ion-exchange reactions between acid mucopolysaccharides

7/28/2019 Ion-Exchange Reactions Between Acid Mucopolysaccharides

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B i o c h e m . J . ( 1 9 6 2 ) 8 5 , 3 3 6

I o n - E x c h a n g e R e a c t i o n s between Acid Mucopolysaccharides

and V a r i o u s C a t i o n s

BY J . R. DUNSTONED e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y o f Q u e e n s l a n d , B r i s b a n e , A u s t r a l i a

( R e c e i v e d 1 9 March 1 9 6 2 )

I n s t u d i e s o f c a t i o n - b i n d i n g b y a c i d m u c o p o l y -

s a c c h a r i d e s and t h e p o s s i b l e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e

r e a c t i o n s i n c a l c i f i c a t i o n p r o c e s s e s , i t h a s b e e n s h o w n ,

i n c a r t i l a g e , t h a t t h e c h o n d r o i t i n s u l p h a t e com-

p o n e n t i s s o l e l y r e s p o n s i b l e f o r t h e c a t i o n - b i n d i n g

c a p a c i t y , t h a t t h e c a t i o n - b i n d i n g r e ac t i o n s a r e o f

t h e i o n - e x c h a n g e t y p e and t h a t d i f f e r e n t c a t i o n s

e x h i b i t v a r y i n g d e g r e e s o f a f f i n i t y f o r t h e c a r t i l a g e

( B o y d & Neuman, 1 9 5 1 ; D u n s t o n e , 1 9 5 9 , 1 9 6 0 ) .

C a t i o n s h a v e b e e n shown t o i n a c t i v a t e , i n v i t r o ,t h e c a l c i f i c a t i o n o f r a c h i t i c - b o n e s e c t i o n s ( S o b e l ,

1 9 5 5 ) . The o r d e r o f i n a c t i v a t i n g power o f t h e s e

c a t i o n s d i f f e r s f r o m t h e i r o r d e r o f a f f i n i t y f o r c a r t i -l a g e ( D u n s t o n e , 1 9 6 0 ) . T h e s e d i f f e r e n c e s m a y b e

d u e e i t h e r t o t h e c h o nd ro i t i n s u l p h a t e o f t h e c a r t i -l a g e d i f f e r i n g s t r u c t u r a l l y o r i n i t s c o m b i n a t i o n

w i t h p r o t e i n f r o m t h a t i n t h e c a l c i f y i n g t i s s u e u s e d

by S o b e l ( 1 9 5 5 ) , o r i t m a y b e t h at t h e p r o c e s s o f

i n h i b i t i o n o f c a l c i f i c a t i o n d o e s n o t i n v o l v e s i m p l e

c a t i o n - e x c h a n g e c o m p e t i t i o n . The c a r t i l a g e p r e p a -

r a t i o n s s o f a r u s e d r e p r e s e n t p a r t i c u l a r c a s e s .S a m p l e s t a k e n f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s o r s u b j e c t e d

t o d i f f e r e n t t r e a t m e n t s m i g h t y i e l d a d i f f e r e n t o r d e ro f c at i o n a f f i n i t y .

C o n s e q u e n t l y , a s t u d y , u n d e r a v a r i e t y o f e x p e r i -

m e n t a l c o n d i t i o n s , o f t h e a s s o c i at i o n o f t h e s ec a t i o n i c i n h i b i t o r s o f c a l c i f i c a t i o n w i t h a n u mb e r o f

s t r u c t u r a l l y d i f f e r e n t s u l p h a t e d a c i d m u c o p o l y -s a c c h a r i d e s ( c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A , c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e B , h e p a r i n , h e p a r i n m o n o s u l p h a t e ) i n

s o l u t i o n and w i t h c a r t i l a g e - b o u n d c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e h a s b e e n u n d e r t a k e n . The f a c t o r s t h a t

i n f l u e n c e t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n c a t i o n s and a c i d

m u c o p o l y s a c c h a r i d e s h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d and

an a t t e m p t h a s b e e n m a d e t o g i v e a q u a n t i t a t i v ei n t e r p r e t a t i o n t o t h e a s s o c i a t i o n p h e n o m e n a . The

a f f i n i t i e s o f t h e c a t i o n s f o r t h e a c i d m u c o p o l y -s a c c h a r i d e s h a v e b e e n m e a s u r e d by t h e i o n - e x -

c h a n g e m e t h o d s o u t l i n e d by S c h u b e r t ( 1 9 5 2 ) and

by D j u r f e l d t & S a m u e l s o n ( 1 9 5 7 a , b ) , and h a v eb e e n r e c o r d e d i n t h e f o r m o f e x c h a n g e p a r a m e t e r s

c a l c u l a t e d f r o m R o t h m u n d & K o r n f e l d ( 1 9 1 8 )

e q u a t i o n s .

EXPERIMENTAL

T h e i n t e r a c t i o n o f c a t i o n s w i t h a n a c i d m u c o p o l y -s a c c h a r i d e i n s o l u t i o n m a y b e t r e a t e d , a s a f i r s t a p p r o x i -

m a t i o n , b y c o n s i d e r i n g t h e p o l y e l e c t r o l y t e a s a p h a s e

s e p a r a t e f r o m t h e o u ts i de s o l u t i o n ( s e e D j u r f e l d t & S a m u e l -s o n , 1 9 5 7 b ) , w i t h i t s e l e c t r i c a l c h a r g e n e u t r a l i z e d b yc o u n t e r i o n s h e l d i n t h e p o t e n t i a l f i e l d o f t h e m ac r o - i o n.

T h e r e l a t i v e a f f i n i t i e s o f v a r i o u s c a t i o n s f o r t h e p o l y -

e l e c t r o l y t e c a n t h e n b e e s t i m a t e d i n a n o p e ra ti o n al f a sh i o n

b y d e s c r i b i n g t h e i o n d i s t r i b u t i o n s o b t a i n e d when c a t i o n s

f r o m t h e s o l u t i o n p h a s e e x c h a n g e w i t h t h e c o un te r i o ns o f

t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e . S u c h i o n d i s t r i b u t i o n s c a n b e

d e s c r i b e d b y t h e e m p i r i c a l r e l a t i o n s h i p o f Rothm und &K o r n f e l d ( 1 9 1 8 ) .

F o r t h e e x c h a n g e b e t w e e n a b i v a l e n t c a t i o n f r o m t h e

s o l u t i o n p h a s e a n d a u n i v a l e n t c a t i o n f r o m t h e p o l y e l e c t r o -l y t e p h a s e , t h e r e l e v a n t e q u a t i o n i s

I =, K ( E M ] , ) ( 1 )

w h e r e XN a n d X . a r e r e s p e c t i v e l y t h e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n s( f o r d e f i n i t i o n s e e D u n s t o n e , 1 9 6 0 ) o f t h e b i - a n d u n i - v a l e n t

c a t i o n s N a n d M i n t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e , [ N ] a n d [ M ]a r e t h e i r e q u i v a l e n t c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s o l u t i o n p h a s e ,a n d K a n d p a r e e m p i r i c a l p a r a m e t e r s . I n t h i s s t u d y , t h e

p a r a m e t e r K h as b e e n u s e d a s a m e a s u r e o f t h e a f f i n i t y o f

c a t i o n s f o r t h e p o l y e l e c t r o l y t e s . U n d e r s p e c i f i e d e x p e r i -m e n t a l c o n d i t i o n s t h e p a r a m e t e r p h a s b e e n f o u n d t o

a p p r o x i m a t e t o u n i t y ( s e e F i g . 1 ) , a n d t h i s v al ue h a s b e e nu s e d i n t h e d e r i v a t i o n o f a l l s u b s e q u e n t e q u a t i o n s .S c h u b e r t ( 1 9 5 2 ) h a s s h o w n t h a t , when one o f t h e c a t i o n s

u n d e r i n v e s t i g a t i o n i s p r e s e n t a t t r a c e r l e v e l , t h e u p t a k eo f t h e t r a c e r c a t i o n b y t h e e x c h a n g e m a t e r i a l i s p r o p o r t i o n a lt o t h e t r a c e r c o n c e n t r a t i o n i n t h e o ut si d e s o l u t i o n . T h e p r o -

p o r t i o n a l i t y f a c t o r , c a l l e d t h e d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t , K d , i sd e f i n e d b y

% o f c a t i o n b o u n d t o e x c h a n g e r v vK d = X-=Ax- ( 2 )

% o f c a t i o n i n s o l u t i o n m m

w h e r e v i s t h e v o l u m e o f t h e s o l u t i o n ( 1 . ) , m t h e m ass o f t h e

e x c h a n g e r ( g . ) a n d A i s t h e r a t i o o f t h e p e r c e n t a g e o f c a t i o n

b o u n d t o t h a t i n s o l u t i o n .

U n d e r c o n d i t i o n s w h e r e a b i v a l e n t t r a c e r c a t i o n i se x c h a n g i n g f o r a u n i v a l e n t c a t i o n i n t h e p o l y e l e c t r o l y t ep h a s e , t h e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n o f t h e u ni v al e nt i o n i n t h e

p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e ( X M ) a p p r o x i m a t e s t o u n i t y i r r e -s p e c t i v e o f t h e amount o f t r a c e r c a t i o n e x c h a n g e d . H e n c e ,a s s u m i n g t h a t XM = 1 a n d p = 1 , e q u a t i o n ( 1 ) can b e

c o m b i n e d w i t h e q u a t i o n ( 2 ) t o g i v e

K = Kax [ M I ]

C( 3 )

w h e r e C i s t h e e q u i v a l e n t b i n d i n g c a p a c i t y o f t h e p o l y -e l e c t r o l y t e ( e q u i v . / g . ) .

T h i s e q u a t i o n i s a l s o a p p l i c a b l e when t h e p o l y e l e c t r o -l y t e i s c o m b i n e d t o a s e p a r a t e i n s o l u b l e p h a s e , i . e . t h e a c i dm u c o p o l y s a c c h a r i d e b o u n d t o an i n s o l u b l e m a t r i x s u c h a s

c a r t i l a g e .

3 3 6



CATIONS AND ACID MUCOPOLYSACCHARIDES

T a b l e 1 . C a l c u l a t i o n o f t h e p a r a m e t e r Kfrom i o n - d i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s c a r r i e d o u t

a c c o r d i n g t o m e t h o d 1

M e t h o d 1 i s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . S o d i u m v e r o n a l b u f f e r ( 4 m l . ; I 0 - 1 6 , p H 7 . 2 - 7 . 4 ) , 0 - 1 5 g .o f Dowex 5 0 ( N a + f o r m ) r e s i n ( 0 - 4 8 2 m - e q u i v . ) , a m l . o f C a C l 2 s o l n . ( 5 3 - 3 m m ) , b m l . o f c h o n dr o i ti n s ul ph a te A

s o l n . ( C S A - 2 B , 5 3 mm i n d i s a c c h a r i d e r e p e a t i n g u n i t , 0 1 6 M i n N a C l , Na+ c o u n t e r i o n ) a n d 36- ( a + b ) m l . o f

N a C l s o l n . ( 0 - 1 6 1 w ) w e r e m i x e d a n d e q u i l i b r a t e d f o r 3 h r . a t 2 0 0 . T h e r e s i n was s e p a r a t e d f r o m t h e s o l u t i o n ,w a s h e d a n d a n a l y s e d f o r i t s c o n s t i t u e n t c a t i o n s . Al l r e s u l t s a r e e x p r e s s e d as mean v a l u e s o b t a i n e d f r o m d u p l i c a t e

e x p e r i m e n t s . T h e i o n d i s t r i b u t i o n s i n t h e a b s e n c e o f c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A ( c a l i b r a t i o n o f r e s i n ) a r e s h o w n i n ( A ) ,a n d t h e i o n d i s t r i b u t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A i n ( B ) .

( A ) I o n d i s t r i b u t i o n s i n t h e a b s e n c e o f c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A

a ( m l . ) 4 - 0 3 - 2 2 - 4

C a 2 + b o u n d t o r e s i n ( m - e q u i v . ) 0 - 2 0 8 0 - 1 8 9 0 - 1 5 3E q u i v a l e n t - f r a c t i o n C a 2 + i n r e s i n 0 - 4 3 2 0 - 3 9 2 0 - 3 1 7C o n e n . o f C a 2 + i n s o l n . ( m - e q u i v . / l . ) 5 - 4 6 0 3 - 8 0 3 2 - 5 7 1

C o n e n . o f Na+ i n s o l n . ( m - e q u i v . / l . ) 1 4 9 - 2 1 5 1 - 9 1 5 4 - 2[ N a + ] 2 / [ C a 2 + ] 4 - 0 8 6 - 0 7 9 - 2 5

( B ) I o n d i s t r i b u t i o

a ( m l . )b ( m l . )

C a 2 + b o u n d t o r e s i n ( m - e q u i v . )E q ui v a le n t- f r ac t i o n C a 2 + i n r e s i n[ N a + ] 2 / [ C a 2 + ] *T o t a l c a t i o n i n s o l n . ( m - e q u i v . )F r e e C a 2 + i n s o l n . ( m - e q u i v . )C a 2 + b o u n d t o c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A

( m - e q u i v . )C h o n d r o i t i n s u l p h a t e A i n s o l n . ( m - e q u i v . )E q u i v a l e n t - f r a c t i o n C a 2 + i n c h o n d r o i t i ns u l p h a t e A ( X c a )

X c a I X 2 aK ( c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n 1 )

o n e i n t h e p r e s e n c e o f c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A

4 - 0 4 . 0 4 . 02 4 - 0 2 0 - 0 1 6 - 0

0 - 1 4 7 0 - 1 5 2 0 - 1 6 70 3 0 5 0 - 3 1 5 0 - 3 4 69 . 7 9 . 3 8 - 06 - 1 8 6 6 - 1 8 6 6 - 1 8 60 - 0 9 6 0 * 1 0 0 0 - 1 1 50 - 1 8 3 0 - 1 7 4 0 - 1 4 4

2 - 5 4 40 - 0 7 2

0 - 0 8 40 - 8 1

2 - 1 2 00 - 0 8 2

0 - 0 9 70 - 9 0

1 - 6 9 60 - 0 8 5

0 - 1 0 10 - 8 0

1 - 60 - 1 0 60 - 2 2 01 - 6 1 4

1 5 6 - 31 5 - 1

4 - 08 - 0

0 - 1 7 40 - 3 6 17 - 36 - 1 8 60 - 1 2 60 - 1 2 6

1 - 2 7 20 - 0 9 9

0 - 1 2 20 - 8 9

0 - 80 - 0 6 00 - 1 2 50 - 6 3 2

1 5 8 - 33 9 - 8

4 - 04 - 0

0 - 1 8 70 - 3 8 86 - 16 - 1 8 60 - 1 5 00 - 0 8 9

0 - 8 4 80 - 1 0 5

0 - 1 3 10 - 8 0

* From c a l i b r a t i o n g r a p h .

T h e d i s t r i b u t i o n o f a c a t i o n b e t w e e n t h e p o l y e l e c t r o l y t ea n d t h e s o l u t i o n p h a s e c a n b e m e a s u r e d b y m a i n -

i n c o n t a c t w i t h t h e a q u e o u s p o l y e l e c t r o l y t ea s e p a r a t e i n s o l u b l e p h a s e , i . e . a n i o n - e x c h a n g e

t h a t c o n t a i n s t h e c a t i o n b u t n o t t h e p o l y e l e c t r o l y t e& S a m u e l s o n , 1 9 5 7 a , b ; S c h u b e r t , 1 9 5 2 ; H u g h e s

K l o t z , 1 9 5 6 ) , a n d d e t e r m i n i n g t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e

b e t w e e n s o l u t i o n a n d t h e i o n - e x c h a n g e r e s i n i n t h e

a n d a b s e nc e o f t h e p o l y e l e c t r o l y t e . From t h e s et h e d e g r e e o f a s s o c i a t i o n o f t h e c a t i o n w i t h t h e

c a n b e c a l c u l a t e d . A s t h e m e t h o d s o f c a l c u -d e p e n d o n w h e t h e r e q u a t i o n ( 1 ) o r ( 3 ) i s u s e d t o

t h e i o n d i s t r i b u t i o n s , d e t a i l s o f t h e r e l e v a n t c a l c u -a r e i n c l u d e d w i t h t h e d e s c r i p t i o n s o f t h e m e t h o d s

u s e d f o r t h e d e t e r m i na t i o n o f t h e i o n d i s t r i b u t i o n s .

o f d e t e r m i n i n g i o n d i s t r i b u t i o n s b e t w e e n

m u c o p o l y s a c c h a r i d e s i n s o l u t i o n a n d c a t i o n r1 )

P r o c e d u r e . S o d i u m v e r o n a l b u f f e r ( a p p r o x . o n e - t e n t h o f

s o l u t i o n v o l u m e ) , N a C l s o l n . a n d t h e c h l o r i d e s o l u t i o nf t h e b i v a l e n t i o n u n d e r i n v e s t i g a t i o n w e r e m i x e d a n d t h e

a + f o r m o f t h e i o n - e x c h a n g e r e s i n was a d d e d ( 0 - 0 2 - 0 - 5 g . ) .h e m i x t u r e s w e r e s h a k e n a t 2 0 0 f o r 3 h r . o n a r o t a r y s h a k e r

1 1 r e v . / m i n . ) . A f t e r t h i s t i m e t h e r e s i n was s e p a r a t e d f r o m

h e s o l u t i o n b y r a p i d f i l t r a t i o n w i t h a s m a l l s i n t e r e d - g l a s sThe

r e s i n w a s w a s h e d w i t h w a t e r a n dt h e

b o u n dw e r e e l u t e d w i t h 3 N - H C l . T h e e l u a t e was a n a l y s e dr i t s c o n s t i t u e n t c a t i o n s .

2 2

A s e r i e s o f s i m i l a r e x p e r i m e n t s w a s c a r r i e d o u t w i t h p r e .d e t e r m i n e d v o l u m e s o f a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s o l u t i o nr e p l a c i n g e q u a l v o l u m e s o f N a C l s o l n .

C a l c u l a t i o n s . I n t h e f i r s t s e r i e s o f e x p e r i m e n t s t h e e x p e r i -m e n t a l l y d e t e r m i n e d amount o f t h e b i v al ent i o n i n t h e

r e s i n , t o g e t h e r w i t h a k n o w l e d g e o f t h e a m o u n t s o f t h e

m a t e r i a l s t a k e n , w e r e s u f f i c i e n t d a t a f o r t h e c a l c u l a t i o n o f

t h e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n s i n t h e r e s i n p h a s e a n d t h e e q u i -v a l e n t c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s o l u t i o n p h as e o f b o t h t h e

u n i - a n d b i - v a l e n t c a t i o n s . A c a l i b r a t i o n c u r v e w a s t h e n

d r a w n b y p l o t t i n g X 2 M I X N a g a i n s t [ M ] 2 / [ N ] , w h e r e X Z a n d

XN ar e r e s p e c t i v e l y t h e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n s o f t h e u n i - a n db i - v a l e n t i o n s i n t h e r e s i n p h a s e a n d [ M ] a n d [ N ] ar e

r e s p e c t i v e l y t h e i r e q u i v a l e n t c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s o l u t i o n

p h a s e .T h e e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d amount o f t h e b i v a l e n t

c a t i o n i n t h e r e s i n , when m u c o p o l y s a c c h a r i d e w a s p r e s e n t ,

e n a b l e d t h e r a t i o X N / X N t o b e c a l c u l a t e d a n d t h e v a l u e o f

[ M ] 2 / [ N ] r e a d f r o m t h e c a l i b r a t i o n g r a p h . T h e c o n c e n t r a -

t i o n s o f t h e f r e e a n d m u c o p o l y s a c c h a r i d e - b o u n d c a t i o n

w e r e t h e n d e t e r m i n e d a n d t h e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n s o f t h e

c a t i o n s i n t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e c a l c u l a t e d . T h e e x -

c h a n g e p a r a m e t e r s w e r e t h e n c a l c u l a t e d b y a p p l y i n g

e q u a t i o n ( 1 ) . I n t h e s e c a l c u l a t i o n s t h e c h a n g e i n v o l u m e o f

t h e o u t e r s o l u t i o n c a u s e d b y t h e p r e s e n c e o f r e s i n a n d a c i d

m u c o p o l y s a c c h a r i d e h a s n o t b e e n t ak e n i n t o c o n s i d e r a t i o n .E r r o r s i n t h e c a l c u l a t i o n s a r i s i n g f r o m t h e s e a s s u m p t i o n s

a r et h o u g h t

t ob e i n s i g n i f i c a n t ( s e e D i s c u s s i o n ) . T a b l e 1 ,c o n t a i n i n g a t y p i c a l s e t o f e x p e r i m e n t a l d e t a i l s , i s i n c l u d e d

t o i l l u s t r a t e t h e c a l c u l a t i o n s b y t h i s m e t h o d .

B i o c h . 1 9 6 2 , 8 5

8 5 3 3 7



J . R . DUNSTONE

M e t h o d o f d e t e r m i n i n g i o n d i s t r i b u t i o n s b e t w e e n a c i d

m u w o p o l y s a c c h a r i v 8 s i n s o l u t i o n a n d c a t i o n s p r e s e n t

at t r a c e r l e v e l s ( m e t h o d 2 )


t o t a l s o l u t i o n v o l u m e ) c o n t a i n i n g t r a c e r l e v e l s o f t h e c a t i o n

u n d e r i n v e s t i g a t i o n , a p r e d e t e r m i n e d v o l u m e o f a c i d m u c o -p o l y s a c c h a r i d e s o l u t i o n ( N a + c o u n t e r i o n ) a n d N a C l s o l n .

w e r e m i x e d a n d s h a k e n f o r 1 h r . a t 2 0 0 . S o l u t i o n s , i n w h i c ht h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s o l u t i o n w a s r e p l a c e d b yN a C l s o l n . , w e r e a l s o i n c l u d e d . P o r t i o n s ( 1 - 5 m l . ) o f t h e

s o l u t i o n s w e r e t a k e n f o r r a d i o c h e m i c a l a n a l y s i s a n d t h e

N a + f o r m o f t h e i o n - e x c h a n g e r e s i n ( 0 - 0 2 - 0 - 5 g . ) w a s a d d e d .

T h e m i x t u r e w a s e q u i l i b r a t e d i n t h e m a n n e r d e s c r i b e d i nm e t h o d 1 . P o r ti o n s ( 1 -5 m l . ) o f t h e s u p e r n a t a n t s o l u t i o n sw e re t h e n t a k e n f o r r a d i o c h e m i c a l a n a l y s i s . Where n o r a d i o -a c t i v e i s o t o p e w a s a v a i l a b l e , e . g . M g 2 + , o r when b a l a n c e

s t u d i e s w e r e m a d e , t h e c at i o n c o nt e nt s o f b o t h t h e r e s i np h a s e a n d t h e s o l u t i o n p h a se w e re d e t e r m i n e d .

C a l c u l a t i o n s . From t h e s e e x p e r i m e nt s t h e p e r c e n t a g er a t i o s f o r t h e u p t a k e o f t r a c e r c a t i o n b y t h e i o n - e x c h a n g e

r e s i n i n t h e p r e s e n c e a n d t h e a b s e n c e o f t h e p o l y e l e c t r o l y t ew e r e c a l c u l a t e d .T h e d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t f o r t h e u p t a k e o f t h e t r a c e r

c a t i o n b y t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e c a n b e r e p r e s e n t e db y

K d = ( o / A l - 1 ) x ( v / m ) ( 4 )

w h e r e A 0 a n d A a r e r e s p e c t i v e l y t h e p e r c e n t a g e r a t i o s o f t h e

c a t i o n b o u n d t o t h e r e s i n t o t h a t f r e e i n s o l u t i o n i n t h e

a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e ( s e eS c h u b e r t , 1 9 5 6 ) . S u bs ti t ut i o n o f e q u a t i o n ( 4 ) i n e q u a t i o n

( 3 ) g i v e s( A / A - 1 ) x ( 5 )

[ C ] x M ] ( 5

w h e r e [ C ] i s t h e e q ui v al e n t b i n d i n g c a p a c i t y o f t h e a c i d

m u c o p o l y s a c c h a r i d e i n e q u i v . / l .T h e p a r a m e t e r K w a s t h e n c a l c u l a t e d b y s u b s t i t u t i n g t h e

e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d p e r c e n t a g e r a t i o s i n e q u a t i o n ( 5 ) .T a b l e 2 , c o n t a i n i n g a t y p i c a l s e t o f e x p e r i m e n t a l d e t a i l s , i si n c l u d e d t o i l l u s t r a t e t h e c a l c u l a t i o n b y t h i s m e t h o d .

M e t h o d o f d e t e r m i n i n g i o n d i a t r i b u t i o n 8 b e t w e e n a c i d

m u c o p o l y p a c c h a r i d e 8 b o u n d t o an i n 8 o l u b l e p h a s e a n dc a t i o n s p r e s e n t a t t r a c e r l e v e l s ( m e t h o d 3 )


t o t a l s o l u t i o n v o l u m e ) c o n t a i n i n g t r a c e r l e v e l s o f t h e c a t i o n

u n d e ri n v e s t i g a t i o n ,

ap r e d e t e r m i n e d m a s s o f N a + - s a t u -r a t e d c a r t i l a g e ( 0 - 1 - 0 g . ) a n d N a C l s o l n . w e r e m i x e d a n d

e q u i l i b r a t e d a s d e s c r i b e d i n m e t h o d 1 . P o r t i o n s ( 1 - 5 m l . )o f t h e s u p e r n a t a n t s o l u t i o n s w e r e t h e n t a k e n f o r r a d i o -c h e m i c a l a n a l y s i s .

C a l c u l a t i o n s . From t h e s e e x p e r i m e n t s t h e d i s t r i b u t i o n

T a b l e 2 . C a l c u k a t i o n o f t h e p a r a m e t e r Kf r o m i o n - d i 8 t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o m e t h o d 2

M e t h o d 2 i s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . S o d i u m v e r o n a l b u f f e r ( 2 m l . ; 1 0 - 1 6 , pH 7 - 2 - 7 - 4 )c o n t a i n i n g 8 9 9 0 S r , a m l . o f c h o n d r o i ti n s u l p h a t e A s o l n . ( C S A - 2 B , 5 9 mm i n d i s a c c h a r i d e r e p e a t i n g u n i t ,0 - 1 6 M i n N a C l , Na+ c o u n t e r i o n ) a n d 1 4 - a m l . o f N a C l s o l n . ( 0 - 1 6 M ) w e r e m i x e d a n d s h a k e n f o r 1 h r . a t 2 0 ° .T h r e e p o r t i o n s ( 2 - 0 m l . ) w e r e t a k e n f o r r a d i o c h e m i c a l a n a l y s i s a n d 0 - 0 2 g . o f Dowex 5 0 ( N a + f o r m ) r e s i n w as

a d d e d . T h e s o l u t i o n w a s e q u i l i b r a t e d f o r 3 h r . a t 2 0 ° a n d t h r e e p o r t i o n s ( 2 - 0 m l . ) o f t h e s u p e r n a t a n t s o l u t i o nw e r e t a k e n f o r r a d i o c h e m i c a l a n a l y s i s . Al l r e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s t h e m e a n v al ue s o f d u p l i c a t e e x p e r i m e n t s .

A c t i v i t y o f 8 9 - 9 0 S r( c o u n t s / m i n . )_-.

B e f o r e r e s i n A f t e r r e s i na d d e d a d d e d

1 2 6 8 3 6 51 2 3 0 4 3 41 0 5 3 4 3 01 0 4 5 4 8 21 0 7 2 5 2 3

D i s t r i b u t i o n o f 8 9 - 9 0 S rb e t w e e n p h a s e s ( % )

R e s i nS o l n . ( c a l c . )

2 8 - 8 7 1 - 23 5 - 3 6 4 - 74 0 - 8 5 9 - 24 6 - 1 5 3 - 94 8 - 8 5 1 - 2

T a b l e 3 . C a l c u l a t i o n o f t h e p a r a m e t e r Kfrom i o n - d i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t 8 c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o method 3

M e t h o d 3 i s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . S a m p l e s o f N a + - c a r t i l a g e ( 0 - 7 9 m - e q u i v . / g . ) were e q u i l i -b r a t e d w i t h 5 m l . o f s o d i u m v e r o n a l b u f f e r ( I 0 - 1 6 , p H 7 - 2 - 7 - 4 ) c o n t a i n i n g 8 9 - 9 0 S r a n d 4 5 m l. o f NaCl s o l n . ( 0 - 1 6 M )f o r 3 h r . a t 2 0 0 . T h r e e p o r t i o n s ( 2 - 0 m l . ) o f t h e s u p e r n a t a n t s o l u t i o n were taken f o r r a d i o c h e m i c a l a n a l y s i s .A l l r e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s mean v a l u e s o f d u p l i c a t e e x p e r i m e n t s .

M a s s o f

c a r t i l a g e( g . )0

0 - 20-5

0 - 81 - 0

8 9 ' 9 0 5 r a c t i v i t y

( c o u n t s / m i n . )

7 6 66 4 6

5 2 14 5 64 1 8

D i s t r i b u t i o n o f 8 9 - 9 0 S rb e t w e e n p h a s e s ( % )

A 1 0 2 K d K

C a r t i l a g e ( c a l c . f r o m ( c a l c . f r o mS o l n . ( c a l c . ) e q u a t i o n 2 ) e q u a t i o n 3 )

8 4 - 3

6 8 - 05 9 - 5

5 4 - 6

1 5 - 7

3 2 - 04 0 - 54 5 - 4

4 - 6 5

4 - 7 14 - 2 64 - 1 6

1 - 5 1

1 - 5 31 - 3 81 - 3 5

a

( m l . )

0

1 - 02 - 03 - 0

4 - 0

C o n e n . o fc h o n d r o i t i n

s u l p h a t e( m - e q u i v . / l . )

0

7 - 3 81 4 - 7 62 2 - 1 42 9 - 5 2

A

2 - 4 7 ( A O )1 - 8 31 - 4 51 - 1 71 - 0 5

A O / A - 1

0 - 3 50 - 7 01 - 1 1

1 - 3 5

K( c a l c . f r o me q u a t i o n 5 )

1 - 2 21 - 2 21 - 2 91 - 1 7

3 3 8 1 9 6 2




c o e f f i c i e n t s f o r t h e u p t a k e o f t r a c e r c a t i o n b y t h e b o u n da c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e w e r e c a l c u l a t e d d i r e c t l y b ya p p l y i n g e q u a t i o n ( 2 ) . E q u a t i o n ( 3 ) w a s t h e n u s e d t o c a l c u -l a t e t h e p a r a m e t e r K . T a b l e 3 , c o n t a i n i n g a t y p i c a l s e t o f

e x p e r i m e n t a l d e t a i l s , i s i n c l u d e d t o i l l u s t r a t e t h e c a l c u -l a t i o n s b y t h i s m e t h o d .

A n a l y t i c a l m e t h o d 8

U r o n i c a c i d . T h e c a r b a z o l e m e t h o d o f D i s c h e ( 1 9 4 7 ) w a su s e d w i t h D - g l u c u r o n i c a c i d ( S i g m a C h e m i c a l C o . ) a s

s t a n d a r d .

N i t r o g e n . T h i s w a s d e t e r m i n e d b y a m i c r o - K j e l d a h l

p r o c e d u r e ( F r a n c i s , M u l l i g a n & W o r m a l l , 1 9 5 4 b ) .H e x o s a m i n e . D e t e r m i n a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t b y t h e

p r o c e d u r e o f E l s o n & M o r g a n ( 1 9 3 3 ) a s m o d i f i e d b y B o a s

( 1 9 5 3 ) w i t h t h e o m i s s i o n o f t h e i o n - e x c h a n g e s e p a r a t i o n .H e x o s a m i n e was l i b e r a t e d f r o m t h e a c i d m u c o p o l y -s a c c h a r i d e s b y h y d r o l y s i s w i t h 6 N - H C l i n s e a l e d a m p o u l e sa t 1 0 0 0 f o r 1 5 h r . D - G l u c o s a m i n e h y d r o c h l o r i d e ( N u t r i -t i o n a l B i o c h e m i c a l s C o r p . ) , s u b m i t t e d t o t h e same t r e a t -

m e n t , was u s e d a s s t a n d a r d .

S u l p h a t e . D e t e r m i n a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t b y r e f l u x i n gt h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e w i t h 2 N - H C 1 f o r 4 h r . a n d

t h e n u s i n g t h e m e t h o d o f F r i t z , Yamamura & R i c h a r d

( 1 9 5 7 ) .R a d i o c h e m i c a l a n a l y 8 e s . P o r t i o n s ( 1 - 5 m l . ) o f r a d i o -

a c t i v e s o l u t i o n s w e r e t r a n s f e r r e d t o 2 5 m m . d i a m e t e r

p l a n c h e t s a n d 2 0 d r o p s o f a n a s b e s t o s s u s p e n s i o n ( F r a n c i s ,M u l l i g a n & W o r m a l l , 1 9 5 4 a ) w e r e a d d e d t o a s s i s t s p r e a d i n g ,a n d t h e p l a n c h e t s w e r e d r i e d u n d e r an i n f r a r e d l a m p ( 8 0 ° ) .S o l u t i o n s c o n t a i n i n g 1 4 0 B a w e r e f r e e d o f t h e 1 4 0 L a ' d a u g h t e r 'b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y O v e r m a n & C l a r k ( 1 9 6 0 ) .H o w e v e r , t h e 1 4 0 B a was n o t p r e c i p i t a t e d a s t h e s u l p h a t e

b u t p l a n c h e t s w e r e p r e p a r e d f r o m t h e 1 4 0 L a - f r e e s o l u t i o ni n t h e manner d e s c r i b e d a b o v e . T h e r a d i o a c t i v i t i e s o f t h e

4 5 C a , 8 9 ' 9 0 S r a n d ' 4 " B a w e r e t h e n m e a s u r e d w i t h an e n d -

w i n d o w G e i g e r - M u l l e r t u b e ( n o . 1 8 5 0 6 , P h i l i p s E l e c t r i c a lI n d u s t r i e s ) , a n d t h e r a d i o a c t i v i t y o f 1 3 3 B a s a m p l e s w a s

m e a s u r e d w i t h a s c i n t i l l a t i o n d e t e c t o r (PW 4 1 1 1 , P h i l i p sE l e c t r i c a l I n d u s t r i e s ) , b o t h t y p e s o f d e t e c t o r b e i n g

c o u p l e d w i t h a s t a n d a r d s c a l i n g a n d r e c o r d i n g u n i t .Amounts o f r a d i o a c t i v i t y w e r e s e l e c t e d s o t h at c o i nc i d e n c e

c o r r e c t i o n s w e r e u n n e c e s s a r y ( c o u n t r a t e l e s s t h a n 2 0 0 0 /

m i n . ) . No c o r r e c t i o n s w e r e n e c e s s a r y f o r p h y s i c a l d e c a y o r

s e l f - a b s o r p t i o n a s m e a s u r e m e n t s o f i n i t i a l a n d f i n a l c o n c e n -

t r a t i o n s w e r e made a t a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e t i m e f r o m

s a m p l e s o f a l m o s t i d e n t i c a l c o m p o s i t i o n . S a m p l e s c o n -

t a i n i n g 8 9 ' 9 0 S r w e r e l e f t f o r a t l e a s t 1 5 d a y s a n d t h o s e

c o n t a i n i n g 1 4 ' B a f o r 1 0 d a y s b e f o r e c o u n t i n g t o e n a b l er a d i o a c t i v e e q u i l i b r i u m t o b e a t t a i n e d . A l l p l a n c h e t s w e r e

p r e p a r e d i n t r i p l i c a t e a n d t h e a c t i v i t i e s o f t h e r e p l i c a t e s d i d

n o t d i f f e r f r o m t h e m e a n v a l u e b y m o r e t h a n 2% when

4 0 0 0 o r m o r e c o u n t s w e r e t a k e n .

C a t i o n s . S o d i u m a n d p o t a s s i u m w e r e a n a l y s e d d i r e c t l yb y a f l a m e - s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d w i t h a Beckman

m o d e l DU f l a m e s p e c t r o p h o t o m e t e r . M a g n e s i u m , c a l c i u m ,s t r o n t i u m a n d b a r i u m w e r e d e t e r m i n e d b y a m e t h o dd e s c r i b e d b y D u n s t o n e & P a y n e ( 1 9 5 9 ) o r b y a m o d i f i -c a t i o n o f t h i s p r o c e d u r e i n w h i c h a l l c o n c e n t r a t i o n s w e r e

d e c r e a s e d t o o n e - f i f t h a n d e x t i n c t i o n s ( a t 2 2 5 m , u ) m e a -s u r e d i n 5 o r 1 0 c m . c e l l s . I n s o m e e x p e r i m e n t s w h e r e

m a g n e s i u m a n d c al c i u m w e r e p r e s e n t a t c o n c e n t r a t i o n s

g r e a t e r t h a n 0 - 1 mm, t h e m a g n e s i u m w a s a l s o d e t e r m i n e db y t h e T h i a z o l Y e l l o w m e t h o d d e s c r i b e d b y S a n d e l l ( 1 9 5 0 ) ,

t h e e x t i n c t i o n s ( a t 5 3 5 mu) b e i n g m e a s u r e d i n 5 c m . c e l l s ,a n d t h e c a l c i u m w a s d e t e r m i n e d b y t i t r a t i o n w i t h EDTA

a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f D u n s t o n e ( 1 9 5 7 ) .

P h y 8 i c a l m e t h o d 8

V i s c o s i t y . The t e r m i n o l o g y f o r t h e v i s c o s i t y f u n c t i o n s

u s e d w a s t h a t p r o p o s e d b y C r a g g ( 1 9 4 6 ) . T h e m e a s u r e m e n t s

w e r e made i n m o d i f i e d U b b e l o h d e v i s c o m e t e r s w h i c h p e r -

m i t t e d s u c c e s s i v e d i l u t i o n s w i th i n t h e i n s t r u m e n t s ( D a v i s &E l l i o t t , 1 9 4 9 ) . T h e i n s t r u m e n t s w e r e c a l i b r a t e d w i t h w a t e r

a n d s u c r o s e s o l u t i o n s a n d t h e n e c e s s a r y c o r r e c t i o n s f o rk i n e t i c e n e r g y w e r e c a l c u l a t e d b y t h e m e t h o d o f J o h n s o n &

Rowe ( 1 9 6 1 ) . B e c a u s e o f t h e s m al ln e s s o f t h e d e t e r m i n e d

c o r r e c t i o n s (< 0 . 5 % ) t h e y h a v e n o t b e e n a p p l i e d t o t h e

d a t a r e p o r t e d . A l l s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d i n 0 - 1 5 M -

s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 0 , 0 - 2 M i n N a C l , a n d c e n t r i -f u g e d a t 5 0 0 0 0 g a v . f o r 1 h r . ( S p i n c o m o d e l L c e n t r i f u g e ,r o t o r n o . 3 0 ) b e f o r e u s e . T h e t e m p e r a t u r e o f t h e s y s t e m w a sm a i n t a i n e d a t 3 0 - 0 ± 0 - 0 1 0 , t h e t i m e o f f l o w w a s m e a s u r e dt o 0 . 1 s e c . a n d a t l e a s t s i x r e a d i n g s w e r e made a t e a c h

c o n c e n t r a t i o n . T h e i n t r i n s i c v i s c o s i t y [ X ] was d e t e r m i n e d

b y p l o t t i n g r e d u c e d v i s c o s i t y , 7 7 p . / c , a g a i n s t c ( c o n c e n -t r a t i o n , g . / 1 0 0 m l . ) a n d e x t r a p o l a t i n g t o c = 0 .O p t i c a l r o t a t i o n . M e a s u r e m e n t s w e r e made o n 1 - 5 - 2 - 0 %

( w / v ) s o l u t i o n s i n 2 d m . t u b e s i n a H i l g e r p o l a r i m e t e r .T e n r e a d i n g s w e r e t ak e n o n e a c h s o l u t i o n .

M a t e r i a l 8

C a r t i l a g e . C a t i o n - s a t u r a t e d c a r t i l a g e w a s p r e p a r e d a n da n a l y s e d b y t h e m e t h o d s d e s c r i b e d b y D u n s t o n e ( 1 9 5 9 ) .

A c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e 8 . T a b l e 4 l i s t s t h e s o u r c e s ,m e t h o d s o f p r e p a r a t i o n a n d c h e m i c a l a na ly s e s o f t h e a c i d

m u c o p o l y s a c c h a r i d e s u s e d . I n g e n e r a l , t h e a n a l y t i c a l d a t a

r e p o r t e d w e r e s u f f i c i e n t f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e v a r i o u s

m u c o p o l y s a c c h a r i d e s . T h e s o l u b i l i t y i n a q u e o u s e t h an o l o f

t h e c a l c i u m s a l t s o f a l l c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A p r e p a r a t i o n s

w a s t e s t e d t o v e r i f y t ha t t h e s e m a t e r i a l s c o n t a i n e d o n l y

m i n i m a l a m o u n t s o f c h o n d r o i t i n s u l p h a t e C . I n a l l c a s e s ,more t h a n 9 0 % o f t h e p r e c i p i t a b l e m a t e r i a l w a s r e c o v e r e d

a t o r b e l o w e t h a n o l c o nc e nt ra t i o ns o f 40% ( v / v ) . T h i s

i n d i c a t e s c o n t a m i n a t i o n w i t h o n l y s m a l l q u a n t i t i e s o f

c h o n d r o i t i n s u l p h a t e C , w h i c h r e q u i r e s h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s

o f e t h a n o l f o r p r e c i p i t a t i o n ( s e e M e y e r, D av i d s o n, L i n k e r &

H o f f m a n , 1 9 5 6 ) .U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d , a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s f o r

u s e i n b i n d i n g e x p e r i m e n t s w e r e p r e p a r e d b y d i s s o l v i n ga p p r o x . 2 g . o f t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e i n 1 0 0 m l . o f

w a t e r a n d p a s s i n g t h e s o l u t i o n t h re e t i m e s t h r o u g h a

c o l u m n o f Dowex 5 0 ( N a + f o r m ) . T h e s o l u t i o n s w e r e c o n -c e n t r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d c l a r i f i e d b y c e n t r i -f u g i n g a t 2 3 0 0 0 g , V f o r 1 h r . ( S p i n c o m o d e l L c e n t r i f u g e ,r o t or n o . 2 1 ) . T h e p H w a s a d j u s t e d t o 7 - 2 - 7 - 4 (NaOH o r

H C I ) , N a C l w a s a d d e d t o g i v e t h e d e s i r e d I a n d a c r y s t a l o f

t h y m o l a d d e d t o p r e v e n t b a c t e r i a l g r o w t h . S o l u t i o n s w e r e

k e p t r e f r i g e r a t e d u n t i l u s e d . I n s o m e e x p e r i m e n t s K+ i o n

was s u b s t i t u t e d f o r t h e Na+ i o n i n a l l s t e p s o f t h e p r e p a -

r a t i o n .I o n - e x c h a n g e r e s i n f o r e q u i l i b r i u m e x p e r i m e n t s . Dowex 5 0

( X 8 ; 5 0 - 1 0 0 m e s h ) was p r e p a r e d i n v a r i o u s c a t i o n f o r m s b yt h e m e t h o d o f S c h u b e r t ( 1 9 5 2 ) . A n a l y s i s o f t h e a i r - d r i e dN a + f o r m s h o w e d a c a p a c i t y o f 3 - 3 7 m - e q u i v . / g . a n d a

m o i s t u r e c o n t e n t o f 2 9 - 0 % ( d r i e d a t 1 1 0 0 t o c o n s t a n t

w e i g h t ) . T h e c a p a c i t y v a r i e d i n t h e r a n g e 3 - 3 7 - 3 - 2 1 m-

e q u i v . / g . o v e r a p e r i o d o f 2 y e a r s .

2 2 - 2

8 5 3 3 9



J . R . D U N S T O N E

V e r o n a l b u f f e r ( p H 7 - 2 - 7 - 4 , I 0 - 1 6 ) . D i e t h y l b a r b i t u r i c

a c i d ( 2 8 - 6 m - m o l e s ) ( D r u g H o u s e s o f A us tr al i a L t d . ) w a s

d i s s o l v e d i n a b o u t 2 0 0 m l . o f a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 2 8 - 6 m -

m o l e s o f NaOH; 1 5 1 - 4 m - m o l e s o f N a C l a n d 2 0 m - m o l e s o f

HC I w e r e t h e n a d d e d a n d t h e s o l u t i o n w a s d i l u t e d t o 1 1 .

I n e x p e r i m e n t s w i t h a t r a c e r c a t i o n a b o u t 0 - 1 m c o f t h e

r a d i o a c t i v e i s o t o p e w a s a d d e d p e r l i t r e o f b u f f e r . I n e x p e r i -m e n t s w h e r e t h e N a + i o n w a s r e p l a c e d b y o t h e r c a t i o n s , t h e

o x i d e o r h y d r o x i d e o f t h e p a r t i c u l a r c a t i o n w a s s u b s t i t u t e d

f o r t h e N a O H a n d i t s c h l o r i d e f o r t h e N a C l i n a m o u n t s t og i v e a t o t a l I o f 0 - 1 6 .

R a d i o a c t i v e i s o t o p e 8 . T h e r a d i o a c t i v e i s o t o p e s 4 5 C a , 8 9 S r ,

T a b l e 4 . S o u r c e s , m e t h o d 8 o f p r e p a r a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f a c i d m u c o p o l y 8 a c c h a r i d e 8 u s e di n d i a t r i b u t i o n e x p e r i m e n t 8

A l l v a l u e s g i v e n i n t h i s T a b l e h a v e b e e n c o r r e c t e d f o r t h e l o s s i n w e i g h t o n d r y i n g .

P e r c e n t a g e s

S u b s t a n c e

C h o n d r o i t i n s u l p h a t e A [ N a + c o u n t e r -i o n ; L . L i g h t a n d C o . L t d . ( C S A- 1 ) ]

C h o n d r o i t i n s u l p h a t e A [ u n k n o w nc o u n t e r i o n ; G e n e r a l B i o c h e m i c a l sI n c . ; a s r e c e i v e d ( C S A - 2 A ) ]

C h o n d r o i t i n s u l p h a t e A [ K + c o u n t e r -i o n ; G e n e r a l B i o c h e m i c a l s I n c . ;p u r i f i e d t w i c e b y m e t h o d o f E i n b i n d e r& S c h u b e r t ( 1 9 5 0 ) ( C S A - 2 B ) ]

C h o n d r o i t i n s u l p h a t e A [ K + c o u n t e r -

i o n ; p r e p a r e d f r o m a c e t o n e - d r i e db o v i n e n a s a l s e p t a b y t h e m e t h o d o fD o r f m a n & C i f o n e l l i ( 1 9 5 7 ) ; p u r i f i e do n c e b y m e t h o d o f E i n b i n d e r &S c h u b e r t ( 1 9 5 0 ) ( C S A - 3 ) ]

C h o n d r o i t i n s u l p h a t e A [ N a + c o u n t e r -

i o n ; p r e p a r e d f r o m a c e t o n e - d r i e d

b o v i n e n a s a l s e p t a b y m e t h o d o fM a t h e w s & D o r f m a n ( 1 9 5 3 ) ; p u r i f i e db y p r e c i p i t a t i n g t w i c e w i t h C o ( N H 3 ) 3 +i o n s ( C S A - 4 ) ]

C h o n d r o i t i n s u l p h a t e A [ N a + c o u n t e r -

i o n ; p r e p a r e d f r o m f r e s h b o v i n e n a s a ls e p t a b y m e t h o d o f M a t h e w s &Dorfman ( 1 9 5 3 ) ; p u r i f i e d b y p r e c i p i -t a t i n g t w i c e w i t h C o ( N H , ) B + i o n s

( C S A - 5 ) ]P a r t i a l l y d e s u l p h a t e d c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e A [ N a + c o u n t e r i o n ; p r e -p a r e d f r o m p u r i f i e d c h o n d r o i t i ns u l p h a t e A ( G e n e r a l B i o c h e m i c a l s

I n c . ) b y m e t h o d o f K a n t o r &

S c h u b e r t ( 1 9 5 7 ) ( C S A - 6 ) ]C h o n d r o i t i n s u l p h a t e B [ , - h e p a r i n ,Na+ c o u n t e r i o n ; F . H o f m a n n - L aR o c h e a n d C o . L t d . ; p r e p a r e d f r o mox l u n g b y m e t h o d o f M a r b e t &W i n t e r s t e i n ( 1 9 5 3 ) ]

H e p a r i n 1 [ N a + c o u n t e r i o n ; A b b o t tL a b o r a t o r i e s L t d . ]

H e p a r i n 1 1 [ N a + c o u n t e r i o n ; T h eU p j o h n C o . ]

H e p a r i n m o n o s u l p h a t e [ N a + c o u n t e r -

i o n ; T h e U p j o h n C o . ; p u r i f i e d b yf r a c t i o n a t i o n w i t h c e t y l p y r i d i n i u mc h l o r i d e b y m e t h o d o f C i f o n e l l i &D o r f m a n ( 1 9 6 0 ) ; t h e ' h e p a r i n mono-

s u l p h a t e ' f r a c t i o n s o o b t a i n e d wast h e n r e f r a c t i o n a t e d b y t h e sam e

m e t h o d ]

[ z ] D( c 1 - 5 - 2 - 0i n w a t e r )

-26

-32

-22

L o s s i n w t .o n d r y i n g( 1 1 0 ° i n

U r o n i c v ac u o o v e ra c i d P 2 0 5 f o r

H e x o s a m i n e ( c a r b a z o l e ) N S O 4 2 h r . )

3 0 - 4 3 1 - 6 3 - 3 1 7 - 0 1 9 - 6

3 2 - 2 3 3 * 4 3 - 9 1 4 - 7 7 . 9

2 7 - 9 3 7 - 0 2 - 6 1 6 - 4 2 0 - 1

- 2 7 2 9 - 0

- 3 1 2 5 - 4

- 3 2 2 5 - 6

-18 3 6 - 0

-66 2 8 - 5

+50

+48

2 6 - 0

2 4 - 0

+51 2 8 - 2

P r o t e i n( n o n -

h e x o s a m i n eN x 6 - 2 5 )

5 - 7

8 - 6

2 - 5

3 3 - 7 2 - 6 1 5 - 8 4 - 0 2 - 0

3 0 - 5 4 - 1 1 4 - 5 1 1 - 0 1 3 - 1

3 3 - 7 3 - 8 1 3 - 3 1 8 - 0 1 0 - 3

4 4 - 5 2 - 8 1 1 - 1 1 6 - 2 -

1 8 - 2 2 - 6 1 7 - 2 1 4 - 5 2 - 3

4 4 - 4 2 - 3 3 3 - 8 2 1 - 7 1 - 6

4 4 - 8 2 - 6 3 9 - 6 1 6 - 5 4 - 4

4 7 - 1 2 - 6 2 0 - 7 1 6 - 8 2 - 4

3 4 0 1 9 6 2



CATIONS AND ACID MU C OPOLYSA C CH A RIDES

a n d 1 4 0 B a w e r e o b ta i n e d a s t h e i r c h l o r i d e s f r o m t h e

ak R i d g e N a t i o n a l L a b o r a t o r y , Oak R i d g e , T e n n . , U . S . A .

h e 4 5 C a a n d 1 3 3 B a h a d s p e c i f i c a c t i v i t i e s o f 3 5 3 8 4 m c / g .

n d 0 - 8 0 4 m c / g . r e s p e c t i v e l y , w h e r e a s t h e 8 9 S r , w h i c h c o n -

s o m e 9 0 S r (< 1 0% o f o r i g i n a l a c t i v i t y ) , a n d t h e

w e r e c a r r i e r - f r e e .

R ESULTS

P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s

Time o f a t t a i n m e n t o f e q u i l i br i um . I n a l l e x p e r i -

e q u i l i b r i u m was r e a c h e d w i t h i n 1 h r . , and

o c h a n g e s i n t h e i o n d i s t r i b u t i o n s o c c u r r e d i n t h e

u b s e q u e n t 2 5 h r .V a l i d i t y o f m e t h o d s . ( i ) C a t i o n b a l a n c e s were

a r r i e d o u t on a l l e q u i l i b r i a i n v o l v i n g a c i d muco-

p o l y s a c c h a r i d e s i n s o l u t i o n . The r e c o v e r y o f a d d e db i v a l e n t c a t i o n d e t e r m i n e d by a n a l y s i s o f t h e

s o l u t i o n a n d r e s i n p h a s e s was f o u n d t o b e 1 0 1 + 3 % .The c a p a c i t y o f t h e c a t i o n - e x c h an ge r e s i n a s d e t e r -

m i n e d by t h e a n a l y s i s o f t h e r e si n a f te r e q u i l i b r a t i o nw as 9 9 - 3 + 1 - 5 0 / o f t h e v a l u e o b t a i n e d b e f o r e -

e q u i l i b r a t i o n .( i i ) W h e n r a d i o a c t i v e i s o t o p e s w e r e u s e d e x p e r i -

m en ts w er e c a r r i e d o u t t o c h e c k w h e t h e r t h e i s o -t o p e was a d s o r b e d on t o t h e w a l l s o f t h e g l a s s

v e s s e l s . R a d i o a c t i v e s o l u t i o n s w e r e t r a n s f e r r e d

f r o m v e s s e l t o v e s s e l w i t h 3 0 m i n . s h a k i n g b e t w e e n

e a c h t r a n s f e r . R a d i o c h e m i c a l a n a l y s e s w e r e m a d e

b e f o r e e a c h t r a n s f e r and no s i g n i f i c a n t c h a n g e s i n

c o u n t r a t e o c c u r r e d i n f i v e t r a n s f e r s w i t h an y o f

t h e i s o t o p e s u s e d .

( i i i ) E q u a t i o n s ( 2 ) , ( 3 ) a n d ( 4 ) a r e v a l i d o n l y

when t h e d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t s a r e i n d e p e n d e n t

o f t h e e x t e n t t o w h i c h t h e t r a c e r c a t i o n i s a d s o r b e d

( S c h u b e r t , 1 9 5 6 ) . The c o n c e n t r a t i o n s o f t r a c e r

c a t i o n a t w h i c h t h e d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t s s h o u l d

b e g i n t o d e v i a t e were c a l c u l a t e d by t h e method

d e s c r i b e d by S c h u b e r t ( 1 9 5 6 ) . A l l e x p e r i m e n t s

were c ar r i e d o u t a t c o n c e n t r a t i o n s l e s s t h a n t h e

c a l c u l a t e d f i g u r e s . At c o n s t a n t I , t h e d i s t r i b u t i o n

c o e f f i c i e n t s were f o u n d t o b e c o n s t a n t f o r a l l c o n -

c e n t r a t i o n s o f t r a c e r c a t i o n u s e d , e x c e p t w i t h

c a r t i l a g e , w h e r e d i f f e r e n c e s were o b s e r v e d when t h e

t r a c e r c o n c e n t r a t i o n a p p r o a c h e d t h e m a x i m u m

a l l o w a b l e ( f o r f u r t h e r d e t a i l s s e e b e l o w , and

D i s c u s s i o n s e c t i o n ) .( i v ) I n c h e c k i n g t h e r e l i a b i l i t y o f e x p e r i m e n t s

w i t h r a d i o a c t i v e i s o t o p e s S c h u b e r t ( 1 9 5 2 ) h a s

shown t h a t a p l o t o f 1 / A v e r s u s [ C ] s h o u l d g i v e a

s t r a i g h t l i n e , w h i c h w h e n e x t r a p o l a t e d t o [ C ] = 0

g i v e s an i n t e r c e p t o f 1 / A O . T h i s p l o t h a s b e e n u s e d

i n a l l t h e s y s t e m s s t u d i e d a n d t h e v a l u e s o f A 0d e d u c e d i n t h i s w a y were f o u n d t o b e 1 0 1 + 6 % o f

t h e v a l u e s o b t a i n e d by d i r e c t m e a s u r e m e n t .

A n e s t i m at e h a s b e e n m a d e o f t h e a c c u r a c y o f

d e t e r m i n a t i o n s o f t h e p a r a m e t e r K b y c a l c u l a t i n g

t h e c o e f f i c i e n t s o f v ar i at i o n ( S . D . / m e a n v a l u e ) . Thev a l u e s f o r m e t h o d s 1 , 2 and 3 ( E x p e r i m e n t a l

s e c t i o n ) w e r e r e s p e c t i v e l y 0 - 1 9 ( 1 4 ) , 0 - 0 8 ( 5 9 ) and

0 - 1 4 ( 1 2 ) , w h e r e t h e f i g u r e s i n p a r e n t h e s e s r e p r e s e n t

t h e nu m ber o f d e g r e e s o f f r e e d o m .

R e v e r s i b i l i t y o f e x c h a n g e r e a c t i o n s . The r e v e r s i -b i l i t y o f t h e r e a c t i o n s w i t h t h e i o n - e x c h a n g e r e s i n

and w i t h c a r t i l a g e wa s c h e c k e d by m e a s u r i n g t h e

d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t s o v e r a r a n g e o f v / m v a l u e s .

The d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t s were f o u n d t o b e i n d e -p e n d e n t o f t h e v / m r a t i o ( f o r c a r t i l a g e , s e e T a b l e 3 )and t h e r e f o r e t h e r e a c t i o n s c a n b e c o n s i d e r e d

r e v e r s i b l e ( S c h u b e r t , 1 9 5 6 ) .

The r e v e r s i b i l i t y o f r e a c t i o n s w i t h a c i d m u c o -

p o l y s a c c h a r i d e s i n s o l u t i o n was i n v e s t i g a t e d by

v a r y i n g t h e o r d e r o f a d d i t i o n o f t h e r e a g e n t s . The

r e s u l t i n g i o n d i s t r i b u t i o n s w e r e i n d e p e n d e n t o f t h e

s e q u e n c e i n w h i c h t h e r e a g e n t s were a d d e d and

h e n c e t h e s e r e a c t i o n s m a y a l s o b e c o ns i d e r e d r e -

v e r s i b l e ( D j u r f e l d t & S a m u e l s o n , 1 9 5 7 a , b ) .E v a l u a t i o n o f t h e p a r a m e t e r p . The p a r a m e t e r p

can b e e v a l u a t e d by a pp l y i ng e q u a ti o n ( 1 ) t o t h er e s u l t s o f i o n d i s t r i b u t i o n s o b t a i n e d by method 1

( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) , a n d p l o t t i n g l o g X l / X 5a g a i n s t l o g [ M ] 2 / [ N ] , t h e s l o p e o f t h e s t r a i g h t l i n eo b t a i n e d b e i n g e q u a l t o p . S u c h an e x p e r i m e n t h a s

b e e n c a r r i e d o u t w i t h C a 2 + i o n s and c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e A ( C S A - 2 B , Na+ c o u n t e r i o n ) a t I 0 - 0 2 3

a n d I 0 - 1 6 . The s t r a i g h t l i n e s p l o t t e d i n F i g . 1 h a v e

b e e n c a l c u l a t e d by t h e method o f l e a s t s q u a r e s

( Y u l e & K e n d a l l , 1 9 4 5 ) and t h e i r s l o p e s a r e r e s p e c -

t i v e l y 0 - 9 8 ± 0 - 0 4 ( S . D . ) a n d 0 - 9 1 + 0 - 0 3 ( S . D . ) .

A f f i n i t i e s o f c a t i o n s f o r a c i d muco-

p o l y s a c c h a r i d e s i n s o l u t i o n

The d i s t r i b u t i o n s b e t w e e n t r a c e r c a t i o n s and

v a r i o u s a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s i n s o l u t i o n h a v e

b e e n d e t e r m i n e d a t p H 7 - 2 - 7 - 4 by m e t h o d s 1 and 2

d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . As t h e

a f f i n i t y o f K+ i o n s f o r t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s

c o u l d not b e d e t e r m i n e d d i r e c t l y , e x p e r i m e n t s were

c a r r i e d o u t w i t h K+ i o n s i n s t e a d o f Na+ i o n s a s t h e

u n i v a l e n t e x c h a n g i n g i o n s . A c o m p a r i s o n o f t h e

a f f i n i t i e s o f a g i v e n b i v a l e n t i o n f o r t h e Na+- and

f o r t h e K + - a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s h o w s w h i c h

o f t h e tw o u n i v a l e n t i o n s i s m o r e s t r o n g l y h e l d by

t h e p o l y e l e c t r o l y t e . O w i n g t o t h e f a c t t h a t h e p a r i n

s a m p l e s show v a r y i n g d e g r e e s o f s u l p h a t i o n t w o

h e p a r i n p r e p a r a t i o n s h a v e b e e n s t u d i e d . S h o r t a g e

o f m a t e r i a l p r e v e n t e d a m o r e d e t a i l e d s t u d y o f t h e

f a m i l y o f c o m p o u n d s w h i c h a s s a y a s h e p a r i n m o n o -

s u l p h a t e . The v a l u e s f o r t h e p a r a m e t e r K h a v e b e e n

c a l c u l a t e d f r o m t h e r e l e v a n t e q u a t i o n s and a r e

t a b u l a t e d i n T a b l e 5 .

T h e s e r e s u l t s show marked d i f f e r e n c e s i n t h e

r e l a t i v e a f f i n i t i e s o f t h e c at i o ns f o r t h e v a r i o u s a c i d

m u c o p o l y s a c c h a r i d e s . B e c a u s e o f t h e s e w i d e

v a r i a t i o n s s u b s e q u e n t s t u d i e s h a v e b e e n c o n c e r n e d

w i t h t h e f a c t o r s t h a t m a y a f f e c t t h e s e c at i o na f f i n i t i e s .

8 5 3 4 1



J . R . DU N S T O N E

E f f e c t o f d i a l y 8 i n g s o l u t i o n s b e f o r e e x p e r i m e n t o n t h ea f f i n i t y o f c a t i o n s f o r a c i d m u c o p o l y 8 a c c h a r i d e 8

Owing t o t h e f a c t t h a t a marked d i f f e r e nc e i n

c a t i o n - b i n d i n g a f f i n i t y f o r C a 2 + i o n was shown b y

1 . 6 r

1 - 5 -

1 4 1

1 - 3 Fg

c q Z

N 0

_t

1 2 1

1 - 1 F -

1 - 0 1

0 a 9 [

0 4 0 5 0 - 6 0 - 7 0 8

l o g [ N a + ] 2 / [ C a 2 + ]

0 /

0 o

0 9 1 F

F i g . 1 . E v a l u a t i o n o f t h e p a r a m e t e r p o f e q u a t i o n ( 1 ) .I o n - d i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t b e t w e e nC a 2 + i o n s a n d c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A ( C S A - 2 B , Na+c o u n t e r i o n ) b y m e t h o d 1 ( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) at p H 7 - 2 -

7 - 4 a n d I 0 - 0 2 3 a n d 0 - 1 6 . T h e t e r m s X / X 2 c a n d [ N a + ] 2 /

[ C a 2 + ] o f e q u a t i o n ( 1 ) w e r e c a l c u l a t e d ( s e e T a b l e 1 ) a n dt h e i r l o g a r i t h m s p l o t t e d a s i n d i c a t e d i n t h e F i g u r e .

* , I 0 - 0 2 3 ; 0 , I 0 - 1 6 . T h e s t r a i g h t l i n e s w e r e c a l c u l a t e d b yt h e l e a s t - s q u a r e s m e t h o d a n d t h e s l o p e s w e r e r e s p e c t i v e l y

0 - 9 8 + 0 - 0 4 ( S . D . ) a n d 0 - 9 1 ± 0 - 0 3 ( S . D . ) .

t h e t w o s a m p l e s o f h e p a r i n , t h e e f f e c t o f d i a l y s i n g

a l l s a m p l e s i n t h e i n i t i a l s t a g e o f p r e p a r a t i o n , t o

remove p o s s i b l e s m a l l - m o l e c u l a r - w e i g h t s u b s t a n c e s ,

was i n v e s t i g a t e d . T h i s p r o c e s s p r o d u c e d s i g n i f i c a n t

c h a n g e s i n c a t i o n a f f i n i t y and i n t h e r e l a t i v e

a f f i n i t i e s f o r t h e v a r i o u s c a t i o n s o n l y w i t h h e p a r i n 1( A b b o t t L a b o r a t o r i e s L t d . ) . A s e c o n d s a m p l e o f

h e p a r i n from t h e same m a n u f a c t u r e r showeds i m i l a r p r o p e r t i e s t o t h e f i r s t s a m p l e . For com-

p ar i s o n t h e r e s u l t s o f t h e d i a l y s i s e x p e r i m e n t s w i t h

h e p a r i n 1 have b e e n i n c l u d e d i n T a b l e 5 .

E f f e c t o f d e 8 u l p h a t i o n o f c h o n d r o i t i n 8 u l p h a t e A

o n i t 8 a f f i n i t y f o r c a t ? o n s

To i n v e s t i g a t e t h e n a t u r e o f t h e c a t i o n a s s o c i a -

t i o n a c o m p a r i s o n h a s b e e n m a d e o f t h e a f f i n i t y f o r

C a 2 + i o n s o f c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A ( C S A - 2 B ) and

d e s u l p h a t e d c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A ( C S A - 6 ) a t

I 0 - 1 6 , pH 7 - 2 - 7 - 4 . The r e s u l t s ( T a b l e 6 ) show

c l e a r l y t h a t t h e a m o u nt o f c a t i o n bound i s d e c r e a s e dc o n s i d e r a b l y by s u l p h a t e r e m o v a l , a s shown by t h e

l a r g e r e d u c t i o n i n t h e v a l u e o f A O / A - 1 , b u t t h e

c a t i o n a f f i n i t y r e m a i n s u n a l t e r e d .

A f f i n i t y o f c a t i o n 8 f o r d i f f e r e n tc h o n d r o i t i n 8 u l p h a t e A p r e p a r a t i o n 8

The e x c h a n g e p a r a m e t e r s f o r r e a c t i o n s between

C a 2 + i o n s and a nu m ber o f c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A

p r e p a r a t i o n s h a v e b e e n d e t e r m i n e d w i t h method 2

( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) . A n a l y t i c a l d e t a i l s o f t h e

p r e p a r a t i o n s s t u d i e d a r e g i v e n i n T a b l e 4 . The

i n t r i n s i c v i s c o s i t y h a s b e e n u s e d a s an i n d e x o f t h em o l e c u l a r w e i g h t o f t h e v ar i o u s s a m p l e s . A l o w -

m o l e c u l a r - w e i g h t s a m p l e w a s p r e p a r e d b y i n c u -

b a t i n g 4 m l . o f a s o l u t i o n o f CSA- 2 B ( N a + c o u n t e r -

i o n , I 0 . 1 6 ) , 2 m l . o f v e r o n a l b u f f e r ( I 0 - 1 6 , p H 7 - 2 -

7 . 4 ) c o n t a i n i n g 4 5 C a , 1 0 m l . o f NaCl s o l n . ( I 0 . 1 6 )

T a b l e 5 . C ( a l c u l a t e d p a r a m e t e r 8 f o r e x c h a n g e r e a c t i o n m b e t w e e n a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e 8 a n d c a t i o n s

I o n - d i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s ( p H 7 . 2 - 7 . 4 ) w e r e c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o m e t h o d 2 ( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n )u n l e s s o t h e r w i s e s p e c i f i e d . T h e p a r a m e t e r s , K , h a v e b e e n c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n ( 5 ) a n d t h e r e s u l t s a r e q u o t e da s m ean v a l u e s w i t h t h e n u m b e r s o f d e t e r m i n a t i o n s i n p a r e n t h e s e s . V a l u e s o b t a i n e d a t I 0 - 1 6 a r e g i v e n i n ( A ) ,a n d v a l u e s o b t a i n e d a t I 0 - 0 6 a r e g i v e n i n ( B ) .

C a t i o no r i g i n a l l y

a s s o c i a t e d w i t ha c i d m u c o -

p o l y s a c c h a r i d e

( A ) Na+

K+

( B ) Na+

E x c h a n g i n gc a t i o n

M g 2 +M g 2 +4 5 C a 2 +C a 2 +8 9 , 9 0 S r 2 +

1 3 3 B a 2 +4 5 C a 2 +

4 5 C a 2 +8 9 , 9 0 S r 2 +1 3 3 B a 2 +

C h o n d r o i t i ns u l p h a t e A( C S A - 2 B )

0 5 9 ( 3 )0 4 ( 9 ) *0 * 7 5 ( 1 0 )0 * 8 4 ( 5 ) *1 . 2 1 ( 8 )1 - 8 4 ( 1 2 )1 - 1 8 ( 5 )

0 * 5 7 ( 2 )0 - 7 8 ( 2 )

1 1 1 ( 2 )

C h o n d r o i t i ns u l p h a t e B

1 - 0 5 ( 3 )

0 - 9 0 ( 8 )

0 9 0 ( 3 )0 - 9 8 ( 6 )1 - 1 2 ( 3 )

0 - 6 3 ( 2 )0 5 5 ( 2 )

0 7 4 ( 2 )

H e p a r i n 1( A b b o t t )

1 4 8 ( 4 )

7 3 ( 6 )7 . 3 ( 6 )

H e p a r i n 1( A b b o t t )d i a l y s e d

1 - 4 9 ( 3 )

3 - 3 2 ( 4 )

2 - 2 9 ( 7 )2 - 6 5 ( 4 )2 - 5 2 ( 3 )

2 - 2 0 ( 2 )2 - 3 2 ( 2 )2 - 4 4 ( 2 )

H e p a r i n I 1 1( U p j o h n )

3 - 2 4 ( 2 )

H e p a r i nm o n o -

s u l p h a t e

0 - 8 7 ( 2 )

1 * 8 ( 2 )

1 * 5 ( 2 )5 - 4 ( 2 )

1 . 4 ( 2 )

* M e t h o d 1 ; K c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n ( 1 ) ( p 1 ) .

3 4 2 1 9 6 2



CATIONS AND ACID MUCOPOLYSACCHA RIDES

T a b l e 6 . E f f e c t o f d e s u l p h a t i o n o f c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A o n t h e a f f i n i t y f o r c a t i o r m s

D i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d i n m e t h o d 2 ( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) a t I 0 1 6 , p H 7 - 2 -7 - 4 . N a + i o n w a s t h e c o u n t e r i o n o r i g i n a l l y a s s o c i a t e d w i t h t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s a n d ' S C a 2 + w a s t h e

o t h e r e x c h a n g i n g c a t i o n . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s m e a n v a l u e s o f f i g u r e s o b t a i n e d f r o m d u p l i c a t e e x p e r i m e n t s .

P r e p a r a t i o nC h o n d r o i t i n s u l p h a t e A ( C S A - 2 B )P a r t i a l l y d e s u l p h a t e d c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A ( C S A - 6 )

C o n e n . o f a c i dm u c o p o l y s a c c h a r i d e

( m o l e s o f d i s a c c h a r i d e

r e p e a t i n g u n i t / l . )0 * 0 1 50 - 0 1 5

E q u i v a l e n t -b i n d i n gc a p a c i t y

( e q u i v . / l . )0 0 3 00 * 0 2 3

K( c a l c . f r o m

A O / A - 1 e q u a t i o n 5 )0 - 8 50 - 6 6

0 * 7 30 - 7 4

c o n t a i n i n g 7 5 0 i . u . o f t e s t i c u l a r h y a l u r o n i d a s e

( R o n d a s e , Evans M e d i c a l S u p p l i e s L t d . , London)

a t 3 7 0 f o r 2 4 h r . T he e nzy me was i n a c t i v a t e d b y

h e a t i n g a t 1 0 0 0 f o r 3 m i n . T h i s s o l u t i o n was t h e n

t r e a t e d i n t h e m a nner d e s c r i b e d i n me t hod 2

( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s

s h o w e d t h a t t h e i n t r i n s i c v i s c o s i t y was a p p r o x i -

m a t e l y h a l v e d and t h e r e d uc i n g v a l u e ( d e t e r m i n e d

by t h e method o f P a r k & J o h n s o n , 1 9 4 9 ) a p p r o x i -m a t e l y d o u b l e d by t h i s p r o c e d u r e . N e i t h e r t h e

p r e s e n c e o f i n a c t i v a t e d enzyme n o r h e a t i n g o f t h e

s o l u t i o n a l t e r e d t h e v a l u e o f t h e e x c h a n g e p a r a -

m e t e r .

The r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s ( T a b l e 7 ) show

t h a t ( a ) t h e p r o t e i n c o m p o n e n t , i n s a m p l e s o f

r e l a t i v e l y l o w m o l e c u l a r w e i g h t , h a s l i t t l e e f f e c t on

t h e e x c h a n g e p a r a m e t e r , ( b ) d e g r a d a t i o n a l s o

c a u s e s l i t t l e c h a n g e i n t h e e x c h a n g e p a r a m e t e r , and

( c ) s a m p l e s ( C S A - 5 , C S A - 4 ) e x t r a c t e d b y m i l d

p r o c e d u r e s , w h i c h c o n t a i n c h o n d r o i t i n s u l p h a t e o f

h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p l u s s o m e p r o t e i n , haveg r e a t e r a f f i n i t y f o r C a 2 + i o n s t h a n t h e o t h e r

p r e p a r a t i o n s .

T h i s h i g h e r c a t i o n a f f i n i t y was i n v e s t i g a t e d

f u r t h e r b y m e a s u r i n g t h e r e l a t i v e a f f i n i t i e s o f

s a m p l e s C S A - 5 and CSA-2B f o r C a 2 , S r 2 + and B a 2 +i o n s . The r e s u l t s , g i v e n i n T a b l e 8 , c o n f i r m t h e

p r e v i o u s o b s e r v a t i o n ( T a b l e 7 ) t h a t s a m p l e CSA-5

h a s a g r e a t e r a f f i n i t y f o r c a t i o n s t h a n s a m p l e

C S A - 2 B , a n d a l s o show t h a t t h e a f f i n i t i e s f o r C a 2 ,S r 2 + a n d B a 2 + i o n s , r e l a t i v e t o e a c h o t h e r , a r e a l m o s t

t h e s a m e w i t h b o t h s a m p l e s .

The r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e a c i d m u c o p o l y -s a c c h a r i d e component o f t h e p r e p a r a t i o n i s p r i -m a r i l y r e s p o n s i b l e f o r t h e b i n d i n g o f c a t i o n s and

t h a t t h e d i f f e r e n c e s i n t h e m a g n i t u d e o f t h e e x -

c h a n g e p a r a m e t e r s i s d u e t o t h e s t a t e o f p o l y -

m e r i z a t i o n o f t h i s c o m p o n e n t . H o w e v e r , t h e

c o n t r i b u t i o n o f t h e p r o t e i n component h a s n o t b e e n

c o m p l e t e l y e v a l u a t e d , and i t m a y b e o f some

s i g n i f i c a n c e a s t h e p r o t e i n - c o n t a i n i n g s a m p l e sshowed v i s c o s i t y p r o p e r t i e s q u i t e d i f f e r e n t f r o m

e s s e n t i a l l y p r o t e i n - f r e e p r e p a r a t i o n s . The v i s c o s i t y

d i f f e r e n c e s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g . 2 , i n w h i c h

r e d u c e d v i s c o s i t y i s p l o t t e d a g a i n s t c o n c e n t r a t i o n .The s l o p e c o n s t a n t s k ' [ k ' = s l o p e / [ i q ] , s e e Mathews

T a b l e 7 . A f f i n i t i e s o f v a r i o u s c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e A p r e p a r a t i o n s f o r C a 2 + i o n s

I o n - d i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t a c c o r d i n g

t o m e t h o d 2 ( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) a t I 0 - 1 6 , pH 7 * 2 - 7 * 4 ,w i t h a n u m b e r o f c h o n d ro i t i n s u lp h a te A p r e p a r a t i o n s ( s e eT a b l e 4 ) . I n a l l e x p e r i m e n t s Na+ i o n w a s t h e c a t i o n o r i g i n -a l l y a s s o c i a t e d w i t h t h e c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A a n d 4 5 C a 2 +w a s t h e o t h e r e x c h a n g i n g c a t i o n . I n t r i n s i c v i s c o s i t y h a s b e e n

u s e d a s a n i n d e x o f m o l e c u l a r w e i g h t . T h e p a r a m e t e r K w a s

c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n ( 5 ) . A l l r e s u l t s a r e g i v e n as mean

v a l u e s o b t a i n e d f r o m d u p l i c a t e e x p e r i m e n t s .

S u b s t a n c e

E n z y m i c a l l y d e g r a d e dc h o n d r o i t i n s u l p h a t e A

CSA-2AC S A - 2 BC S A - 1C S A - 3C S A - 5C S A - 4

[ X 1 ]0 . 1 9

0 - 2 60 - 3 80 - 4 20 - 4 40 - 7 71 - 0 7

K

0 * 6 4

0 - 7 20 - 7 50 - 6 60 - 7 61 * 0 71 - 6

T a b l e 8 . R e l a t i v e a f f i n i t i e o f C a 2 , S r 2 + a n d B a 2 +i o n s f o r t w o c h o n d ro i ti n s u l p h a t e A p r e p a r a t i o n s


t o m e t h o d 2 ( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) a t I 0 - 1 6 , p H 7 - 2 - 7 * 4 ,w i t h t w o c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A p r e p a r a t i o n s o f i n t r i n s i cv i s c o s i t i e s 0 - 3 8 a n d 0 - 7 7 r e s p e c t i v e l y ( s e e T a b l e 7 ) . I n a l le x p e r i m e n t s Na+ i o n w a s t h e c a t i o n o r i g i n a l l y a s s o c i a t e dw i t h t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e . T h e p a r a m e t e r K w a s

c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n ( 5 ) . A l l r e s u l t s ar e g i v e n a s mean

v a l u e s o b t a i n e d f r o m d u p l i c a t e e x p e r i m e n t s .

E x c h a n g i n gc a t i o n

4 5 C a 2 +8 9 . 9 0 S r 2 +1 3 3 B a 2 +

K ( c a l c . f r o m e q u a t i o n 5 )

C S A - 2 B C S A - 5

( [ - q ] 0 - 3 8 ) ( [ 7 1 ] 0 7 7 )0 - 7 5 1 - 0 71 - 2 1 1 * 5 71 - 8 4 2 - 9 9

( 1 9 5 6 ) ] f o r t h e p r o t e i n - c o n t a i n i n g s a m p l e s ( C S A - 2 A ,

C S A - 4 , C S A - 5 ) a r e c o n s i d e r a b l y l a r g e r t h a n t h o s e

f o r t h e o t h e r p r e p a r a t i o n s . T h i s d i f f e r e n c e i s p r o b -

a b l y d u e t o t h e p r e s e n c e o f t h e p r o t e i n and r e f l e c t sd i f f e r e n c e s i n s o l u t i o n p r o p e r t i e s o f p r o t e i n - f r e e and

p r o t e i n - c o n t a i n i n g p r e p a r a t i o n st h a t

m a y i n f l u e n c et h e e x c h a n g e p a r a m e t e r s .

V o l . 8 5 3 4 3




Ef f e c t o f i o n i c 8 t r e n g t h o n t h e a f f i n i t y o f c a t i o n s

f o r a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s i n 8 o l u t i o n

I n t h e e x p e r i m e n t s t o e v a l u a t e t h e p a r a m e t e r p ,

t h e r e s u l t s ( F i g . 1 ) i n d i c at e d t h a t I had a mar k e d

e f f e c t on t h e i o n d i s t r i b u t i o n s a t pH 7 - 2 - 7 - 4 . T h i s

e f f e c t h a s b e e n s t u d i e d f u r t h e r b y d e t e r m i n i n g t h e

i o n d i s t r i b u t i o n s b e t w e e n C a 2 + i o n s and c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e A ( N a + c o u n t e r i o n ) o v e r a r a n g e o f I( I 0 . 0 1 3 - 0 - 5 ) w i t h method 2 ( E x p e r i m e n t a l

s e c t i o n ) . The v a l u e s f o r t h e p a r a m e t e r K d e t e r -

mined from t h e s e e x p e r i m e n t s a r e t a b u l a t e d i n

T a b l e 9 . They show a d e c r e a s e i n magnitude w i t h

d e c r e a s e i n I . Owing t o t h i s w i d e v a r i a t i o n i n K

w i t h I , t h e r e l a t i v e a f f i n i t i e s o f t h e v ar i o u s c a t i o n s

f o r t h e a c i d - m u c o p o l y s a c c h a r i d e s have b e e n

measured a t I 0 - 0 6 , and t h e r e l a t i v e a f f i n i t i e scompared w i t h t h o s e o b t a i n e d a t I 0 - 1 6 . The

r e s u l t s , t a b u l a t e d i n T a b l e 5 ( B ) , c o n f i r m t h e

d e c r e a s e i n a f f i n i t y w i t h t h e d e c r e a s e i n I ( T a b l e 9 )a nd s ho w t h a t t h e r e l a t i v e a f f i n i t i e s f o r c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e A and f o r c h o n d r o i t i n s u l p h a t e B a r e

s i m i l a r a t b o t h I v a l u e s , w i t h s l i g h t l y s m a l l e r d i f -f e r e n c e s f o r c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A . H o w e v e r ,w i t h h e p a r i n a t I 0 - 1 6 t h e a f f i n i t y f o r C a 2 + i o n s i sg r e a t e r t h a n t h o s e f o r M g 2 + , S r 2 + and B a 2 + i o n s ,b u t a t I 0 - 0 6 t h e r e i s l i t t l e d i f f e r e n c e between t h e

a f f i n i t i e s f o r C a 2 + , S r 2 + and B a 2 + i o n s .

A

A

A~~~

A

t- A

AAZ

A f f i n i t y o f c a t i o n s f o r c a r t i l a g e - b o u n d

a c i d m u c o p o l y 8 a c c h a r i d e s

The r e a c t i o n s b e t w e e n c a r t i l a g e and c a t i o n s have

b e e n examined u n d e r c o n d i t i o n s s i m i l a r t o t h o s e

u s e d i n s t u d i e s w i t h t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s

i n s o l u t i o n ( I 0 - 1 6 , pH 7 . 2 - 7 - 4 ) .The i o n d i s t r i b u t i o n s have b e e n measured w i t h

m eth o d 3 ( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) . V a l u e s f o r t h e

p a r a m e t e r K a r e r e c o r d e d i n T a b l e 1 0 . The o r d e r

o f i n c r e a s i n g a f f i n i t y i n d i c a t e d by t h e v a l u e o f K

f o r t h e c a t i o n s s t u d i e d i s c l e a r l y Ba + , C a + - S r + .

T h i s o rd e r o f c a t i o n a f f i n i t y w a s u n e x p e c t e d , a s

a p r e v i o u s s t u d y ( D u n s t o n e , 1 9 6 0 ) had shown t h e

o r d e r o f i n c r e a s i n g a f f i n i t y f o r c a r t i l a g e t o b e Ca + ,S r 2 + a nd Ba2+ i o n s . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n o f t h i s

r e v e r s a l o f o rd e r i s a f f o r d e d by t h e f a c t t h a t t h e

1 3 3 B a u s e d was o f l o w s p e c i f i c a c t i v i t y and h e n c e

t h e a c t ua l e q u i va le n t -f r ac t i o n o f barium i n t h e

*e**- - 0

T a b l e 9 . E f f e c t o f i o n i c s t r e n g t h o n t h e a f f i n i t y o f

c a t i o n s f o r a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s i n s o l u t i o n

I o n - d i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t a c c o r d i n gt o m e t h o d s 1 a n d 2 ( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) at p H 7 - 2 - 7 - 4a n d t h e p a r a m e t e r K w a s c a l c u l a t e d r e s p e c t i v e l y f r o m

e q u a t i o n ( 1 ) a n d e q u a t i o n ( 5 ) . T h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d eu s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s w a s c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A( C S A - 2 B , Na+ c o u n t e r i o n ) a n d C a 2 + w a s t h e o t h e r e x -c h a n g i n g c a t i o n . A l l r e s u l t s a r e mean v a l u e s o f f i g u r e so b t a i n e d f r o m t r i p l i c a t e e x p e r i m e n t s .

I I I I L I0 0 - 1 0 - 2 0 - 3 04 0 - 5

C o n e n . ( g . / 1 0 0 m l . )

F i g . 2 . R e d u c e d v i s c o s i t y d a t a o f v a r i o u s c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e A p r e p a r a t i o n s . A n a l y t i c a l d a t a f o r t h e p r ep a r a -

t i o n s a r e g i v e n i n T a b l e 4 . C o n c e n t r a t i o n s a r e b a s e d on t h e

w e i g h t o f t h e p r e p a r a t i o n s a f t e r d r y i n g a t 1 1 0 0 i n v a c u o

o v e r P 2 0 5 f o r 2 h r . The s l o p e c o n s t a n t s , k ' s h o w n b e l o w ,h a v e b e e n c a l c u l a t e d f r o m t h e r e l a t i o n k ' =s l o p e / [ , q ] .0, C S A - 2 A ( k ' 0 - 7 ) ; * , CS A - 2 B ( k ' 0 - 1 ) ; A , CSA-5 ( k ' 1 - 7 ) ;

A, C S A - 4 ( k ' 1 - 8 ) . S t r a i g h t l i n e s s i m i l a r t o t h a t f o r CSA-2Bw e r e o b t a i n e d w i t h t h e o t h e r p r e p a r a t i o n s l i s t e d i n T a b l e 7 .

2 0 r

1 - 8 1

1 - 6 -

1 - 4 1

1 - 2 I

e 1 - 0

0 - 8

0 - 6 _

0 - 4

0 - 2 _

M e t h o du s e d

212222122122

22

I

0 - 0 1 30 - 0 2 30 - 0 2 70 0 3 00 - 0 4 70 - 0 6 00 - 0 7 50 - 0 9 70 - 1 6 00 - 1 6 00 - 1 8 00 - 2 6 4

0 - 3 4 60 - 5 2 0

K

0 - 0 90 - 1 60 - 2 90 - 3 10 - 4 20 - 5 70 - 6 10 - 6 70 - 7 50 - 8 01 * 1 71 - 7 3

1 - 8 02 - 7 0

3 4 4 1 9 6 2



CATIONS AND A C I D MUCOPOLYSACCHARIDES

a t e q u i l i b r i u m w o u l d b e l a r g e r t h a n t h e

v a l u e f o r c a l c i u m and s t r o n t i u m ,

w e r e u s e d i n a l m o s t c a r r i e r - f r e e f o r m . T h i s

e q u i v a l e n t - f r a c t i o n c o u l d g i v e r i s e t o a n

c o n s t a n t l o w e r t h a n t h a t o b t a i n a b l e a t

c o m p a r a b l e w i t h t h o s e o f

1 0 . C al c ul at e d p a r am e t e r s f o r e x c h a n g e r e -b e tw e e n c ar ti lag e -b o und a c i d m u c o p o l y -

a n d c a t i o n s

I o n - d i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t a c c o r d i n go m e t h o d 3 ( E xp e ri m e n t al s e c t i o n ) a t 1 0 - 1 6 , p H 7 - 2 - 7 - 4 .

( 0 - 7 9 m - e q u i v . / g . ) w a s u s e d i n a l l e x p e r i -T h e p a r a m e t e r K w a s c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n ( 3 )

n d t h e r e s u l t s a r e q u o t e d a s m e a n v a l u e s w i t h t h e n u m b e r

f d e t e r m i n a t i o n s i n p a r e n t h e s e s .

E x c h a n g i n g c a t i o n

4 5 C a 2 +8 S , 9 0 S r 2 +i a $ B a 2 +4 5 C a 2 +

K

1 - 4 6 ( 4 )1 . 4 4 ( 4 )0 - 3 7 ( 5 )1 - 3 7 ( 7 ) *

* C a l c u l a t e d f r o m B o y d & Neuman ( 1 9 5 1 ) .

c a l c i u m a n d s t r o n t i u m ( s e e D i s c u s s i o n s e c t i o n ) . To

t e s t t h i s h y p o t h e s i s , e x c h a n g e p a r a m e t e r s were

d e t e r m i n e d f o r t h e r e a c t i o n s C a 2 + + N a + - c a r t i l a g eand B a 2 + + N a + - c a r t i l a g e w i t h d i f f e r e n t c o n c e n -

t r a t i o n s o f t h e t r a c e r c a t i o n s . The c o n c e n t r a t i o n s

u s e d were l e s s t h a n t h o s e w h i c h s h o u l d p r o d u c es i g n i f i c a n t v a r i a t i o n i n t h e d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t s

( f o r c a l c u l a t i o n so f t h e s e c o n c e n t r a t i o n s s e e

S c h u b e r t , 1 9 5 6 ) . The r e s u l t s shown i n T a b l e 1 1

i n d i c a t e t h a t t h e e x c h a n g e p a r a m e t e r s a r e s e n s i t i v et o c h a n g e s i n t h e c o n c e n t ra ti o n o f t h e t r a c e r c a t i o n ,an i n c r e a s e i n t h e c a t i o n c o n c e n t r a t i o n c a u s i n g a

d e c r e a s e i n t h e m a g n i t u d e o f t h e e x c h a n g e p a r a -

m e t e r . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e a b o v e - m e n t i o n e d

h y p o t h e s i s i s p r o b a b l y c o r r e c t . H o w e v e r , t h e o r d e r

o f c a t i o n a f f i n i t y f o r c a r t i l a g e , u n d e r t h e s e e x p e r i -m e n t a l c o n d i t i o n s , r e m a i n e d u n a l t e r e d .

V a r i a t i o n s i n t h e v al u e o f t h e p a r a m e t e r K f o r

t h e r e a c t i o n 4 5 C a 2 + + N a + - c a r t i l a g e , o v e r a r a n g e o f

I 0 - 0 1 3 - 0 - 4 1 6 , h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d by t h e sa m e

m et hod an d t h e c a l c ul at e d v a l u e s f o r t h i s p a r a -

meter a r e r e c o r d e d i n T a b l e 1 2 . T h e r e i s a d e c r e a s e

i n K w i t h t h e d e c r e as e i n I .

1 1 . E f f e c t o f t h e t r a c e r - c a t i o n c o n c e n t r a t i o n on

h e e x c h a n g e p a r a m e t e r s f o r r e a c t i o n s b e t w e e n c a t i o n s

nd c a r t i l a g e


o m e t h o d 3 ( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) w i t h N a + - c a r t i l a g e

m - e q u i v . / g . ) a t 1 0 - 1 6 , p H 7 - 2 - 7 - 4 . T h e p a r a m e t e r Ka s c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n ( 3 ) a n d t h e r e s u l t s a r e e x -

a s mean v a l u e s o b t a i n e d f r o m d u p l i c a t e e x p e r i -M a s s o f c a r t i l a g e 0 - 5 g . , v o l u m e o f s o l u t i o n 5 0 m l .

Tracer

c a t i o n

4 5 C a 2 +

C a 2 +l 3 3 B a 2 +

1 4 O B a 2 +

Initial concn.

o f t r a c e r c a t i o n(mM)

0 - 2

0 - 1< 1 0 - 5

K

1 - 4 6

0 - 3 60 - 3 70 - 7 6

1 2 . E f f e c t o f i o ni c s tr e ng th on t h e a f f i n i t y o f

f o r c a r t i l a g e - b o u n d a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e

I o n - d i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s were c a r r i e d out a c c o r d i n g

o method 3 ( E x p e r i m e n t a l s e c t i o n ) w i t h N a + - c a r t i l a g e

m - e q u i v . / g . ) a t p H 7 - 2 - 7 - 4 . The t r a c e r c a t i o n was

The p a r a m e t e r K was c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n ( 3 )n d t h e r e s u l t s a r e e x p r e s s e d as mean v a l u e s o f f i g u r e s

f r o m t r i p l i c a t e e x p e r i m e n t s .

I K

0 - 0 1 3 0 - 4 3

0 - 0 3 3 0 - 6 20 - 0 7 6 1 - 0 4

0 - 1 1 6 1 - 2 5

0 - 1 6 0 1 - 4 6

0 - 2 1 6 1 - 8 2

0 - 3 1 6 2 - 6 00 - 4 1 6 6 - 8

DISCUSSION

N a t u r e o f c a t i o n a s s o c i a t i o n w i t h a c i d

m u c o p o l y s a c c h a r i d e s i n s o l u t i o n

G i l b e r t & M y e r s ( 1 9 6 0 ) h a v e i n v e s t i g a t e d t h e

b i n d i n g o f c a t i o n s by c h o n d r o i t i n s ul p h a t e A , and

have c o n c l u d e d t h a t o n l y ' s i n g l e - s i t e ' a s s o c i a t i o n

b e t w e e n c a t i o n and c a r b o x y l g r o u p o c c u r s . I f t h i si s s o , t h e n t h e i n f l u e n c e o f t h e s u l p h a t e g r o u p s on

c a t i o n a s s o c i a t i o n s h o u l d b e s m a l l . E x p e r i m e n t s i n

w h i c h s o m e o f t h e s u l p h a t e g r o u p s o f c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e A h a v e b e e n removed i n d i c a t e d t h a t t h e

d e g r e e o f c a t i o n a s s o c i a t i o n w as m a r k e d l y d e c r e a s e d

by t h i s p r o c e s s , b u t t h e a f f i n i t y ( a s i n d i c a t e d by

t h e v a l u e o f t h e p a r a m e t e r K) o f t h e c a t i o n f o r t h e

a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e r e m a i n e d c o n s t a n t

( T a b l e 6 ) . The f a c t t h a t r e m o v a l o f s u l p h a t e d i d

not c a u s e any c h a n g e i n t h e a f f i n i t y s u g g e s t s t h a t

t h e b i n d i n g i s m a i n l y o f a t y p e not d e p e n d i n g on

t h e s p e c i f i c p r o p e r t i e s o f t h e a n i o n i c g r o u p s ,i . e . p r o b a b l y e l e c t r o s t a t i c . S p e c i f i c b i n d i n g by t h e

c a r b o x y l g r o u p s p r o b a b l y o c c u r s , b u t i t i s t h o u g h t

t h a t i t s c o n t r i b u t i o n t o t h e o v e r a l l c a t i o n a s s o c i a -

t i o n , a s m e a s u r e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s , i s s m a l l .

I n v i e w o f t h e w i d e v ar i a t i o n o f t h e e x c h a n g e

p a r a m e t e r s w i t h I ( T a b l e s 5 B and 9 ) an a n a l y s i s o f

t h e t h e o r y o f c a t i o n i n t e r a c t i o n s w i t h a c i d muco-

p o l y s a c c h a r i d e s h a s b e e n m a d e t o ( a ) e v a l u a t e t h e

f a c t o r s t h a t m a y c a u s e t h e e x c h a n g e p a r a m e t e r Kt o v a r y , and ( b ) o b t a i n a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f

t h e mechanism o f t h e c a t i o n a s s o c i a t i o n s o t h a t t h e

r e s u l t s o f t h e e x p e r i m e n t s w i t h t h e v a r i o u s a c i dm u c o p o l y s a c c h a r i d e s m a y b e v a l i d l y i n t e r p r e t e d .

8 5 3 4 5




B y c o n s i d e r i n g t h e p o ly e l e c t r o ly t e a s a s e p a r a t e

p h a s e i t i s p o s s i b l e t o d e s c r i b e t h e i o n - e x c h a n g e

r e ac t i o n s a s Do nna n m e m b r a n e e q u i l i b r i a ( O v e r -

b e e k , 1 9 5 6 ) . I f t h e p o l y e l e c t r o l y t e i s i n e q u i l i b r i u m

w i t h an a q u e o u s s o l u t i o n c o n t a i n i n g a b i v a l e n t

c a t i o n N, a u n i v a l e n t c a t i o n Mand t h e a n i o n A,

t h e n a c c o r d i n g t o t h e Do nna n c o n c e p t

a M A = C I A O C A

and ( 6 )2 --22

ONA = X C A

w h e r e a r e p r e s e n t s t h e a c t i v i t y o f a component i n

t h e s o l u t i o n p h a s e a nd a t h e a c t i v i t y i n t h e p o l y -

e l e c t r o l y t e p h a s e .

C a n c e l l i n g t h e c o m m o n a n i o n a c t i v i t i e s andi n t r o d u c i n g c o n c e n t r a t i o n s and a c t i v i t y c o e f f i c i e n t si n p l a c e o f a c t i v i t i e s , w e g e t

[ N ] _ 2 [ N ] *y N

[ M ] 2 Y N [ M ] 2 y -(y7w h e r e Y N ' y V I and Y N ' Y - r e p r e s e n t r e s p e c t i v e l y t h e

a c t i v i t y c o e f f i c i e n t s o f t h e c a t i o n s i n t h e s o l u t i o n

and p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e s , and [ N ] , [ M ] and

[ N ] , [ M ] r e p r e s e n t r e s p e c t i v e l y t h e e q u i v a l e n t

c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s o l u t i o n and p o l y e l e c t r o l y t e

p h a s e s .

I n t e r m s o f e q u i v a l e n t - f r a c t i o n s r a t h e r t h a n

c o n c e n t r a t i o n s f o r t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e

X N - ~~N ] _yN

X N Y N M] 2 ( 8 )2 t - i [M]2" ( 8 ) M

w h e r e C i s t h e t o t a l e q u i v a l e nt c o n c e n t r at i o n o f t h e

p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e ( e x p r e s s e d a s e q u i v a l e n t s p e ru n i t v o l u m e ) .

E q u a t i o n ( 8 ) and e q u a t i o n ( 3 ) a r e i d e n t i c a l w h e n

p = 1 and -2

K=y YN

Y 2YN

Thus t h e v a r i a t i o n o f K w i t h I can a r i s e from t h e

v ar i a t i o n o f t h e terms on t h e r i g h t - h a n d s i d e o f

e q u a t i o n ( 9 ) . A s p o l y e l e c t r o l y t e s i n s o l u t i o n s w e l l

a s I i s l o w e r e d (Hermans & O v e r b e e k , 1 9 4 8 ) t h e

v a l u e o f t h e t e r m a w o u l d be e x p e c t e d t o d e c r e a s e

o w i n g t o t h e l a r g e r v o l u m e o c c u p i e d by t h e p o l y -

e l e c t r o l y t e , a n d t h i s l o w e r i n g o f c o n c e n t r a t i o nwould p r o b a b l y c a u s e an i n c r e a s e i n t h e magnitude

o f t h e r a t i o Y I / N . Th e r a t i o Y N / Y ' w o u l d not be

e x p e c t e d t o vary b y more than 10-15%o v e r t h e

range o f I s t u d i e d . These e s t i m a t e s have been

m a d e with t h e a c t i v i t y - c o e f f i c i e n t data g i v e n b yHarne d & O w e n ( 1 9 5 8 ) . T h e data a t p r e s e n t a v a i l -

a b l e do not p e r m i t an e v a l u a t i o n o f t h e magnitude

o f t h e s e c h a n g e s but i t w o u l d seem u n l i k e l y t h a t

t h e s e f a c t o r s a l o n e could e x p l a i n the observed 3 0 -

f o l d v a r i a t i o n i n K o v e r the r a n g e of I s t u d i e d .

Th e n a t u r e o f t h e d i s t r i b u t i o n o f c o u n t e r i o n s

about t h e p o l y e l e c t r o l y t e c o u l d , i n i t s e l f , p r o v i d ean e x p l a n a t i o n o f t h e s e v a r i a t i o n s i n K with I. T h e

u n i v a l e n t c o u n t e r i o n s t h a t n e u t r a l i z e t h e e l e c t r i c a lc h a r g e o f a p o l y e l e c t r o l y t e a r e t h o u g h t t o b e d i s t r i -b u t e d t h r o u g h o u t t h e i o n i c a t m o s p h e r e o f t h e

p o l y i o n w i t h a f r a c t i o n o f t h e i r nu m ber h e l d s o

c l o s e t o t h e p o l y m e r s k e l e t o n t h a t t h e y m a y b e

t e r m e d ' b o u n d ' ; t h i s c l o s e l y h e l d f r a c t i o n i sv i s u a l i z e d a s a r e l a t i v e l y m o b i l e m o n o l a y e r , w h e r e -

a s t h e o t h e r c o u n t e r i o n s , m o r e d i s t a n t f r o m t h ep o l y i o n , a r e c o n s i d e r e d ' f r e e ' ( L a p a n j e , H a e b i g ,D a v i s & R i c e , 1 9 6 1 ) . The s o - c a l l e d ' b o u n d '

c o u n t e r i o n s have b e e n shown t o m o v e w i t h t h e

p o l y i o n i n t r a n s p o r t e x p e r i m e n t s ( H u i z e n g a ,

G r i e g e r & W a l l , 1 9 5 0 a , b ; M a t h e w s , 1 9 5 9 ; S t r a u s s ,

Woodside & Wineman, 1 9 5 7 ) and t h e f r a c t i o n o f

t h e t o t a l c o u n t e r i o n s w h i c h a r e ' b o u n d ' v a r i e s

w i t h I w i t h i n a f a i r l y l i m i t e d r a n g e . F o r e x a m p l e ,S t r a u s s e t a l . ( 1 9 5 7 ) showed t h a t , w i t h a p o l y -

p h o s p h a t e , t h e f r a c t i o n o f ' b o u n d ' c o u n t e r i o n s

( N a + ) v a r i e d o v e r t h e r a n g e 0 A 4 - 0 - 7 a s I w a s v a r i e d

f r o m 0 - 0 1 t o 0 3 5 . With b i v a l e n t i o n s t h e ' b o u n d 'f r a c t i o n i s t h o u g h t t o b e m u c h l a r g e r t h a n t h a t w i t h

u n i v a l e n t i o n s ( A l d r i c h , 1 9 5 8 ; G r e g o r , 1 9 5 6 ) .N e v e r t h e l e s s , a l l c o u n t e r i o n s , b o t h ' f r e e ' and

' b o u n d ' , seem t o b e i m m o b i l i z e d s u f f i c i e n t l y b y t h e

p o l y i o n t o p r e v e n t them c o n t r i b u t i n g t o t h e I o f

t h e s o l u t i o n . The v a l i d i t y o f t h i s s t a t e m e n t i si l l u s t r a t e d by t h e f a c t t h a t i n c r e a s e s i n a c i d muco-

p o l y s a c c h a r i d e c o n c e n t r a t i o n d i d n o t a l t e r t h e

e x c h a n g e p a r a m e t e r s . F o r e x a m p l e , i n t h e r e -

a c t i o n 4 5 C a 2 + + N a + - c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A , t h e

v a l u e o f t h e e x c h a n g e p a r a m e t e r r e m a i n e d c o n -

s t a n t even when t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d ec o n c e n t r a t i o n w as c h a n g e d f r o m 0 . 0 1 t o 0 0 4

e q u i v . / l . a t I 0 - 0 2 . F r o m t h e s e c o n s i d e r a t i o n s , t h e

e x c h a n g e b e t w e e n a b i v a l e n t c a t i o n f r o m s o l u t i o n

and a u n i v a l e n t c a t i o n a s s o c i a t e d w i t h t h e a c i d

m u c o p o l y s a c c h a r i d e m a y b e d e s c r i b e d by tw o i o n

d i s t r i b u t i o n s , o n e a s s o c i a t e d w i t h t h e ' b o u n d '

c o u n t e r i o n s and t h e o t h e r w i t h t h e ' f r e e ' c o u n t e r -

i o n s . As t h e b i v a l e n t i o n s a r e p r e d o m i n a n t l y' b o u n d ' , t h e e x c h a n g e i n v o l v i n g ' b o u n d ' u n i v a l e n t

i o n s and b i v a l e n t i o n s f r o m s o l u t i o n p r o b a b l y makesa g r e a t e r c o n t r i b u t i o n t o t h e o v e r a l l d i s t r i b u t i o n

t h a n t h e e x c h a n g e w i t h ' f r e e ' i o n s . As t h e f r a c t i o n

o f ' b o u n d ' u n i v a l e n t i o n s i s a p p r o x i m a t e l y 0 5 w i t ht h e c h o n d r o i t i n s u l p h a t e s ( M a t h e w s , 1 9 5 9 ) , i tm i g h t b e e x p e c t e d t h a t f o r e a c h b i v a l e n t i o n

e x c h a n g e d , o n e ' b o u n d ' u n i v a l e n t i o n i s d i s p l a c e d .Thus t h e e x c h a n g e p a r a m e t e r f o r t h e r e a c t i o n c o u l d

b e r e p r e s e n t e d by t h e f o l l o w i n g m o d i f i e d f o r m o f

e q u a t i o n ( 3 ) K K

K -x [ M ] ( 1 0 )[ C ]

I f t h e e x p e r i m e n t a l d a t a o f T a b l e 9 a r e f i t t e d t o

t h i s e q u a t i o n t h e v a l u e o f K b e c o m e s a p p r o x i m a t e l yc o n s t a n t o v e r t h e r an g e o f I s t u d i e d . T h i s i n d i c a t e s

t h e p o s s i b l e v a l i d i t y o f t h e s u g g e s t e d mechanismf o r c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A . A s i m i l a r s e t o f

3 4 6 1 9 6 2



C ATIONS AND ACID M U C OP OLY S A C C H A R I D E S

c o n d i t i o n s s h o u l d a l s o a p p l y t o r e ac ti o n s w i t h

c h o n d r o i t i n s u l p h a t e B . The c h a n g e s i n K w i t h I

do n o t a p p e a r t o b e a s marked w i t h h e p a r i n a s w i t h

t h e c h o n d r o i t i n s u l p h a t e s . T h i s c o u l d b e e x p l a i n e d

i n t e r m s o f a g re a te r f r ac t i o n o f ' b o u n d ' u n i v a l e n t

c o u n t e r i o n s w i t h h e p a r i n , w h i c h would b e e x p e c t e d

b e c a u s e o f t h e h i gh e r c h a r g e d e n s i t y o f t h i s s u b -

s t a n c e . A l t h o u g h t h i s d i s t i n c t i o n b e t w e e n ' b o u n d 'a n d ' f r e e ' c o u n t e r i o n s i s u s e f u l i n p r o v i d i ng a

p o s s i b l e e x p l a n a t i o n o f t h e v a r i a t i o n s o f t h e p a r a -

m e t e r K w i t h I , t h e c o n c e p t i s , t o a c e r ta i n e x te n t,

a r b i t r a r y .

T w o o t h e r f a c t o r s , namely t h e e f f e c t on t h e c a l c u -

l a t i o n o f t h e e x c h a n g e p a r a m e t e r s o f t h e volume o f

t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e and o f c o - i o n p e n e t r a t i o n

i n t o t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e , must a l s o b e

c o n s i d e r e d .

The d i m e n s i o n s o f a p o l y e l e c t r o l y t e m o l e c u l e i n

s o l u t i o n a r e o f t e n d e s c r i b e d i n t e r m s o f i t s h y d r o -

d y n a m i c v o l u m e , w h i c h a p p r o x i m a t e s t o t h ed o m a i n o f t h e m o l e c u l e i n s o l u t i o n . T h i s domain i su s u a l l y f r e e l y p e r m e a b l e t o s o l u t i o n , h e n c e i t s e e m s

p r o b a b l e t h a t t h e e x c h a n g e r e a c t i o n s o c c u r i n a

r e g i o n c l o s e t o t h e p o l y m e r s k e l e t o n . I f t h i s i s s o

t h e n t h e v o l u m e o f t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e

i n v o l v e d i n t h e i o n - e x c h a n g e r e a c t i o n s s h o u l d b e

c o n s i d e r a b l y s m a l l e r t h a n t h e h y d r o d y n a m i cvolume a n d t h u s s m a l l c o m p a r e d w i t h t h e v o l u m eo f t h e o u t s i d e s o l u t i o n . H o w e v e r , s h o u l d t h e

volume o f t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e i n v o l v e d i n

i o n - e x c h a n g e r e a c t i o n s a p p r o a c h t h e h y d r o -

d y n a m i c v o l u m e ,w i t h t h e

e x c l u s i o no f

c a t i o n so t h e r t h a n t h o s e r e q u i r e d t o m a i n t a i n e l e c t r i c a ln e u t r a l i t y , t h e n t h e t r u e c o n c e n t r a t i o n o f t h e

s o l u t i o n p h a s e w o u l d b e g r e a t e r t h a n t h e c a l c u -

l a t e d c o n c e n t r a t i o n . T h i s w o u l d m e a n t h a t t h e

v a l u e o f K c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n ( 1 ) i s g r e a t e r

t h a n t h e t r u e v a l u e . H o w e v e r , t h e f a c t t h a t c a l c u -

l a t e d v a l u e s o f K r e m a i n c o n s t a n t o v e r f o u r f o l d

v a r i a t i o n s i n p o l y e l e c t r o l y t e c o n c e n t r a t i o n ( 0 - 2 5 -

1 - 0 % , w / v ) a t I 0 0 1 - 0 5 s u p p o r t s t h e c o n t e nt i o n

t h a t t h e f u n c t i o n a l volume o f t h e p o l y e l e c t r o l y t e

p h a s e i s i n d e e d s m a l l . T h e r e f o r e no c o r r e c t i o n h a s

b e e n a p p l i e d f o r t h e v o l u m e o f t h e a c i d muco-

p o l y s a c c h a r i d e s .

The c a l c u l a t i o n o f t h e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n s o f t h e

c a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h t h e p o l y e l e c t r o l y t e i sc o m p l i c a t e d by t h e f a c t t h a t c o - i o n s m a y a l s o b e

p r e s e n t i n t h e p o ly e l e c tr o ly t e p h a s e . T h e s e c o - i o n s

m ust b e a c c o m p a n i e d by an e q u i v a l e n t amoun t o f

c a t i o n , o v e r and a b o v e t h e amoun t r e q u i r e d t o

m a i n t a i n t h e e l e c t r i c a l n e u t r a l i t y o f t h e p o l y -

e l e c t r o l y t e p h a s e . P r o v i d e d t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n

o f c a t i o n s i n t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e i s l a r g e i nc o m p a r i s o n w i t h t h a t o f t h e o u t s i d e s o l u t i o n , t h e

a p p l i c a t i o n o f t h e Donnan c o n c e p t s h o w s t h a t c o -

i o n s w i l l b e l a r g e l y e x c l u d e d f r o m t h i s p h a s e ; where

t h e r e a r e l o w c o n c e n t r a t i o n s i n t h e p o l y e l e c t r o l y t e

p h a s e c o - i o n p e n e t r a t i o n m a y h a v e c o n s i d e r a b l e

i n f l u e n c e on t h e c a l c u l a t i o n o f t h e amounts o f

c a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h t h i s p h a s e .

A c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s h a v e a h i g h s u r f a c e

p o t e n t i a l , and a s t h e f u n c t i o n a l v o l u m e o f t h e p o l y -

e l e c t r o l y t e s i s p r o b a b l y s m a l l , t h e c a t i o n c o n c e n -

t r a t i o n i n t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e i s p r o b a b l y

f a i r l y h i g h , and t h u s c o - i o n p e n e t r a t i o n i n t o t h i sp h a s e s h o u l d b e s m a l l . H o w e v e r , some c o - i o n s w i l lb e p r e s e n t i n t h e p o l y e l e c t r o l y t e p h a s e , b u t a s

s u f f i c i e n t d a t a a r e n o t a v a i l a b l e t o a p p l y a c o r -

r e c t i o n , t h e e f f e c t o f t h e p e n e t ra t i o n o f t h e s e c o -

i o n s h a s b e e n n e g l e c t e d .

A f f i n i t y o f c a t i o n a f o r a c i d m u c o p o l y a a c c h a r i d e si n s o l u t i o n

The f a c t o r s t h a t i n f l u e n c e t h e s e l e c t i v i t y o f

e x c h a n g e m a t e r i a l s f o r c a t i o n s h a v e b e e n e x t e n s i v e l y

s t u d i e d ( K i t c h e n e r , 1 9 5 7 ) b u t no e x p l a n a t i o n o f t h e

s e l e c t i v i t y , i n t e r m s o f a f e w s i m p l e f a c t o r s , h a sb e e n f o r t h c o m i n g . H o w e v e r , a s t h e r e l a t i v ea f f i n i t i e s o f t h e c a t i o n s f o r t h e v ar i o u s a c i d m u c o -

p o l y s a c c h a r i d e s h a v e b e e n d e t e r m i n e d f r o m e x p e r i -

ments c a r r i e d o u t u n d e r i d e n t i c a l c o n d i t i o n s , i t i sr e a s o n a b l e t o s u p p o s e t h a t t h e o b s e r v e d d i f f e r e n c e sw e r e d u e t o t h e n a t u r e s o f t h e v a r i o u s p o l y e l e c t r o -

l y t e m o l e c u l e s i n s o l u t i o n .

The c h o n d r o i t i n s u l p h a t e s A a n d B a r e l i n e a r

p o l y e l e c t r o l y t e s w i t h i d e n t i c a l c h a i n c h a r a c t e r i s t i c s

i n d i l u t e s o l u t i o n and t h e sa m e e l e c t r o p h o r e t i c

p o t e n t i a l s ( M a t h e w s , 1 9 5 9 , 1 9 6 0 ) . N e v e r t h e l e s s ,

c h o n d r o i t i ns u l p h a t e

B s h o w s l i t t l es e l e c t i v i t y

f o r

c a t i o n s w h e r e a s c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A i s s e l e c t i v e .T h i s i n d i c a t e s a p r o b a b l e d i f f e r e n c e i n p h y s i c a l

c o n f i g u r a t i o n i n s o l u t i o n b e t w e e n t h e two t y p e s o f

m o l e c u l e . T h i s d i f f e r e n c e o b v i o u s l y a r i s e s f r o m t h e

d i f f e r e n c e i n c h e m i c a l s t r u c t u r e b e t w e e n t h e t wo

c o m p o u n d s , n a m e l y t h e p r e s e n c e o f D - g l u c u r o n i c

a c i d i n c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A and o f L - i d u r o n i c

a c i d i n c h o n d r o i t i n s u l p h a t e B , t h e r e m a i n i n g p a r t s

o f t h e m o l e c u l e s b e i n g i d e n t i c a l ( M u i r , 1 9 6 1 ) .Mathews ( 1 9 6 0 ) h a s i n d i c a t e d t h a t c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e B b i n d s c a t i o n s m o r e s t r o n g l y t h a n d o e s

c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A . The work r e p o r t e d h e r e

d o e s n o t s u p p o r t t h i s , b u t s h o w s t h at t h e o rd e r o f

a f f i n i t y d e p e n d s upon t h e c a t i o n u s e d and p o s s i b l y

on t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e p o l y i o n s . Thus i t

seems u n l i k e l y t h a t t h e d i f f e r e n c e s i n c a t i o n a f f i n i t yb e t w e e n t h e s e c h o n d r o i t i n s u l p h a t e s , a t l e a s t f o r

s m a l l c a t i o n s , can b e e x p l a i n e d i n terms o f a s i n g l ef a c t o r , n a m e l y e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n

n e i g h b o u r i n g g r o u p s a s s u g g e s t e d b y Mathews

( 1 9 6 0 ) f o r t h e a s s o c i a t i o n o f t h e l a r g e c a t i o n ,C o ( N H 3 ) 3 + .

Wolfrom ( 1 9 5 8 ) h a s i n d i c a t e d t h a t h e p a r i n m a yb e c o m p o s e d o f d i s a c c h a r i d e r e p e a t i n g u n i t s c o n -

t a i n i n g e q u i m o l a r a m o u n t s o f D - g l u c u r o n i c a c i d

and D - g l u c o s a m i n e w i t h b e t w e e n t wo a n d t h r e e

V o l . 8 5 3 4 7



J . R . DUNSTONE

s u l p h a t e g r o u p s p e r d i s a c c h a r i d e . The h e x o s a m i n e

n i t r o g e n and some o f t h e h y d r o x y l g r o u p s a r e

s u l p h a t e d . H e p a r i n m o n o s u l p h a t e ( h e p a r i t i n s u l -p h a t e ) i s t h o u g h t t o b e a p o l y m e r c o n t a i n i n g

r e p e a t i n g u n i t s o f D - g l u c o s a m i n e d i s u l p h a t e ( O - a n dN - s u l p h a t e g r o u p s ) and D - g l u c u r o n i c a c i d , w i t h a

s u l p h a t e - f r e e p o r t i o n c o n t ai n i ng r e p e a t i n g u n i ts o f

N - a c e t y l g l u c o s a m i n e and D - g l u c u r o n i c a c i d at -t a c h e d . T h e r e i s a l s o t h e p o s s i b i l i t y t h a t h e p a r i n

m o n o s u l p h a t e h a s a b r a n c h e d s t r u c t u r e ( L i n k e r &S a m p s o n , 1 9 6 0 ) . H o w e v e r , C i f o n e l l i & Dorfman

( 1 9 6 2 ) h a v e i n d i c a t e d t h a t L - i d u r o n i c a c i d i s a l s o

p r e s e n t i n p r e p a r a t i o n s o f h e p a r i n and h e p a r i n

m o n o s u l p h a t e . F r o m t h e a b o v e c o n s i d e r a t i o n s i twould a p p e a r t h a t , a l t h o u g h t h e s t r u c t u r e s o f t h e s e

two s u b s t a n c e s h a v e n o t y e t b e e n f u l l y e l u c i d a t e d ,

t h e r e d o e s e x i s t a nu m ber o f s t r u c t u r a l s i m i l a r i t i e sb e t w e e n t h e m . T h i s s i m i l a r i t y i n s t r u c t u r e i s f u r t h e r

i l l u s t r a t e d by t h e f a c t t h a t b o t h o f t h e s e s u b s t a n c e s

h a v e c a t i o n a f f i n i t i e s o f c o m p a r a b l e m a g n i t u d e anda l s o show a s i m i l a r o r d e r o f c a t i o n a f f i n i t y . The same

g e n e r a l o r d e r o f a f f i n i t y f o r t h e b i v a l e n t c a t i o n s

s t u d i e d h a s b e e n f o u n d w i t h h e p a r i n , h e p a r i n m o n o -

s u l p h a t e and c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A , e x c e p t t h a t

w i t h h e p a r i n t h e r e i s a g r e a t e r a f f i n i t y f o r c a l c i u m

t h a n f o r t h e o t h e r c a t i o n s and w i t h h e p a r i n m on o -

s u l p h a t e t h e r e i s a l m o s t an e q u a l a f f i n i t y f o r

c a l c i u m and s t r o n t i u m ( t h e s l i g h t l y g r e a t e r a f f i n i t yf o r c a l c i u m m a y b e d u e t o t h e p r e s e n c e o f s o m e

h e p a r i n i n t h e h e p a r i n m o n o s u l p h a t e f r a c t i o n ) . T h i s

c o m m o n o r d e r o f a f f i n i t y , n a m e l y

M g 2 + < C a 2 + < S r 2 + < B a 2 +

s u p p o r t s t h e i d e a t h a t , i n g e n e r a l , t h e r e a c t i o n s

s t u d i e d a r e o f t h e i o n - e x c h a n g e t y p e w i t h n o n -

s p e c i f i c e l e c t r o s t a t i c b i n d i n g r a t h e r t h a n o f t h e

m o r e s p e c i f i c c h e l a t e t y p e where t h e o r d e r

Mg2+ > C a 2 + > S r 2 + > B a 2 +

w o u l d b e e x p e c t e d ( s e e M a r t e l l & C a l v i n , 1 9 5 2 ) .I n g e n e r a l , h e p a r i n a n d h e p a r i n m o n o s u l p h a t e

show g r e a t e r a f f i n i t y f o r c a t i o n s t h a n t h e c h o n dr o i t i n

s u l p h a t e s . T h i s i s p r o b a b l y d u e t o t h e g r e a t e r c h a r g e

d e n s i t y o f t h e s e p o l y m e r s p r o d u c e d by t h e l a r g e r

number o f c h a r g e d g r o u p s p e r r e p e a t i n g u n i t ( s e eB o y d , S o l d a n o & B o n n e r , 1 9 5 4 ; H u t s c h n e k e r &

D e u e l , 1 9 5 6 ) . Both t h e h e p a r i n and h e p a r i n m o n o -

s u l p h a t e c o n t a i n N - s u l p h a t e g r o u p s a s w e l l a s

0 - s u l p h a t e g r o u p s a n d t h e s e N - s u l p h a t e g r o u p s

m a y e x e r t so m e s p e c i f i c e f f e c t s , w h i c h a r e , i n p a r t ,

r e s p o n s i b l e f o r t h e g r e a t e r a f f i n i t y .The c h o n d r o i t i n s u l p h a t e s h a v e a g r e a t e r a f f i n i t y

f o r s o d i u m t h a n f o r p o t a s s i u m , w h e r e a s w i t h

h e p a r i n t h e r e v e r s e i s t r u e ( T a b l e 5 ) . T h i s b e h a v i o u r

i s p r o b a b l y d u e t o s p e c i f i c e f f e c t s o f t h e g r o u p s

r e s p o n s i b l e f o r t h e b i n d i n g . I n t h e c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e s t h e b i n d i n g i s s h a r e d e q u a l l y by w e a k l ya c i d i c c a r b o x y l g r o u p s and s t r o n g l y a c i d i c 0 -

s u l p h a t e e s t e r g r o u p s , w h e r e a s w i t h h e p a r i n

s t r o n g l y a c i d i c 0 - and N - s u l p h a t e g r o u p s p r e -

d o m i n a t e o v e r t h e weaker c a r b o x y l g r o u p s . T h e s e

r e a c t i o ns a re s i m i l a r t o t h o s e w i t h weakly a c i d i c

c a r b o x y l i c a c i d r e s i n s w h e r e s o d i u m i s p r e f e r r e d

t o p o t a s s i u m , a n d w i t h s t r o n g l y a c i d i c s u l p h o n i c

a c i d r e s i n s w h e r e p o t a s s i u m i s p r e f e r r e d t o s o d i u m .

The m a g n i t u d e o f t h e m e a s u r e d e x c h a n g e p a r a -m e t e r s i nd i c at e s t h a t t h e b i v a l e n t i o n s a r e bound

m o r e s t r o n g l y t h a n t h e u ni v a l e nt i o n s . The c a l c u -

l a t i o n upon w h i c h t h i s s t a t e m e n t i s b a s e d i s m a d e

by s u b s t i t u t i n g t h e e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d

v a l u e o f K and v a r i o u s v a l u e s o f XN i n e q u a t i o n ( 1 )and t h e n c a l c u l a t i n g t h e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n o f t h e

b i v a l e n t i o n i n t h e s o l u t i o n p h a s e . The s h a p e o f t h e

p l o t o f XN a g a i n s t t h e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n o f t h e

b i v a l e n t i o n i n t h e s o l u t i o n p h a s e i n d i c a t e s which

o f t h e i o n s i s t h e more s t r o n g l y bound ( s e e Dun-

s t o n e , 1 9 6 0 ) .

The e f f e c t o f d i a l y s i s o f t h e h e p a r i n s o l u t i o n s h a sb e e n i n c l u d e d b e c a u s e o f t h e m a r k e d d i f f e r e n c e i n

b e h a v i o u r o f t h e d i a l y s e d and n o n - d i a l y s e d

s a m p l e s , a n d b e c a u s e some w o r k e r s ( M a t h e w s ,

1 9 6 0 ) h a v e u s e d m a t e r i a l f r o m t h e same s o u r c e

( A b b o t t L a b o r a t o r i e s L t d . ) w i t h o u t i n d i c a t i n g any

p r i o r t r e a t m e n t . The f a c t t h a t t h e h i g h b i n d i n g

a f f i n i t y a n d t h e o r d e r o f c a t i o n a f f i n i t y were a l t e r e d

by d i a l y s i s s h o w e d t h a t t h e r e was p r e s e n t i n t h e

n o n - d i a l y s e d m a t e r i a l some s m a l l - m o l e c u l a r - w e i g h t

s u b s t a n c e o r s u b s t a n c e s t h a t had a s t r o n g a f f i n i t yf o r t h e c a t i o n s s t u d i e d . S i m i l a r s u b s t a n c e s w e r e

n o t d e t e c t e d i n a s a m p l e f r o m a d i f f e r e n t m a nu -

f a c t u r e r ( T h e U p j o h n C o . ) . The p r e s e n c e o f t h i sp o w e r f u l b i n d i n g a g e n t o r a g e n t s d i d n o t a p p e a r t o

i n f l u e n c e t h e a n t i c o ag u l a n t p r o p e r t i e s , a s a l ls a m p l e s t e s t e d had s i m i l a r a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t i e s .

A f f i n i t y o f c a t i o n s f o r c a r t i l a g e - b o u n da c i d m U c o p o l y 8 a c c h a r i d e 8

The c a t i o n a f f i n i t i e s f o r c a r t i l a g e - b o u n d a c i d

m u c o p o l y s a c c h a r i d e o b t a i n e d i n t h e p r e s e n t s t u d y

d i f f e r f r o m t h o s e o b t a i n e d b y D u n s t o n e ( 1 9 6 0 ) i n

t h a t t h e m a g n i t u d e s o f t h e e x c h a n g e p a r a m e t e r s ,

m e a s u r e d a t t h e s a m e I , a r e d i f f e r e n t [ C a 2 + + N a + -

c a r t i l a g e a t I - 0 - 0 3 : p r e s e n t s t u d y , K 0 - 6 2 ;D u n s t o n e ( 1 9 6 0 ) , K 0 . 0 5 ] . T h i s v a r i a t i o n can o n l y

b e a t t r i b u t e d t o t h e d i f f e r e n t e x p e r i m e n t a l c o n d i -

t i o n s u s e d i n t h e tw o s t u d i e s . K i t c h e n e r ( 1 9 5 7 )h a s p o i n t e d o u t t h a t t h e a f f i n i t y o f c a t i o n s f o re x c h a n g e m a t e r i a l s v a r i e s w i t h t h e c a t i o n c o m -

p o s i t i o n o f t h e e x c h a n g e r . I t h a s b e e n f o u n d t h a t

t h e l o w e r t h e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n o f a p a r t i c u l a rc a t i o n i n t h e e x c h a n g e r , t h e h i g h e r i s t h e a f f i n i t y f o rt h i s p a r t i c u l a r c a t i o n . T h i s , t h e n , c o u l d e x p l a i n

( a ) t h e g r e a t e r a f f i n i t y f o r c a t i o n s o b s e r v e d i n t h e

p r e s e n t s t u d y , w h e r e t h e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n s o f t h e

p a r t i c u l a r c a t i o n a r e v e r y s m a l l c o m p a r e d w i t h t h er e l a t i v e l y l a r g e e q u i v a l e n t - f r a c t i o n s o b t a i n e d i n

3 4 8 1 9 6 2




t h e e a r l i e r w o r k , and ( b ) t h e s e n s i t i v i t y o f t h e

methods u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y t o c h a n g e s i n

t h e c o nc e nt ra t i o n o f t h e t r a c e r c a t i o n s ( T a b l e 1 1 ) .The r e s u l t s o f t h e p r e s e n t s t u d y i n d i c a t e t h a t t h e

c a t i o n c o n t e n t o f t h e m u c o p o l y s a c c h a r i d e s i n

s o l u t i o n e x e r t s no e f f e c t on t h e measured e x c h a n g e

p a r a m e t e r s , a s s i m i l ar v a l u e s w e r e o b t a i n e d f o r t h e

C a 2 + + N a + - c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A and t h eMg2+ + N a + - c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A s y s t e m s a t

e q u i v a l e n t - f r a c t i o n s a p p r o a c h i n g z e r o and a t e q u i -

v a l e n t - f r a c t i o n s o f a p p r o x i m a t e l y 0 1 ( T a b l e s 5 , 1 ) .T h i s i s t o b e e x p e c t e d , a s K i t c h e n e r ( 1 9 5 7 ) h a s

i n d i c a t e d t h a t t h e l o w e r t h e d e g r e e o f c r o s s - l i n k i n g

o f t h e e x c h a n g e r t h e l e s s t h e e f f e c t o f e x c h a n g e r

c o m p o s i t i o n on t h e e x c h a n g e p a r a m e t e r s , h e n c e no

s u c h e f f e c t s h o u l d b e o b s e r v e d w h e r e a l i n e a r p o l y -

e l e c t r o l y t e i n s o l u t i o n i s c o n c e r n e d , b u t m a y b e

o b s e r v e d i n a s o l i d e x c h a n g e r s u c h a s c a r t i l a g e ,w h e r e t h e p o l y e l e c t r o l y t e i s somewhat r e s t r i c t e d .

I n c a r t i l a g e s y s t e m s t h e v a r i a t i o n o f t h e e x c h a n g ep a r a m e t e r w i t h I was n o t a s mar k e d a s i n s y s t e m s

w i t h t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e i n s o l u t i o n . The

i n t r o d u c t i o n o f s o lu t i o n a c ti v i t y c o e f f i c i e n t s i n t h e

m a nner d e s c r i b e d b y B o y d & N e u m a n ( 1 9 5 1 )

s l i g h t l y r e d u c e d t h e v a r i a t i o n b u t t h e v al u e s d i d

n o t a p p r o a c h t h e c o n s t a n c y o b s e r v e d b y t h e s e

a u t h o r s , w h o s t u d i e d t h e d i s t r i b u t i o n s o n l y o v e r a

narrow r a n g e o f I . N o e x p l a n a t i o n o f t h e v a r i a t i o n s

can b e g i v e n a t p r e s e n t .

P h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f c at i o n a s s o c i a t i o nw i t h a c i d m u c o p o l y 8 a c c h a r i d e s

The o r d e r o f t h e a b i l i t y o f c a t i o n s t o i nh i b i t

c a l c i f i c a t i o n ( S o b e l , 1 9 5 5 ) i s n o t t h e s a m e a s any o f

t h e c a t i o n - a f f i n i t y s e r i e s o b t a i n e d w i t h a c i d muco-

p o l y s a c c h a r i d e s e i t h e r bound o r i n s o l u t i o n . T h i s

m a y m e a n t h a t t h e p r o c e s s o f i n a c t i v a t i o n o f c a l c i -f i c a t i o n i n v i t r o , e n v i s a g e d a s s e l e c t i v e b i n d i n g o f

c a t i o n s t o a ' l o c a l f a c t o r ' s u c h a s an a c i d muco-

p o l y s a c c h a r i d e , i s n o t d u e t o an i o n - e x c h a n g e

p r o c e s s o f t h e t y p e r e p o r t e d i n t h i s p a p e r . O n t h e

o t h e r h a n d , t h e o r d e r o f a f f i n i t y o f c a t i o n s f o r t h e

c a l c i f y i n g m a t r i x c o u l d w e l l b e t h e s a m e a s t h a t f o r

i n a c t i v a t i o n o f c a l c i f i c a t i o n o w i n g t o t h e e f f e c t s o f

( a ) t h e c h e m i c a l s t r u c t u r e o f t h e a g e n t r e s p o n s i b l e

f o r t h e b i n d i n g , ( b ) t h e p h y s i c a l s t a t e o f t h i s a g e n t ,

i . e . s o l i d , g e l o r s o l u t i o n , and ( c ) t h e c a t i o n com-

p o s i t i o n o f t h e m a t r i x , upon t h e o r d e r o f a f f i n i t y .The s u g ge s t i o n t h a t t h e c a t i o n c o m p o s i t i o n o f t h e

m a t r i x m a y h a v e an i m p o r t a n t r e g u l a t o r y f u n c t i o n

i n d e t e r m i n i n g c a t i o n a f f i n i t i e s h a s n o t p r e v i o u s l y

b e e n m a d e , b u t t h e r e s u l t s show t h a t i t m a y b e

i m p o r t a n t . F o r e x a m p l e , a d e f i c i e n c y o f a p a r t i c u l a r

c a t i o n i n t h e m a t r i x m a y e na b l e t h e m a t r i x t o

e x h i b i t a g r e a t e r a f f i n i t y f o r t h i s c a t i o n t h a n f o r

a n o t h e r c a t i o n t h a t w o u l d n o r m a l l y h a v e g r e a t e r

i n t r i n s i c a f f i n i t y f o r t h e m a t r i x b u t i s p r e s e n t i nt h e m a t r i x i n l a r g e r q u a n t i t y .

T h e r e m i g h t b e b e t t e r a g r e e m e n t b e t w e e n t h e

a f f i n i t y s e r i e s and t h e i n a c t i v a t i o n s e r i e s i f t h e

b i n d i n g o f some c a t i o n s were m o r e c o v a l e n t t h a n

e l e c t r o s t a t i c . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e g r o u p s

o f t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s a r e p r e d o m i n a n t l y

c o n c e r n e d w i t h e l e c t r o s t a t i c b i n d i n g and n o t

s p e c i f i c s i t e b i n d i n g . Thus f o r c o v a l e n t b i n d i n g t o

o c c u r , t h e p a r t i c i p a t i o n o f g r o u p s o t h e r t h a n t h o s ep r e s e n t i n a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s m i g h t b e

e x p e c t e d . H o w e v e r , J . R . van W a zer ( i n t h e

D i s c u s s i o n on t h e p a p e r o f H a r r i s & R i c e , 1 9 5 4 )

h a s p o i n t e d o u t t h a t w i t h c e r t a i n u n i f u n c t i o n a l

p o l y e l e c t r o l y t e s b o t h n o n - s p e c i f i c e l e c t r o s t a t i c and

s p e c i f i c c o v a l e n t b i n d i n g o c c u r , even w i t h t h e

a l k a l i m e t a l s . H e n c e , a s y s t e m t h a t b i n d s c a t i o n s

by o n e o r b o t h o f t h e s e m e c h a n i s m s c o u l d e x i s t i n

t h e s y s t e m s s t u d i e d by S o b e l ( 1 9 5 5 ) , w h i c h b e a r

c l o s e r r e s e m b l a n c e t o t h o s e f o u n d i n v i v o t h a n

t h o s e s t u d i e d h e r e , i f ( a ) o t h e r f u n c t i o n a l g r o u p s

were p r o v i d e d by t h e m a t r i x t o w h i c h t h e m u c o -p o l y s a c c h a r i d e i s bound a n d / o r ( b ) t h e p o l y e l e c t r o -

l y t e i s o f s u c h a n a t u r e a s t o p e r m i t b o t h t y p e s o f

b i n d i n g . I n v i e w o f t h e e x p e r i m e n t a l f i n d i n g sr e p o r t e d i n t h i s p a p e r , b o t h o f t h e s e p o s s i b i l i t i e sseem u n l i k e l y .

Owing t o t h e v a r i e t y o f f a c t o r s t h a t m a y a f f e c tt h e o r d e r o f c a t i o n a f f i n i t y f o r a c a l c i f y i n g m a t r i x ,

m o re m us t b e k n o w n a b o u t t h e c h e m i c a l and

p h y s i c a l n a t u r e o f t h e m a t r i x a t t h e s i t e o f c a l c i f i -c at i o n b e f o r e any c o n c l u s i o n s can j u s t l y b e m a d e

a b o u t t h e mechanism o f c a t i o n - b i n d i n g . A l t h o u g ha c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s have b e e n t h o u g h t t o

p r o v i d e s i t e s , by c a t i o n - b i n d i n g , f o r t h e i n i t i a t i o no f c r y s t a l n u c l e i upon w h i c h e p i t a c t i c g r o w t h o f

b o n e m i n e r a l t a k e s p l a c e , e v i d e n c e f r o m t h e p r e s e n t

work i n d i c a t e s t h a t t h e s e s u b s t a n c e s , a l o n e , b i n d

c a t i o n s i n a r a t h e r n o n - s p e c i f i c w a y by e l e c t r o s t a t i cf o r c e s . S u c h b i n d i n g w o u l d not b e e x p e c t e d t o

p r o v i d e s p e c i f i c s i t e s f o r c r y s t a l g r o w t h .

SUMMARY

1 . The i n t e r a c t i o n s o f c a t i o n s w i t h a c i d m u c o -

p o l y s a c c h a r i d e s i n s o l u t i o n h a v e b e e n t r e a t e d a s

i o n - e x c h a n g e r e a c t i o n s .

2 . The r e l a t i v e a f f i n i t i e s o f t h e c a t i o n s N a + , K + ,M g 2 + , C a 2 + , S r 2 + and B a 2 + f o r c h o n d r o i t i n s u l p h a t e

A , c h o n d r o i t i n s u l p h a t e B , h e p a r i n and h e p a r i nm o n o s u l p h a t e h a v e b e e n m e a s u r e d and r e c o r d e d

i n t h e f o r m o f e x c h a n g e p a r a m e t e r s c a l c u l a t e d f r o m

a R o t h m u n d & K o r n f e l d ( 1 9 1 8 ) e q u a t i o n .

3 . The o r d e r s o f i n c r e a s i n g c a t i o n a f f i n i t y a r e :

K + , N a + , M g 2 + , C a 2 + , S r 2 + , B a 2 + f o r c h o n d r o i t i n

s u l p h a t e A ; K + , N a + , Mg2+Ca2+-Sr2+Ba 2+for

c h o n d r o i t i n s u l p h a t e B ; N a + , K + , M g 2 + , S r 2 + ,B a 2 + , C a 2 + f o r h e p a r i n ; N a + , M g 2 + , C a 2 + S r 2 + ,

B a 2 + f o r h e p a r i n m o n o s u l p h a t e . The d i f f e r e n c e si n t h e o r d e r s o f a f f i n i t y h a v e b e e n a t t r i b u t e d t o

V o l . 8 5 3 4 9



3 5 0 J . R . DUNS T O NE 1 9 6 2

d i f f e r e n c e s i n t h e s t r u c t u r e s o f t h e v ar i o u s a c i d

m u c o p o l y s a c c h a r i d e s .

4 . Exchange p a r a m e t e r s h a v e b e e n f o u n d t o

v a r y w i t h i o n i c s t r e n g t h , and a t h e o r e t i c a l e v a l u a -

t i o n o f t h e o r i g i n s o f t h i s v a r i a t i o n h a s b e e n made.

5 . Under t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s u s e d , t h e

a s s o c i a t i o n o f c a t i o n s w i t h a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s

i n s o l u t i o n i s t h o u g h t t o b e m a i n l y o f an e l e c t r o -s t a t i c t y p e .

6 . M u c o p o l y s a c c h a r i d e s e x t r a c t e d from c a r t i l a g e

by m i l d p r o c e d u r e s b i n d c a t i o n s more s t r o n g l y t h a n

t h e m a t e r i a l s e x t r a c t e d by r e l a t i v e l y h a r s h p r o -

c e d u r e s . The c a u s e o f t h e s t r o n g e r b i n d i n g a p p e a r s

t o b e a s s o c i a t e d w i t h t h e s t a t e o f p o l y m e r i z a t i o n

o f t h e m u c o p o l y s a c c h a r i d e , b u t t h e e f f e c t o f t h e

p r o t e i n w h i c h i s e x t r a c t e d w i t h t h e m u c o p o l y -

s a c c h a r i d e h a s n o t b e e n c o m p l e t e l y e v a l u a t e d .

7 . A c o m p a r i s o n o f t h e a f f i n i t y o f c a t i o n s f o r

a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s i n s o l u t i o n and f o r

c a r t i l a g e - b o u n d a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e h a sshown

t h a t t h e o r d e r o f a f f i n i t y f o r c a t i o n s o f t h e c a r t i -l a g e - b o u n d a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e u n d e r t h e

e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s d e s c r i b e d by Dunstone

( 1 9 6 0 ) i s s i m i l a r t o t h a t f o r c h o n d r o i t i n s u l p h a t e A

i n s o l u t i o n . H o w e v e r , w h e n i o n - e x c h a n g e

methods w i t h t r a c e r c a t i o n s a r e u s e d t o s t u d y r e -

a c t i o n s w i t h c a r t i l a g e , t h e e x c h a n g e p a r a m e t e r s

v a r y w i t h t h e c a t i o n c o m p o s i t i o n o f t h e c a r t i l a g e

p h a s e and c a u s e t h e o r d e r o f a f f i n i t y f o r c a t i o n s t o

a l t e r . T h i s t y p e o f v ar i a t i o n d o e s n o t o c c u r when

t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e i s p r e s e n t i n s o l u t i o n .

8 . The e x c h a n g e p a r a m e t e r s f o r r e a c t i o n s b e -

tween c a r t i l a g e and c a t i o n s v a r y w i t h i o n i c s t r e n g t h

b u t t h e v a r i a t i o n i s c o n s i d e r a b l y l e s s t h a n t h a t

w h i c h o c c u r s when t h e a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e i s

p r e s e n t i n s o l u t i o n .

9 . The s i g i n i f i c a n c e o f t h e s e r e s u l t s w i t h r e s p e c t

t o t h e f u n c t i o n o f a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s i n

c a l c i f i c a t i o n p r o c e s s e s i s b r i e f l y d i s c u s s e d .

I w i s h t o e x p r e s s m y t h a n k s t o P r o f e s s o r H . J . G . H i n e s

o f t h e U n i v e rs i ty o f Q u e e n s l a n d f o r h i s c o n t i n u e d i n t e r e s ta n d h e l p f u l a d v i c e , a n d t o P r o f e s s o r A . G . O g s t o n , F . R . S . ,o f t h e A u s t r a l i a n N a t i o n a l U n i v e r s i t y , f o r h i s i n t e r e s t a n d

h e l p f u l c r i t i c i s m . T h a n k s ar e a l s o d u e t o L e s l e y P o w e r f o r

h e r s k i l l e d t e c h n i c a l a s s i s t a n c e ; t o F . Hofmann-La R o c h ea n d C o . L t d . , B a s l e , S w i t z e r l a n d , f o r g i f t s o f , - h e p a r i n ; t o

A b b o t t L a b o r a t o r i e s L t d . , N . C h i c a g o , I l l . , U . S . A . f o ra g i f t o f s o d i u m h e p a r i n ; t o T h e U p j o h n C o . , K a l a m a z o o ,

M i c h . , U . S . A . f o r g i f t s o f s o d i u m h e p a r i n a n d h e p a r i n

m o n o s u l p h a t e ; a n d t o F o g g i t t J o n e s P t y . L t d . f o r s u p p l y i n g

t h e n a s a l s e p t a .

REFERENCES

A l d r i c h , B . I . ( 1 9 5 8 ) . B i o c h e m . J . 7 0 , 2 3 6 .B o a s , N . F . ( 1 9 5 3 ) . J . b i o l . C h e m . 2 0 4 , 5 5 3 .B o y d , E . S . & N e u m a n , W. F . ( 1 9 5 1 ) . J . b i o l . C h e m . 1 9 3 ,

2 4 3 .

B o y d , G . E . , S o l d a n o , B . A . & B o n n e r , 0 . D . ( 1 9 5 4 ) .J . p h y 8 . C h e m . 5 8 , 4 5 6 .

C i f o n e l l i , J . A . & D o r f m a n , A . ( 1 9 6 0 ) . J . b i o l . C h e m . 2 3 5 ,

3 2 8 3 .

C i f o n e l l i , J . A . & D o r f m a n , A . ( 1 9 6 2 ) . B i o c h e m . b i o p h y s .R e s . Commun. 7 , 4 1 .

C r a g g , L . H . ( 1 9 4 6 ) . J . C o l l o i d S c i . 1 , 2 6 1 .D a v i s , W . E . & E l l i o t t , J . H . ( 1 9 4 9 ) . J . C o l l o i d S c i . 4 , 3 1 3 .D i s c h e , Z . ( 1 9 4 7 ) . J . b i o l . C h e m . 1 6 7 , 1 8 9 .D j u r f e l d t , R . & S a m u e l s o n , 0 . ( 1 9 5 7 a ) . A c t a c h e m . s c a n d .

1 1 , 1 2 0 9 .D j u r f e l d t , R . & S a m u e l s o n , 0 . ( 1 9 5 7 b ) . A c t a c h e m . s c a n d .1 i , 1 2 1 6 .

D o r f m a n , A . & C i f o n e l l i , J . A . ( 1 9 5 7 ) . I n M e t h o d s i n

E n z y m o l o g y , v o l . 3 , p . 2 4 . E d . b y C o l o w i c k , S . P . &

K a p l a n , N . 0 . Ne w Y o r k : A c a d e m i c P r e s s I n c .D u n s t o n e , J . R . ( 1 9 5 7 ) . M e d . J . A u s t . 2 , n o . 1 6 , 5 7 1 .D u n s t o n e , J . R . ( 1 9 5 9 ) . B i o c h e m . J . 7 2 , 4 6 5 .D u n s t o n e , J . R . ( 1 9 6 0 ) . B i o c h e m . J . 7 7 , 1 6 4 .D u n s t o n e , J . R . & P a y n e , E . ( 1 9 5 9 ) . A n a l y 8 t , 8 4 , 1 1 0 .E i n b i n d e r , J . & S c h u b e r t , M . ( 1 9 5 0 ) . J . b i o l . C h e m . 1 8 5 ,

7 2 5 .

E l s o n , L . A . & M o r g a n , W . T . J . ( 1 9 3 3 ) . B i o c h e m . J . 2 7 ,

1 8 2 4 .

F r a n c i s , G . E . , M u l l i g a n , W . & W o r m a l l , A . ( 1 9 5 4 a ) .

I s o t o p i c T r a c e r s , p . 1 3 7 . L o n d o n : T h e A t h l o n e P r e s s .F r a n c i s , G . E . , M u l l i g a n , W . & W o r m a l l , A . ( 1 9 5 4 b ) .

I s o t o p i c T r a c e r s , p . 2 7 7 . L o n d o n : T h e A t h l o n e P r e s s .F r i t z , J . S . , Yamamura, S . S . & R i c h a r d , M . J . ( 1 9 5 7 ) .

A n a l y t . C h e m . 2 9 , 1 5 8 .G i l b e r t , I . G . F . & M y e r s , N . A . ( 1 9 6 0 ) . B i o c h i m . b i o p h y s .

A d a , 4 2 , 4 6 9 .

G r e g o r , H . P . ( 1 9 5 6 ) . T r a n s . N . Y . A c a d . S c i . 1 8 , 6 6 7 .

H a i n e d , H . S . & O w e n , B . B . ( 1 9 5 8 ) . T h e P h y s i c a l C h e m i s t r y

o f E l e c t r o l y t i c S o l u t i o n s . N e w Y o r k : R e i nh o l d P u b l i s h i n g

C o r p .

H a r r i s , F . E . & R i c e , S . A . ( 1 9 5 4 ) . J . p h y s . C h e m . 5 8 , 7 3 3 .

H e r m a n s , J . J . & O v e r b e e k , J . T . G . ( 1 9 4 8 ) . R e c . T r a v .c h i m . P a y s - B a s , 6 7 , 7 6 1 .

H u g h e s , T . R . & K l o t z , I . M . ( 1 9 5 6 ) . M e t h . b i o c h e m . A n a l .

3 , 2 6 5 .

H u i z e n g a , J . R . , G r i e g e r , P . F . & W a l l , F . T . ( 1 9 5 0 a ) .J . A m e r . c h e m . S o c . 7 2 , 2 6 3 6 .

H u i z e n g a , J . R . , G r i e g e r , P . F . & W a l l , F . T . ( 1 9 5 0 b ) .J . A m e r . c h e m . S o c . 7 2 , 4 2 2 8 .

H u t s c h n e k e r , K . & D e u e l , H . ( 1 9 5 6 ) . H e l v . c h i m . a c t a , 3 9 ,1 0 3 8 .

J o h n s o n , P . & R o w e , A . J . ( 1 9 6 1 ) . B i o c h e m . J . 7 9 , 5 2 4 .K a n t o r , T . G . & S c h u b e r t , M . ( 1 9 5 7 ) . J . A m e r . c h e m . S o c .

7 9 , 1 5 2 .K i t c h e n e r , J . A . ( 1 9 5 7 ) . I o n E x c h a n g e R e s i n s , c h a p . 3 .

L o n d o n : M e t h u e n a n d C o . L t d .

L a p a n j e , S . , H a e b i g , J . , D a v i s , T . & R i c e , S . A . ( 1 9 6 1 ) .J . A m e r . c h e m . S o c . 8 3 , 1 5 9 0 .

L i n k e r , A . & S a m p s o n , P . ( 1 9 6 0 ) . B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a ,4 3 , 3 6 6 .

M a r b e t , R . & W i n t e r s t e i n , A . ( 1 9 5 3 ) . H e l v . c h i m . a c t a , 3 4 ,2 3 1 1 .

M a r t e l l , A . E . & C a l v i n , M . ( 1 9 5 2 ) . C h e m i s t r y o f t h e M e t a l

C h e l a t e C o m p o u n d s , c h a p t s . 5 a n d 9 . Ne w Y o r k : P r e n t i c e -

H a l l I n c .M a t h e w s , M . B . ( 1 9 5 6 ) . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 6 1 , 3 6 7 .M a t h e w s , M . B . ( 1 9 5 9 ) . B i o c h i m . b i o p h y s . A d a , 3 5 , 9 .

M a t h e w s , M . B . ( 1 9 6 0 ) . B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a , 3 7 , 2 8 8 .

M a t h e w s , M . B . & D o r f m a n , A . ( 1 9 5 3 ) . A r c h . B i o c h e m .B i o p h y s . 4 2 , 4 1 .



V o l . 8 5 CATIONS AND ACID MUCOPOLYSACCHARIDES 3 5 1

M e y e r , K . , D a v i d s o n , E . A . , L i n k e r , A . & H o f f m a n , P .

( 1 9 5 6 ) . B i o c h i m . b i o p h y 8 . A c t a , 2 1 , 5 0 6 .

M u i r , H . M . ( 1 9 6 1 ) . S y m p . b i o c h e m . S o c . 2 0 , 4 .

O v e r b e e k , J . T . G . ( 1 9 5 6 ) . P r o g r . B i o p h y 8 . b i o p h y 8 . C h e m .

6 , 5 8 .O v e r m a n , R . T . & C l a r k , H . M . ( 1 9 6 0 ) . R a d i o i s o t o p e

T e c h n i q u e s , p . 3 3 0 . N e w Y o r k : M c G r a w - H i l l B o o k

C o . I n c .

P a r k , J . T . & J o h n s o n , M . J . ( 1 9 4 9 ) . J . b i o l . C h e m . 1 8 1 ,1 4 9 .

R o t h m u n d , V . & K o r n f e l d , G . ( 1 9 1 8 ) . Z . a n o r g . C h e m . 1 0 3 ,

1 2 9 .

S a n d e l l , E . B . ( 1 9 5 0 ) . C o l o r i m e t r i c D e t e r m i n a t i o n o f T r a c e s

o f M e t a l s , p . 4 2 5 . N e w Y o r k : I n t e r s c i e n c e P u b l i s h e r s I n c .

S c h u b e r t , J . ( 1 9 5 2 ) . J . p h y s . C h e m . 5 6 , 1 1 3 .S c h u b e r t , J . ( 1 9 5 6 ) . M e t h . b i o c h e m . A n a l . 3 , 2 4 7 .

S o b e l , A . E . ( 1 9 5 5 ) . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 6 0 , A r t . 5 , 7 1 3 .S t r a u s s , U . P . , W o o d s i d e , D . & W i n e m a n , P . ( 1 9 5 7 ) .

J . p h y 8 . C h e m . 6 1 , 1 3 5 3 .W o l f r o m , M . L . ( 1 9 5 8 ) . I n P o l y s a c c h a r i d e s i n B i o l o g y ,

T r a n s . 4 t h C o n f . , p . 1 1 5 . E d . b y S p r i n g e r , G . F . Ne wY o r k : J o s i a h M a c y , J u n . F o u n d a t i o n .

Y u l e , G . U . & K e n d a l l , M . G . ( 1 9 4 5 ) . A n I n t r o d u c t i o n t o t h e

T h e o r y o f S t a t i s t i c s , p . 3 1 5 , L o n d o n : G r i f f i n a n d C o . L t d .

B i o c h e m . J . ( 1 9 6 2 ) 8 5 , 3 5 1

A C o m p a r a t i v e S t u d y o f N i c o t i n a m i d e N u c l e o t i d e Coenzymes

d u r i n g Growth o f t h e S h e e p a n d R a t

B Y P . C A I G E R A N D R . K . MORTON

D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r a l C h e m i s t r y , W a i t e A g r i c u l t u r a l R e s e a r c h I n s t i t u t e , U n i v e r s i t y o f A d e l a i d e

AND 0 . H . FILSELL A ND I . G . JARRETT

C . S . I . R . O . D i v i s i o n o f B i o c h e m i s t r y a n d G e n e r a l N u t r i t i o n , A d e l a i d e , S o u t h A u s t r a l i a

( R e c e i v e d 6 A p r i l 1 9 6 2 )

A l t h o u g h o b s e r v a t i o n s h a v e b e e n m a d e on t h e

c o n c e n t r a t i o n s o f n i c o t i n a m i d e n u c l e o t i d e c o -

e n z y m e s i n t h e t i s s u e s o f a nu m ber o f l a b o r a t o r y

a n i m a l s , t h e r e a p p e a r s t o b e no i n f o r m a t i o n on t h e

c o n c e n t r a t i o n o f t h e o xi d i z e d and r e d u c e d f o r m s o f

t h e s e s u b s t a n c e s i n r u m i n a n t t i s s u e .M a n y a s p e c t s o f c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m i n t h e

a d u l t s h e e p d i f f e r f r o m t h o s e i n m o n o g a s t r i c

a n i m a l s ( s e e L i n d s a y , 1 9 5 9 ) , a n d d i f f e r e n c e s i n

enzyme p a t t e r n s h a v e b e e n shown t o e x i s t b e t w e e n

l a m b , a d u l t - s h e e p and r a t t i s s u e s ( J a r r e t t & F i l s e l l ,1 9 5 8 ; M c L e a n , 1 9 5 8 a ; G a l l a g h e r & B u t t e r y , 1 9 5 9 ) .

M o r e o v e r , t h e m e t a b o l i s m o f a young lamb more

c l o s e l y r e s e m b l e s t h a t o f a n o n - r u m i n a t i n g a n i m a l

t h a n t h a t o f an a d u l t s h e e p , w h i c h r e l i e s l a r g e l y on

l o w e r f a t t y a c i d s f o r i t s e n e r g y r e q u i r e m e n t s

( J a r r e t t & P o t t e r , 1 9 5 2 , 1 9 5 3 ) .The q u a n t i t a t i v e s i g n i f i c a n c e o f g l u c o s e i n t h e

m e t a b o l i s m o f m a t u r e r u m i n a n t s and t h e i n t e r -r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n g l u c o s e and l o w e r f a t t y a c i d s

h a s s t i l l t o b e e l u c i d a t e d ( L i n d s a y , 1 9 5 9 ; J a r r e t t &

F i l s e l l , 1 9 6 1 ) . S i n c e n i c o t i n a m i d e n u c l e o t i d e c o -

enzymes a r e r e q u i r e d f o r b o t h o x i d a t i v e m e t a -

b o l i s m and r e d u c t i v e s y n t h e s e s , f u r t h e r i n f o r m a -

t i o n i s r e q u i r e d on t h e s u p p l y and demand f o r

t h e s e c o e n z y m e s i n r u m i n a n t s t h a t u s e a c e t a t e

b o t h f o r o x i d a t i v e m e t a b o l i s m and f o r l i p o g e n e s i s

( s e e L i n d s a y , 1 9 5 9 ; A n n i s o n & L i n d s a y , 1 9 6 1 ) .

The r a t e o f s y n t h e s i s and t h e c e l l u l a r c o n c e n -t r a t i o n s o f n i c o t i n a m i d e n u c l e o t i d e c o e n z y m e s i n

t h e l i v e r i n c r e a s e c o n s i d e r a b l y d u r i n g g r o w t h o f

t h e mouse and r a t ( B r a n s t e r & M o r t o n , 1 9 5 6 ;

M o r t o n , 1 9 5 8 ; D a w k i n s , 1 9 5 9 ) , and a p p e a r t o b e

c l o s e l y r e l at e d t o t h e r a t e o f c e l l d i v i s i o n ( M o r t o n ,

1 9 6 1 ) . S i m i l a r i n f o r m a t i o n w i t h r e s p e c t t o r u m i -

n a n t s h a s n o t b e e n a v a i l a b l e .

The c o n c e n t r a t i o n s o f b o t h o x i d i z e d and r e d u c e d

n i c o t i n a m i d e n u c l e o t i d e c o e n z y m e s i n t h e l i v e r s o f

l a m b s and s h e e p , and o f young and mature r a t s ,h a v e n o w b e e n m e a s u r e d . The r e s u l t s a r e d i s c u s s e d

i n r e l a t i o n t o t h e g r o w t h and c h a n g e s i n m e t a b o l i s m

o f t h e s e a ni m al s .

EXPERIMENTAL

Enzyme p r e p a r a t i o n s

I 8 o c i t r a t e d e h y d r o g e n a 8 e . T h i s w a s p r e p a r e d f r o m p i g

h e a r t ( G r a f l i n & O c h o a , 1 9 5 0 ) ; t h e a m m o n i u m s u l p h a t e

f r a c t i o n o b t a i n e d b e t w e e n 5 0 a n d 6 0% s a t u r a t i o n w a s d i s -s o l v e d i n 0 0 4 M - s o d i u m p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ,p H 7 - 4 , d i a l y s e d a g a i n s t t h e s a m e b u f f e r f o r a b o u t 8 h r . a t

0 ° a n d t h e n s to r ed a t - 1 5 ° .

G l u t h a t h i o n e r e d u c t a 8 e . T h i s w a s p r e p a r e d f r o m d r i e d

p e a s ( K a p l a n , C o l o w i c k & N e u f e l d , 1 9 5 3 ) ; t h e a m m o n i u m

s u l p h a t e f r a c t i o n o b t a i n e d b e t w e e n 4 0 a n d 6 0% s a t u r a t i o n

w a s d i s s o l v e d i n 0 - l m - t r i s - H C l b u f f e r , p H 7 5 , a n d s t o r e d

a t -1 5 ° .A l c o h o l d e h y d r o g e n a s e . A 1% ( w / v ) s o l u t i o n o f t h e

c r y s t a l l i n e e n z y m e ( C . F . B o e h r i n g e r u n d S o e h n e , M a n n -

h e i m , G e r m a n y ) w a s u s e d .E n z y m e 8 p e c i f i c i t y . U n d e r t h e c o n d i t i o n s o f a s s a y u s e d

ion-exchange reactions between acid mucopolysaccharides

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