propõe estudar os efeitos do veneno da Crotalus durissus
cascavella e de uma fração isolada, o Peptídeo Natriurético, utilizando várias
metodologias, com o objetivo de elucidar possíveis mecanismos envolvidos com a
fisiopatologia das alterações vasculares e renais, bem como uma possível ação
citotóxica.
63
OBJETIVOS
64
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVOS GERAIS
1. Estudar o Veneno Bruto da serpente Crotalus durissus cascavella
(Cdcasca) em relação aos seus efeitos vasculares e às atividades citotóxicas.
2. Estudar o Peptídeo Natriurético isolado da Crotalus durissus cascavella
(NPcasca) com o objetivo de avaliar suas atividades renais e vasculares, visando a
descoberta de substâncias ou ferramentas com potencial diagnóstico ou terapêutico,
determinando quando possível o mecanismo de ação.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar a citotoxicidade em cultura de células, do veneno ofídico da
serpente região Nordeste Crotalus durissus cascavella (Cdcasca) para verificação de
uma efetiva atividade.
2. Avaliar a atividade pressórica do veneno bruto da Cdcasca indutora de
hipotensão e o Bloqueio Farmacológico com L-NAME na pressão arterial.
3. Avaliar a citotoxicidade do veneno da Cdcasca no coração, rim,
pulmão, fígado e cérebro, para observar possíveis alterações, após a infusão do
veneno bruto no sistema de pressão arterial.
4. Estudar a ação farmacológica renal de um Peptídeo Natriurético isolado
do veneno da Cdcasca e realizar uma análise histológica dos rins.
5. Estudar a Biologia Molecular do tecido Renal após a perfusão com o
Peptídeo Natriurético.
6. Estudar a atividade citotóxica do veneno bruto da serpente Cdcasca em
diferentes linhagens tumorais in vitro.
65
MATERIAL E MÉTODOS
66
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. OBTENÇÃO DO VENENO BRUTO E FRAÇÕES DA SERPENTE Crotalus
durissus cascavella
O veneno bruto da Crotalus durissus cascavella (Cdcasca) foi extraído e
cedido pela professora Doutora Diva Maria Borges Nojosa do núcleo Regional de
Ofiologia da Universidade Federal do Ceará – NUROF-UFC, para realização dos
estudos da atividade farmacológica.
As serpentes eram submetidas a uma câmara de vidro contendo gelo
seco, para diminuição do seu metabolismo e seus reflexos (figura 14). Logo após
este procedimento, as serpentes eram manipuladas com muita cautela, evitando
acidentes com os animais e com os profissionais.
O veneno extraído era mantido a uma temperatura de -20ºC e logo em
seguida era liofilizado e conservado a mesma temperatura.
O Peptídeo Natriurético da Cdcasca foi gentilmente cedido pelo professor
Marcos Hikari Toyama, da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
(Campus do Litoral Paulista, São Vicente) (UNESP), para realização dos ensaios
biológicos.
FIGURA 14: Serpente Crotalus durissus cascavella submetida a uma câmara
de vidro contendo gelo seco, para diminuição do seu metabolismo e seus
reflexos.
67
4.1.1. Purificação e isolamento do Peptídeo Natriurético da Crotalus durissus
cascavella
O Peptídeo Natriurético isolado do veneno da Cdcasca (NPcasca) foi
gentilmente purificado e cedido pelo professor Marcus Hikari Toyama, da
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (Campus do Litoral Paulista,
São Vicente), para realização dos ensaios biológicos.
O NPcasca foi fracionado por uma combinação de dois procedimentos
cromatográficos descrito por Toyama e colaboradores (2000). Na primeira etapa, o
veneno total (10mg) foi diluído em 400µL de bicarbonato de amônia (0.2M, pH 7.8)
até completa diluição, seguida por centrifugação à 4500xg por 5 minutos. O
sobrenadante resultante foi eluído em HPLC de exclusão molecular (AP1, 1x60cm)
com Superdex 75. O fracionamento do veneno foi conduzido em condição de
funcionamento isocrático, usando uma taxa de fluxo constante de 0.2mL/min. em
280nm. Todas as frações obtidas foram liofilizadas e armazenadas em -20°C. As
frações V e VI foram submetidas separadamente ao HPLC de fase reversa utilizando
a coluna analítica C18, a qual foi equilibrada previamente com tampão A (TFA-
trifluoroacetato 0.1%) durante 10 minutos. As frações V e VI (3mg) foram diluídas
neste tampão até completa diluição, centrifugadas à 4500xg e eluídas então em
coluna de fase reversa. A purificação do peptídeo foi realizada utilizando um
gradiente linear da concentração do tampão B (Acetonitrila 66 no tampão A) e a
cromatografia foi realizada em A214nm (figuras 15 a/b e 16 a/b).
A eletroforese, Tricine PAGE-SDS, foi realizada para a caracterização de
proteínas e peptídeos de baixo peso molecular, seguindo o protocolo descrito por
Shagger e por Von Jagow (1987). A fração resultante foi diretamente submetida a
um seqüenciamento em um seqüenciador automático de amino-ácidos.
68
FIGURA 15: a) Cromatografia em HPLC de exclusão molecular do veneno
total; b) Cromatografia da fração VI em HPLC de fase reversa, identificando o
peptídeo natriurético isolado.
Fonte: Gentileza do Professor Dr. Marcus Hikari Toyama, da Universidade Estadual Paulista
Júlio de Mesquita Filho (Campus do Litoral Paulista, São Vicente).
69
FIGURA 16: a) Espectrometria de massa MALD-TOFF do NP2_Casca; b)
Seqüência completa de aminoácidos da proteína.
Fonte: Gentileza do Professor Dr. Marcus Hikari Toyama, da Universidade Estadual Paulista
Júlio de Mesquita Filho (Campus do Litoral Paulista, São Vicente).
70
4.2. ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Ratos Wistar machos pesando entre 250 e 300g. Os animais foram
mantidos em jejum por 12 horas antes do experimento com água “ad libitum” para a
realização dos experimentos de pressão arterial, anel de aorta e com o rim isolado.
Os animais utilizados nos experimentos com leito vascular isolado não foram
submetidos a jejum.
4.3. MODELO EXPERIMENTAL DE PRESSÃO ARTERIAL EM RATOS
Os animais foram anestesiados pelo pentobarbital sódico (50 mg/kg) e
submetidos à cirurgia onde foi realizada uma incisão na linha mediana da região
cervical. Após isolamento das glândulas parótidas direita e esquerda, aprofundou-se
a incisão até a traquéia. Após divisão marginal deste órgão, foi identificado o feixe
vascular-nervoso de onde foi isolada a artéria carótida esquerda, com muito cuidado
para não lesar o nervo vago. Procedeu-se então a canulação desta artéria para
registro da pressão arterial média. Igual manobra foi realizada com vistas a
canulação da veia jugular externa com o propósito de injetar as substâncias testes e
os padrões (figura 17) (NASCIMENTO et al., 2006).
Os registros das experiências foram obtidos através de transdutores P23
Statham acoplados a um polígrafo Narco BioSystem. Antes do início das
experiências foi realizada a calibração do instrumento utilizando-se um manômetro
numa escala de 50 a 250 mmHg. Este ensaio foi utilizado para testes, onde foi
verificado, por resultados preliminares, a indução intensa da queda pressórica
(SILVA et al., 2005).
As substâncias utilizadas nos experimentos foram injetadas lentamente
pela veia jugular na forma de Bolus, com intervalo mínimo entre as injeções de 10
minutos. As Variações na Pressão Arterial Média (∆PAM) expressa em mmHg e
calculada segundo a fórmula:
PAM = PD + (PS – PD)/3.
71
Após um período para controle inicial de 20 minutos, com registro contínuo
da pressão arterial, o veneno bruto e o Npcasca foi injetado nas doses de 0,1 e
0,3µg/mL. Os experimentos foram realizados em 4 animais de cada grupo de doses.
Foi realizado um grupo experimental (n=4) com bloqueio farmacológico
com L-NAME (10mg/Kg i.p.) 30 minutos antes do veneno bruto da Cdcasca.
FIGURA 17: Técnica Cirúrgica dos experimentos de Pressão Arterial em ratos
anestesiados.
4.3.1. Análise histológica após inoculação do veneno bruto no sistema de
pressão arterial
Após cada experimento de pressão arterial, fragmentos do coração, rim,
pulmão, fígado e cérebro foram retirados do animal e acondicionados em frascos de
formol 10% para proceder à análise histológica da avaliação sistêmica da ação do
veneno. O controle foi obtido com os mesmos órgãos retirados de animais controles
submetidos ao mesmo protocolo experimental.
Os fragmentos dos órgãos dos animais tratados com o veneno foram
desidratados, diafanizados e em seguida cortados no micrótomo na espessura de
5µm. Procedeu-se a coloração do material por Hematoxilina-Eosina e as lâminas
foram analisadas em microscopia de luz.
Cânula na veia jugular Cânula na artéria carótida
72
4.3.2. Análises estatísticas
Os resultados dos cálculos das pressões foram mostrados como média ±
erro padrão nos quatro experimentos em cada grupo. Diferenças entre os grupos
foram comparadas utilizando teste t de Student com significância de 5%.
4.4. MODELO EXPERIMENTAL DE ANEL DE AORTA DE RATOS
Foram utilizados ratos machos Wistar adultos (300g). Após deslocamento
cervical, os animais foram sacrificados e a cavidade torácica foi exposta e a aorta
retirada.
Segmentos de aorta de aproximadamente 5mm foram montados
horizontalmente em banhos para registro isométrico de 5mL de capacidade em
solução de Krebs-Henseleit (composição em mmol/L: NaCl 120; KCl 4,7; CaCl2 1,8;
MgCl2 1,43; NaHCO3 25; KH2PO4 1,17 e Glicose 11) aerada com mistura
carbogênica 95% O2 e 5% CO2. Os Registros das alterações de tensão foram
obtidos por intermédio de um transdutor de força acoplado a um polígrafo de 2
canais.
Após um período de equilíbrio de 1 hora com lavagens sucessivas a cada
15 minutos, o anel vascular foi contraído com Fenilefrina 1µM (PHE). No platô da
contração (correspondente a 60% da resposta máxima), induzida pela PHE, as
respostas aos fármacos foram comparadas pela construção de uma curva de
concentração resposta ao NPcasca, nas concentrações de 10-11M a 10-7M, tanto na
presença, como também na ausência do endotélio.
A integridade do endotélio foi testada pela adição de Ach 1µM e
considerava-se um relaxamento acima de 70% em relação à resposta contrátil
máxima para termos um endotélio íntegro. Foram também realizadas curvas em
aortas pré-contraídas com solução despolarizante de potássio (K+ 80mM). Por
último, um conjunto de curvas concentração-resposta foi realizado na presença do
Isatin (10 µM), um bloqueador inespecífico de guanilato ciclase de membrana
acoplado ao receptor natriurético, onde este foi incubado por 30 minutos, após o
platô da contração por fenilefrina.
73
4.5. DOSAGEM DE NITRITO – DETERMINAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO
NÍTRICO
Após a infusão do veneno da Cdcasca (veneno bruto e o peptídeo
natriurético, com suas respectivas doses) nos grupos experimentais de pressão
arterial (quatro animais de cada grupo), foi feita a coleta de sangue da artéria
carótida antes da morte do animal, o sangue foi centrifugado e o sobrenadante
conservado a uma temperatura de -70◦C para posterior dosagem de nitrito.
O bloqueio farmacológico com L-NAME (10mg/Kg i.p.) foi realizado nos
experimentos de pressão arterial (grupo de quatro animais) 30 minutos antes do
veneno bruto da Cdcasca.
A produção de NO é obtida através da determinação do conteúdo total de
nitrito (NO–2) nas mucosas jugais através da concentração total nas amostras
determinada especfotometricamente pela reação de Griess.
Utilizam-se placas de 96 poços, e fazem-se as determinações em
duplicata. Coloca-se 50 µL da amostra experimental em cada poço. Uma série de
diluições da curva padrão de referência de NO–2 (80 µmol, 40 µmol, 20 µmol, 10
µmol, 5 µmol, 2,5 µmol, 1,25 µmol e 0,625 µmol) é preparada, e 50 µL do padrão é
colocado em uma segunda placa de 96 poços em duplicata. A seguir, é colocado 50
µL de solução de sulfanilamida em cada poço de ambas as placas e incubados por
10 minutos à temperatura ambiente e protegidos da luz. Após este período de
incubação, adiciona-se 50µL de uma solução de dicloreto de N-1-naftiletilenodiamina
e incuba-se novamente nas mesmas condições anteriores (MEDEIROS et al., 2007).
A coloração púrpura/magenta aparece imediatamente e é medida em leitor
de placas com filtro entre 520-550 nm. Os valores obtidos para as amostras
experimentais são comparados com os obtidos para curva padrão.
74
4.6. MODELO DE PERFUSÃO DE RIM ISOLADO
4.6.1. Substâncias e reagentes utilizadas nos experimentos com perfusão renal
NaHCO3 (Synth)
NaH2PO4.H2O (Synth)
NaCl (Synth)
MgSO4 . 7H2O (Reagen)
CaCl2 . 2H2O (Reagen)
Manitol (Reagen)
Uréia (Reagen)
KCl (Merck)
Glicose (Squibb)
Penicilina G Potássica Cristalina (Squibb)
Heparina (EUROFARMA)
Inulina (Sigma)
Pentobarbital Sódico (Cristália)
4.6.1.1. Solução perfusora e seu preparo
A solução empregada nas experiências foi a de Krebs-Henseleit
modificada, contendo albumina bovina 6g%.
A solução de Krebs-Henseleit modificada, concentrada a 20%, continha
NaCl = 138g, KCl = 7g, NaH2PO4 . H2O = 3,2g, MgSO4. 7 H2O = 5,8g e Uréia = 10g.
48 horas antes dos experimentos, 100mL desta solução foi separada e acrescidos
NaHCO3 = 4,2g, CaCl2. 2 H2O = 0,74g, glicose = 2g, e penicilina G potássica
cristalina = 0,05g. Em seguida, o volume foi completado para 2000mL com água
bidestilada. Foi retirado 300mL desta solução, na qual foi adicionada albumina
bovina (6g%). Em seguida, solução foi dialisada com albumina, auxiliada por um
homogeneizador. A diálise tem como objetivo retirar substâncias contaminantes
como piruvato, citrato e lactatos (HANSON & BALLARD, 1968; COHEN et.al., 1977;
ROSS 1978; FONTELES et. al. 1983).
75
A solução de Kresb-Henseleit para a diálise foi trocada com 24 horas. No
final, após 48 horas de diálise, a solução perfusora foi acrescida com 0,15g de
inulina. O pH da solução perfusora foi ainda ajustado entre os valores de 7,3 e 7,4.
4.6.2. O sistema de perfusão renal
A necessidade do conhecimento dos mecanismos de controle da função
renal levou inúmeros pesquisadores a desenvolver a técnica de perfusão de rim
isolado. O nosso sistema consiste na perfusão de rim isolado com recirculação com
dois sistemas, um “in situ” e outro com circuito fechado para perfusão “in vitro”,
mantidos ambos a uma temperatura de 38°C. Este sistema apresenta a vantagem de
manutenção constante de parâmetros funcionais renais, com utilização da albumina
na solução perfusora com oxigenação adaptada ao sistema.
Este método foi inicialmente baseado nos estudos desenvolvidos por
Bowman e Mack (1974) e Ross (1978). Modificado pelo trabalho de Fonteles e
colaboradores (1983), os quais adicionaram um pulmão artificial do tipo silástico,
baseado no modelo de Hamilton e colaboradores (1974).
Neste sistema o perfusato recircula no rim com uma quantidade de 100 mL
de solução Krebs-Hanseleit modificada e a oxigenação é adaptada ao sistema
(MONTEIRO, 1990).
O sistema de perfusão de rim isolado com recirculação (figuras 18 e 19) é
composto por um conjunto de equipamentos cada um deles desempenha uma
determinada função:
1) Condensador - Mantém aquecido o cilindro reto que comporta a solução
do experimento;
2) Coletor de urina - Frasco que recebe a urina do rim montado no
sistema, trocados em intervalos de 10 minutos;
3) Seringa coletora de perfusão - Coletor da solução de perfusão no
sistema feita em intervalos de 10 minutos;
4) Bomba de perfusão (Watson) - Bombeia a solução de perfusão no
sistema, apresenta cinco velocidades;
5) Filtro de millipore (5µm) - Filtra a solução perfusora;
76
6) Banho Maria - aquece o oxigenador ou o pulmão artificial mantendo a
temperatura constante entre 37 ºC;
7) Fluxômetro - Mede o fluxo da solução;
8) Manômetro de mercúrio -Mede a pressão do perfusato;
9) Catabolhas - Retira as bolhas formadas evitando assim embolia no rim;
10) Oxigenador ou pulmão artificial - Promove as trocas gasosas (95% de
O2 e 5% de CO2).
FIGURA 18: Sistema de perfusão de rim Isolado com recirculação.
77
FIGURA 19: Representação gráfica do sistema de perfusão de rim isolado
com recirculação.
FONTE: Manoel Odorico de Moraes Filho.
4.6.2.1. Calibração e preparo do sistema de perfusão renal
A calibração foi sempre feita com o sistema em funcionamento na
presença de solução fisiológica a 0,9%, aquecida na temperatura de 37ºC. A cada
unidade da bomba de perfusão (1, 2, 3, 4 e 5), foi coletado a solução por 1 minuto
em proveta milimetrada (fluxo na ponta da cânula arterial), e anotada a medida do
fluxômetro e a pressão de perfusão, através do manômetro de mercúrio ligado ao
sistema. Para melhor adaptação do sistema às unidades de bomba, foi estabelecido
3 minutos de intervalos entre cada coleta.
A calibração tem como objetivo conhecer o fluxo de perfusão em face da
resistência da própria cânula arterial. O sistema foi calibrado sempre antes do início
Fluxômetro
Seringa
Oxigenador
Catabolhas
Manômetro
Cânula Arterial
Coletor de Urina
Condensador
O2/CO2
Filtro Bomba
Banho Maria
Rim Canulado
78
dos experimentos. Foi avaliado em cada uma das bombas a pressão de perfusão
(PP) em mmHg, o fluxo urinário (L/h) e o volume de urina coletado em um minuto
(mL/min). Os resultados estão demonstrados nas figuras 20,21 e 22, logo abaixo.
Figura 20: Valores registrados de pressão de perfusão (PP) durante a
calibração do sistema (n =6).
Figura 21: Valores registrados pelo Fluxômetro (L/h) durante a calibração do
sistema (n=6).
-20
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5
Bomba
PP
(m
mH
g)
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 4 5
Bomba
Vo
lum
e u
rin
ário
(m
L/m
in)
79
Figura 22: Valores registrados de volume urinário (mL/min) durante a
calibração do sistema (n = 6).
4.6.3. Técnica cirúrgica para isolamento e canulação do rim
Após a anestesia do animal com pentobarbital sódico na dose de 50mg/Kg
intraperitonial (IP), foi injetado na veia femoral, devidamente identificada, 3mL de
manitol a 20 %, com intuito de melhorar o acesso cirúrgico ao ureter. Após assepsia
do abdômen, foi realizada uma incisão da parede abdominal com base na linha alba
e duas incisões perpendiculares à primeira no meio da parede, para aumentar o
campo cirúrgico. Rebatidas às vísceras para o lado esquerdo para visualização do
rim direito e conseqüente limpeza dos tecidos presentes na área. Em seguida, o
ureter foi isolado e canulado com tubo de polietileno (PE 50) (figura 23).
Com o intuito de evitar interferência fisiológica da glândula adrenal direita
no experimento, esta foi identificada, isolada e seccionada, para com isso
providenciar a descapsulação do rim. Cumpridos estes procedimentos, a artéria renal
foi canulada a partir da artéria mesentérica superior. Após sua identificação, a artéria
mesentérica superior foi ocluída em seu lado direito e pinçado no seu lado esquerdo.
Com pequeno corte em seu tecido foi introduzida a cânula por 3 a 5 mm e fixada
cânula e artéria. Logo a seguir, o órgão foi isolado com pinças e seccionado,
promovendo a retirada do rim e ureter. Devidamente liberado, o rim já acoplado ao
sistema, passa por um período de adaptação in vitro de aproximadamente 30
minutos.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
1 2 3 4 5
Bomba
Flu
xo
(L
/h)
80
FIGURA 23: Procedimento cirúrgico para perfusão de rim isolado. A:
isolamento da artéria femoral para injeção de manitol; B: isolamento e fixação
da cânula ao ureter; C: isolamento das artérias mesentérica e renal; D: cânula
fixada a artéria renal. (A= veia femoral, B= ureter canulado, C= artérias
mesentérica e renal e D= cânula arterial).
C
D C
A B
81
4.6.4. Protocolo experimental
Os testes experimentais foram realizados em quatro animais de cada
grupo. Os experimentos foram iniciados após a adaptação do órgão ao sistema de
perfusão num tempo de aproximadamente 20 minutos. O tempo total de perfusão do
órgão foi de 120 minutos. Durante esse período, foram coletados a cada 5 minutos
as medida do fluxômetro e a pressão do perfusato. Em intervalos de 10 minutos, de
maneira intercalada, foram coletados a urina e o perfusato, de modo que na hora de
coletar o último não se trocava o coletor de urina e vice e versa. Estes frascos com
urina foram pesados e, juntamente com os frascos de perfusato, mantidos em
temperatura de -20ºC para permitir posteriores dosagens de potássio, sódio, cloro,
inulina e osmolaridade. Sempre aos 30 minutos do início do experimento,
administrou-se Cdcasca.
Com o rim direito montado no sistema, o rim esquerdo foi coletado para
controle, o qual foi pesado e retirado dois fragmentos: um fragmento foi utilizado para
posterior análise histológica e o outro para o estudo da biologia molecular. Após o
fim do experimento, foi realizado o mesmo procedimento com o rim direito.
4.6.5. Avaliação bioquímica de perfusatos e urinas
Perfusatos e urinas foram coletados em intervalos de 10 minutos, de forma
intercalada, conforme o protocolo experimental acima descrito. Com este material
foram realizados testes bioquímicos de dosagem de sódio e potássio, pelo método
de fotometria de chama (Flame photometer - modelo 443IL). As dosagens de cloro
foram realizadas seguindo o método descrito pelo kit do fabricante Labtest. A inulina
foi dosada a partir do mesmo material, através de hidrólise direta, descrita por
Fonteles e Leibach (1982). Finalmente foi medida a osmolaridade das amostras com
um osmômetro (vapor Pressure osmometer - modelo 5100c NESCOR). Todas as
análises bioquímicas foram realizadas na Unidade de Pesquisas Clínicas da
Universidade Federal do Ceará.
82
4.6.6. Análise histológica dos rins perfundidos
Após cada experimento, fragmentos dos dois rins foram retirados e
acondicionados em frasco de formol a 10% para proceder à análise histológica.
Estes fragmentos foram desidratados, diafanizados e em seguida cortados, numa
espessura de 5µm. Procedeu-se à coloração do material por Hematoxilina-Eosina e
as lâminas foram analisadas por microscópio de luz (Nikon).
Todas as lâminas dos rins submetidos à perfusão foram confeccionadas
no Laboratório de Anatomia Patológica - Biopse, e avaliadas no Departamento de
Patologia e Medicina Legal da Universidade Federal do Ceará.
4.6.7. Cálculo dos parâmetros funcionais renais
Foram Utilizadas as seguintes fórmulas para determinação dos parâmetros
funcionais renais (Martinez-Maldonado et al., 1978; Fonteles, 1980):
1. FU (mL.g-1. min-1) = Fluxo urinário
FU = (Peso do volume urinário / Peso do rim esquerdo) x 10 (admitiu-se que a
urina possui a mesma densidade da água)
2. PP (mmHg) = Pressão de perfusão. Leitura em manômetro
3. RFG (mL.g-1.min-1) = Ritmo de filtração glomerular
RFG = (DOU in / DOP in x FU) sendo DOU in = densidade ótica da inulina na urina
e DOP in = densidade ótica da inulina no perfusato
4. FPR (mL.g-1.min-1) = Fluxo de perfusão renal (registrado a cada 10 min/peso
do rim/intervalo de tempo)
5. RVR (mmHg/mL.g-¹.min-1) = Resistência vascular renal
RVR = PP (mmHg) / FPR
83
6. FNa+= (µµµµEq.g-1. min-1) = Sódio filtrado
FNa+ = RFG x PNa+ (PNa+ = Concentração de sódio no perfusato)
7. ENa+ = (µµµµEq.g-1. min-1) = Sódio excretado
ENa+ = FU x UNa+ (UNa+ = Concentração de sódio na urina)
8. TNa+= (µµµµEq.g-1. min-1) = Sódio transportado
TNa+ = FNa+ - ENa+
9. %TNa+ = Percentual de sódio transportado
%TNa+ = TNa+ x 100 / FNa+
10.Cosm (mL.g-1.min-1) = Clearance osmótico
[Uosm / Posm] x FU (onde Uosm = Osmolaridade urinária e Posm = Osmolaridade
do perfusato)
11. FK+ (µµµµEq.g-1. min-1) = Potássio filtrado
FK+ = RFG x PK+ (PK+ = concentração de potássio no perfusato)
12. EK+ (µµµµEq.g-1. min-1) = Potássio excretado
EK+ = FU x UK+ (UK+ = Concentração de potássio na urina)
13. TK+ (µµµµEq.g-1. min-1) = Potássio transportado
TK+ = FK+ x EK+
14. %TK+ (µµµµEq.g-1. min-1) = Percentual de potássio transportado
%TK+ = TK+ x 100 / FK+
15. TCl – (µµµµEq.g-1. min-1) = Cloro transportado
TCl – = FCl – x ECl –
16. % TCl – (µµµµEq.g-1. min-1) = Percentual de cloro transportado
% TCl – = TCl – x 100 / F TCl –
84
4.6.8. Análises estatísticas
Os resultados dos cálculos das pressões foram mostrados como média ±
erro padrão nos quatro experimentos em cada grupo. Diferenças entre os grupos
foram comparadas utilizando teste t de Student ou Análise de Variância (ANOVA)
seguida do teste de Bonferroni com significância de 5%.
4.7. MODELO DE PERFUSÃO EM LEITO VASCULAR MESENTÉRICO
A perfusão seguiu a descrição de Mcgregor (1965). Ratos Wistar machos,
pesando entre 280-350g foram anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/Kg).
Depois de aberto o abdômen, a artéria mesentérica superior foi isolada e canulada
com uma cânula de polietileno (PE20). O intestino foi separado do leito mesentérico
com o ligamento do leito nas extremidades intestinais (duodeno e ceco).
O mesentério foi perfundido em sistema aberto (figura 24) com solução de
Krebs contendo: 114.0mM of NaCl; 4.96mM of KCl; 1.24mM of KH2PO4; 0.5mM of
MgSO4.7H2O; 24.99mM of NaHCO3; 2.10mM of CaCl2.2H2O; e 3.60mM of glicose.
A solução foi mantida a 37ºC e o leito foi perfundido a um fluxo constante (4 mL/min),
enquanto a variação da pressão foi mensurada pela média das pressões de perfusão
através de um transdutor (Statham P23, Gould, Oxnard, CA, USA) conectado ao
sistema. As variações na pressão de perfusão foram continuamente grafadas por um
fisiógrafo quatro-canais (Narco BioSystems, Houston, TX, USA). Com isso,
analisamos o efeito vascular do veneno bruto de Cdcasca (10µg/mL/min.; n = 6),
infundido a uma taxa constante de 0.1 mL/min, comparado com a infusão do veículo
sozinho.
85
FIGURA 24: Desenho esquemático do sistema de perfusão de leito vascular
mesentérico.
4.8. BIOLOGIA MOLECULAR
Avaliou-se por biologia molecular a expressão gênica do Fator de Necrose
Tumoral alfa (TNFα), Óxido Nítrico Sintase Induzida (iNOS), Ciclooxigenase-2 (COX-
2) e Interleucina 1β (IL-1β) em rins perfundidos na ausência (controle) ou presença
do Peptídeo Natriurético isolado da serpente Crotalus durissus cascavella. Para
tanto, os seguintes procedimentos foram utilizados:
4.8.1. Isolamento de RNA total
O RNA total dos rins controle (perfundidos com solução de Krebs-
Henseleit modificada) e rins perfundidos com o Peptídeo Natriurético da Cdcasca
(NPcasca) foram isolados utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo o
protocolo descrito pelo fabricante. As amostras foram trituradas e homogeneizadas
86
com 1mL do reagente Trizol para cada 50-100 mg de tecido e, em seguida,
centrifugado. O sobrenadante foi coletado e a este se adicionou 0,2mL de
clorofórmio para cada 1mL de Trizol utilizado, realizando assim a fase de separação.
Essa mistura foi novamente centrifugada e o sobrenadante coletado com o cuidado
para não coletar a fase intermediária contendo DNA. Em seguida, iniciou-se a fase
de precipitação e lavagem, usando álcool isopropílico e etanol (75%),
respectivamente. Cada um destes procedimentos foi seguido por centrifugação da
amostra. O procedimento de lavagem foi executado duas vezes. Finalmente, o
precipitado foi resuspenso em água miliQ autoclavada. A quantidade e qualidade do
RNA total isolado foram avaliadas por espectrofotômetro, baseados na leitura em
260nm e na razão da absorção a 260nm e a 280nm, respectivamente.
4.8.2. Reação de RT- PCR
RNA total isolado de 4 rins perfundidos para cada grupo experimental, na
quantidade de 2 µg de RNA foi transcrito em DNA complementar (cDNA) a partir do
método descrito pelo fabricante do kit “RETROscript Reverse transcription for RT-
PCR” (Ambion). O cDNA sintetizado foi usado numa reação de polimerase em
cadeia (PCR) para a amplificação do genes descritos. Primers específicos foram
obtidos no sítio eletrônico do National Center for Biotechnology Information
(NCBI). Para o desenho dos primers foi utilizado o Oligo PerfectTM Designer
disponível no sítio eletrônico http://www.invitrogen.com. A tabela 01 descreve a
seqüência destes primers.
87
TABELA 01: Sequência dos primers específicos utilizados na reação de
polimerase em cadeia.
Primers Sense (5´- 3´) Antisense (5´- 3´)
18S RNA ACATCCAAGGAAGGCAGCAG GCTGGAATTACCGCGGCTG
TNFα CAGACCCTCACACTCAGATC TGTCCCTTGAAGAGAACCTG
iNOS GCCACGGAAGAGACGCACAGG TGGGTCTTCGGGCTTCAGGTTATT
COX-2 GATTGACAGCCCACCAACTT CGGGATGAACTCTCTCCTCA
IL1-β GCTCTCCACCTCAATGGACAG ACTCTCCAGCTGCAGGGT
A reação de PCR consistiu da seguinte mistura:
• 1x tampão de PCR (10X)
• 1,5 mM de MgCl2 (50mM)
• 0,2 mM de deoxinucleotídeos (10mM cada)
• 0,2 µM primer senso (2µM)
• 0,2 µM primer antisenso (2µM)
• 1 µL de cDNA
• 0,025 U/µL de Taq DNA polimerase (Invitrogen)
• Água miliQ autoclavada para completar volume final de 10 µL
A reação seguiu para o termociclador que foi iniciada com uma
temperatura de desnaturação de 95°C por 5 minutos. Em seguida, foram realizados
35 ciclos de amplificação com uma temperatura de 95°C por 30 segundos, uma fase
de anelamento por 30 segundos e temperaturas de 67°C para o primer do gene de
iNOS, 60,4°C de 18S RNAr, 57,9°C de COX2, e 54°C para os primers de IL-1β e
TNFα. Em seguida foi programada uma extensão dos produtos por 1 minuto a 72°C.
Ao término destes 35 ciclos foi executado uma extensão final por 10 minutos à 72°C.
Todas as reações continham controle negativo no qual cDNA era substituído por
água miliQ autoclavada.
88
4.8.3. Eletroforese em gel de agarose
Ao término da reação de PCR, o DNA amplificado, relacionado à
especificidade dos primers utilizados em cada estudo, foi analisado através da
técnica de eletroforese em gel de agarose. A agarose é um polissacarídeo que,
quando suspenso em uma solução (tampão de corrida) contendo Tris-acetato EDTA
(TAE) e aquecido, se dissolve completamente, solidificando-se vagarosamente
conforme a queda da temperatura. A técnica de eletroforese em gel de agarose se
vale do princípio no qual a carga de uma fita de DNA é negativa.
Portanto, uma solução que possua íons livres (eletrolítica) e que tenha
moléculas de DNA em suspensão pode ser purificada aplicando-se uma corrente
elétrica. Ao final do processo as cadeias de DNA estarão próximas ao catodo
(positivo), atraente de moléculas de carga negativa. No entanto, o foco da técnica é
separar os fragmentos por tamanho, uma vez que a reação de PCR gera fragmentos
de DNA com produtos de tamanho específicos de acordo com os primers utilizados.
A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é comparada
com a distância que outros fragmentos de marcadores moleculares de tamanhos
conhecidos percorreram no mesmo gel.
A amostra de DNA amplificado da reação de PCR foi preparada para ser
aplicada nos poços do gel de agarose com a adição de um tampão de amostra que
continha o corante azul de bromofenol glicerol, para aumentar a viscosidade do DNA
amplificado e impedir que o mesmo flutue no tampão de corrida. Ao término das
aplicações das amostras nos poços, foi aplicada uma voltagem de 100 volts entre as
extremidades do gel e uma corrente de 400 mA. A concentração do gel de agarose
foi de 1,5%.
A visualização dos produtos no gel após a corrida ocorreu pela reação de
ligação do DNA com Brometo de Etídio (EtBr). Este composto tem a capacidade de
inserir-se nas fendas da cadeia de DNA e apresenta fluorescência quando excitado
com radiação ultravioleta. Os géis foram imersos em uma solução contendo 10µg/mL
de EtBr e descansaram por alguns minutos.
Os géis foram fotodocumentados pelo equipamento ChemiDoc XS (Bio-
Rad) e a intensidade da bandas dos genes foi analisada através do método da
quantificação relativa utilizando o gene de referência da cadeia 18S do RNA
ribossômico.
89
4.9. ENSAIOS CITOTÓXICOS COM O VENENO BRUTO DA C.d.cascavella
(Cdcasca)
Os experimentos com células tumorais in vitro foram realizados sob
orientação dos Professores Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho e Dra. Letícia Veras
Costa Lotufo no Laboratório de Oncologia Experimental (LOE) da Universidade
Federal do Ceará – UFC.
4.9.1. Estudo da citotoxicidade em células tumorais in vitro
Análise de citotoxicidade pelo método do MTT (sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-
2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium) vem sendo utilizada no programa de
screening do National Cancer Institute (NCI), que testa mais de 10.000 amostras a
cada ano (quadro 02). É um método rápido, sensível e barato. Foi descrita
primeiramente por Mosman em 1983 e modificado por Alley em 1996, tendo a
capacidade de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise
colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-
brometo de tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas
mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente ativas.
A citotoxicidade realizada através do método do MTT (Mosmann, 1983)
utilizou as seguintes linhagens celulares: SF-295 (Tumor de Sistema Nervoso
Central humano), HL-60 (Leucemia humana), MDAMB-435 (Tumor de Mama
humano) e HCT-8 (Tumor de Cólon humano), todas estas linhagens foram obtidas
pelo Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI – EUA).
As linhagens celulares foram cultivadas em frascos plásticos para cultura
com meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) complementado com 10% de
soro fetal bovino e 1% de antibióticos. As células foram incubadas em estufa a 37°C
com atmosfera de 5% de CO2. O VB da C.d.cascavella foi utilizado nas
concentrações de 5,10 e 15 µg/mL e incubado juntamente com as células tumorais
por 72h.
As células tumorais em suspensão ou monocamadas foram plaqueadas
em multiplacas de 96 cavidades em densidades pré-estabelecidas para cada
90
linhagem. A substância teste (VB da C.d.cascavella) foi então incubada durante 72
horas juntamente com a suspensão de células.
Após o período de incubação, as placas foram centrifugadas (1000 rpm/5
min), e o sobrenadante descartado. Cada cavidade recebeu 200µL da solução de
MTT (10% em meio RPMI 1640) e foi reincubada durante 3 horas, em estufa a 37°C
e a 5% CO2. Após esse período, as placas foram novamente centrifugadas (1000
rpm/5min), o sobrenadante desprezado e o precipitado ressuspendido em 150µL de
DMSO (Dimetil Sulfóxido).
Para a quantificação do sal reduzido nas células vivas, as absorbâncias
foram lidas com o auxílio do espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de
550nm.
O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir facilmente a
citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação (figura 25).
Os danos de membrana plasmática causados pelo VB da C.d.cascavella
foram investigados em eritrócitos de ratos após 1, 2 e 4 horas de incubação com
solução salina.
QUADRO 02: Linhagens de células cultivadas em meio de cultura cedidas pelo
National Cancer Institute (NCI-EUA).
Linhagem Celular Origem
SF-295 Sistema Nervoso Central
HL60 Leucemia
MDA-MB-435 Mama
HCT-8 Cólon
91
Contagem Diluição
Incubação com as amostras
72 h72 h3 h3 h
MTT
Absorbância em 550nm
Cultura de células
FIGURA 25: Figura esquemática do ensaio de citotoxicidade pelo Método
MTT (sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium).
4.9.2. Análise dos dados
A substância foi testada em diluição seriada, em duplicata ou triplicata. Foi
plotado o gráfico absorbância x concentração e determinado suas CI50 (concentração
inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo) e seus respectivos
intervalos de confiança (IC 95%) realizado a partir de regressão não-linear utilizando
o programa Prism versão 4.0 (GraphPad Software).
4.9.3. Inibição da síntese de DNA
A Bromodeoxiuridina (BrDU) é uma base nitrogenada análoga a Timina.
Quando as células estão sintetizando o DNA o BrDU é incorporado no lugar da
Timina. A detecção do BrDU incorporado nas células é feita por técnicas
imunohistoquímicas. O BrDU é adicionado 3h antes do término do período de
incubação, para que esse seja incorporado ao DNA das células em mitose. Em
92
seguida são adicionados os anticorpos e um cromógeno específico, a
diaminobenzidina (DAB). Para corar as células não marcadas pelo cromógeno,
utiliza-se Hematoxilina (0,1%). São contadas as 200 (duzentas) primeiras células
observadas em microscópio óptico. Considera-se positivas para proliferação, as
células de núcleo corado pelo DAB (cor marrom) e, negativas, as células de núcleo
corado com Hematoxilina (cor azul).
Três horas após a adição do BrDU na cultura de células HL-60 (0,3 x 106),
lâminas para cada amostra foram preparadas e postas para secar por 2h. Após o
período de secagem foram fixadas em metanol: ácido acético (7:1,5) por 5 minutos.
As células foram lavadas com tampão Tris (TBS) e incubadas em solução
desnaturante por 90 minutos a 70°C e pH 7,4. Após uma segunda lavagem com
TBS, as células foram circuladas cm caneta hidrofóbica e incubadas com anticorpo
primário e deixadas na geladeira durante a noite em câmara úmida. As células foram
incubadas com anticorpo secundário biotinado por 20 minutos e, em seguida, com a
solução de estreptavidina-fluoresceína por mais 20 minutos.
Foi adicionado o cromógeno DAB por 1-5 minutos e, em seguida, removido
com água destilada. A contracoloração das células foi realizada com hematoxilina da
Hanks a 0,1%. A Doxorrubicina (0,3 µL/mL) foi usada como controle positivo.
4.9.3.1 Análise dos dados após a inibição da síntese de DNA pela BrDU
Duzentas células foram contadas diferenciando-as entre núcleo marrom
(incorporaram o BrDU) e o não-marrom. A proporção de células marcadas em
marrom e não-marcadas entre os diferentes grupos foi comparada pelo teste χ2 com
nível de significância de 5% (p<0,05).
4.9.4. Viabilidade celular por exclusão do Azul de Tripan
O teste de exclusão por Azul de Tripan permite qualificar as células viáveis
das células mortas pela substância testada. O corante penetra em todas as células,
porém somente as células viáveis conseguem bombear o tripan para fora, sendo
possível, dessa maneira, observar uma coloração azulada nas células mortas.
93
Células da linhagem HL-60, na concentração de 0.3 x 106 células/mL,
foram incubadas por 24h com as drogas e examinadas ao microscópio de inversão.
A concentração utilizada foi estimada a partir do valor da CI50 encontrada no método
do MTT para esta mesma linhagem celular. Foi retirado 90µL da suspensão de
células e adicionado a 10µL do azul de tripan. As células viáveis e não viáveis foram
diferenciadas e contadas em câmara de Newbauer. A Doxorrubicina (0,3 µL/mL) foi
usada como controle positivo.
4.9.5. Análise Morfológica – Coloração por Hematoxilina-Eosina (HE)
A coloração utilizada nesse experimento permite distinguir o citoplasma e o
núcleo, sendo possível analisar a célula quanto a sua integridade nuclear, bem como
alterações no citoplasma. A hematoxilina é um corante alcalino que tem afinidade
pelas proteínas nucleares, dando ao núcleo uma cor azul. A eosina, ao contrário,
liga-se ao citoplasma conferindo-lhe uma coloração rósea.
Células da linhagem HL-60, plaqueadas na concentração de 0,3 x 106
cél/mL, foram incubadas por 24h com as drogas e examinadas ao microscópio de
inversão. A concentração utilizada foi estimada a partir do valor da CI50 encontrada
no método do MTT para esta mesma linhagem celular. Para observar a morfologia,
50µL da suspensão de células foram adicionadas a centrífuga de lâmina (cytospin).
Após a adesão das células na lâmina a fixação foi feita com etanol 96% por 5
minutos e a coloração primeiramente utilizada foi a hematoxilina, seguida pela
eosina.
4.9.5.1 Análise dos dados após a análise morfológica pela coloração por HE
As lâminas contendo as células coradas foram levadas ao microscópio de
luz para avaliação das suas características morfológicas e comparadas ao controle
(não-tratadas).
94
4.9.6. Atividade antiproliferativa em Células Periféricas Mononucleares do
Sangue – Ensaio do Alamar Blue
A técnica do Alamar blue utiliza o indicador de óxido-redução (redox). O
Alamar blue ou resazurina (azul e não fluorescente) é reduzido por células viáveis a
resorufina (róseo e altamente fluorescente) que pode ser reduzido a hidroresorufina
(incolor e não fluorescente).
Com intuito de investigar a sensibilidade da proliferação de células
normais, o veneno bruto da C.d.cascavella foi diluído em DMSO na concentração de
1mg/mL (solução estoque) e testada em células periféricas mononucleares do
sangue durante 72h de exposição. Sangue heparinizado foi coletado de voluntários
sadios e as células periféricas mononucleares foram isoladas segundo gradiente de
centrifugação de Ficoll-Hypaque.
As células mononucleares foram lavadas com solução tampão fosfato
estéril e ressuspendidas em meio RPMI 1640 (mistura de sais enriquecidos com
aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para o crescimento celular)
suplementado com 20% de soro fetal bovino, 100U/mL, 100µg/mL de estreptomicina
e 4% de fitohemaglutinina. As células foram plaqueadas na concentração de 0,3x106
cél./mL. Após 24h de incubação o veneno bruto da C.d.cascavella foi adicionado a
cada poço por 72h.
Doxorrubicina foi utilizada como controle positivo. 24h antes do fim do
período de incubação, 10 µL de solução estoque (0,312 mg/mL) de Alamar blue
(resazurina, Sigma-Aldrich Co.) foi adicionada a cada poço. A absorbância foi
determinada nos comprimentos de onda de 570nm (estado reduzido) e 595nm
(estado oxidado), utilizando um leitor multiplaca (DTX 880 Multimode Detector,
Beckman Coulter). A percentagem de Alamar blue reduzido foi calculada segundo a
fórmula: % reduzido = ALW – (AHW x RO) x 100.
Onde: ALW = representa a leitura do estado reduzido
AHW = representa a leitura do estado oxidado
RO = representa a divisão AOLW /AOHW.
AOLW = representa a absorbância do meio sozinho subtraído da absorbância
do meio com Alamar blue em baixo comprimento de onda.
95
AOHW= representa a absorbância do meio sozinho subtraído da absorbância
do meio com Alamar blue em alto comprimento de onda.
4.9.7. Citometria de Fluxo
4.9.7.1. Determinação da integridade da membrana celular
A integridade da membrana das células foi avaliada pela exclusão do
Iodeto de Propídeo (PI)(50 µg/mL). O teste baseia-se na capacidade do iodeto de
propídeo penetrar nas células cuja membrana esteja rompida e após a ligação ao
DNA emitir alta fluorescência quando é excitado pelo laser. As células com
membrana íntegra emitem baixa fluorescência. Células HL-60 foram tratadas com o
VB da C.d.cascavella nas concentrações de 5,10 e 15 µg/mL por 24h.
As células foram recolhidas (500µL) e depositadas em um tubo para
centrifugação a 2000 rpm/5min. O sobrenadante foi descartado e 500µL de PBS foi
adicionado, 50µL do IP (2µL/mL) também foi adicionado 5 minutos antes da leitura
no citômetro de fluxo.
4.9.7.2. Fragmentação do DNA
Esse teste baseia-se na capacidade do Iodeto de Propídeo (PI) se ligar ao
DNA. Inicialmente a membrana é lisada por um detergente para que o PI possa se
ligar ao núcleo. Células com núcleo integro emitirão alta fluorescência, já núcleos
com condensação da cromatina e DNA fragmentado incorporam menos PI e por isso
emitem menor fluorescência sugestivo de apoptose. Células HL-60 foram tratadas
com o VB da C.d.cascavella nas concentrações de 5,10 e 15 µg/mL por 24h.
As células foram recolhidas (1,5mL) e depositadas em tubo para
centrifugação a 5000 rpm/2min. O sobrenadante foi descartado e 200µL de solução
de lise (0,1% de citrato de sódio, 0,1% de Triton X-100 e 2µL/mL iodeto de propídio
em PBS) foi adicionada. Após um período de 30 minutos onde os tubos
permaneceram no escuro, as amostras foram analisadas no citômetro de fluxo.
96
4.9.7.3. Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria
Este teste baseia-se na capacidade da mitocôndria seqüestrar a rodamina
123, um corante fluorescente. Quando esta apresenta potencial transmembrânico
inalterado, as células com rodamina emitem alta fluorescência quando atingidas pelo
laser. Alterações no potencial mitocondrial transmembrânico levam ao efluxo da
rodamina de dentro da mitocôndria, gerando eventos que levarão a menor
fluorescência, quando comparado com as células que possuem mitocôndrias
normais. Foi realizado este teste com o VB da C.d.cascavella nas concentrações de
5,10 e 15 µg/mL por 24h de incubação.
As células HL-60 foram recolhidas (1mL) e depositadas em tubo para
centrifugação a 2000 rpm/5min. O sobrenadante foi descartado e 500µL da solução
de rodamina 1µL/mL foi adicionada. Após 15 minutos de incubação no escuro, a
suspensão de células foi novamente centrifugada por 2000 rpm/5min. Para efetuar a
leitura no citômetro de fluxo, o sobrenadante foi descartado e 500µL de PBS foram
acrescentados por 30 minutos.
4.9.7.4. Análise dos dados obtidos no citômetro de fluxo
A fluorescência das células foi determinada por citometria de fluxo no
citômetro Mini Guava usando o software Guava Express Plus, onde cinco mil
eventos foram avaliados.
Todos os dados obtidos no citômetro de fluxo foram apresentados como
média e o desvio padrão da média dos experimentos. Análise estatística realizada
pela análise de variância (ANOVA), seguido por Student Newman-Keuls e teste
Dunnet com o nível de significância de 5%.
4.10. ASPECTOS ÉTICOS
Este Projeto foi devidamente submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa
com Animais da Universidade Federal do Ceará, atendendo a todas as normas de
cuidados com animais.
97
RESULTADOS
98
5. RESULTADOS
5.1. RESULTADOS DOS EXPERIMENTOS REALIZADOS COM O VENENO
BRUTO DA Crotalus durissus cascavella (Cdcasca)
5.1.1. MODELO EXPERIMENTAL DE PRESSÃO ARTERIAL EM RATOS
5.1.1.1. Efeitos do Veneno Bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) nas Freqüências
Cardíaca, Respiratória e na Pressão Arterial Média.
O veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) utilizado nos experimentos foi
injetado no volume final de 0,1 e 0,3mL lentamente pela veia jugular na forma de
Bolus, com intervalo mínimo entre as injeções de 10 minutos. As freqüências
cardíaca (FC) nas doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL (Controle = ±150bat/min.;
Cdcasca(0,1µg/mL) = ±100bat/min.; Cdcasca(0,3µg/mL) = ±50bat/min.) e respiratória (FR)
também nas doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL (Controle = ±40mL/min.;
Cdcasca(0,1µg/mL) = ±25mL/min.; Cdcasca(0,3µg/mL) = ±15mL/min.) reduziram
significativamente após a infusão do veneno da Crotalus durissus cascavella
(Cdcasca) (figuras 26a/ b).
Nas doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL o veneno da Cdcasca diminuiu a
pressão arterial média (PAM) (Controle = ±100mmHg; Cdcasca(0,1µg/mL) = ±70mmHg;
Cdcasca(0,3µg/mL) = ±55mmHg) de forma dose-dependente (figura 27).
99
Controle Cdcasca 0,1µµµµg/mL Cdcasca 0,3µµµµg/mL0
50
100
150
200
*
*
Fre
qu
ênci
a C
ard
íaca
(bat
/min
)
Controle Cdcasca 0,1µµµµg/mL Cdcasca 0,3µµµµg/mL0
10
20
30
40
50
60
*
*
Fre
qu
ênci
a R
esp
irat
óri
a(m
L/m
in.)
FIGURA 26: Efeitos do Veneno Bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) na
freqüência cardíaca (FC) (a) e freqüência respiratória (FR) (b). Nas doses
de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL a FC (a) demonstrou uma redução significativa nos
batimentos cardíacos (Controle=±150bat/min.; Cdcasca(0,1µg/mL)= ±100bat/min.;
(Cdcasca(0,3µg/mL)= ±50bat/min.).Nas doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL a FR
(b)reduziu significativamente
(Controle=±40mL/min.;Cdcasca(0,1µg/mL)=±25mL/min.;Cdcasca(0,3µg/mL)=
±15mL/min.) A análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA (teste de
Bonferroni) e teste t de Student, considerando p<0,05. Os dados são
expressos em média ± E.P.M., comparando com o respectivo grupo controle
em cada dose.
a)
b)
100
Controle Cdcasca 0,1µµµµg/mL Cdcasca 0,3µµµµg/mL0
25
50
75
100
125
150
**
Pre
ssão
Art
eria
l M
édia
(mm
Hg
)
FIGURA 27: Efeitos do Veneno Bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) na
pressão arterial média (PAM) em ratos anestesiados. a) Registro da queda
da PAM em um polígrafo de 4 canais. b) Nas doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL
a PAM demonstrou uma redução significativa comparando ao controle
(Controle=±100mmHg;Cdcasca(0,1µg/mL)=±70mmHg;Cdcasca(0,3µg/mL)=±55mmHg
A análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA (teste de Bonferroni) e
teste t de Student, considerando p<0,05. Os dados são expressos em média ±
E.P.M., comparando com o respectivo grupo controle em cada dose.
b)
a)
101
5.1.1.2. Efeitos do Veneno Bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) após bloqueio
farmacológico com o L-Name na Pressão Arterial Média.
Após o bloqueio farmacológico com L-Name (10mg/Kg i.p.) nos
experimentos de pressão arterial utilizando o veneno bruto da C.d.cascavella
(Cdcasca) observou-se que nas doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL o veneno da
Cdcasca apresentou aumento significativo (p<0,05) da pressão arterial média (PAM)
(Controle = ±95mmHg; L-Name = ±155mmHg; Cdcasca(0,1µg/mL) = ±150mmHg;
Cdcasca(0,3µg/mL) = ±135mmHg) depois da infusão de L-NAME 30 minutos antes do
Cdcasca (figuras 28). A mesma pressão arterial manteve-se alta comparando-a ao
grupo controle, até o término do experimento.
Controle L-NAME 10mg/Kg Cdcasca 0,1 µµµµg/mL Cdcasca 0,3µµµµg/mL0
25
50
75
100
125
150
175 **
*
Pre
ssão
Art
eria
l M
édia
(mm
Hg
)
FIGURA 28: Efeitos do Veneno Bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) na
pressão arterial média (PAM) após bloqueio farmacológico com o L-
Name (10mg/Kg) nas doses de 0,1µµµµg/mL e 0,3µµµµg/mL. Nas doses de
0,1µg/mL e 0,3µg/mL a PAM apresentou aumento significativo (p<0,05)
comparando-a ao grupo controle (Controle=±95mmHg; L-Name=±155mmHg;
Cdcasca(0,1µg/mL)=±150mmHg; Cdcasca(0,3µg/mL)=±135mmHg). A análise
estatística foi realizada pelo teste ANOVA (teste de Bonferroni) e teste t de
Student, considerando p<0,05. Os dados são expressos em média ± E.P.M.,
comparando com o respectivo grupo controle em cada dose.
102
5.1.1.3 DOSAGEM DE NITRITO APÓS EXPERIMENTOS DE PRESSÃO
ARTERIAL COM O VENENO BRUTO DA C.d.cascavella (Cdcasca)
Após a infusão do Cdcasca (dose de 0,3µg/mL) nos grupos experimentais
de pressão arterial foi realizada a coleta de sangue da artéria carótida, antes da
morte de cada animal. Após a reação de Griess (descrita em material e métodos)
observou-se um aumento significativo na produção de nitrito (µmol) logo após os 30
minutos de infusão do Cdcasca (Controle30min = ±50µmol; Cdcasca 30min = ±135µmol).
Aos 90 e 180 minutos de infusão do Cdcasca houve um aumento na produção de
nitrito quando comparados aos seus respectivos grupos controle (Controle90min =
±35µmol; Cdcasca90min = ±75µmol e Controle180min = ±15µmol; Cdcasca180min =
±50µmol) (figura 29).
O bloqueio farmacológico com L-Name (10mg/Kg) 30 minutos antes da
infusão do Cdcasca no sistema de pressão arterial demonstrou uma diminuição
significativa (p<0,05) na produção de nitrito comparando-o ao grupo tratado com VB
(Controle = ±20µmol; Cdcasca = ±115µmol; L-Name = ±25µmol). O nível de nitrito
após o bloqueio se manteve próximo ao grupo controle (figura 30).
Controle 30min Cdcasca 30min Controle 90min Cdcasca 90min Controle 180min Cdcasca 180min0
25
50
75
100
125
150
175
200
*
**
Nit
rito
( µµ µµ m
ol)
FIGURA 29: Dosagem de nitrito (µmol) após a inoculação do veneno
bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) nos grupos experimentais de pressão
arterial, na dose de 0,3µµµµg/mL. As dosagens foram realizadas aos 30, 90 e
180 minutos após a infusão do Cdcasca. Logo após os 30 primeiros minutos
observamos um aumento significativo (p<0,05) na produção de nitrito
(Controle30min=±50µmol; Cdcasca 30min=±135µmol). Aos 90 e 180 minutos de
103
infusão do Cdcasca houve um aumento na produção de nitrito quando
comparados aos seus respectivos grupos controle (Controle90min=±35µmol;
Cdcasca90min=±75µmol e Controle180min=±15µmol; Cdcasca180min=±50µmol). A
análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA (teste de Bonferroni) e teste
t de Student, considerando p<0,05. Os dados são expressos em média ±
E.P.M., comparando com o respectivo grupo controle em cada tempo de
dosagem.
Controle Cdcasca 0,3µg/mL Cdcasca 0.3mg/mL+ L-Name0
25
50
75
100
125
150
*
Nit
rito
( µµ µµ m
ol)
FIGURA 30: Dosagem de nitrito (µmol) após o bloqueio farmacológico
com L-Name (10mg/Kg i.p.) 30 minutos antes da inoculação do veneno
bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) nos grupos experimentais de pressão
arterial, na dose de 0,3µµµµg/mL. Observamos um aumento significativo
(p<0,05) na produção de nitrito (Controle=±20µmol; Cdcasca=±115µmol) com
o Cdcasca. Após o bloqueio farmacológico com L-Name (10mg/Kg i.p.) 30
minutos antes da inoculação do Cdcasca foi evidente a diminuição na
produção de nitrito (Cdcasca+L-Name=±25µmol). A análise estatística foi
realizada pelo teste ANOVA (teste de Bonferroni) e teste t de Student,
considerando p<0,05. Os dados são expressos em média ± E.P.M.,
comparando com o respectivo grupo controle em cada tempo de dosagem.
104
5.1.2. ANÁLISE HISTOLÓGICA APÓS INOCULAÇÃO DO VENENO BRUTO DA
C.d.cascavella (Cdcasca) NOS ENSAIOS DE PRESSÃO ARTERIAL
No grupo tratado com o veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) foram
observados fenômenos degenerativos reversíveis representados por material
proteináceo no glomérulo renal (figuras 31a/b) e túbulos contorcidos proximais e
distais (figura 32). No interstício renal e região perivascular (figura 33) observou-se
infiltrado inflamatório com a presença de linfócitos e plasmócitos.
No tecido pulmonar (figuras 34a/b) e no músculo estriado cardíaco (36a/b)
foram evidenciados intensos infiltrados inflamatórios polimorfonucleares e discretos
infiltrados a nível hepático (figura 37) e cerebral (figura 39).
A observação de congestão vascular hepática intensa é analisada nas
figuras 38a/b e evidenciou-se hemorragia intersticial pulmonar intensa na figura 35.
Grupo A (controle) Grupo B (tratado)
FIGURA 31: Fotomicrografia de rim de rato evidenciando o glomérulo
renal, ao final do experimento de pressão arterial com veneno bruto da
C.d.cascavella (Cdcasca). No grupo B tratado com o Cdcasca (0,3µg/mL)
observou-se a presença de material proteináceo no espaço de Bowman (seta)
No grupo A identificou-se um rim normal, com glomérulo e túbulos renais
normais (setas). (H.E.), (aumento 400x).
105
FIGURA 32: Fotomicrografia de rim de rato evidenciando os túbulos
renais, ao final do experimento de pressão arterial na presença do
veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) (0,3µµµµg/mL). Nesta figura
observou-se a presença de material proteináceo na luz dos túbulos renais e
vacuolização do epitélio cúbico simples (setas). (H.E.), (aumento 400x).
FIGURA 33: Fotomicrografia de rim de rato evidenciando vaso sangüíneo
intersticial, ao final do experimento de pressão arterial na presença do
veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) (0,3µµµµg/mL). Nesta figura
identificou-se a presença de infiltrado inflamatório com linfócitos e plasmócitos
na região perivascular (seta). (H.E.), (aumento 400x).
106
a) Vaso Congesto e Infiltrado Inflamatório. b) Infiltrado Inflamatório, Vasos Congestos e
Hemorragia Intra-alveolar.
FIGURA 34: Fotomicrografia de pulmão de rato ao final do experimento
de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella
(Cdcasca) (0,3µµµµg/mL). a) Observou-se infiltrado inflamatório pulmonar
intenso – “Manguito Perivascular” (seta cheia) e um vaso congesto ( ); b)
Evidenciou-se infiltrado inflamatório linfocitário inter-alveolar (seta cheia) e
congestão vascular de pequenos vasos e capilares (seta cheia), bem como
hemorragia intra-alveolar ( ). (H.E.), (aumento 400x).
107
FIGURA 35: Fotomicrografia de pulmão de rato ao final do experimento
de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella
(Cdcasca) (0,3µµµµg/mL). Observou-se hemorragia intersticial e intra-alveolar
intensa (seta). (H.E.), (400x).
a) Infiltrado Inflamatório no Tecido Muscular
Estriado Cardíaco (aumento 40X).
b) Infiltrado Inflamatório no Tecido Muscular
Estriado Cardíaco (aumento 100X).
FIGURA 36: Fotomicrografia de coração de rato ao final do experimento
de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella
(Cdcasca) (0,3µµµµg/mL). Identificou-se infiltrado polimorfonuclear cardíaco
intenso no miocárdio (seta cheia) e próximo ao epicárdio que constitui o
pericárdio visceral ( )(H.E.), a) Tecido muscular estriado cardíaco no
aumento de 40X e b) Tecido muscular estriado cardíaco no aumento de 100 x.
108
FIGURA 37: Fotomicrografia de fígado de rato ao final do experimento de
pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella
(Cdcasca) (0,3µµµµg/mL). Observou-se infiltrado inflamatório de
polimorfonucleares discreto no tecido hepático (seta cheia) próximo a uma
veia central ( ) (H.E.), (aumento 400x).
FIGURA 38: Fotomicrografia de fígado de rato ao final do experimento de
pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella
(Cdcasca) (0,3µµµµg/mL). a) Evidenciou-se congestão vascular (grande vaso)
hepática intensa (seta) e b) Observando veias centrolobulares congestas
(setas). (H.E.), (aumento 40x).
109
FIGURA 39: Fotomicrografia de cérebro de rato ao final do experimento
de pressão arterial na presença do veneno bruto da C.d.cascavella
(Cdcasca) (0,3µµµµg/mL). Observou-se infiltrado linfopolimorfonuclear discreto
no tecido do córtex cerebral (seta). (H.E.), (aumento 400x).
5.1.3. PERFUSÃO EM LEITO VASCULAR MESENTÉRICO
5.1.3.1. Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) em leito vascular
mesentérico
A pressão de perfusão no leito vascular mesentérico não apresentou
mudança significativa (p>0,05) após a infusão do veneno bruto de Crotalus durissus
cascavella (Cdcasca) (10µg/mL/min). Este efeito observado foi obtido através de
preparações com endotélio intacto (figura 40).
110
0 20 40 60 800
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
BASAL Cdcasca FENILEFRINA (PHE) PHE. + Cdcasca.
Tempo (min.)
Pre
ssão
(m
mH
g)
FIGURA 40: Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca)
(10µµµµg/mL/min) na pressão do leito vascular mesentérico em preparações
com endotélio intacto. A pressão de perfusão no leito vascular mesentérico
não apresentou mudança significativa após a infusão do Cdcasca. Foi
demonstrada a validade funcional do sistema pela vasoconstricção induzida
pela fenilefrina. Os dados são expressos em média ± E.P.M.. Análise
estatística foi realizada pelo teste ANOVA (teste de Bonferroni) e teste t de
Student, considerando p<0,05.
5.1.4 ENSAIOS CITOTÓXICOS
5.1.4.1 Efeitos citotóxicos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) pelo
Método do MTT (sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de
tetrazolium)
O Cdcasca demonstrou inibição de crescimento após 24 horas de
incubação com a linhagem tumoral HL-60 (Leucemia), apresentando concentração
inibitória média (CI50) de 7,784 (78%) (p<0,05) (figura 41).
O Cdcasca foi fortemente citotóxico após 72 horas de incubação nas
concentrações inibitórias médias de: 0.66; 1.56; 3.01 e 3.30µg/mL nas linhagens
tumorais de HL-60 (Leucemia); MDA-MB435 (Tumor de Mama); HCT-8 (Tumor de
Cólon); e SF-295 (Tumor de Sistema Nervoso), respectivamente. O Cdcasca não
111
demonstrou nenhuma atividade hemolítica nas concentrações testadas nos períodos
de 1; 2; e 4 horas de observação, após a sua administração em eritrócitos, com
concentração efetiva (CE50) >500 µg/mL,) (p<0,05) (tabela 02).
-2 -1 0 1 20
25
50
75
100Cdcasca 24h
*
Log [µµµµg/mL]
% d
e I
nib
içã
o d
oC
res
cim
en
to
FIGURA 41: Efeitos citotóxicos do veneno bruto da C.d.cascavella
(Cdcasca) pelo Método do MTT (sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-
brometo de tetrazolium) sobre a inibição de crescimento tumoral da
linhagem HL-60 (Leucemia). O Cdcasca demonstrou inibição de crescimento
após 24 horas de incubação com a linhagem tumoral HL-60 (leucemia), com
concentração inibitória média (CI50) de 75% nas células leucêmicas. Para a
análise estatística utilizou-se o teste t-Student e Student Newman Keuls com
p<0,05.
112
TABELA 02: Valores de CI50 e CE50 (µg/mL) para veneno bruto da C.d.cascavella
(Cdcasca) pelos métodos MTT (sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-
brometo de tetrazolium) e atividade hemolítica. Nos ensaios tumorais utilizando
as linhagens de Leucemia (HL-60); Tumor de Mama (MDA-MB435); Tumor de Cólon
(HCT-8); e Tumor de Sistema Nervoso (SF-295), observou-se forte atividade
citotóxica após 72 horas, nas concentrações inibitórias médias (CI50) de 1.56; 3.01;
3.30; e 0.66 µg/mL, respectivamente. O Cdcasca não demonstrou nenhuma
atividade hemolítica nas concentrações testadas nos períodos de 1; 2; e 4 horas de
observação após a sua administração em eritrócitos (concentração efetiva (CE50)
>500 µg/mL,). Para a análise estatística utilizou-se o teste t-Student e Student
Newman Keuls com p<0,05.
5.1.4.2 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a Incorporação
de Bromodeoxiuridina (BrDU) e Inibição da Síntese de DNA
A Bromodeoxiuridina (BrDU) é uma base nitrogenada análoga a Timina. A
incorporação do BrDU às células é compatível com a síntese de DNA. Desta forma,
não houve redução da síntese de DNA nas células HL-60 (Leucemia) tratadas com o
Cdcasca em todas as concentrações utilizadas 5, 10 e 15 µg/mL (controle positivo
Doxorrubicina (DOX) ±10%; Cdcasca5 ±27%; Cdcasca10 ±25%; Cdcasca15 ±25%) em
relação ao grupo controle (controle ±30%). Pois, não foi identificado redução na
incorporação do BrDu nas células tratadas (p>0,05) (figura 42).
>500 >500 >500 0,6572 3,012 3,304 1,564 Cdcasca
4h 2h 1h 72h 72h 72h 72h
Eritrócitos SF-295 MDA-MB435
HCT-8 HL-60
CE50 (µg/mL) CL50 (µg/mL)
24h
7,784
113
Controle DOX 5µµµµg/mL 10µµµµg/mL 15µµµµg/mL
0
5
10
15
20
25
30
35
*
Cdcasca Cdcasca Cdcasca
% d
e In
corp
ora
ção
de
BrD
U
FIGURA 42: Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a
incorporação de Bromodeoxiuridina (BrDU) e inibição da síntese de DNA nas
células HL-60 (Leucemia) em 24 horas de incubação. O Cdcasca não apresentou
inibição significativa da síntese de DNA (p>0,05) das células tratadas em todas as
concentrações utilizadas (5,10 e 15 µg/mL) (controle ±30%; controle positivo
Doxorrubicina (DOX) ±10%; Cdcasca5 ±27%; Cdcasca10 ±25%; Cdcasca 15 ±25%).
Para a análise estatística utilizou-se o teste t-Student e Student Newman Keuls com
p<0,05.
5.1.4.3 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) em Células
Periféricas Mononucleares do Sangue – Ensaio do Alamar Blue
Ao investigar a sensibilidade da proliferação de células normais tratadas
com o veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca), observou-se que o Cdcasca na
concentração testada de 0,312 mg/mL não apresentou atividade na proliferação de
células periféricas mononucleadas do sangue.
114
5.1.4.4 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a Viabilidade
celular por exclusão do Azul de Tripan
Após o teste de exclusão por Azul de Tripan, as células da linhagem HL-60
(Leucemia) tratadas com o veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) nas
concentrações de 5,10 e 15 µg/mL apresentaram diminuição significativa na
viabilidade celular (controle positivo Doxorrubicina (DOX) ±90 células x 104/mL;
Cdcasca5 ±95 células x 104/mL; Cdcasca10 ±95 células x 104/mL e Cdcasca15 ±88
células x 104/mL) em relação ao grupo controle (controle ±125 células x 104/mL). O
corante penetra em todas as células, porém somente as células viáveis conseguem
bombear o Tripan para fora, sendo possível desta maneira observar uma coloração
azulada nas células mortas (p<0,05) (figura 43).
Controle DOX 5µµµµg/mL 10µµµµg/mL 15µµµµg/mL
0
50
100
150
* ** *
Nú
mer
o d
e cé
lula
s x
104/m
L
Cdcasca Cdcasca Cdcasca
FIGURA 43: Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a
viabilidade celular por exclusão do Azul de Tripan. O número de células viáveis
diminuiu após o tratamento com o Cdcasca nas concentrações de 5, 10e 15 µg/mL
(controle ±125 células x 104/mL; controle positivo Doxorrubicina (DOX) ±90 células x
104/mL; Cdcasca5 ±95 células x 104/mL; Cdcasca10 ±95 células x 104/mL; Cdcasca15
±88 células x 104/mL). Para a análise estatística utilizou-se o teste t-Student e
Student Newman Keuls com p<0,05.
115
5.1.4.5 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a
fragmentação do DNA detectada por Citometria de Fluxo
Após o tratamento das células HL-60 (Leucemia) com o veneno bruto da
C.d.cascavella (Cdcasca) demonstrou-se que ocorre fragmentação do DNA
significativa nas concentrações de 10 e 15 µg/mL (controle ±2,5%; controle positivo
Doxorrubicina (DOX) ±45%; Cdcasca10 ±8%; Cdcasca15 ±9%). A fragmentação foi
avaliada por fluorescência nuclear usando Iodeto de Propídeo, Triton X-100 e citrato
detectada por citometria de fluxo. O Triton lisa a membrana celular das células
leucêmicas e o Iodeto de Propídeo (PI) se liga ao DNA. As células com núcleos
íntegros emitem alta fluorescência e as células com condensação da cromatina e
DNA fragmentado emitem baixa fluorescência (p<0,05) (figura 44).
Controle DOX 5µµµµg/mL 10µµµµg/mL 15µµµµg/mL05
10152025303540455055
* *
*
% d
a F
rag
men
taçã
o d
oD
NA
FIGURA 44: Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre a
fragmentação do DNA avaliada por fluorescência nuclear usando Iodeto
de Propídeo (PI), Triton X-100 e citrato detectada por citometria de fluxo.
O número de células viáveis diminuiu após o tratamento com o Cdcasca nas
concentrações de 5 e 15 µg/mL (controle ±2,5%; controle positivo
Doxorrubicina (DOX) ±45%; Cdcasca10 ±8%; Cdcasca15 ±9%). Para a análise
estatística utilizou-se o teste t-Student e Student Newman Keuls com p<0,05.
116
5.1.4.6 Efeitos do veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca) sobre o Potencial
Transmembrânico da Mitocôndria detectado por Citometria de Fluxo
Nos experimentos utilizando células HL-60 (Leucemia) incubadas por 24h
com o veneno bruto da C.d.cascavella (Cdcasca), nas concentrações de 5,10 e 15
µg/mL demonstraram que não houve diferença estatística (p>0,05) em relação à
despolarização da membrana mitocondrial das células tratadas com o Cdcasca.
Nestes ensaios foi utilizado a rodamina 123, um corante fluorescente, que
a mitocôndria tem a capacidade da seqüestrar, quando esta apresenta potencial
transmembrânico inalterado. As células com rodamina emitem alta fluorescência
quando atingidas pelo laser. Alterações no potencial mitocondrial transmembrânico
levam ao efluxo da rodamina de dentro da mitocôndria.
5.1.4.7 Métodos de análise dos resultados
Os experimentos foram analisados segundo suas médias e respectivos
erros-padrão. O cálculo das CI50 (concentração inibitória média capaz de provocar
50% do efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (CI 95%) foi
realizado a partir de regressão não-linear no programa GraphPad Prism. Para
verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os resultados obtidos em
diferentes tratamentos, utilizou-se o teste t-Student (comparação entre duas médias)
e análise de variância seguida de Student Newman Keuls (comparações múltiplas)
com p<0,05 de significancia.
117
5.2 RESULTADOS DOS EXPERIMENTOS REALIZADOS COM O PEPTÍDEO
NATRIURÉTICO (NP) DA Crotalus durissus cascavella (NPcasca)
5.2.1 MODELO EXPERIMENTAL DE PRESSÃO ARTERIAL EM RATOS
5.2.1.1 Efeitos do Peptídeo Natriurético da Crotalus durissus cascavella
(NPcasca) nas Freqüências Cardíaca, Respiratória e na Pressão Arterial Média.
O peptídeo natriurético isolado da Cdcasca (NPcasca) utilizado nos
experimentos de pressão arterial em ratos foi lentamente injetado pela veia jugular
na forma de Bolus, com intervalo mínimo entre as injeções de 10 minutos. As
freqüências cardíaca (FC) (doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL) (Controle =
±125bat/min.; NPcasca(0,1µg/mL) = ±80bat/min.; (NPcasca(0,3µg/mL) = ± 50bat/min.).e
respiratória (FR) (doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL) (Controle= ± 50mL/min.;
NPcasca(0,1µg/mL) = ±30mL/min.; NPcasca(0,3µg/mL) = ±15mL/min.). reduziram
significativamente (p<0,05) após a sua infusão (figuras 45 a/b).
Nas doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL) o Npcasca diminuiu a pressão arterial
média (PAM) de forma dose-dependente (Controle = ±125mmHg; NPcasca(0,1µg/mL) =
±100mmHg; NPcasca(0,3µg/mL) = ±75mmHg ). (p<0,05) (figuras 46).
118
Controle NPcasca 0,1µµµµg/mL NPcasca 0,3µµµµg/mL
0
50
100
150
200
*
*
Fre
qu
ênci
a C
ard
íaca
(bat
/min
)
Controle NPcasca 0,1µµµµg/mL NPcasca 0,3µµµµg/mL0
10
20
30
40
50
60
*
*
Fre
qu
ênci
a R
esp
irat
óri
a(m
L/m
in.)
FIGURA 45: Efeitos do Peptídeo Natriurético da C.d.cascavella (NPcasca)
na freqüência cardíaca (FC) (a) e freqüência respiratória (FR) (b). Nas
doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL a FC (a) demonstrou uma redução significativa
nos batimentos cardíacos (Controle=±125bat/min.; NPcasca(0,1µg/mL)=
±80bat/min.; (NPcasca(0,3µg/mL)= ±50bat/min.). Nas doses de 0,1µg/mL e
0,3µg/mL a FR (b)reduziu significativamente
(Controle=±50mL/min.;NPcasca(0,1µg/mL)=±30mL/min.;NPcasca(0,3µg/mL)=±15mL/
min.). A análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA (teste de
Bonferroni) e teste t de Student, considerando p<0,05. Os dados são
expressos em média ± E.P.M., comparando com o respectivo grupo controle
em cada dose.
a)
b)
119
Controle NPcasca 0,1µµµµg/mL NPcasca 0,3µµµµg/mL0
25
50
75
100
125
150
175
**
Pre
ssão
Art
eria
l M
édia
(mm
Hg
)
FIGURA 46: Efeitos do Peptídeo Natriurético da C.d.cascavella (Npcasca)
na pressão arterial média (PAM) em ratos anestesiados. a) Registro da
queda da PAM em um polígrafo de 4 canais. b) Após a inoculação em bolus
(IV) de 0,1mL e 0,3mL nas doses de 0,1µg/mL e 0,3µg/mL a PAM demonstrou
uma redução significativa comparando ao controle (Controle=±125mmHg;
NPcasca(0,1µg/mL)=±100mmHg e NPcasca(0,3µg/mL)=±75mmHg. A análise
estatística foi realizada pelo teste ANOVA (teste de Bonferroni) e teste t de
Student, considerando p<0,05. Os dados são expressos em média ± E.P.M.,
comparando com o respectivo grupo controle em cada dose
5.2.1.2 Dosagem de nitrito após experimentos de pressão arterial com o
peptídeo natriurético (NP) da C.d.cascavella (NPcasca)
Após a infusão do Npcasca (dose de 0,1µg/mL) nos grupos experimentais
de pressão arterial foi realizada a coleta de sangue da artéria carótida, antes da
morte de cada animal. Após a reação de Griess (descrita em material e métodos)
a)
b)
120
observamos um aumento significativo (p<0,05) na produção de nitrito (µmol) após a
infusão do Npcasca (Controle = ±20µmol; Npcasca = ±100µmol) (figura 47).
0
25
50
75
100
125
150
Controle
*
NPcasca
Nit
rito
( µµ µµ m
ol)
FIGURA 47: Dosagem de nitrito (µmol) após a inoculação do Peptídeo
Natriurético da C.d.cascavella (Npcasca) nos grupos experimentais de
pressão arterial, na dose de 1,0µµµµg/mL. Observou-se um aumento
significativo (p<0,05) na produção de nitrito quando comparado ao grupo
controle (Controle=±20µmol; NPcasca=±100µmol). A análise estatística foi
realizada pelo teste ANOVA (teste de Bonferroni) e teste t de Student,
considerando p<0,05. Os dados são expressos em média ± E.P.M.,
comparando com o respectivo grupo controle em cada tempo de dosagem.
5.2.2 ANEL DE AORTA
5.2.2.1. Efeito do Peptídeo Natriurético da C.d.cascavella (Npcasca) em banho
isolado de aorta de ratos.
Nos experimentos em banhos isolados de aorta pré-contraídos com
fenilefrina, na presença de endotélio intacto (e+) e na ausência do endotélio (e-),
utilizando o NPcasca nas concentrações de 10-11M a 10-7M, observou-se um efeito
relaxante vascular significativo (p<0,05) com o endotélio intacto (±55% de
121
contração) e na presença de Isatin (10 µM) (±60% de contração), um antagonista
de receptor de guanilato-ciclase -A (GC-A) (figura 48).
Utilizando uma solução isosmótica de potássio-Krebs-Henseleit (K+
80mM), evidenciou-se um aumento significativo (p<0,05) da contração da
musculatura vascular (±90% de contração). Nos experimentos utilizando endotélio
não íntegro observou-se também um aumento significativo (p<0,05) da contração
da musculatura vascular (±95% de contração) (figura 48).
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -60
NPcasca-e+
NPcasca-e-
NPcasca-ISATIN
NPcasca-K+80
50
70
90
110
**** *
***
****
NPcasca (Log M)
Co
ntr
ação
(%
)
FIGURA 48: Curva dose-concentração-resposta do Peptídeo Natriurético
da C.d.cascavella (Npcasca) em anéis de aorta torácica na presença de
endotélio intacto (e+) ou endotélio desnudo (e-) pré-contraídos com
fenilefrina (PE;1 µM). O efeito relaxante vascular do NPcasca foi comparado
em endotélios intactos pré-contraídos com PE e incubados com Isatin (10µM),
um antagonista de receptor de GC-A, 30 minutos após a curva dose-
concentração-resposta de PE. A resposta relaxante também foi estudada em
endotélio intacto pré-contraídos em solução isosmótica de potássio-Krebs-
Henseleit (K+80 mM). Os dados foram expressos em média ± E.P.M e
comparados pelo teste ANOVA seguido pelo teste Tukey. *p<0,05 vs
NPcasca-e+.
122
5.2.3. PERFUSÃO DE RIM ISOLADO COM O PEPTÍDEO NATRIURÉTICO DA
C.d.cascavella (Npcasca)
5.2.3.1. Grupo Controle Perfundido
Os parâmetros renais do grupo controle foram estabelecidos através de um
período experimental de perfusão. Os dados estão expressos como média ± erro
padrão.
5.2.3.2. Efeitos renais do Peptídeo Natriurético isolado da Crotalus durissus
cascavella (NPcasca)
O peptídeo natriurético isolado do veneno da Cdcasca (NPcasca; 0,3 e
0,1 µg/mL) aumentou significativamente a pressão de perfusão (PP) (figura 49a) e a
resistência vascular renal (RVR) (figura 49b) aos 60, 90 e 120 minutos de perfusão,
quando comparados ao grupo controle.
Na dose de 0,3 µg/mL de NPcasca, o fluxo urinário (FU) e o ritmo de
filtração glomerular (RFG) aumentaram significativamente aos 60, 90 e 120 minutos
do experimento, enquanto na dose 0,1 µg/mL o FU aumentou aos 60, 90 e 120
minutos de perfusão e o RFG aumentou aos 90 e 120 minutos, quando comparados
ao grupo controle (figuras 50a/b).
O percentual de transporte total tubular de sódio (%TNa+) e o percentual
de transporte tubular proximal de sódio (%pTNa+) reduziu aos 60, 90 e 120 minutos
de perfusão na dose 0,1 µg/mL. Enquanto na dose de dose 0,3 µg/mL diminuiu aos
120 minutos experimentais (figura 51).
Os transportes total tubular de potássio (%TK+) e cloreto (%TCl-) e o
percentual de transporte tubular proximal de potássio (%pTK+) e cloreto (%pTCl-)
não apresentaram alterações significativas quando comparados ao grupo controle.
123
30 60 90 1200
102030405060708090
100110120130140
Controle
NPcasca 0,3µg/mL
NPcasca 0,1µg/mL
Te mpo (min.)
Pre
ss
ão
de
Pe
rfu
sã
o (
mm
Hg
)
30 60 90 1200.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5
Controle
NPcasca 0,3µg/mL
NPcasca 0,1µg/mL
Te mpo (min.)
Re
sis
tên
cia
Va
sc
ula
r R
en
al
(mm
Hg
/mL
.g-1
.min
-1)
FIGURA 49: Efeitos do peptídeo natriurético isolado da C.d.cascavella
(NPcasca) na pressão de perfusão (PP) (a) e resistência vascular renal
(RVR) (b). O NPcasca nas doses de 0,3 µg/mL e 0,1 µg/mL aumentou
significativamente a PP e a RVR aos 60, 90 e 120 minutos de perfusão, quando
comparados ao grupo controle. Os dados são expressos em média ± E.P.M..
Análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA (teste de Bonferroni) e teste t
de Student, considerando p<0,05. *Comparação entre os diferentes tempos
60, 90 e 120 e o controle interno do grupo (tempo 30). *Comparação com
controle externo na mesma faixa de tempo.
a)
b)
* *
*
* *
*
* * *
* *
*
*
124
30 60 90 1200.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45Controle
NPcasca 0,3µg/mL
NPcasca 0,1µg/mL
Tempo (min.)
Flu
xo
Uri
ná
rio
(mL
.g-1
.min
-1)
30 60 90 1200.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.3
Controle
NPcasca 0,3µg/mL
NPcasca 0,1µg/mL
Tempo (min.)
Rit
mo
de
Fil
tra
çã
oG
lom
eru
lar
(mL
.g-1
.min
-1)
FIGURA 50: Efeitos do peptídeo natriurético isolado da C.d.cascavella
(NPcasca) no fluxo urinário (FU) (a) e ritmo de filtração glomerular (RFG)
(b). O NPcasca na dose de 0,3µg/mL aumentou o FU e o RFG
significativamente aos 60, 90 e 120 minutos de experimento. Enquanto na dose
de 0,1 µg/mL o FU aumentou aos 60, 90 e 120 minutos e o RFG aumentou aos
90 e 120 minutos, quando comparados ao grupo controle. Os dados são
expressos em média ± E.P.M.. Análise estatística foi realizada pelo teste
ANOVA (teste de Bonferroni) e teste t de Student, considerando p<0,05.
*Comparação entre os diferentes tempos 60, 90 e 120 e o controle interno do
grupo (tempo 30). *Comparação com controle externo na mesma faixa de
tempo.
a)
b)
* *
*
*
* *
*
*
*
*
*
125
30 60 90 1200
10
20
30
40
50
60
70
80
90Controle
NPcasca 0,3µg/mL
NPcasca 0,1µg/mL
Tempo (min.)
%T
Na
+
30 60 90 1200
10
20
30
40
50
60
70
80
90Controle
NPcasca 0,3µg/mLNPcasca 0,1µg/mL
Tempo (min.)
%p
TN
a+
FIGURA 51: Efeitos do peptídeo natriurético isolado da C.d.cascavella
(NPcasca) no percentual de transporte total tubular de sódio (%TNa+) (a) e
no percentual de transporte tubular proximal de sódio (%pTNa+) (b). O
percentual de sódio tubular total transportado (%TNa+) e o percentual de sódio
tubular proximal transportado (%pTNa+) reduziu aos 120 minutos de perfusão
na dose 0,3 µg/mL. Enquanto na dose de dose 0,1 µg/mL diminuiu aos 60, 90 e
120 minutos experimentais. Os dados são expressos em média ± E.P.M..
Análise estatística foi realizada pelo teste ANOVA (teste de Bonferroni) e teste t
de Student, considerando p<0,05. *Comparação entre os diferentes tempos
60, 90 e 120 e o controle interno do grupo (tempo 30). *Comparação com
controle externo na mesma faixa de tempo.
a)
b)
*
* * * *
* * *
126
5.2.3.3. Análise histológica dos rins perfundidos pelo Peptídeo Natriurético da
C.d.cascavella (NPcasca)
Nos experimentos de perfusão renal com o grupo tratado com o NPcasca
na dose de 0,1µg/mL foram observados fenômenos degenerativos reversíveis
discretos representados por material proteináceo no glomérulo renal e túbulos
contorcidos proximais e distais (figuras 52 e 53).
FIGURA 52: Fotomicrografia de rim de rato após a perfusão renal com o
peptídeo natriurético da C.d.cascavella (NPcasca) (0,1µµµµg/mL).
Evidenciando o glomérulo renal, observou-se a presença discreta de material
proteináceo no espaço de Bowman (seta). (H.E.), (aumento 400x).
127
FIGURA 53: Fotomicrografia de rim de rato após a perfusão renal com o
peptídeo natriurético da C.d.cascavella (NPcasca) (0,1µµµµg/mL).
Observando os túbulos renais evidenciou-se a presença de material
proteináceo na luz tubular e discreta degeneração hidrópica vacuolar das
células epiteliais cúbicas (seta). (H.E.), (aumento 400x).
5.2.4 BIOLOGIA MOLECULAR DOS RINS APÓS PERFUSÃO RENAL DO
PEPTÍDEO NATRIURÉTICO DA C.d.cascavella (NPcasca)
As figuras 54 a 58 mostram os géis referentes as cinco reações de PCR e
as figuras 59 a 62 demonstram a quantificação relativa entre os grupos testados
destacando que não houve aumento significativo da expressão dos genes testados
em comparação ao grupo controle.
128
FIGURA 54: Expressão gênica da cadeia 18S do RNA ribossômico
amplificada em reação de PCR de rins de ratos perfundidos (n=4)
controles ou após perfusão com Peptídeo Natriurético isolado da
serpente Crotalus durissus cascavella (NPcasca) nas doses de 0,1 e
0,3µg/mL. A eletroforese foi realizada em gel agarose 1,5% corada com
brometo de etídeo. MM = marcador molecular de 100 pb; CN= controle
negativo.
FIGURA 55: Expressão gênica da Óxido Nítrico Sintase Induzida (iNOS)
amplificada em reação de PCR de rins de ratos perfundidos (n=4)
controles ou após perfusão com o Peptídeo Natriurético isolado da
serpente C. durissus cascavella (Cdcasca) nas doses de 0,1 e 0,3ug/mL.
A eletroforese foi realizada em gel agarose 1,5% corada com brometo de
etídeo. MM = marcador molecular de 100 pb; CN= controle negativo.
Controle MM CN 0,1µg/mL 0,3µg/mL
MM Controle 0,1µg/mL CN 0,3µg/mL CN
129
FIGURA 56: Expressão gênica do TNF alfa (TNFαααα) amplificada em reação
de PCR de rins de ratos perfundidos (n=4) controles ou após perfusão
com Peptídeo Natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella
nas doses de 0,1 e 0,3 ug/mL. A eletroforese foi realizada em gel agarose
1,5% corada com brometo de etídeo. MM = marcador molecular de 100 pb;
CN= controle negativo.
FIGURA 57: Expressão gênica da IL-1 beta (IL-1ββββ) amplificada em reação
de PCR de rins de ratos perfundidos (n=4) controles ou após perfusão
com Peptídeo Natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella
nas doses de 0,1 e 0,3 ug/mL (n=4). A eletroforese foi realizada em gel
agarose 1,5% corada com brometo de etídeo. MM = marcador molecular de
100 pb; CN= controle negativo.
Controle 0,1µg/mL
0,3µg/mL
MM CN CN
Controle 0,1µg/mL
0,3µg/mL
MM CN CN
130
FIGURA 58: Expressão gênica da ciclooxigenase 2 (COX-2) amplificada
em reação de PCR de rins de ratos perfundidos (n=4) controles ou após
perfusão com Peptídeo Natriurético isolado da serpente C. durissus
cascavella nas doses de 0,1 e 0,3 ug/mL (n=4). A eletroforese foi realizada
em gel agarose 1,5% corada com brometo de etídeo. MM = marcador
molecular de 100 pb; CN= controle negativo.
Controle 0,1 µµµµg/mL 0,3 µµµµg/mL0.0
0.5
1.0
Exp
ress
ão r
elat
iva
de
iNO
S
FIGURA 59: Avaliação da expressão gênica relativa do óxido nítrico
sintase induzida em rins perfundidos de ratos controles (n=4) ou
tratados com o Peptídeo Natriurético isolado da serpente C. durissus
cascavella nas doses de 0,1 e 0,3 ug/mL (n=4). Para análise relativa foi
utilizado o gene de referência da cadeia 18S do RNA ribossômico.
Controle MM CN 0,1µg/mL 0,3µg/mL CN
131
Controle 0,1 µµµµg/mL 0,3 µµµµg/mL0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Exp
ress
ão r
elat
iva
de
TN
Fαα αα
FIGURA 60: Avaliação da expressão gênica relativa do TNF alfa em rins
perfundidos de ratos controles (n=4) ou tratados com o Peptídeo
Natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella nas doses de 0,1
e 0,3 ug/mL (n=4). Para análise relativa foi utilizado o gene de referência da
cadeia 18S do RNA ribossômico.
Controle 0,1 µµµµg/mL 0,3 µµµµg/mL0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Exp
ress
ão r
elat
iva
de
IL-1
ββ ββ
FIGURA 61: Avaliação da expressão gênica relativa da IL-1 beta em rins
perfundidos de ratos controles (n=4) ou tratados com o Peptídeo
Natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella nas doses de 0,1
e 0,3 ug/mL (n=4). Para análise relativa foi utilizado o gene de referência da
cadeia 18S do RNA ribossômico.
132
Controle 0,1 µµµµg/mL 0,3 µµµµg/mL0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Exp
ress
ão r
elat
iva
de
CO
X-2
FIGURA 62: Avaliação da expressão gênica relativa da COX-2 em rins
perfundidos de ratos controles (n=4) ou tratados com o Peptídeo
Natriurético isolado da serpente C. durissus cascavella nas doses de 0,1
e 0,3 ug/mL (n=4). Para análise relativa foi utilizado o gene de referência da
cadeia 18S do RNA ribossômico.
133
5.3. RESUMO DE TODOS OS RESULTADOS OBTIDOS COM AS DIVERSAS
METODOLOGIAS
VENENO BRUTO
Cdcasca
Pressão Arterial Diminuição
(Hipotensor)
Dosagem de Nitrito Aumento
(Envolvimento NO)
Citotoxicidade
Diminuição da
Viabilidade Celular e
Fragmentação do
DNA
PEPTÍDEO
NATRIURÉTICO
NPcasca
Pressão Arterial Diminuição
(Hipotensor)
Dosagem de Nitrito Aumento
(Envolvimento NO)
Anel de Aorta
Relaxamento
E
Contração
Perfusão Renal Aumento da Diurese
e Natriurese
134
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
135
6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
6.1. DISCUSSÃO DOS EFEITOS VASCULARES DO VENENO BRUTO DA
Crotalus durissus cascavella (Cdcasca)
Reconhecidos por sua complexidade bioquímica, os venenos de serpentes
contêm proteínas cujo conhecimento dos mecanismos de ação e de seus alvos pode
favorecer o desenvolvimento de drogas terapêuticas ou de ferramentas biológicas
(FOX et al., 2003; BARRAVIERA & PEREIRA, 1994).
O veneno de serpente é uma mistura complexa de toxinas, enzimas,
fatores do crescimento, ativadores e inibidores com atividades biológicas de amplo
espectro (BRAGA et al., 2006). O estudo dos venenos tem motivado uma série de
pesquisas, as quais, na medida em que revelam detalhes funcionais contribuem para
a elucidação dos mecanismos envolvidos nas injúrias para a elucidação da
fisiopatologia e na perspectiva de descobertas de ferramentas farmacológicas ou
substâncias farmacologicamente ativas (BON, 2000).
Rocha e Silva, em 1949, descobriu um dos elementos chave do processo
inflamatório, a Bradicinina, ao estudar o veneno da Bothrops jararaca, dando uma
importante contribuição ao desenvolvimento científico (FERREIRA, 1970). Desde
então se vem discutindo também aspectos do desenvolvimento científico,
tecnológico e econômico, inclusive, com questionamentos sobre o relacionamento da
indústria farmacêutica e o meio acadêmico.
Analisando os resultados referentes aos experimentos utilizando o modelo
de pressão arterial observou-se uma diminuição significativa da pressão arterial
média (PAM) em ratos tratados com o Cdcasca sendo dose-dependente (figura 27).
As freqüências cardíaca e respiratória também reduziram significativamente após a
infusão do veneno (figuras 26a e 26b).
Embora o mecanismo de ação hipotensor do Cdcasca não esteja
elucidado, mas partindo-se de uma premissa científica seguida por Rocha e Silva
(1949) e Ferreira (1970), onde através da observação de efeitos causados pela
picada da serpente Bothrops jararaca, que provoca uma súbita queda de pressão
arterial nas vítimas, pode-se sugerir que o efeito hipotensor se deva a um importante
componente do Cdcasca que ainda não foi isolado.
136
Inicialmente foi identificado o Fator Potencializador da Bradicinina (BPF)
presente no veneno de Bothrops jararaca (FERREIRA & ROCHA E SILVA, 1965;
AMORIM et al., 1967), que teve em seguida constatadas suas características de
ação como inibidor das enzimas inativadoras da bradicinina (BK) (FERREIRA &
ROCHA E SILVA, 1965; FERREIRA & VANE, 1967), sendo posteriormente
identificada a enzima conversora da angiotensina I em angiotensina II (BAHKLE et
al., 1968), finalmente sintetizada por pesquisadores da indústria de medicamentos
levando ao Captopril (CUSHMAN et al.,1998; AMORIM et al., 1967; FERREIRA et
al., 1970; FERREIRA, 1994).
Assim como foi pesquisado anteriormente no veneno de B. jararaca, pode-
se investigar o mecanismo envolvido no efeito hipotensor do Cdcasca.
Por outro lado, o endotélio vascular vem aumentando seu papel na
importância do controle do tônus vascular e no controle da pressão arterial, fluxo
cardíaco e débito cardíaco. Atuando não apenas como barreira passiva entre o
plasma e o líquido extracelular, mas como fonte de numerosos mediadores químicos
potentes (NASCIMENTO et al., 2003). Esses mediadores controlam ativamente a
contração do músculo liso subjacente e também influenciam a ação das plaquetas e
das células mononucleares (WEBB et al., 2000; WANG et al., 1999).
As células endoteliais têm a capacidade peculiar de sintetizar e secretar
substâncias vasoativas que controlam o fluxo sangüíneo, por exemplo, o óxido
nítrico, a prostaciclina e peptídeos vasoativos, como a endotelina (FLORA FILHO &
ZILBERSTEIN, 2000).
O fator de relaxamento derivado do endotélio (EDRF, endothelium-derived
relaxing factor) foi descoberto por Furchgott & Zawadzki, em 1980, e identificado
subseqüentemente como Óxido Nítrico (NO) pelos grupos de Moncada e Ignarro
(DUSSE et al., 2003). O reconhecimento deste mediador expandiu enormemente a
compreensão do papel desempenhado pelo endotélio.
O NO é o ativador endógeno da guanilato ciclase solúvel, resultando na
formação de GMPc, que atua como segundo mensageiro em muitas células,
incluindo nervos, músculo liso, monócitos e plaquetas (DUSSE et al, 2003). O NO
mostra-se particularmente importante nos vasos de resistência em virtude da sua
liberação contínua, produzindo um tônus vasodilatador e contribuindo para o controle
fisiológico da pressão arterial (RANG et al., 2004; IGNARRO, 1987; IGNARRO,
1991; FLORA FILHO & ZILBERSTEIN, 2000).
137
Os mecanismos de ação rápida para o controle da pressão arterial são
quase que inteiramente reflexos agudos ou outras respostas nervosas (OPARIL &
HARBER, 1974; PEREIRA & MALDONADO, 2007). Após a infusão do Cdcasca, nos
grupos experimentais de pressão arterial, observou-se um aumento significativo na
produção de nitrito com pico logo após os 30 minutos de infusão (figura 29).
Este resultado sugere a participação do óxido nítrico no mecanismo
vasodilatador e conseqüentemente hipotensor do Cdcasca. Sabe-se que o NO é
uma substância instável, mas pode formar nitrosotióis mais estáveis, após a sua
combinação com o grupo heme da hemoglobina ou por oxidação a Nitrito e Nitrato,
que são excretados na urina (RANG et al.,2004; SNYDER & BREDT 1992; NATHAN
1994).
O NO é um importante mensageiro intercelular nos mamíferos superiores.
O mecanismo de sinalização intercelular é, em geral, realizado através de receptores
de membrana expressos na célula alvo. Estes receptores são, habitualmente,
transmembranosos tendo contato com o citoplasma e desencadeando uma "cascata"
de sinalização intracelular que finalizará em uma resposta celular. As características
químicas do NO de alta difusibilidade é fundamental para a sua sinalização direta em
nível intracelular, sem receptores transmembranosos. Devido à sua penetração
intracelular sem intermediários membranosos, o organismo utiliza o NO em funções
fisiológicas em que é necessária uma resposta rápida. (DUSSE et al., 2003;
STABILE, et al., 2007).
As enzimas NO sintases (NOS) são fundamentais para o controle da
biossíntese de NO. Existem três isoformas conhecidas de NOS: uma forma induzível
- iNOS importante em resposta a estímulos patológicos; e duas formas constitutivas -
eNOS e nNOS que estão presentes em condições fisiológicas no endotélio e nos
neurônios, respectivamente (RANG et al.,2004; NATHAN, 1994; SNYDER & BREDT
1992; HARE & COLUCCI, 1995; WANG et al., 1999)
Com a observação de um aumento agudo de nitrito aos 30 minutos após a
infusão do Cdcasca, há a possibilidade da participação inicial da isoforma iNOS em
resposta à agressão tecidual de componentes do Cdcasca. Com o decorrer dos
minutos e o declínio na produção de nitrito, sugere-se o envolvimento da isoforma
constitutiva eNOS produzida pela células endoteliais e responsável pela manutenção
do efeito vasodilatador e hipotensor do Cdcasca.
138
Após o bloqueio farmacológico com L-Name nos experimentos de pressão
arterial utilizando o Cdcasca observou-se um aumento da pressão arterial média
(PAM), que se manteve alta até o término do experimento (figura 28). Imediatamente
após a morte dos animais a dosagem de nitrito, apresentou uma diminuição
significativa quando comparada ao grupo tratado com Cdcasca. A dosagem de nitrito
após o bloqueio se manteve próximo ao grupo controle, sem apresentar queda de
pressão (figura 30).
Ao avaliar a participação do óxido nítrico (NO) utilizando um bloqueador
inespecífico (L-Name) de NOS, sugere-se que a ação hipotensora de substâncias
biologicamente ativas do veneno Cdcasca atuem na fisiologia vascular através da
enzima induzida (iNOS) e/ou da enzima constitutiva (eNOS) (ZATZ & BAYLIS, 1998;
DIAS & COLOMBARI, 2006) .
Estudos posteriores para um maior esclarecimento do mecanismo
envolvido poderão ser realizados com bloqueadores mais seletivos para a iNOS,
como a aminoguanidina. Pode-se também realizar experimentos futuros utilizando
um bloqueador inespecífico adicionado do substrato da reação (L-arginina) e seu
isômero (D-arginina), bem como utilizando o ensaio com L-arginina marcada (ZATZ
& BAYLIS, 1998).
Os estudos realizados no leito vascular mesentérico tiveram como objetivo
investigar a atividade direta do Cdcasca nos vasos de resistência, observando
vasodilatação ou vasoconstricção. Neste sistema a solução é desprezada após a
passagem no leito vascular, não permitindo a recirculação de possíveis substâncias
produzidas pelo endotélio, além de não permitir a interferência das contrações
intestinais. A infusão do Cdcasca na pressão de perfusão no leito vascular
mesentérico não apresentou resultados com alteração significativa.
139
6.2. PROVÁVEL MECANISMO DE AÇÃO DO VENENO BRUTO DA Crotalus
durissus cascavella (Cdcasca) NO SISTEMA VASCULAR
Endotélio Vascular
VENENO BRUTO Crotalus durissus
cascavella.
EFEITO HIPOTENSOR
Enzima Induzida
iNOS
NOS
Enzima Constitutiva
eNOS
Macrófagos neutrófilos linfócitos
fibroblastos
Lesão Tecidual provocada pelo VB da Cdcasca
Guanilato Ciclase (GC)
basal
Condições Fisiológicas
ÓXIDO NÍTRICO
Células musculares
lisas dos vasos de
resistência
Guanilato Ciclase (GC)
ativada
+
GTP cGMP +
RELAXAMENTO !!!
140
6.3. DISCUSSÃO DAS ALTERAÇÕES HISTOLÓGICAS PROVOCADAS PELO
VENENO BRUTO DA Crotalus durissus cascavella (Cdcasca)
O veneno da C.d.cascavella (Cdcasca), neste trabalho, alterou a
arquitetura renal provocando fenômenos degenerativos reversíveis representados
por material proteináceo no glomérulo renal e túbulos contorcidos proximais e distais,
bem como vacuolização do epitélio cúbico simples (figuras 31 e 32). Observou-se
também no interstício renal e região perivascular infiltrado inflamatório com a
presença de linfócitos e plasmócitos (figura 31). Provavelmente a toxicidade do
Cdcasca deva-se a ação direta ou indireta de substâncias do veneno que atuam
isoladamente e/ou em sinergismo.
Martins e colaboradores (1998) observaram que o túbulo proximal renal foi
o principal local do efeito tóxico do veneno após a perfusão renal do veneno bruto da
C.d. cascavella. O grupo tratado apresentou cilindros hialinos na luz de todos os
túbulos proximais e a presença de material proteináceo, alterando de moderado a
intenso, no espaço urinário.
A isquemia é uma alteração marcante, nos casos de insuficiência
circulatória renal como a que ocorre no choque hipovolêmico pela diminuição do
fluxo sangüíneo renal; e a lesão tóxica direta do epitélio de revestimento tubular, no
caso de intoxicações químicas, como nos envenenamentos (KUMAR et al., 2005;
BERCHOVICI et al., 2004).
Nos tecidos pulmonar, cardíaco, hepático e cerebral foram evidenciados
infiltrados inflamatórios polimorfonucleares (figuras 34a/b, 35a/b, 36, 37 e 39),
sugestivos de uma agressão tecidual aguda do veneno Cdcasca, que provavelmente
resultou em quimiotaxia, proveniente da atividade de mediadores químicos
inflamatórios liberados, como prostaciclinas, histamina, bradicinina, ou o óxido nítrico
e conseqüente diapedese de células inflamatórias para o local da lesão (BRAGA et
al, 2007).
A observação de congestão vascular hepática intensa (figuras 38a/b)
centrolobular foi a característica mais evidente entre os animais tratados com
Cdcasca. A isquemia transitória hepática causa significativas alterações histológicas
no fígado de rato, o que sugere o dano decorrente da isquemia-reperfusão hepática
(RHODEN et al., 2000).
141
A congestão de leitos capilares e venosos está intimamente relacionada ao
desenvolvimento de edema. A estase de sangue pouco oxigenado causa hipóxia que
pode acarretar em degeneração ou morte das células parenquimatosas, às vezes,
com cicatrizes microscópicas. A ruptura de vasos nestes locais de congestão
também pode causar pequenos focos de hemorragia (LEDUC & BOM, 1998).
A evidência de hemorragia intersticial pulmonar e intra-alveolar intensa
após o tratamento com o veneno Cdcasca (figura 35) indica extravasamento de
sangue em virtude de ruptura vascular. Conforme discutido anteriormente, o
sangramento capilar pode ocorrer sob condições de congestão vascular.
6.4. DISCUSSÃO DOS EFEITOS CITOTÓXICOS DO VENENO BRUTO DA
Crotalus durissus cascavella (Cdcasca)
Células de mamíferos em cultura são importantes ferramentas para avaliar
a atividade citotóxica de substâncias com potencial terapêutico (PARKIN et al.,
2001). O Instituto Nacional do Câncer nos Estados Unidos desenvolve um programa
de screening efetivo baseado num diverso painel de linhagens celulares tumorais. O
screen utiliza sessenta linhagens tumorais derivadas de nove tipos de câncer e
organizadas em subpainéis representados por câncer de células brancas, pulmão,
cólon, sistema nervoso central, pele, ovário, rim, próstata e mama. Inicialmente um
pré-screen com três linhagens seleciona os compostos que irão ser testados nas
linhagens restantes. Foi constatado que as três linhagens são capazes de detetar
mais de 95% dos compostos ativos nas respectivas sessenta linhagens restantes
(CRAGG & NEWMAN, 2000; HAMID et al., 2004).
Outros modelos mais baratos podem ser utilizados para avaliar a
citotoxicidade de substâncias potenciais. A atividade citotóxica do veneno Cdcasca
foi avaliada pelo método do MTT ((sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo
de tetrazolium) em células tumorais.
O Cdcasca foi fortemente citotóxico após 72 horas de incubação nas
linhagens tumorais de HL-60 (Leucemia); MDA-MB435 (Tumor de Mama); HCT-8
(Tumor de Cólon) e SF-295 (Tumor de Sistema Nervoso). O Cdcasca não
demonstrou nenhuma atividade hemolítica nas concentrações testadas nos períodos
142
de 1; 2; e 4 horas de observação, após a sua administração em eritrócitos humanos
(figura 41 e tabela 01). O resultado não hemolítico foi um ponto positivo, visto que, o
Cdcasca não apresentou toxicidade nestas células normais estudadas.
O MTT é um método rápido, sensível e barato, que através de uma análise
colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-
brometo de tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas
mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente ativas, permite definir
facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação. Essa técnica tem a
capacidade de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula (MOSMANN,
1983).
Vários estudos experimentais com venenos de serpentes têm-se
direcionado para o tratamento de tumores em animais. Da Silva e colaboradores
(2002) estudaram o veneno de Bothrops jararaca observando e analisando seus
efeitos terapêuticos na cinética tumoral de crescimento, influxo inflamatório, e
sobrevida dos animais in vivo, bem como seus efeitos tóxicos e/ou mitóticos in vitro.
Os efeitos do veneno bruto Cdcasca sobre a síntese de DNA foram
avaliados através da incorporação de Bromodeoxiuridina (BrDU) às células HL-60. A
BrDU é uma base nitrogenada análoga a Timina. A incorporação do BrDU às células
é compatível com a síntese de DNA. Desta forma, não houve redução da síntese de
DNA nas células HL-60 tratadas com o Cdcasca em todas as concentrações
utilizadas. Pois, não foi identificado redução na incorporação do BrDu nas células
tratadas (figura 42).
A síntese de DNA tem sido estudada com precursores radioativos (timina –
H3) e métodos bioquímicos e radioautográficos. Verificou-se, então, que a duplicação
do DNA ocorre na interfase (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).
As neoplasias malignas expressam características anormais devido a
padrões alterados de expressão gênica nas células cancerosas em decorrência de
alterações genéticas (DA SILVA et al., 2002), observaram a ação do veneno da
Crotalus durissus terrificus e da Bothrops jararaca diretamente sobre as células do
tumor de Ehrlich (Este foi introduzido por Ehrlich em 1886 e descrito em 1906 como
um carcinoma mamário de camundongos fêmeas).
Os estudos realizados com o Cdcasca sobre a viabilidade celular,
utilizaram o método por exclusão do Azul de Tripan. Após este teste, as células da
linhagem HL-60 tratadas com o Cdcasca apresentaram diminuição significativa na
143
viabilidade celular. Como o corante Azul de Tripan penetra em todas as células, mas
somente as células viáveis conseguem bombear o Tripan para fora, a proporção de
células de coloração azulada é compatível com as células mortas (figura 43). Desta
forma, o Cdcasca interferiu na vitalidade celular das células leucêmicas.
Células de melanoma humano Skmel-28 foram tratadas com uma
metaloproteinase, desintegrina, isolada do veneno da Bothrops jararaca. O efeito
citotóxico do veneno aumentou consideravelmente nas concentrações mais elevadas
(maiores que 0.4 µM), embora não tenha afetado a adesão celular. As respostas à
migração e invasão celular foram significativamente inibidas in vitro (CORRÊA-JR.,
2002).
Estudos realizados com o Cdcasca sobre a fragmentação do DNA nas
células HL-60 demonstram que ocorre fragmentação do DNA significativa nas
concentrações testadas. A fragmentação foi avaliada por fluorescência nuclear
usando Iodeto de Propídeo, Triton X-100 e citrato detectada por citometria de fluxo.
Nestes experimentos observou-se que o Triton lisou as membranas celulares das
células leucêmicas e o Iodeto de Propídeo (PI) se ligou ao DNA. Células com o
núcleo íntegro emitem alta fluorescência, já núcleos com condensação da cromatina
e DNA fragmentado incorporam menos PI e por isso emitem menor fluorescência
sugestivo de apoptose (figura 44).
As células em apoptose mantêm suas membranas íntegras durante quase
todo o processo celular, até a sua morte, diferentemente das necróticas. A
condensação da cromatina e fragmentação nuclear são características marcantes de
células em processo apoptótico, enquanto que as células necróticas geralmente
mantêm seus núcleos íntegros e picnóticos (PINKEL, 2000).
O estudo in vivo da atividade anticâncer da enzima crotalase purificada do
veneno da Crotalus adamanteus sobre células do melanoma B 16, demonstrou
inibição bem como regressão do tumor após tratamento utilizando a crotalase
(PINKEL, 2000; DREWS, 2000).
Em 1971, o médico argentino Juan Carlos Vidal isolou a crotoxina do
veneno da cascavel (Crotalus durissus terrificus), constatando que ela reduzia o
volume dos tumores de um paciente com câncer.
A diversidade de toxinas dos venenos de serpentes tem a habilidade de
interagir com múltiplas integrinas, onde resulta na inibição da agregação celular, e
144
da angiogênese, bem como a indução da morte das células tumorais por apoptose.
Trabalho de revisão recente mostra os efeitos de toxinas de veneno de serpentes
que se ligam a integrinas e provocam efeitos antiangiogênicos e antitumorais
(RUSSEL, 1983).
Nos nossos experimentos os efeitos do Cdcasca sobre o potencial
transmembrânico da mitocôndria foram detectados por citometria de fluxo utilizando
células HL-60. Os resultados demonstraram que não houve diferença estatística na
despolarização da membrana mitocondrial das células tratadas com o Cdcasca.
Nestes ensaios foram utilizados a rodamina 123, um corante fluorescente, que a
mitocôndria tem a capacidade da seqüestrar, quando esta apresenta potencial
transmembrânico inalterado. As células com rodamina emitem alta fluorescência
quando atingidas pelo laser. Alterações no potencial mitocondrial transmembrânico
levam ao efluxo da rodamina de dentro da mitocôndria. Este método evidencia a
lesão celular por apoptose, um influxo de íons H+ através da membrana mitocondrial,
seria sugestivo de alteração do potencial transmembrânico, visto que, a rodamina
123 é um corante fluorescente nucleofílico.
Ao investigar a sensibilidade da proliferação de células normais tratadas
com o Cdcasca observou-se que não houve atividade na proliferação de células
periféricas mononucleadas do sangue. O método Alamar Blue para linfócitos utilizou
o indicador de óxido-redução, o Alamar Blue ou resazurina (azul e não fluorescente)
é reduzido por células viáveis a resorufina (róseo e altamente fluorescente) que pode
ser reduzido a hidroresorufina (incolor e não fluorescente) (NAKAYAMA et al., 1997;
HAMID et al., 2004; DE FRIES & MITSUHASHI, 1995).
Este ensaio avaliou a sensibilidade do Cdcasca sobre células
mononucleares sangüíneas normais, demonstrando seu potencial citotóxico em
células tumorais e não apresentando citotoxicidade para células normais.
145
6.5. PROVÁVEL MECANISMO DE AÇÃO DO VENENO BRUTO (VB) DA Crotalus
durissus cascavella (Cdcasca) NA ATIVIDADE CITÓTÓXICA
Membrana Celular
?
VENENO BRUTO Crotalus durissus
cascavella.
EFEITO CITOTÓXICO
NÚCLEO CELULAR
Fragmentação do DNA
MORTE CELULAR!!!
Alteração do potencial
transmembrânico da mitocôndria
?
?
QUAL FASE DO CICLO
?
146
6.6. DISCUSSÃO DOS EFEITOS VASCULARES DO PEPTÍDEO NATRIURÉTICO
ISOLADO DA Crotalus durissus cascavella (NPcasca)
Várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas com frações de veneno das
serpentes, como ativadores da protrombina que estimulam a coagulação (MASCI et
al., 1988), antimicrobianos (STABELI et al., 2004) e peptídeos natriuréticos (LISY et
al., 1999).
A natriurese pressórica consiste em um importante mecanismo para
regulação da pressão arterial e se baseia no conceito de que a pressão arterial é
mantida em um nível necessário requerido pelos rins para excretar um volume de
urina equivalente ao incremento diário de volume (SWENSON, 1988; COWLEY,
1992).
Cicala e colaboradores (1993) demonstraram que a fosfolipase A2 isolada
do veneno da Naja mocambique moçambique induziu uma hipotensão em ratos.
Os peptídeos potencializadores de bradicinina (PPBs) identificados e
isolados do veneno de Bothrops jararaca, foram fundamentais para o
desenvolvimento do Captopril, o primeiro inibidor da enzima conversora de
angiotensina (ECA), sendo um medicamento mundialmente utilizado para tratar
hipertensão (FERREIRA, 1994; HAYASHI & CAMARGO, 2005).
Soares e colaboradores (2005) identificaram um peptídeo potencializador
da bradicinina e um peptídeo natriurético tipo C do veneno da Lachesis muta.
De Mesquita e colaboradores (1991) demonstrou uma atividade
hipotensora da serpente Crotalus atrox.
Recentemente, o produto gênico de peptídeos potencializadores da
bradicinina ACEI/BPP-tipo-C foram isolados do veneno da família crotalidae
(HIGUCHI et al., 2006).
Os resultados com o NPcasca no sistema de pressão arterial
demonstraram uma diminuição significativa na pressão arterial média (figura 46),
bem como nas freqüências cardíaca (FC) e respiratória (FR) (figuras 45 a/b).
As propriedades viscoelásticas das artérias de grande calibre determinam
a complacência arterial. Trata-se de um importante fator no sistema circulatório, que
é impulsionado por uma bomba intermitente, mais do que contínua. O sangue
ejetado do ventrículo esquerdo é acomodado, a princípio, pela distensão do sistema
arterial, que absorve as pulsações no débito cardíaco e libera um fluxo relativamente
147
constante para os tecidos. Quanto maior a complacência do sistema, mais
efetivamente as flutuações são amortecidas, e menores as oscilações da pressão
arterial a cada batimento cardíaco (ADAMS et al, 1966).
Nos nossos experimentos a dosagem de nitrito apresentou um aumento
significativo na sua produção (figura 47), este resultado sugere a participação do NO
no mecanismo vasodilatador e conseqüentemente hipotensor do NPcasca
semelhante ao efeito observado e discutido para o veneno bruto Cdcasca.
Nos experimentos com anéis de aorta isolados na presença de endotélio
intacto (e+) e na ausência do endotélio (e-) pré-contraídos com fenilefrina, utilizando o
NPcasca observou-se um efeito relaxante vascular significativo com o endotélio
intacto e na presença de Isatin, um antagonista endógeno de guanilato-ciclase
acoplado a um receptor de peptídeo natriurético (figura 48). Analisando estes
resultados, sugere-se que o efeito relaxante observado é dependente do endotélio
vascular e provavelmente de substâncias liberadas pelas células endoteliais que
influenciam o efeito vasodilatador e conseqüentemente hipotensor do NPcasca.
Porém, este efeito relaxante não apresenta influência nos receptores de peptídeos
natriuréticos.
O Isatin é um composto endógeno com propriedades ansiogênica. No
cérebro de ratos (hipocampo) encontram-se elevados os níveis de isatin (0,1µg/g).
Este composto apresenta poucos efeitos nas transmissões neuronais e hormonais,
mas ele age como um inibidor de receptor de peptídeo atrial natriurético.
A regulação endógena da atividade do peptídeo natriurético atrial, está
envolvida no controle de atividades relacionadas à ansiedade e natriurese.
Utilizando uma solução isosmótica de potássio-Krebs-Henseleit (K+ 80mM)
pré-contraída com fenilefrina e na ausência de endotélio, evidenciou-se um aumento
da contração da musculatura vascular (figura 48). Estes resultados sugerem o
provável envolvimento de canais de potássio no mecanismo de ação do NPcasca.
Cermak e colaboradores (1996) demonstraram que peptídeos natriuréticos
aumentam a condutância de íons K+ em células mesangiais de ratos.
148
6.7. DISCUSSÃO DOS EFEITOS RENAIS DO PEPTÍDEO NATRIURÉTICO
ISOLADO DA Crotalus durissus cascavella (NPcasca)
O peptídeo atrial natriurético (ANP) apresenta efeitos importantes sobre o
rim e o sistema vascular. Em resposta a sobrecarga de volume ocorre a liberação de
ANP pelos átrios. Os principais efeitos dos peptídeos natriuréticos consistem em
aumentar a excreção de sódio e de água pelo rim, em relaxar o músculo liso
vascular, em aumentar a permeabilidade vascular e em inibir a liberação e/ou ações
de vários hormônios e mediadores, incluindo aldosterona, angiotensina II, endotelina
e hormônio antidiurético (STABILE et al., 2007; RANG et al, 2004).
Desde a descoberta do peptídeo atrial natriurético por Stabile e
colaboradores (2007) Ocorreu um progresso científico no conhecimento do papel
fisiológico, diagnóstico e terapêutico dos peptídeos natriuréticos (NPs) no organismo
sadio e nas patologias.
O peptídeo natriurético isolado do veneno da C.d.cascavella (NPcasca)
promoveu aumento significativo na pressão de perfusão (PP) (figura 49a) e na
resistência vascular renal (RVR) (figura 49b). O fluxo urinário (FU) e o ritmo de
filtração glomerular (RFG) também aumentaram significativamente após a infusão do
NPcasca (figuras 50a/b). Este aumento na pressão de perfusão renal provavelmente
não está relacionado a uma ação vasoconstritora direta, visto que, o veneno bruto
Cdcasca não apresentou efeitos no leito vascular arteriolar mesentérico.
O aumento na pressão de perfusão renal, no fluxo urinário e no ritmo de
filtração glomerular observados com o peptídeo natriurético NPcasca, nos
experimentos realizados neste trabalho, foram semelhantes aos resultados obtidos
com o veneno bruto por Martins e colaboradores (1998).
Martins e colaboradores (1998) mostraram que as alterações renais
induzidas pelo veneno de Crotalus durissus cascavella eram resultantes do efeito
direto deste sobre o rim isolado de rato, e que a dexametasona era capaz de
bloquear todas as alterações renais induzidas nesse modelo.
Após a perfusão renal com o NPcasca o percentual de transporte total
tubular de sódio (%TNa+) e o percentual de transporte tubular proximal de sódio
(%pTNa+) reduziram significativamente (figura 51). Os transportes total tubular de
potássio (%TK+) e cloreto (%TCl-) e o percentual de transporte tubular proximal de
149
potássio (%pTK+) e cloreto (%pTCl-) não apresentaram alterações significativas
quando comparados ao grupo controle. Esta observação sugere que, o NPcasca,
altera os parâmetros de transporte de sódio, sem interferir na fisiologia renal dos
transportes de potássio e cloreto.
O sistema renina-angiotensina-aldosterona atua de modo sinérgico com o
sistema nervoso simpático. Estimula também a secreção de aldosterona e
desempenha um papel central no controle da excreção renal sódio e volume de
líquido, bem como do tônus vascular (WEIR & DZAU, 2007).
A atividade nervosa simpática renal é exercida por agonistas dos
receptores β-adrenérgicos e a PGI2 estimula diretamente a secreção de renina,
enquanto a angiotensina II age na inibição por retroalimentação. O peptídeo
natriurético atrial também inibe a secreção de renina. A mácula densa é rica em
NOS, porém o efeito do NO sobre a secreção de renina é controvertido, havendo
opiniões divergentes quanto a uma ação de inibição ou estimulação (RANG et al,
2004).
Os peptídeos natriuréticos isolados de venenos de serpentes foram
descritos e estão sendo bastante estudados como ferramentas fisiológicas e
farmacológicas (HIGUCHI et al., 2006; FAVREAU et al., 2007). Um peptídeo foi
identificado e isolado do veneno da serpente Dendroaspis angusticeps, bem como a
serpente “Mamba Verde” apresentou em seu veneno um peptídeo com efeitos
diuréticos e natriuréticos (LISY et al., 1999; LISY et al.,1999 e 2001).
Estudos realizados em sistema de rim isolado, com veneno da Crotalus
durissus terrificus e a sua fração crotoxina aumentaram o fluxo urinário e o ritmo de
filtração glomerular, possivelmente pela presença de um componente com efeito
natriurético (MONTEIRO et al., 2001).
No estudo com o veneno de Crotalus durissus terrificus, foi observado que
este produziu um aumento no ritmo de filtração glomerular e no fluxo urinário, mas
de forma contrária ao ocorrido com o veneno de Crotalus durissus cascavella, que
produziu um decréscimo na pressão de perfusão (MARTINS et al., 1998;
MONTEIRO et al., 2001).
A Guanilina e Uroguanilina são pequenos peptídeos produzidos na
mucosa intestinal e são responsáveis pela regulação da função celular através da
ativação do receptor de guanilato-ciclase C, sinalizando moléculas locais em células-
alvo do intestino e à distância pela via endócrina. Os mecanismos e os sítios de ação
150
renal da guanilato-ciclase C continuam sem seu completo entendimento. Receptores
renais para guanilina são provavelmente acoplados à proteína G. O envolvimento da
guanilina e uroguanilina na natriurese, caliurese e diurese é extremamente
complexo. Outro mecanismo de sinalização da guanilina independente do GMPc
envolve uma fosfolipase A2 e o ácido aracdônico para as células principais do
estômago no homem e células dos ductos coletores corticais de rato (SINDIC &
SCHLATTER, 2007).
A observação histológica em alguns rins perfundidos (25%) pelo peptídeo
natriurético da C.d.cascavella (NPcasca) demonstrou fenômenos degenerativos
reversíveis representados por discreto depósito de material proteináceo no glomérulo
renal e túbulos contorcidos proximais e distais (figuras 52 e 53), porém este achado
não se repetiu em todos os rins, fato este também observado em alguns controles
(BRAGA et al.,2007). Estes resultados diferem dos encontrados após infusão com o
veneno bruto, no qual as alterações histológicas renais são mais intensas,
irreversíveis e presentes na maioria dos rins perfundidos (MARTINS, 2002).
Para análise da expressão gênica utilizou-se os primers de iNOS, TNF
alfa, IL-1 beta, COX-2 e da cadeia 18S de RNA ribossômico e foram realizadas
reações de PCR. Em nossos experimentos com rim isolado de rato utilizando o
peptídeo natriurético de C.d. cascavella não houve alteração de expressão gênica de
mediadores inflamatórios. Estudos mais detalhados sobre a expressão gênica se
fazem necessários para uma maior compreensão do mecanismo molecular
envolvido.
151
6.8. PROVÁVEL MECANISMO DE AÇÃO DO PEPTÍDEO NATRIURÉTICO
ISOLADO DA Crotalus durissus cascavella (NPcasca)
RIM
PEPTÍDEO NATRIURÉTICO (NPcasca)
EFEITO HIPOTENSOR
NOS
Enzima Constitutiva
eNOS
Guanilato Ciclase (GC)
basal
ÓXIDO NÍTRICO
Células musculares
lisas dos vasos de
resistência
Guanilato Ciclase (GC)
ativada
+
GTP cGMP +
RELAXAMENTO !!!
DIURESE E
NATRIURESE
152
CONSIDERAÇÕES FINAIS
153
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
7.1. Ações do Veneno Bruto da Crotalus durissus cascavella
O Veneno Bruto da Crotalus durissus cascavella (Cdcasca) no sistema
vascular causou uma diminuição significativa nas freqüências cardíaca (FC) e
respiratória (FR), bem como na pressão arterial média (PAM).
O Veneno Bruto da Cdcasca aumentou a produção de Nitrito no sangue dos
animais experimentais.
Após o bloqueio farmacológico com L-NAME os efeitos na FC, FR e PAM
foram abolidos; bem como diminuiu a produção de Nitrito no sangue dos animais.
O veneno bruto Cdcasca não apresentou efeitos no leito vascular arteriolar
mesentérico.
O veneno bruto da Cdcasca foi fortemente citotóxico em linhagens tumorais
de HL-60 (Leucemia); MDA-MB435 (Mama); HCT-8 (Cólon); e SF-295 (Sistema
Nervoso Central).
O Cdcasca não mostrou nenhuma atividade hemolítica nas concentrações
testadas.
Estudos sobre o provável mecanismo de ação antitumoral do Cdcasca
demonstraram que ocorreu uma diminuição na viabilidade celular, bem como um
aumento na fragmentação do DNA de células HL-60 (Leucemia).
O Cdcasca não apresentou atividade na proliferação de células periféricas
mononucleadas do sangue.
154
7.2. Ações do Peptídeo Natriurético isolado da Crotalus durissus cascavella
O Peptídeo Natriurético (NPcasca) reduziu as Freqüências Cardíaca e
Respiratória e a Pressão Arterial Média, aumentando a produção de Nitrito no
sangue dos animais experimentais.
O Peptídeo Natriurético (NPcasca) nos experimentos de Anel de Aorta
demonstrou um relaxamento dependente de endotélio e na presença do Isatin.
O Peptídeo Natriurético (NPcasca) nos experimentos de Anel de Aorta na
presença de solução isosmótica de potássio, demonstrou vasoconstricção,
efeito semelhante observado com o endotélio desnudo.
O Peptídeo Natriurético (NPcasca) promoveu aumento na pressão de
perfusão (PP) e na resistência vascular renal (RVR).
O fluxo urinário (FU) e o ritmo de filtração glomerular (RFG) também
aumentaram após a infusão do NPcasca.
As alterações histológicas dos rins perfundidos foram discretas, comparando-
as com as alterações observadas com o veneno total Cdcasca.
Nos experimentos com rim isolado não houve alteração de expressão gênica
de mediadores inflamatórios.
155
8. CONCLUSÕES
O Veneno Bruto da Crotalus durissus cascavella (Cdcasca) alterou os
parâmetros fisiológicos das Freqüências Cardíaca e Respiratória e a Pressão
Arterial Média. Observando uma redução significativa destes parâmetros em
todos os animais tratados.
O Veneno Bruto da Crotalus durissus cascavella (Cdcasca) apresentou
citotoxicidade na linhagem tumoral HL-60, com diminuição da viabilidade celular e
aumento da fragmentação do DNA.
O Peptídeo Natriurético (NPcasca) reduziu as Freqüências Cardíaca e
Respiratória e a Pressão Arterial Média. Bem como, aumentou a Pressão de
Perfusão e a Resistência Vascular Renal, o Fluxo Urinário e o Ritmo de Filtração
Glomerular.
O Peptídeo Natriurético (NPcasca) aumentou a diurese e a natriurese.
156
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2007.
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