Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren

Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 04

Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren

1. Nukleinsäureextrakion:1) Isolierung2) Reinigung3) Konzentrationsbestimmung

2. Nukleinsäureextrakion genomischer DNA

3. Nukleinsäureextrakion niedermolekularer DNA

4. Analyse:1. Elektrophorese2. Färbung

5. Zusammenfassung

1. Nukleinsäureextraktion

• Aufgereinigte Nukleinsäureextrakte Grundvoraussetzung der Nukleinsäureanalytik– Verunreinigungen: Nukleasen, Nukleinsäuren

anderer Art, Salze, Makromoleküle

• Grundsätzliche Verfahrensschritte:1. Isolierung2. Reinigung3. Konzentrationsbestimmung4. Analyse

• Verfahren abhängig von Species, Nukleinsäuretypus und weiterer Anwendung

1.1. Isolierung

• Isolierung genomischer DNA:

• Isolierung niedermolekularer DNA:

Herkunft Eigenschaften Probleme• Gewebe• Zellkulturen• Organismen

(z.B. Bakterien, Hefe)

•Hochmolekular (>200 kbp)

•Zerstückelung durch Scherkräfte •Verpackung (Histone, u.a.)

Herkunft Eigenschaften Probleme•Bakterien-Plasmide•Hefe-Plasmide•virale DNA•extrachromos. DNA

•Niedermolekular (2-200kbp)•oft zirkulär

•Verunreinigungen

1.1. Isolierung

1. Aufschluss• mit Detergenzien, z.B. SDS• durch Enzyme, z.B. Lysozym bei Bakterien• Mechanischer Aufschluß• Kochen

2. Proteindenaturierung• Proteinase K (Protease)• chemisch: Phenolisierung, SDS, NaOH

1.2. Reinigung

Phenolextraktion:

• Ausschütteln mit Wasser - Phenol:→Phenol denaturiert Proteine, nach

Zentrifugation: wässrige Nukleinsäurelösung – Proteine in Interphase oder Phenolphase

• Ausschütteln mit Wasser - Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol:

→stabilere Phasengrenze, gründlichere Denaturierung

• Phenolisierung wiederholen, bis Interphase sich nicht mehr bildet

Phenolextraktion:

1.2. Reinigung

Gelfiltration• „Molekularsiebeffekt“: große DNA-Moleküle

dringen nicht in Gelporen ein – eluieren schneller als niedermolekulare DNA

→Fraktionierte Sammlung des Eluats

1.2. Reinigung

Ethanolpräzipitation:

• Ausfällung der Nukleinsäure mit Ethanol + monovalente Kationen

→Konzentrierungseffekt, waschen mit 70% Ethanol

1.3. Konzentrationsbestimmung

Photometrische Konzentrationsbestimmung:

• Adsorptionsmaximum doppelsträngiger DNA bei 260 nm durch aromatische Ringe der Basen

→50μg/ml doppelsträngige DNA hat Adsorptionswert von 1 (Vorraussetzung: 1cm Schichtdicke, Quarzküvette)

• Hyperchromie: einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle besitzen höhere Adsorption (1 OD260 entspricht 33 μg/ml RNA bzw. 40 μg/ml einzelsträngiger DNA)

• Konzentrationsbestimmung kurzer Oligonukleotide über Summe der Adsorptionskoeffizienten der einzelnen Basen

• Bestimmung der Reinheit: Messung OD260/OD280-Wert (1,8 = rein)

1.3. Konzentrationsbestimmung

Ethidiumbromidanfärbung:

• bei geringen Nukleinsäuremengen: Bestimmung der Konzentration durch Ethidiumbromidanfärbung – Vergleich mit Verdünnungsreihe

• planare Struktur - interkaliert in die Nukleinsäure durch Interaktion der aromatischen/heteroaromatischen Ringe

2.1 Isolierung genomischer DNA

1. Zellwandaufschluss und Proteinabbau

Organismus Aufschluss Proteinabbau

Eukaryotische Zellkulturen

Natriumdodecylsulfat

(SDS)Proteinase K

Gewebe SDS / Proteinase K Proteinase K

PflanzenSDS oder

N-LaurylsarkosinProteinase K

HefeZymolase oder

LyticaseProteinase K

Bakterien Lysozym Proteinase K

Proteinase K: Serinprotease, schneidet relativ unspezifisch, nicht

hemmbar durch Ionen/EDTA, benötigt SDS

• Molekülgrößen um 80 kbp:– Aufschluss und Proteindenaturierung durch Guanidium-

Hydrochlorid– DNA-Isolation durch Ethanolfällung→ Anwendung: Southern-Blot, PCR

• Molekülgrößen 100-150 kbp:– Phenolextraktion– DNA an Phasengrenze Wasser-Phenol– DNA-Entnahme durch Aufrollen auf steriles Stäbchen → Anwendung: Southern-Blot, Genombanken mit Phage λ

• Molekülgröße > 200 kbp:– Denaturierung von Proteinase K und Protein-DNA-Komplexen

durch Formamid– Dialyse in Collodion-Schläuchen → minimale Scherkräfte→ Anwendung: Cosmidbanken

2.2: Reinigung genomischer DNA

3.1: Isolierung niedermolekularer DNA

1. Anzucht:• Mini- (<10ml), Midi- (<100ml), Maxi- Präparationen

(>100ml Bakterienkultur)• Steigerung der Plasmidausbeute durch selektive

Amplifikation (Translationsinhibitoren)

2. Aufschluss:

Aufschlussart Lyse durch: Hintergrund

alkalische Lyse SDS/NaOH schnell, low copy

Kochlyse Lysozym/100°C

Lithium-Methode LiCl/Triton X-100 <10 kbp

SDS-Lyse Lysozym/SDS >15 kbp

3.1: Isolierung niedermolekularer DNA1. alkalische Lyse: • EDTA, RNase, 95°C, • SDS-Lyse, NaOH-denaturiert DNA• Plasmid-Renaturierung durch Kaliumdodecylsulfat• Abzentrifugation unlöslicher Komponenten• Fällung mit Ethanol oder Isopropanol – waschen→ schnelle Methode – zum Austesten von Klonierungen

2. Kochlyse:• Lysozym, aufkochen, abzentrifugieren denaturierter

Bestandteile• DNA in Lösung, gegebenenfalls Phenolisierung der

DNA gegen Endonuclease – Präzipitation

3.1: Isolierung niedermolekularer DNA

3. Lithium-Methode:• Triton 100X (Detergenz)/LiCl – Auflösung der

Plasmamembran• Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol denaturiert

Proteine/Membranen• Plasmid-DNA bleibt gelöst

4. SDS-Lyse:• Lyse durch SDS, partielle Fällung

chromosomaler DNA durch NaCl• nach Zentrifugation – Plasmide im Überstand→ geeignet für große Plasmide

3.2. Reinigung niedermolekularer DNA

• negativ geladene DNA bindet an positiv geladenes Säulenmaterial (z.B. DEAE)

• degradierte Proteine/RNA binden nicht

• Auswaschen der DNA mit hohen Salzkonzentrationen

1. Reinigung über Anionenaustauschersäulen:

3.2. Reinigung niedermolekularer DNA

2. Dichtegradientenzentrifugation:

• Zentrifugation in CsCl-Gradient + Ethidiumbromid liefert hochreine DNA

• Ethidiumbromid interkaliert stärker in lineare als zirkuläre DNA → Dichteunterschiede (Proteine: geringere Dichte, RNA pelletiert)

• Auswaschung: Ethidiumbromid mit n-Butanol, CsCl durch Dialyse

4. Analyse

• Wie groß sind extrahierte Nukleinsäuren?• In welcher Konformation liegt Nukleinsäure

vor?• Sind eventuell transformierte Elemente

eingebaut worden?

Analyseverfahren:

1. Auftrennung durch Gelelektrophorese

2. Anfärbung

4.1: Analyse - Gelelektrophorese

• Trägermaterial: Agarose oder Polyacrylamid

• Nukleinsäuren negativ geladen (Phosphatgruppen)

• Verhältnis Ladung : Molekulargewicht ist konstant

→Trennung im Gel nach Molekülgrößen

• Ogston-Siebeffekt (globuläre DNA)/ Reptationstheorie (lineare DNA)

4.1: Analyse - Gelelektrophorese

Auftrennung in Agarosegelen:

• Wanderungsgeschw. abh. von Agarosekonz., Spannung, Laufpuffer, interkalierenden Farbstoffen

• denaturierende Bedingungen um Sekundärstrukturbildung zu verhinden

• Trennung linearer, doppelsträngiger DNA: lineare Abh. von log Länge (bp) zu Wanderungsdistanz

• Trennung zirkulärer DNA: superhelical > linear > relaxiert →(Abb)

4.2: Analyse - Anfärbung

Ethidiumbromid:• Anregung unter UV-Licht, Nachweisgrenze: 10-20 ng• ändert Konformation zirkulärer DNA-Moleküle

SYBR Green/TOTO1/YOYO1:• Fluoreszenzfarbstoffe – sensitiver (binden mit höherer

Affinität) und weniger mutagen als Ethidiumbromid

Silberfärbung:• extrem sensitiv: Nachweisgrenze 0,03 ng/mm², nicht

mutagen - Reduktion von Silbernitrat zu reinem Silber • Nachteil: zeitaufwendig, hohe Hintergrundfärbung

5. Zusammenfassung

Nukleinsäureextraktion:

1. Isolierung

2. Reinigung

3. Konzentrationsbestimmung

4. Analyse

• Verfahren abhängig von Größe und Art der Nukleinsäure, Ausgangsorganismus und Verwendungszweck

The End!!