introdução a enzimologia e processos fermentativos
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Msc J.Gabriel Roderjan. Introdução a Enzimologia e Processos fermentativos. Aula 1 e 2 – Farmácia 8ºP 2009. Plano de Trabalho. PROGRAMA TEÓRICO: Plano de trabalho Apresentação da bibliografia; sorteio dos seminários - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Msc J.Gabriel Roderjan
Aula 1 e 2 – Farmácia 8ºP 2009
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Plano de TrabalhoPROGRAMA TEÓRICO:
1. Plano de trabalho Apresentação da bibliografia; sorteio dos seminários
2. Introdução e Histórico; catálise; atividade enzimática; cinética enzimática;
3. Aplicação clínica das enzimas;
4. Microrganismos e Enzimas de importância aos processos fermentativos
5. Obtenção de enzimas e produtos de digestão enzimática
6. Introdução aos processos fermentativos
7. Seminários: Fermentação alcoólica: Aguardentes e outras bebidas
8. Seminários: Fermentação acética: vinagres
9. Seminários: Fermentação alcoólica: cervejas e vinhos
10. Seminários: Fermentação láctica: vegetais
11. Seminários: Fermentação láctica: leite e derivados
12. Seminários: Fermentação láctica: pescados e ensilados
13. Seminários: Processos biotecnológicos
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Aula teórica
Apresentação dos tópicos
Leitura de bibliografia Discussão dos tópicos Perguntas
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Plano de TrabalhoPROGRAMA PRÁTICO:
1. Plano de trabalho de aulas práticas; Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos
2. Obtenção, caracterização e quantificação de enzimas; Biorreatores e transferência de oxigenio em biorreatores
3. Imobilização de enzimas4. Purificação de enzimas5. Preparação para fermentação láctica do leite6. Fermentação láctica: leite7. Preparação para produção de cerveja 8. Fermentação alcoólica: cervejas
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Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos Tutorial Formulação de protocolos de
procedimento; Formulação do plano de ação; Check-list; Documentação e legislação Procedimento operacional padrão Resultados e modificações
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AVALIAÇÕES
AULAS PRÁTICAS
Avaliação de desempenho nas aulas práticas Trabalhos em sala de aula Valor 2,0
PROVAS
1ª prova 1° bimestre - 09/09/2009 - valor 8,0 2ª prova 1°bimestre - 07/10/2009 - valor 8,0 3ª prova 2°bimestre - 04/11/2009 - valor 5,0 4ª avaliação - relatório aulas práticas 2°bimestre - 02/12/2009 - valor 10,0 Provas de 10 à 15 questões, com 1 à 3 questões discursivas
SEMINÁRIOS Trabalho impresso Apresentação Valor 5,0
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BibliografiaLEHNINGER, Albert L.; NELSON, David L.; COX, Michael M. Lehninger princípios de bioquímica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2006.
xxviii, 1202 p. ISBN 85-7378-166-1 (enc.) ALBERTS, Bruce. Fundamentos da biologia celular. Porto Alegre: ArTmed, 2006. 1 v. (várias paginações) ISBN 78-85-363-0679-7 BRUCHMANN, Ernest-Erich. Bioquímica técnica: Ernst-Erich Bruchmann ; traducido por Aurora Perez Torrome. Zaragosa: Acribia,
1980. 233 p. ISBN 84-200-0437-5 LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio; BORZANI, Walter. Tecnologia das fermentações. São Paulo: E. Blücher, c1975. 285 p. AQUARONE, Eugênio; LIMA, Urgel de Almeida; BORZANI, Walter. Alimentos e bebidas produzidos por fermentação. São Paulo: E.
Blücher, 1983. 227 p. (Biotecnologia ; v. 5) CARVALHO, Geraldo Camargo de. Aulas de quimica. São Paulo: Nobel, 1979.v.1 CRUEGER, Wulf; CRUEGER, Anneliese. Biotecnología: manual de microbiología industrial. Zaragosa: Acribia, 1993. 413 p. ISBN 84-
200-0743-9 BORZANI, Walter; LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio. Engenharia bioquímica. São Paulo: E. Blücher, 1975. 300 p.
(Biotecnologia ; v. 3) AMORIM, Henrique Vianna de; LEÃO, Regina Machado. Fermentação alcoólica: ciência e tecnologia. Piracicaba: Fermentec, 2005.
xv, 434 p. ISBN 85-99011-01-04 (enc.)
WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de los enzimas. Zaragosa: Acribia, 1991. 444 p. ISBN 84-200-0705-6
http://www.bireme.br/php/index.phpwww.anvisa.gov.br/www.fda.govwww.biotecnologia.com.br/www.atcc.org/www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme
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Modelo de relatório de seminárioSUMÁRIO1. Introdução2. Aplicação3. Método (como se utiliza e quais vias
bioquímicas envolvidas)4. Organograma (seqüência de eventos)5. Legislação e Controle de qualidade6. Referências7. Anexos
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Aspectos gerais
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Vida= fn(matéria x energia)
Fn é a transformação de partículas, átomos e moléculas;
Reações químicas Estabilidade Conversão da matéria em energia e da
energia em matéria Fonte principal: Sol Meio: água
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Reações químicas
A + B ↔ AB AOH + HB ↔ AB +H2O
Relação entre a constante de equilíbrio e a variação de energia livre de uma reação
S PReação:
Keq = [P]/[S]
G = - RT ln KeqReações com G’ grande e negativo significa que o equilíbrio é favorável à formação dos produtos
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S P
Reação = colisão de moléculas em uma determinada orientação com uma quantidade definida de energia denominada ΔG (energia de ativação do estado de transição ou energia livre de ativação)
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Facilitadores de reação
Catálise = alteração na velocidade da reação
William P. Jencks, article in Advances in Enzymology, 1975
Redução na energia de ativação (ΔG); Sem um catalisador : A + B ↔ AB
em 20 minutos e X de ΔG Com um catalisador : A + B ↔ AB
em 20 milésimos de segundo e X/5 de ΔG
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Tabela da relação entre constante de equilíbrio e energia livre de ativação ΔG
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A velocidade de uma reação e a energia de ativação
a) Reação de 1ª ordem:
b) Reação de 2ª ordem:
V = k [S]
V = k [S1][S2]
k M-1 S-1
Obs. uma pequena diminuição na energia de ativação, corresponde a um grande aumento na velocidade da reação
(uni molecular)
(bi molecular)
A lei de velocidade
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Vantagem da catálise Reação com vários passos: velocidade é
determinada pelo passo com a mais alta ∆G++
Energia de ativação: barreira energética para as reações químicas.
Seletividade celular: reações necessárias para sobrevivência da célula: ∆G++ menores;
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Quem faz a catálise? Catalisador = qualquer molécula que
facilite a reação.
Participa da reação, mas ao final é recuperado de forma a não ser alterado nem consumido na reação.
○ Os reagentes e o catalisador encontram-se na mesma fase, geralmente é líquida;
○ A reação evolui através de espécies intermédios com menor energia de ativação;
○ A reação tem mais do que um passo.
E + S ES EP E + P
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Tipo de catálise
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Biomoléculas e a catálise
○Carboidratos○Lipídeos○Proteínas
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Proteínas funcionais
Seqüência amino acídica é quase infinita Combinação de 20 aminoácidos sem limite
de número e repetições Formação estrutural multivariável Adaptação a vários estados e ambientes
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Enzimas = Proteínas funcionais
Proteínas altamente especializadas com extraordinário poder catalítico.
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As enzimas reduzem a energia de ativação sem alterar a constante de equilíbrio acelerando o processo da reação.
O Estado de Transição de produto e substrato na ausência de um catalisador ou enzima.
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O que há de especializado na função da enzima?
Alto grau de especificidade pelo substrato;
Aceleram as reações;
Atividade depende da temperatura, pH, substrato, co-fatores e produto;
São as principais responsáveis para cada processo bioquímico:
catabolismo e Anabolismo
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O que confere a enzima catalisar reações bioquímicas? Estrutura especializada voltada ao
substrato A forma complementar, carga e
características hidrofílicas/hidrofóbicas, são responsáveis por esta especificidade.
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Catálise enzimática
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O Ajuste Induzido
Mudança conformacional na hexoquinase induzida pela ligação da glicose em seu sítio ativo, faz com que a enzima seja ativada.
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A Enzima é Complementar a seu Substrato no Estado de Transição
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História da EnzimologiaPasteur declarou que "a fermentação alcoólica é
um ato correlacionado com a vida e organização das células do fermento (levedura), e não com a sua morte ou putrefação".
Enzima – do grego ενζυμον, “levedar” ou fermentar – Kuhne 1878;
Buchner provou que extratos de levedura tinham a capacidade de fermentar - 1897
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Histórico Sumner provou que as enzimas
eram proteínas através da cristalização da urease – 1926;
John Northrop e Wendell Meredith Stanley confirmaram as enzimas como proteínas pelo estudo da tripsina, quimotripsina e pepsina – 1930.
Próximo passo é o estudo da catálise enzimática ao nível quântico.
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Especificidade Eficiência
Ação da enzima no substrato é dependente de:
○ Presença de substrato em concentração adequada;
○ pH○ Temperatura○ Concentração de produto;○ Cofatores○ Meio (sólido ou líquido)
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Coenzima: quando o cofator não se liga covalentemente à enzima
Grupo prostético: quando o cofator se liga covalentemente à enzima
COFATORES necessários para o funcionamento da enzima
Holoenzima: enzima + cofator (enzima cataliticamente ativa)
Apoenzima ou apoproteína: refere-se somente a parte protéica da enzima
As enzimas reguladas por modificações não-covalentes são chamadas de alostéricas.
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Cofatores inorgânicos: íons
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A Catálise Enzimática e o Complexo Enzima-Substrato
Quimiotripsina
Sítio ativo – porção da estrutura protéica da enzima onde liga-se o substrato
O centro ativo: região da enzima onde ocorre a catálise
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Coenzimas
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ATP + GLICOSE ADP + GLICOSE-6-FOSFATO
Nome comum da enzima: Hexoquinase
Nome sistemático: ATP:Glicose fosfotransferase
Classificação: E.C.2.7.1.1
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ATP:Glicose fosfotransferase
E.C.2.7.1.1
[EC number]: número de comissão da enzima
2 transferase7 sub-classe: fosfotransferase
1 grupo hidroxil (como grupo aceptor)
1 D- glicose que aceita o grupo fosforil.
Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular.
www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.
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Nomenclatura das enzimasATP:Glicose fosfotransferase
E.C.2.7.1.1[EC number]: número de comissão da enzima
2 transferase
7 sub-classe: fosfotransferase
1 grupo hidroxil (como grupo aceptor)
1 D- glicose que aceita o grupo fosforil.
Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular.
www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.
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Cinética enzimática
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Efeito da Concentração do Substrato na Velocidade Inicial de uma Reação
Enzimática
Equação de Michaelis-Menten
[E] = constante e limitante
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Quando [S] tende a zero(reação de 1ª ordem)
Quando [S] tende para infinito(reação de ordem zero)
Constante de Michaelis-Menten (Km)
É a concentração do substrato [S], quando Vo = Vmax/2
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A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
k1 k2
Modelo Cinético: E + S ES E + P k-1 K-2
Aproximações:
1. Admitindo-se a reação em seu início: k1 k2
E + S ES E + P k-1
2. Considerando-se a segunda etapa como passo limitante, tem-se que a velocidade inicial da reação (Vo) é dada por:
Vo = k2 [ES] (eq. 1)
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A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
3. Considera-se que a concentração de S é muito maior que a de enzima e despreza-se a quantidade de substrato complexada com a enzima, em relação à concentração total de substrato
Note que, numa reação enzimática, a enzima se encontra na forma livre (EL) e na forma complexada com o substrato (ES), daí:
[EL] = [ET] - [ES]
4. Considerando-se estado estacionário, a concentração de ES permanece constante, ou seja, a velocidade de sua formação (Vf) é igual à de seu desaparecimento (Vd)
Vf = k1 [EL][S] ou Vf = k1 ([ET] – [ES]) [S] (eq. 2)
Vd = k2 [ES] + k-1 [ES] ( eq. 3)
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A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN
Igualando a eq. 2 com a eq. 3 e rearranjo os termos, temos:
[ET] [S] [ES] = (eq. 4)
[S] + Km
onde, Km = (k-1+k2)/k1 (Constante de Michaelis-Menten)
Combinando a eq. 1 com a eq. 4, temos: k2[ET] [S] Vmax [S]Vo = ou Vo = [S] + Km [S] + Km
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O gráfico de 1/vo x 1/[S]
A forma dos inversos da equação de Michaelis-Menten ou equação de Lineweaver-Burk
Modo mais correto de se determinar Vmax e Km
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O significado de Km e a afinidade enzimática
Se k2 << k-1, tem-se que Km = k-1/k1 e, portanto a constante de dissociação do complexo ES
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Reações que ocorrem em várias etapas em que o passo EP E + P é o limitante
kcat = k3 e [EP] ~[Et]
Passo limitante
kcat é denominado de número de renovação: equivale ao n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única enzima em uma dada unidade de tempo, quando a enzima está saturada com o substrato
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Para [S] << Km
A Relação kcat/Km
Vo depende da concentração de dois reagentes e o termo kcat/Km é um constante de 2ª ordem. É considerado o melhor parâmetro cinético para comparar eficiência catalítica
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Reações com Dois ou Mais Substratos
(Mecanismo de dupla troca ou pingue-pongue)
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Cinética envolvendo um complexo ternário
Cinética de dupla troca ou pingue-pongue
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Inibição Reversível
KI é a constante de dissociação do complexo EI
a) Inibição Competitiva
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Cinética de uma Inibição
Competitiva
KI é a constante de dissociação do complexo EI
EI E + I
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Não altera a velocidade máxima da reação, porém aumenta a constante de Michaelis-Menten ou seja:
V’max = VmaxK’m > Km
Inibidor Competitivo
Inibição competitiva pode ser revertida por aumentos na concentração do substrato
Admitindo-se que o inverso de Km represente a afinidade enzimática, pode afirmar que este inibidor diminui a afinidade da enzima pelo substrato
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b) Inibição não-competitiva
K’I é a constante de dissociação do complexo ESI
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Cinética de uma Inibição não -competitiva
K’I é a constante de dissociação do complexo ESI
ESI ES + I
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Diminui a velocidade máxima da reação e a constante de Michaelis-Menten ambos por um mesmo valor ’)
V’max < VmaxK’m < Km
Inibidor não-competitivo
Note que independentemente do valor de ’ o coeficiente angular da reta 1/Vo x 1/[S] será sempre o mesmo, daí as retas serem paralelas
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Quando KI = K’I, temos a inibição não competitiva
c) Inibição Mista
K’I é a constante de dissociação
do complexo ESI
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Inibição não competitiva
[I]
1/[S]
1/vo
Sem inibidor
= ’Inibição Mista
(Vmax/ [S[Vo = Km + [S]
- 1/Km
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Inibição Não Competitiva MISTA
Não altera a constante de Michaelis-Menten, porém diminui a velocidade máxima da reação
V’max < Vmax
K’m = Km
Admitindo que o inverso de Km represente a afinidade enzimática, pode afirmar que este inibidor não afeta a afinidade da enzima pelo substrato
Numa inibição mista Vmax diminui e Km aumenta
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Inibição da quimotripsina com o diisopropilfluorofosfato (DIFP), leva à conclusão que a Ser195 é um resíduo chave na catálise
Inibição Irreversível
Inibidores irreversíveis são importantes ferramentas no estudo do mecanismo de uma reação enzimática
Inibidores Suicidas: classe de inibidores irreversíveis pouco reativos, mas que no centro ativo da enzima são modificados e reagem irreversivelmente com a enzima inativando-a. São substâncias utilizadas na industria farmacêutica como remédios ou drogas de poucos efeitos colaterais
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Efeito do pH na Atividade Enzimática
Os grupos laterais dos aminoácidos podem se encontrar com carga positiva, negativa ou neutra, dependendo do pH
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Efeito da Temperatura na Atividade Enzimática
10 20 30 40 50 60 70Temperatura (°C)
Vo
A atividade aumenta com a temperatura até o ponto onde a enzima não se desnatura
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Efeito da Concentração de Enzima na Atividade Enzimática
Concentração de Enzima (mM)
Vo
(mmol/s) [S] em excesso
Se o substrato não estiver em excesso, a velocidade da reação atinge um valor máximo e permanece constante
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As Enzimas Reguladoras
Enzimas que têm sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais
Enzimas Alostéricas: são reguladas por ligações não covalentes
1º Tipo:
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A Aspartato Transcarbamilase
R
R (2 cadeias)
R
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Inibição por Retroalimentação ou Feedback da Conversão de L-Treonina em L-Isoleucina
E1 é a enzima desidratase da L-treonina, que é inibida de forma alostérica por L-isoleucina
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Cinética Sigmoidal das Enzimas Alostéricas
O substrato é um modulador positivo
Com um modulador positivo e um ne-gativo, sem alterar Vmax
Com um modulador negativo que não altera K0,5
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Algumas Enzimas Reguladoras Sofrem Modificações Covalentes
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Regulação Covalente da Fosforilase do Glicogênio
Regulação alostérica por AMP (secundária)
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Ser-P
Ser-P
AMP
AMP
glicose
Piridoxal-P
Piridoxal-P
glicose
![Page 72: Introdução a Enzimologia e Processos fermentativos](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022081416/56814e52550346895dbbe048/html5/thumbnails/72.jpg)
Regulação enzimática por clivagem proteolítica
Ativação do zimogênio por clivagem proteolítica
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Estrutura da quimiotripsina