inmunoensayos 6
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Dra. Gabriela Villarreal Levy Dra. Gabriela Villarreal Levy Directora de Educación Médica Continua y Extensión, Escuela de MedicinaDirectora de Educación Médica Continua y Extensión, Escuela de Medicina
Dr. Jorge SantiagoDr. Jorge SantiagoOCD Professional Education Manager Latin AmericaOCD Professional Education Manager Latin America
Inmunoensayos
Son ensayos de laboratorio que permiten la detección de pequeñas concentraciones de metabolitos.
En los inmunoensayos se utilizan antígenos o anticuerpos para el reconocimiento de la molécula que se desea medir.
Los diferentes tipos de inmunoensayos se diferencian en como se revela que la unión Ag-Ab se produjo.
Los inmunoensayos pueden clasificarse de distintas maneras, por ejemplo:
De acuerdo a como se desarrolla la reacción:
• En fase homogénea(Inmunoturbidimetría, EMIT, etc.)
• En fase heterogénea(Latex, ELISA, etc.)
Inmunoensayos
Inmunoensayos
Otra opción es clasificarlos de acuerdo a como se expresan los resultados:
• CuantitativosEl resultado obtenido indica una concentración
• Cualitativos o Cut-0ffEl resultado obtenido indica sólo la presencia o ausencia de la molécula buscada
Los ensayos Cut-off Inmunoensayos
Núm
ero
de in
divi
duos
Señal
Población sana
Infectados
Falsos Negativos
Falsos Positivos
Verdaderos Positivos
Verdaderos Negativos
Valor Cut-off
Especificidad
En los inmunoensayos la especificidad está dada por la especificidad de la reacción Ag-Ab misma.
Está asociada al porcentaje de falsos positivos (FP) que se obtienen con una determinada técnica.
Los ensayos Cut-off Inmunoensayos
Presente Ausente
Infección
Positivo
Negativo
Resultado
VP FP
FN VN
Especificidad
La especificidad se expresa como:
Presente Ausente
Infección
VP FP
FN VN
Positivo
Negativo
Resultado
E = VN
VN + FP
Sensibilidad
Indica la mínima concentración que una determinada técnica permite medir de un determinado metabolito.
Debe adecuarse a las concentraciones que dicho metabolito tiene en el fluído biológico en los que se desea realizar la medición.
Sensibilidad
En los inmunoensayos la sensibilidad está determinada por la marca que permite revelar la reacción Ag-Ab.
Está asociada al porcentaje de falsos negativos (FN) que se obtienen con una determinada técnica.
Sensibilidad
La sensibilidad se expresa como:
Presente Ausente
Infección
VP FP
FN VN
Positivo
Negativo
Resultado
S = VP
VP + FN
Precisión y exactitud
Valor verdadero
Medición exacta pero no precisa
Medición precisa pero no exacta
Valor verdadero
Precisión y exactitud
Un sistema ideal de medición sería aquel que mida siempre el valor verdadero, por supuesto ese sistema no existe.
¿Qué es más importante en el laboratorio?¿La precisión o la exactitud?
Precisión y exactitud
Un sistema ideal de medición sería aquel que mida siempre el valor verdadero, por supuesto ese sistema no existe.
¿Qué es más importante en el laboratorio?¿La precisión o la exactitud?
Obviamente la precisión.
Precisión y exactitud
Por definición la exactitud es una medida de cuánto se acerca la media de las mediciones realizadas, al valor verdadero.
Más aún. ¿Existe en realidad la exactitud?
Pero el valor verdadero es imposible conocerlo, por lo tanto la exactitud tiene sólo un valor teórico.
Precisión y exactitud
En los análisis biológicos no importan tanto los valores absolutos de concentración sino la concentración que un determinado metabolito presenta frente a su rango de referencia.
Si bien las calibraciones de los ensayos se realizan contra standards internacionales, cada técnica presenta su propio rango de referencia.
Precisión y exactitud
Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva
0
50
100
150
200
250
Access Vitros DELFIA ACS 180 Immulite Axsym Elecsys
Prolactina (ng/ml)
98.6
216.2
ECi
Precisión y exactitud
3.66 1.30 1.66 3.48 1.51 5.70 2.47Coef. Variación %
Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva
0
50
100
150
200
250
Access VitrosECi
DELFIA ACS 180 Immulite Axsym Elecsys
Prolactina (ng/ml)
98.6
216.2
Inmunoensayos más habituales
• Radioinmunoensayo (RIA)
• Enzimoinmunoensayo (EIA)
• Quimioluminiscencia (QL)
Radioinmunoensayo
El marcador es un átomo radioactivo. En general se usa 125I, aunque también se utiliza el tritio (3H).La lectura se realiza midiendo la cantidad de radioactividad en un contador de pozo.
Problemas:- Son lentos- Son difíciles de automatizar- Tienen requerimientos regulatorios
Enzimoinmunoensayo
El marcador es una molécula de enzima (en general peroxidasa). La enzima actúa sobre un sustrato cuyo producto final es coloreado.La medición se realiza en un espectrofotómetro común.
Problemas:- Son Poco sensibles
Quimioluminiscencia
Es la última tecnología desarrollada.El marcador es una molécula c|apaz de emitir luz (en general luminol o ésteres de acridina).
Existen 4 generaciones de reactivos diferentes:
1) Quimioluminiscencia directa2) Quimioluminiscencia indirecta3) Electroquimioluminiscencia4) Quimioluminiscencia amplificada
Quimioluminiscencia directa
En esta técnica el anticuerpo está marcado directamente con la molécula luminiscente.Por lo tanto, por cada anticuerpo marcado se emiten una cantidad limitada de fotones.
Luz
Tiempo
Quimioluminiscencia indirecta
Luz
Tiempo
Funciona de manera similar al EIA. El anticuerpo está marcado con una enzima, ésta actúa sobre un sustrato que es el que emite la luz. Por cada anticuerpo marcado se obtienen muchos fotones.
Electroquimioluminiscencia
Luz
Tiempo
El anticuerpo queda marcado con un complejo Ru-TPA (Tripropilamina) Este complejo emite luz sólo cuando es activado eléctricamente. La energía necesaria para la emisión es provista externamente.
Quimioluminiscencia amplificada
Luz
Tiempo
Es una quimioluminiscencia indirecta.También acá vamos a tener una enzima que va a actuar sobre un sustrato que es el que va a emitir luz, pero hay una molécula que acelera la reacción entre la enzima y el sustrato.
Quimioluminiscencia amplificada
Luz
Tiempo
Es una quimioluminiscencia indirecta.También acá vamos a tener una enzima que va a actuar sobre un sustrato que es el que va a emitir luz, pero hay una molécula que acelera la reacción entre la enzima y el sustrato.
Quimioluminiscencia amplificadaMecanismo de reacción
HRPAg
H2O2
H2O
LUZ
COOH
NH2
COO-
N2Acido 3-aminoftálico
+N
NH2 O •
NH •
NH •
O •
NH2
O •
O •
N •
N •
NH2
O •
O •
HOO-
N
• •
Luminol
(+e)
Quimioluminiscencia amplificadaMecanismo de reacción
HRPAg
H2O2
H2O
LUZ
COOH
NH2
COO-
N2Acido 3-aminoftálico
+N
NH2 O •
NH •
NH •
O •
NH2
O •
O •
N •
N •
NH2
O •
O •
HOO-
N
• •
Luminol
(+e)(+e)
NHCOCH3
NHCOCH3
O •
OH
Cl
Cl
(-e)
Potenciador
Quimioluminiscencia amplificadaCaracterísticas
• Es la última tecnología de quimioluminiscencia desarrollada
• El potenciador multiplica la velocidad de la reacción entre la enzima y el sustrato por un factor de 103
• El sustrato se mantiene emitiendo luz durante 4 horas sin que se pueda detectar una caída en la emisión
• La emisión de luz es 106 veces más brillante que en la quimioluminiscencia directa
• Presenta sensibilidades y rangos dinámicos máximos
Comparación de sensibilidadesSensibilidad
Límite mínimo de detección / moles de marcador
Mét
odo
de d
etec
ción
10-14 10-1910-17 10-1810-16 10-20 10-2110-15
EIA
FPIA
Radioinmunoensayo
Quimiolumiscencia indirecta
Comparación de sensibilidadesSensibilidad
Límite mínimo de detección / moles de marcador
Mét
odo
de d
etec
ción
10-14 10-1910-17 10-1810-16 10-20 10-2110-15
EIA
FPIA
Radioinmunoensayo
Quimiolumiscencia indirecta
Quimiolumiscencia amplificada
Especificidad
Tal como dijimos, en los inmunoensayos la especificidad la aporta la reacción antígeno-anticuerpo misma.
Este tipo de reacciones son altamente específicas, pero con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales esta especificidad ha llegado a niveles sencillamente exquisitos.
Precisión
Concentración
Luz emitidaQuimioluminiscencia amplificada
Quimioluminiscencia directa
Indeterminacionesdebidas al
instrumento
Indeterminacionesen la medición
final
Los ensayos Cut-off Inmunoensayos
Núm
ero
de in
divi
duos
Señal
Población sana
Infectados
Falsos Negativos
Falsos Positivos
Verdaderos Positivos
Verdaderos Negativos
Valor Cut-off
Distribución de resultadosELISA anti-HCV
n = 1229 pacientes
Pacie
nte
s n
o
reacti
vos
Pacie
nte
s re
activ
os
Relación de positividad0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2,0 3.0 5.0 10 15 20 25 30 >30
200
400
600
800
1000
0
1200
100
200
300
0
500
400
704
67
578
253
13691
44 25 19
439
190
1521
41
n = 1229 pacientes
Pacie
nte
s n
o
reacti
vos
Pacie
nte
s re
activ
os
Relación de positividad0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2,0 3.0 5.0 10 15 20 25 30 >30
200
400
600
800
1000
0
1200
100
200
300
0
500
400
88
671
30 24 9 6 3
143
305
145
185
1101
2 6 817
48
Distribución de resultadosVitros anti-HCV
n = 1229 pacientes
Pacie
nte
s n
o
reacti
vos
Pacie
nte
s re
activ
os
Relación de positividad0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2,0 3.0 5.0 10 15 20 25 30 >30
200
400
600
800
1000
0
1200
100
200
300
0
500
400
Distribución de resultadosanti-HCV
MEIA anti-HIVDistribución de resultados
310
2
367
5010 1 1 1 1 1
3 25
88
23
n = 865 pacientes
Pacie
nte
s n
o
reacti
vos
Pacie
nte
s re
activ
os
Relación de positividad
20
40
60
80
0
100
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 40 60 >60
100
200
300
400
500
0
600
700
800
Distribución de resultadosVitros anti-HIV
n = 865 pacientes
Pacie
nte
s n
o
reacti
vos
Pacie
nte
s re
activ
os
Relación de positividad
20
40
60
80
0
100
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 40 60 >60
100
200
300
400
500
0
600
700
800 716
19 2 2 21 2
33
69
19
Distribución de resultadosanti-HIV
n = 865 pacientes
Pacie
nte
s n
o
reacti
vos
Pacie
nte
s re
activ
os
Relación de positividad
20
40
60
80
0
100
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 40 60 >60
100
200
300
400
500
0
600
700
800
MEIA HBsAgDistribución de resultados
Pacie
nte
s n
o
reacti
vos
Pacie
nte
s re
activ
os
Relación de positividad
20
40
60
80
0
100
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 100 200 >200
100
200
300
400
500
0
600
700
800 n = 1208 pacientes
383
386
491
155
327 2 2 1 3 3 3 3
58
21
Distribución de resultadosVitros HBsAg
Pacie
nte
s n
o
reacti
vos
Pacie
nte
s re
activ
os
Relación de positividad
20
40
60
80
0
100
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 100 200 >200
100
200
300
400
500
0
600
700
800 n = 1208 pacientes
190
765
133
15 5 4 1 1 13
1 25
2
80
Distribución de resultadosHBsAg
Pacie
nte
s n
o
reacti
vos
Pacie
nte
s re
activ
os
Relación de positividad
20
40
60
80
0
100
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 100 200 >200
100
200
300
400
500
0
600
700
800 n = 1208 pacientes
HIVLas principales proteínas
SIDA, 1996-2000, REVISIÓN, Septiembre 1998
gp160
gp120
gp41
p55
p40
p24
p17
p66
p51
p31
Denominación
Precursora de envoltura
Glucoproteína externa
Glucoproteína transmembrana
Precursora del core
Proteína principal
Proteína de la matriz
Transcriptasa inversa
Endonucleasa
Proteína
env
gag
pol
Gen
HIVEl diagnóstico de la infección
“No existe ninguna manifestación clínica que sea característica de la infección VIH o del SIDA y, aunque la presencia de alguna de ellas puedan sugerir en un contexto determinado la presencia de la infección, no es posible establecer un diagnóstico clínico de la enfermedad por lo que éste solo se puede establecer de un modo definitivo por técnicas de laboratorio” (1)
(1) SIDA, 1996-2000, REVISIÓN, Septiembre 1998
Técnicas inmunométricasPrimera generación
• Detección de anticuerpos mediante EIA indirecto con antígeno obtenido de lisado vírico y anticuerpos policlonales
Fasesólida
Antígeno proveniente de lisado vírico
Anti-inmunoglobulina humana policlonalconjugada
Muestra del paciente
Técnicas inmunométricasSegunda generación
• Detección de anticuerpos mediante EIA indirecto con antígeno obtenido de lisado vírico y anticuerpos monoclonales
Antígeno proveniente de lisado vírico
Muestra del paciente
Anti-inmunoglobulina humana monoclonalconjugada
Fasesólida
Técnicas inmunométricasTercera generación
• Detección de anticuerpos mediante EIA tipo sandwich o de inmunocaptura, con antígeno obtenido de proteínas recombinantes y/o péptidos sintéticos y detección conjunta de anticuerpos específicos IgG, IgM e IgA
Antígeno recombinante Muestra del
paciente
Anti-inmunoglobulina humana monoclonalconjugada
Fasesólida
Métodos directos
• Cultivo viral
• Detección de antigenemia (p24) (ELISA)
• Detección molecular de DNA provírico o RNA vírico
Miden en forma directa algún componente de la estructura viral
El período ventana
• Uno de los principales desafíos que presenta el diagnóstico del HIV en banco de sangre es el período ventana
• Este período es el lapso que transcurre desde el momento de la infección hasta el momento de la aparición de algún marcador medible
• Obviamente los primeros marcadores que pueden encontrarse son los antígenos virales, en particular la proteína p24
• Al aparecer los anticuerpos anti-p24 la proteína se hace indetectable pues queda enmascarada formando parte de complejos inmunes
Marcadores en la infección por HIV
HIV RNA
Ag p24
Ab anti-p24
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Días
Ag / Ab
Día 11 Día 16 Día 22
G. Contreras Carrasco, Sociedad Española Interdiciplinaria del SIDA, Volumen 14, Número 3, Marzo 2003
El período ventana
• De acuerdo al gráfico precedente la determinación conjunta de p24 y anticuerpos anti-HIV permitiría la reducción del período ventana en poco menos de una semana
• Por esta razón muchas legislaciones en el mundo comenzaron a exigir la determinación tanto de Ag como de Ab como métodos de screening
• Es decir que a cada donante se le deberán realizar dos ensayos inmunométricos en lugar de uno, lo cual conlleva un mayor gasto y una mayor complejidad desde le punto de vista operativo
Pruebas de cuarta generación
• Desde el año 1997 se encuentran disponibles en el mercado los ensayos inmunométricos llamados de “cuarta generación”
• Estos ensayos permiten la determinación simultánea de Ag p24 y anticuerpos anti-HIV con el objetivo de bajar el período ventana pero mediante un solo ensayo
• De esta manera se solucionarían los problemas de tipo económico y operativos
Pruebas de cuarta generaciónEstrategia
Detección de Ag
Detección de Ab
p24
Anti-inmunoglobulina humana monoclonalconjugada
Anti-p24monoclonalconjugada
Anti-p24monoclonal
Muestra del paciente
Antígeno recombinante
Pruebas de cuarta generación
• La principal pregunta que debemos hacer ahora es si realmente consiguen el objetivo buscado
• Lo que claramente se observa es una pérdida de sensibilidad para los dos tipos de moléculas que se están midiendo, es decir tanto para p24 como para los anticuerpos
• En los ensayos tipo sandwich la sensibilidad viene determinada, entre otros factores, por la cantidad de sitios activos, por unidad de superficie, presentes en la fase sólida
La sensibilidadDistribución de sitios en la fase sólida
Medición de Ag p24 (kits de tercera generación)
Medición de Abs (kits de tercera generación)
Medición de Ag p24 y Abs (kits de cuarta generación)
Pruebas de cuarta generación
• “Se han realizado estudios que vienen a demostrar que estos equipos, unos más que otros, tienen ciertos inconvenientes que plantean limitaciones para su uso rutinario en el diagnóstico de la infección. Por un lado, en relación con la sensibilidad, se ha visto que en algunos de ellos el límite de detección para el antígeno p24 está en 20 pg/ml, mientras que para los convencionales de tercera generación está en 3-5 pg/ml. Por otro lado, los anticuerpos pueden perder hasta la tercera parte de su capacidad de unión con los antígenos.” (1)
(1) G. Contreras Carrasco, Sociedad Española Interdiciplinaria del SIDA, Volumen 14, Número 3, Marzo 2003
Pruebas de cuarta generación
• “Estos ensayos pierden algo de sensibilidad analítica en cada uno de sus componentes, de modo que el umbral de detección de antígeno es mayor, y lo mismo ocurre con los anticuerpos, observándose una reducción en la señal de reactividad en las muestras en las que el antígeno desciende o desaparece.” (1)
(1) Diagnóstico de la Infección por el VIH, Manuel Rodriguez Iglesias y Alberto Terrón Pernía
Marcadores en la infección por HIV
HIV RNA
Ag p24
Ab anti-p24
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Días
Ag / Ab
Detección de p24
Detección de anticuerpos
Umbral
Kits de tercera generación
Períodoventana
Marcadores en la infección por HIV
HIV RNA
Ag p24
Ab anti-p24
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Días
Ag / Ab
Detección de anticuerpos
Detección de p24
Umbral
Kits de cuarta generación
Marcadores en la infección por HIV
HIV RNA
Ag p24
Ab anti-p24
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Días
Ag / Ab
Detección de anticuerpos
Detección de p24
Umbral
Primeraventana
Kits de cuarta generación
Marcadores en la infección por HIV
HIV RNA
Ag p24
Ab anti-p24
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Días
Ag / Ab
Detección de anticuerpos
Detección de p24
Segundaventana
Umbral
Primeraventana
Kits de cuarta generación
Pruebas de cuarta generación
• Esto implica un acortamiento del período de detección del Ag p24
• Consecuentemente también se demora la detección de los anticuerpos anti-HIV
(1) Meier T. et al.; J Clin Virol. 2001 Dec;23(1-2):113-6(2) Speers D. et al.; J Clin Microbiol. 2005 Oct;43(10):5397-9
• El primer hallazgo interesante, al utilizar los ensayos de cuarta generación, es la aparición de un segundo período ventana (1), (2)
Pruebas de cuarta generación
• (1) “Frente a paneles de seroconversión no todos los ensayos tuvieron la misma performance, habiendo diferencias en días al tiempo de obtener el primer resultado positivo (2). Al ensayar los ELISAs frente a muestras clínicas provenientes de pacientes en seroconversión hemos detectado que la mayor diferencia entre ellos es su sensibilidad para antígeno p24, en donde muestras antígeno p24 reactivo y anticuerpos negativo por ensayos de tercera generación, no fueron detectadas por algún ensayo de cuarta generación.” (3)
(1) María Belén Bouzas; Infección por HIV: Una revisión sobre la tecnología en diagnóstico(2) Thoai D.L. et al.; J. Clin. Microbio. 2001; 39:3122-3128 (3) Zapiola I. et al.; The 14 International AIDS Conference. Barcelona. July 2002.
Pruebas de cuarta generación
• El número de donantes que pudieran ser detectados durante el período de detección de la proteína p24 es extremadamente bajo
• Peor aún es el hecho de no saber realmente que cantidad de pacientes caen en esa segunda ventana inmunológica, puesto que al ser negativos no se les requiere ningún ensayo posterior
• Estas razones han hecho que este tipo de ensayos prácticamente no sean utilizados
Producción y transmisión a cargo de la
Universidad Virtualdel Tecnológico
de Monterrey.
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de Monterrey.
D. R. © Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey,
Eugenio Garza Sada 2501, Col. Tecnológico,
Monterrey, N.L., C.P. 64849 México 2007
D. R. © Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey,
Eugenio Garza Sada 2501, Col. Tecnológico,
Monterrey, N.L., C.P. 64849 México 2007
“Se prohibe la reproducción totalo parcial de este documento por cualquier medio sin el previo y expreso consentimiento por escrito del ITESM”.
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