USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

I. OBJETIVO

Conocer sus partes y su funcin, as como el cuidado, manejo y utilidad en el Laboratorio de Microbiologa.

II. FUNDAMENTO TEORICO

MICROSCOPIO OPTICO Se usa para aumentar el tamao de la imagen aparente de los objetos, lo cual permite observar los detalles estructurales de los microorganismos. El microscopio ptico normal que se usa para observar bacterias y otros organismos celulares es un microscopio compuesto, el cual est provisto de una fuente luminosa, una lente condensadora de luz que la dirige hacia el objeto a observar y dos juegos de lentes que ayudan a la amplificacin de la imagen. A travs de la refraccin o reflexin de los rayos luminosos mediante el sistema de lentes del microscopio, se forma la imagen del objeto, que es ms grande que el objeto mismo, permitiendo el examen de sus estructuras en detalle.

AMPLIFICACION La capacidad amplificadora de un microscopio compuesto es el producto del aumento individual de los oculares y los lentes objetivos. Un microscopio tpico que se usa en bacteriologa tiene objetivos con poder de resolucin de 10X, 40X y 100X y oculares de 10X, por lo cual es capaz de amplificar la imagen de la muestra 100, 400 y 1000 veces. En un aumento de 1000X, las bacterias y microorganismos grandes se pueden visualizar muy bien, pero los virus y muchos de los detalles finos de las estructuras bacterianas no se pueden ver.

PODER DE RESOLUCION La resolucin se define como el espacio de mxima aproximacin entre dos puntos en el que an se pueden observar claramente como dos entidades independientes, es decir, es la distancia entre dos entidades estructurales de un objeto en la cual todava se pueden observar como estructuras separadas en la imagen amplificada. El poder de resolucin de un microscopio est sujeto a la longitud de onda de la luz y a la propiedad de las lentes conocidas como la apertura numrica (AN). El lmite del poder de resolucin de un microscopio es aproximadamente igual a 0.61/AN que para un microscopio ptico es de alrededor de 200 nm (nanmetros). A menor longitud de onda de la luz y AN de las lentes, ser mejor el poder de resolucin del microscopio. Por lo tanto, queda claro que el poder de resolucin de los microscopios pticos se encuentra restringido por AN que se obtenga de los sistemas de lentes y las longitudes de onda del espectro de luz visible. APERTURA NUMERICA Esta expresin, que suele abreviarse AN, indica la cantidad de luz que entra en un objetivo desde un punto del campo del microscopio. Tal valor es de suma importancia, ya que, como se dijo anteriormente, de l depende el Poder de Resolucin, la propiedad ms importante de un objetivo. La AN de una lente depende del ndice de refraccin (N) del medio que llena el espacio entre el objeto y la parte frontal del objetivo, y del ngulo () de los rayos de luz ms oblicuos que puedan entrar al objetivo. La frmula para calcular la AN es: AN = N x sen /2 El aire tiene un ndice de refraccin de 1.0, que limita la resolucin que se puede obtener, pero se puede incrementar la AN poniendo aceite de inmersin entre el espcimen y el objetivo, aumentando as el poder de resolucin del microscopio. El aceite de inmersin tiene un ndice de refraccin de 1.5, lo que aumenta considerablemente la AN y esto mejora el poder de resolucin del microscopio.

TIPOS DE MICROSCOPIO Simple. Los primeros microscopios, construidos por Leeuwenhoek alrededor de 1675, eran simples, es decir, contenan slo una lente o lupa. Compuesto. Tiene varias lentes combinadas, capaces de producir gran aumento. Existen varios aditamentos que utilizados en el microscopio ptico ordinario, aumentan mucho su rendimiento como instrumento de observacin, p. ej. Microscopio en Campo Oscuro (Ultramicroscopio), Microscopio de Contraste de Fases, Microscopio de Fluorescencia, Microscopio de Luz Ultravioleta, Microscopio de Interferencia, Microscopio de Contraste de Interferencia Diferencial de Nomarski.

METODOS DE MICROSCOPIA Examen de organismos vivos. La forma ms simple de examinar las bacterias y otros microorganismos vivos es suspenderlos en agua u otro lquido, colocar una gota de esta suspensin en un portaobjetos ordinario y encima un cubreobjetos, utilizando para su observacin al microscopio los objetivos seco dbil y seco fuerte. Existen otros mtodos como son el de gota pendiente y el microcultivo. Examen de bacterias teidas. La forma y estructura de las bacterias se revelan con ms claridad cuando son desecadas sobre un portaobjetos y son coloreadas o examinadas contra un fondo teido. Existen diversas tcnicas de tincin.

PARTES DEL MICROSCOPIO Y SU FUNCION

Base, soporte y brazo. Sirven para mantener en posicin las partes pticas esenciales. La base y el brazo son fuertes, para disminuir la vibracin. Tubo intercambiable. Su funcin es ajustar la longitud mecnica del tubo, es decir, la distancia entre la lente del ocular que est arriba y la unin del objetivo al revlver, que est abajo. Tornillos macromtrico y micromtrico. Sirven para enfocar, logrando que la muestra se vea ntida y clara, ya que permiten subir y bajar todo el cuerpo del tubo junto con sus lentes y en microscopios modernos, junto con la platina. El tornillo micromtrico permite subir o bajar muy ligeramente. Platina. Parte del microscopio donde se coloca la muestra que va a ser examinada. Pinzas de la Platina. Estas sirven para sujetar la muestra a examinar. Tornillos para desplazar la Platina. Estos sirven para mover la muestra que est sobre la platina, hacia arriba, abajo, derecha o izquierda, hasta enfocar el campo adecuado. Fuente de Luz. Se encuentra colocada debajo del objeto; sta emite la luz que pasa por el condensador, para despus iluminar la preparacin. Condensador. Antes de que la luz alcance la muestra en la platina, se condensa y enfoca a travs de una gran lente condensadora que se halla bajo la platina. Diafragma. Sirve para controlar la luz a travs del condensador. Objetivos. La funcin de stos es delimitar el tamao de la imagen: Objetivo de pequeo aumento "Seco dbil". Util para observar microorganismos grandes, p. ej. Protozoarios. Este objetivo est marcado con un 3 2/3, que significa 2/3 de pulgada 16 mm. Tambin est marcado como 10X. Tiene una lente en el extremo mucho ms grande que cualquiera de los otros objetivos. Objetivo de gran aumento "Seco fuerte". Este se usa para el examen de microorganismos vivos suspendidos en gotas de agua u otros lquidos. Est marcado con 6 1/6 que significa 1/6 de pulgada 4 mm. Tambin est marcado como 45X 50X. La lente del extremo es de menor tamao que la del seco dbil. Objetivo de inmersin en aceite. Este objetivo es indispensable para el examen de frotis teidos de bacterias. La lente visible del extremo es mucho ms corta que la de los objetivos secos. Este objetivo est marcado oil inmer o homog inmer que significa inmersin homognea. Tambin est marcado 1/12 (1/12 de pulgada, 1.9 mm, 1.8 mm) y con 97X 100X. Las marcas 10X, 45X y 97X con que suelen estar marcados los objetivos del microscopio corresponden a la potencia amplificadora, y las letras N.A., a la apertura numrica. Mientras mayor sea la cifra N.A., mayor ser el detalle que revela el objetivo. Las cifras 16 mm, etc., en los objetivos, se refieren a lo que se llama distancia focal equivalente, o sea, nos da una idea de la distancia que deber haber entre el extremo del objetivo y la muestra al enfocarse. Oculares. Son tubos cortos, cada uno con dos lentes. La funcin de stos es amplificar la imagen del objeto formado por el objetivo. Los oculares estn marcados 5X, 10X, etc. indicando que amplan la imagen del objetivo 5 veces, 10 veces, etc. Cuando se utiliza el ocular 10X con el objetivo de pequeo aumento da una amplificacin final de 100 veces. El de 50X dar una amplificacin final de 500 veces y el de 100X una amplificacin final de 1000 veces.

MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO

III. PROCEDIMIENTOColocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones.Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias.Para realizar el enfoque:

a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos.b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntido la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino.

Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin (100x).Para realizar el proceso descrito anteriormente se utilizara como muestra o preparacin una letra e minscula y una hebra de hilo, las cuales se colocaran sobre el centro de un portaobjetos con el lado de debajo de la letra hacia arriba en el caso de la e minscula. Ponga una gota de agua sobre la muestra. Despus de esperar unos segundos hasta que el agua haya empapado el papel, coloque la laminilla (cubreobjetos) sobre la preparacin, si quedan algunas burbujas de aire se presiona ligeramente la laminilla con un lpiz hasta que desaparezcan y contine con el procesoPara realzar el proceso descrito anteriormente se usan preparaciones fijas previamente coloreadas. Dibujar lo observado.Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda

IV. RESULTADOS Y OBSERVACIONES

Muestra de Cebolla

Observamos que la clula epidrmica de la cebolla es de forma de rombo, pentgono o hexgono alargado. Estas son la pared celular, conformada por celulosa y principalmente por agua. Tambin el ncleo de la cebolla y el retculo endoplasmastico.

V. CONCLUSIONES

Se requiere lentes de aumento para una mejor visualizacin de las muestras, puesto que son microorganismos. Para una visualizacin con buena nitidez y con mayor resolucin, es de suma importancia conocer tanto la parte mecnica, como la parte ptica del microscopio.

VI. RECOMENDACIONES

Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol.

VII. ANEXOS

CUIDADO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO 1. Para transportar el microscopio a la mesa de trabajo deber tomarse del brazo con la mano derecha y de la base con la mano izquierda y en posicin vertical. 2. Antes de usarlo, limpiar perfectamente la fuente de luz del microscopio, parte superior del condensador, oculares y objetivos con vaho y frotando suavemente con hisopos. 3. No encender la fuente de luz, sino hasta que se vaya a usar. 4. Colocar la muestra sobre la platina y girar el objetivo que se va a usar colocndolo en la posicin correcta mientras que se observa el material. 5. Ver por el ocular y controlar la cantidad de luz adecuada, moviendo el condensador y diafragma. 6. Para enfocar, bajar el objetivo que se va a usar con el uso del tornillo macromtrico hasta donde tope, sin forzarlo, luego enfocar primero con el tornillo macromtrico y una vez que se ha localizado el campo, usar el tornillo micromtrico para enfocar adecuadamente. 7. Con respecto al objetivo de inmersin, hay que tener mucho cuidado, ya que la distancia focal es muy corta y habr que emplear nicamente el tornillo micromtrico y no el macromtrico debido a que se puede daar la preparacin y el lente del objetivo, para su utilizacin es recomendable: a) Levantar el tubo ptico del microscopio, antes de poner el objetivo en posicin. b) Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. No usar aceite en exceso, ya que daa el cemento de las lentes. c) Viendo por fuera del microscopio, como ya se insisti anteriormente, bajar el objetivo con el macromtrico hasta que toque la gota de aceite. A partir de ese momento el objetivo estar prcticamente dentro de su distancia focal. Enfocar la preparacin con movimientos del tornillo micromtrico. 8. Evitar girar el revlver de los objetivos sin antes levantar el tubo ptico del microscopio. 9. Recordar que el objetivo 45X es ms largo que el de 10X y ms todava que el de inmersin, por lo que deber tenerse cuidado, pues si llegan a rozar, la platina los inutiliza permanentemente. 10. Cuando se vaya a utilizar el objetivo seco fuerte (45X), hacer primero el enfoque de la preparacin con el objetivo seco dbil, luego, girar el revlver de tal manera que el siguiente objetivo sea el seco fuerte, cuidando que la lente no tope con la preparacin. 11. Ajustar el enfoque usando el tornillo micromtrico. 12. Mantener el microscopio retirado de la orilla de la mesa.

VII. BIBLIOGRAFIA

Pelaez Garavito, I y Marulanda ngel M.L. Texto Guia de Biologa General y Laboratorio

Morales J. Laboratorio de Biologa, , Universidad Libre, Facultad de Ingeniera.

LABORATORIO DE MICROSCOPIA MICROBIOLOGIA

COLORACION DE BACTERIAS

I. OBJETIVOS

Observar la morfologa y estructura de las bacterias, una vez coloreada con ayuda del microscopio. Reconocer el proceso de coloracin de Gram en nuestras muestras de bacterias. Aprender a interpretar los resultados obtenidos con la tincin de Gram.

II. FUNDAMENTO TEORICO

Tincin de GramEsta tincin es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se manejan pruebas microbiolgicas. Es definida como una tincin diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos:Bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas.Fue desarrollada por el cientfico dans Hans Christian Gram en 1884; hoy en da, sigue siendo una de las tinciones ms utilizadas universalmente debido a lo econmico, sencillo y eficaz que resulta.11 En microbiologa clnica resulta de gran utilidad, ya que a partir de muestras clnicas directas provenientes de sitios estriles se puede saber de manera rpida las caractersticas de la muestra y hacer una diferencia de los potenciales microorganismos causantes de una infeccin. Los principios de la tincin de Gram estn basados en las caractersticas de la pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo.La pared celular de las bacterias Gram negativas est constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; as pues, la composicin qumica y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las caractersticas tintoriales (Figura 1).13-15 La tincin de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formacin de un complejo cristal violeta yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, tambin destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que sta es soluble a la accinde solventes orgnicos, como la mezcla de alcohol acetona.Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayorfuerza este complejo, mientras que las Gram negativasno lo pueden retener por tener menos cantidadde peptidoglicano. Por ltimo, se coloca safranina,la cual funciona como un colorante secundario o decontratincin y sirve para teir las bacterias que nopudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.16 Haybacterias de un mismo gnero que pueden observarseen la misma muestra como Gram positivas y comoGram negativas, a este evento se le llama tincinGram variable secundaria a alteracin en nutrientes,temperatura, pH o concentracin de electrolitos.17 Notodas las bacterias se pueden teir por esta tcnica,

LABORATORIO N 2