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INGENIERÍA GENÉTICA
Clonación molecular
Clonar significa hacer copias idénticas
Este término originalmente fue aplicado al procedimiento de aislar
una célula y permitirle reproducirse creando una población de
células idénticas
Actualmente, la clonación molecular involucra la separación de un
fragmento de DNA específico, unirlo a una pequeña molécula de
DNA acarreador y luego replicar este DNA modificado miles o
millones de veces mediante el incremento en el número de células
así como por al aumento en el número de copias del DNA clonado
en cada célula
El resultado es una amplificación selectiva de un gen o segmento
de DNA en particular
1
5
4
3
2
in a selective medium
1. Aislamiento del DNA a
clonar y purificación del
vector molecular
2. Corte del DNA usando
enzimas de restricción
3. Unión del DNA exógeno
en el vector molecular
4. Introducción del DNA
recombinante en un
organismo para su
amplificación
5. Selección de las células
que contienen el DNA
recombinante
La clonación molecular
involucra los siguientes
pasos
AISLAMIENTO DE DNA
Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes
(detergentes, proteasas, cambios de presión)
Separación del DNA del resto de los componentes celulares
(principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas, solventes (fenol-
cloroformo)
Repetir la extracción. Eliminación del fenol
Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o isopropanol
Disolver el DNA (se concentra)
Análisis del DNA
Análisis de ácidos nucléicos por espectrofotometría
Espectro de absorción de
DNA
Estimación de la concentración
de A.N. por espectrofotometría
A260 = 1
50 g/ml DNA dc
33 g/ml DNA cs
40 g/ml RNA
También se mide la relación de
abs.
A260/ A280 => 1.8-2.0
Análisis electroforético de ácidos nucléicos
Separación en geles de agarosa (1–4%)
Electroforesis horizontal.
Migran al ánodo
Tinción con bromuro de etidio o Sybr safe
Intercala entre las bases del DNA
Forman complejos fluorescentes
Separación
electroforética de
moléculas de DNA
(A) Geles de secuenciación (separación
de bandas con 1 nt de diferencia)
(B) Electroforesis para RFLP (separación
entre 100 a 10,000 nt)
(C) Electroforesis de campo pulsante
(separación de DNA cromosomal)
+
––
–
+
+
Las enzimas de restricción
reconocen secuencias
específicas de DNA y cortan en
esos sitios
•Son purificadas de bacterias
•Las enzimas de restricción son
endonucleasas
•Rompen en sitios específicos del DNA
•Reconocen secuencias palindrómicas
específicas de 4, 6, u 8 pb.
•Algunas generan extremos romos y
otras generan extremos cohesivos,
éstos pueden ser:
- 5’ protruyentes
- 3’ protruyentes
El corte del DNA con enzimas de restricción
Análisis
genera extremos
romos
5’ protruyentes
5’ protruyentes
3’ protruyentes
Las enzimas de restricción fueron aisladas de bacterias; su
función natural es proteger contra DNA extraño
DNA de un plásmido
digerido con EcoRI
DNA genómico digerido
con EcoRI
Extremos son compatibles
Las bases de los extremos cohesivos se aparean, aunque quedan
sin unir covalentemente
Las enzimas de restricción cortan dejando extremos
cohesivos (sticky) que pueden asociarse con otros
semejantes
Vectores de clonación
Plásmidos
Se pueden clonar
fragmentos entre 1,000 y
10,000 nucleótidos
DNA doble cadena,
circular, origen propio
de replicación
Marcadores de resistencia a
antibióticosPermiten la selección de bacterias
transformadas con el plásmido o
con el DNA recombinante
Origen de replicaciónPermite que la molécula
se replique en un cierto
tipo de célula
Características
de los plásmidos
Características
de los plásmidosSitio múltiple de
clonación:Sitios reconocidos por
diferentes enzimas de
restricción que solo cortan
una vez en el plásmido
Off
Operon Lac : regulación de la expresión de lacZ
On
Inductor MonodJacob
IPTG:
Inductor
gratuito
-gal
color azul
Cuando se cultivan colonias silvestres (wild type) en presencia de X-gal y se
induce la expresión de galactosidasa con un inductor gratuito, el X-gal es
cortado produciendo un pigmento azul, y por lo tanto las colonias son azules.
LB-agar IPTG + X-gal
Resultado de romper el X-gal
El gen lacZ tiene dos
mutantes: M15 y
péptido que no son
capaces de producir
galactosidasa activa
Fenotipos de los mutantes lacZ en X-galSin embargo, cuando estos
dos genes mutados se
encuentran en una misma
célula, el péptido se
combina con la proteína -gal
mutante generando una
enzima -gal activa la cual
rompe al X-gal, produciendo
colonias azules.
-Complementación
Aplicación de la -complementación para
la selección de moléculas recombinantes
El MCS del vector está insertado entre el promotor y el
péptido en el extremo 5’ del gen lacZ de E. coli
Cuando el vector contiene un fragmento de
DNA insertado en el MCS, la galactosidasa
no es activa y por lo tanto el X-gal no es roto
y no se producen colonias azules, las
colonias son blancas.
LB-Amp+ IPTG+X-Gal
a) Corte del DNA con enzimas de restricción
b) Ligación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo
al vector
Inserción de DNA exógeno en un vector molecular
Construcción
de una
molécula de
DNA
recombinanteDNA A
DNA B
DNA AB
ligasa
Une covalentemente formando un
enlace fosfodiéster
Reacción de ligación
Introducción de moléculas de DNA
recombinante a bacterias hospederas
Múltiples copias de DNA
recombinante
La transformación implica la introducción de DNA extraño a una
célula hospedante
Plásmido de bajo número de copias
Plásmido de alto número de copias
Cromosomas artificiales de bacteria (BAC´s)
Se pueden clonar hasta
350,000 nt
Gen de -galactosidasa
Medio con sustrato de -gal
Colonias azules: plasmido
nativo
Colonias blancas: plasmido
recombinante
Cromosomas artificiales de levadura (YAC´s)
Se pueden clonar hasta 1,000,000 nucleótidos
Bibliotecas genómicas
DNA genómico
Digestión con enzima de restricción
Bibliotecas de cDNA
Cebador de oligo dT
Reverso transcripción
Síntesis de DNA
doble cadena
RNA mensajero
Bibliotecas genómicas vs. Bibliotecas de cDNA
BUSCANDO UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA
Hibridación y reconocimiento
de secuencias con alta homología
65oC 50oC
Marcaje de un fragmento de DNA
(obtención de una sonda)
dCTP[ 32P]
BUSCANDO UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA
SECUENCIACIÓN DE DNA
Secuenciación de DNA por el método de Sanger
No acepta elongación de la
cadena de nucleotidos por
la DNA polimerasa
• dsDNA molde (¿secuencia?)
• 4 desoxiribonucleótidos (dNTPs)
• cebador de DNA
• DNA polimerasa
SECUENCIACIÓN DE DNA
La lectura de la secuencia se
hace de abajo hacia arriba
Secuenciación automatizada de DNA
• En una sola reacción
se incluyen los cuatro
dideoxys marcados
con un fluoróforo
distinto cada uno.
• No es necesario
detener la reacción.
• Es posible
secuencias
fragmentos 800 pb
• Se lee con un láser y
se almacena la
secuencia en una
computadora.
DETECCIÓN DE UN GENE ESPECÍFICO
Secuencia de pasos para la detección de genes
específicos
A nivel de genoma (DNA)
Southern Blot
A nivel de transcriptoma (RNA)
Northern Blot
1. Aislamiento de DNA
2. Cortar con enzimas de restricción
3. Separar fragmentos por electroforesis
4. Desnaturalizar el DNA
5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon
6. Hibridar con sonda específica
7. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager
1. Aislamiento de RNA
2. Desnaturalizar el RNA
3. Separar por electroforesis desnaturalizante
4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon
5. Hibridar con sonda específica
6. Revelar con placa de Rayos X ó pantalla de fosforimager
Bromuro
de etidio
Sonda 32P
28S
18S
Southern BlotNorthern Blot
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La amplificación es exponencial
En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento
particular de interés
1
2
4 8
El uso de una DNA pol termoresistente ha permitido el desarrollo de la PCR
Great Fountain Geyser,
Yellowstone. Manantial
Temperatura 55-80°C
Thermus aquaticus
TaqDNA Polimerasa
Después del PCR los fragmentos se pueden clonar
Los cebadores son
diseñados con extremos
reconocidos por
enzimas de restricción
El PCR se puede utilizar como alternativa del Southern y
Northern blot
DNA: PCRAmplificación directa
RNA: RT-PCR1. Transcripción
reversa
(obtención de
cDNA)
2. Amplificación
por PCRExones +
intrones
Solo
exones
Pruebas de identidad
La reacción de PCR tiene múltiples aplicaciones
• Detección de alelos mutantes caracterizados.
• Búsqueda de alelos mutantes no conocidos.
• Identificación de microorganismos patógenos.
– Caracterización de cepas del virus de la influenza
• Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de cDNA (Clonación de genes)
• Secuenciación de DNA
• Generación de mutantes puntuales.
• Estudiar la expresión génica.