inmunoterapia: células dendríticas
TRANSCRIPT
INMUNOTERAPIA : VACUNAS ANTITUMORALES
BASADAS EN CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCs)
INTRODUCCIÓN
• Inmunoterapia y vacunas antitumorales
• Células Dendríticas (DCs)
• PROYECTO
INMUNOTERAPIA
• Es un tratamiento el cual intenta estimular
el S.I. a cualquier persona o paciente.
VACUNAS
• VACUNAS son procedimientos efectivos que se basan en generar y expandir poblaciones de linfocitos (T y B) contra un antígeno e inducir memoria a largo plazo.
• Preventiva/Terapéutica.
INMUNOTERAPIA
• Para aplicar este tipo de tratamiento necesitamos un antígeno.
• En tumores, estos son Antígenos Asociados a Tumor (AATs)
• AATs tienen expresión aumentada o disminuida de algunas proteínas normales, reprimidas o alteradas
• En menor frec. estos AATs derivan de prot. mutadas
TIPOS DE VACUNAS ANTITUMORALES
• PASIVA introduce anticuerpos contra estos AATs
• ACTIVA se introducen los AATs de diferentes formas
ACTIVA
• 1- Proteínas o péptidos solubles
• 2- Virus recombinantes o bacterias como vectores de portadoes de AATs.
• 3- Inyección de DNA desnudo o acomplejado con liposomas catiónicos (que codifican para AATs)
• 4- Células tumorales modificadas genéticamente para poder expresar moléculas coestimuladoras y/o citoquinas
• 5- DCs son CPA cargadas con AATs o transducidas con genes específicos de tumor
INMUNOTERAPIA VENTAJAS INCONVENIENTES
• Específica (va a céls tumorales )
• Muy destructiva • Pacientes sin recaídas
• Tratamiento complementario • No todos los tumores tienen
AATs• Substancias inmunosupreso-
ras • Ausencia de diferentes moléc
de membrana, como de adhesión, coestimuladoras, HLA,
CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCs)
• DCs fueron descubiertas en 1868 en la epidermis
• En 1973 se identificaron en otros tejidos (se han identificado en todos los tejidos excepto en testículo y cerebro)
• Forman parte del sistema linfohematopoyético y su función era de centinela y iniciador de la respuesta inmunológica
OBTENCIÓN DE DCs
• 1. Sangre Periférica y en Tejidos (0.1-1%)• Se pueden diferenciar de SP a partir de
MONOCITOS
• 2.Células Progenitoras Hematopoyéticas• Médula Osea• Cordón Umbilical
BIOLOGIA DE LAS DCs
1. Céls progenitoras
2.Precursores de sangre
3. DCs inmaduras
4. DCs maduras
Estados Maduración
FUNCIONES DE DCs
• (Depende del estado de maduración)
• 1. CAPTURAR ANTÍGENOS (en tejido) y PROCESARLO
• 2. PRESENTAR EFICIENTEMENTE A LOS LINFOCITOS (estos antígenos en órganos linfoides secundarios) y INICIAR LA EXPANSIÓN Y MADURACIÓN DE LOS LINFOCITOS
DCs
Linfocitos
Células con igual antígeno
Presentación del antígeno
Proliferación de linfocitos
Transducción
”buffy-coat”
CA(monocitos)CnA(linfocitos)
DCimmaduras
DCmadurasLinfocitos
CMNs
Purificación con gradiente de densidad
Purificación por el método de adhesión al plástico
Congelación
Descongelac
+ IL-2
IL-4 + GM-CSF
Transducción Ad- GFP/GAL TNF- +
GM-CSF
Linfocitos sin pre-est.(0)Linfocitos pre-est. GFPlinfocitos pre-est. GAL
Linfocitos DCs transducidas HeLas-
HeLas sin transducirHeLas transducidas con GFPHeLas transducidas con GAL
Ensayo de proliferación con timidina tritiada
Los linfocitos pre-estimulados con un antígeno (GFP o GAL) se activan y PROLIFERAN al reconocer a este antígeno al cual esta pre-estimulado
Transducción
Ad-GFP/GAL
“Buffy-coat”
CMNs
CnA(linfocitos) CA (monocitos)
Purificación por método de gradiente de densidad
Purificación por método deadhesión al plástico
R6
Proporción de CD14 positivo
Resultados
(%)
CMNs
Céls no
adherentes
Céls
adherentes
Marcador de
CD45 89.22 80.48 97.39 Todos los leucocitos
CD14 32.00 22.03 64.28
Monocitos (alta intensidad) y
granulocitos (baja intensidad)
CD1a 0.12 0.02 0.02 DCs immaduras
CD83 0.08 0.02 0.04 DCs maduras
CD4 16.86 14.38 6.88 Linfocitos Thelper
CD8 19.39 9.30 4.67 Linfocitos Tcitotóxicos , NK y B
Monos 11.64
6.80 52.94 Intersección entre CD14 + y el
gate por tamaño de la población
de monocitos
Porcentaje de células positivas para marcadores celulares
CA (Monocitos)
DCs inmaduras
DCs maduras
IL-4 + GM-CSF
Transducción
TNF- + GM-CSF
CD14 CD1a CD83 CD8
Céls no transducidas
Céls transducidas con
Ad-GFP
Céls transducidas con
Ad-Gal
7.65
6.76
5.47
18.67
15.87
12.08
3.93
5.33
6.20
4.25
3.51
5.53
Porcentaje de células positivas para marcadores celulares
R2 R2
R3
Transducción con Ad-, Ad-GFP y Ad-GAL
DCs
HeLas
2.91% 17.34% 3.16%
2.96% 79.99% 88.17%
Linfocitos sin pre-est.(0)Linfocitos pre-est. GFPlinfocitos pre-est. GAL
Linfocitos DCs transducidas HeLas-
HeLas sin transducirHeLas transducidas con GFPHeLas transducidas con GAL
Ensayo de proliferación
Transducción
Ad-GFP/GAL
Objectivos de la proliferación
1. Observar que a mayor nº estimuladoras mayor proliferación.
Ratios (proporción de respondedoras:estimuladoras) cuando aumenta la ratio disminuye el nº de HeLas, el nº de linfocitoses siempre constante
2. Observar que cuando enfrentamos respondedoras (linfocitos) con estimuladoras (HeLas) de la misma expresión (GFP-GFP y GAL-GAL) tendríamos que observar mayor proliferación de estos linfocitos
0,00
2000,00
4000,00
6000,00
8000,00
10000,00
12000,00
14000,00
16000,00
18000,00
2,5:1 5:01 10:01 20:01 40:01 80:1
RATIOS Respondedoras:Estimuladoras
CP
M HeLa0Linfocitos 0
HeLa0LinfocitosGFPHeLa0LinfocitosbGAL 0,00
2000,00
4000,00
6000,00
8000,00
10000,00
12000,00
14000,00
16000,00
18000,00
RATIOS Respondedoras:Estimuladoras
CP
M
HelaGFP Linfocitos 0
HelaGFP Linfocitos GFP
HelaGFP LinfocitosbGAL
0,00
2000,00
4000,00
6000,00
8000,00
10000,00
12000,00
14000,00
16000,00
18000,00
RATIOS Respondedoras:Estimuladoras
CP
M
HeLAbGAL Linfocitos0
HeLAbGAL LinfocitosGFP
HeLAbGAL LinfocitosbGAL
0,00
2000,00
4000,00
6000,00
8000,00
10000,00
12000,00
14000,00
16000,00
18000,00
Linfos 0 Linfos GFP
Control +(PHA)
Control -(Medio)
HeLas sin transducir HeLas transducidas con GFP
HeLas transducidas con GAL Control negativo/positivo
HeLas sin trasducir
Linfocitos sinpre-estimular
Linfocitos pre-esti-mulados GFP
Linfocitos pre-esti-mulados GAL
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
4000,00
5000,00
6000,00
7000,00
8000,00
Proprocion Respondedoras:Estimuladoras
CP
M
HeLa0 Linfocitos 0
HeLa0 Linfocitos GFP
HeLa0 Linfocitos bGAL
HeLas transducidas con GFP
Linfocitos sinpre-estimular
Linfocitos pre-estimulados con GFP
Linfocitos pre-estimulados con GAL
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
4000,00
5000,00
6000,00
7000,00
8000,00
Proporcion Respondedoras:EStimuladoras
CP
M
HelaGFP Linfocitos 0
HelaGFP Linfocitos GFP
HelaGFP LinfocitosbGAL
HeLas transducidas con GAL
Linfocitos sin pre-estimularLinfocitos pre-estimulados con GFP
Linfocitos pre-estimulados con GAL
0,00
1000,00
2000,00
3000,00
4000,00
5000,00
6000,00
7000,00
8000,00
Proporcion Respondedoras: Estimuladoras
CP
M
HeLAbGAL Linfocitos0
HeLAbGAL LinfocitosGFP
HeLAbGAL LinfocitosbGAL
CONCLUSIONES (1)
• 1. Intentar ajustar el método de transducción de DCs para obtener mayor nº de células transducidas.
• 2. Repetir el experimento de proliferación para ver si los datos son reproducibles.
CONCLUSIONES (2)
• 3. En el control negativo observamos proliferación. Esto nos sugiere que estos linfocitos estan pre-estimulados contra antígenos de SBF (suero bovino fetal).
CONCLUSIONES (3)
• 4. Cuanto menor nº de estimuladoras mayor proliferación nos podría indicar que estas (HeLas) estan sintetizando substancias inhibitorias. Por tanto, cuanto mayor nº de HeLas más concentración de estas substancias y menor
proliferación. Para comprobar esta hipotesis podríamos coger SN del cultivo de HeLas y poner diferentes concentraciones y hacer crecer los linfocitos.
CONCLUSIONES (4)
• 5. Las HeLas por si solas tendrían que producir una reacción alogénica. Para evitar esto se podrían guardar células del donante y utilizarlas como céls estimuladoras.
• 6. Para evitar la problématica de si la reacción ha sido contra adenovirus o contra gen podríamos transducir las células estimuladoras con otro vector (retrovirus, electroporación,...)